ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. В.Н. Каразіна

ГОНЧАРОВА АЛІНА ВАЛЕРІЇВНА

УДК: 616.89-008.46-092.9-08:616-089.843:591.88

НЕЙРОФІЗІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ВІДНОВЛЕННЯ ПАМ'ЯТІ У ЩУРІВ ПІД ВПЛИВОМ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ ТКАНИН ГІПОКАМПУ ТА БЛАКИТНУВАТОЇ ПЛЯМИ ЕМБРІОНАЛЬНОГО МОЗКУ

03.00.13 – фізіологія людини та тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків-2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України та в Інституті неврології, психіатрії та наркології АМН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник БЕРЧЕНКО ОЛЬГА ГРИГОРІВНА,

Інститут неврології, психіатрії та наркології АМН України, головний науковий співробітник лабораторії нейрофізіології та імунології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Самохвалов Валерій Гаврилович,

Харківський державний медичний університет Міністерства охорони здоров'я України, завідувач кафедри нормальної фізіології;

доктор біологічних наук, професор

Петренко Олександр Юрійович,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу біохімії.

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка (кафедра фізіології людини та тварин),

м. Київ

Захист відбудеться "12" вересня 2001р. о 15 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України (61077, м.Харків, пл. Свободи, 4, ауд.III-15)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна (61077, м.Харків, пл. Свободи, 4)

Автореферат розісланий 25 червня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Падалко В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнiсть теми. Проблема памўяті є однією з актуальних у сучасних нейробіологічних дослідженнях діяльності мозку [Анохин П.К., 1968; Громова Е.А., 1980; Сторожук В.М., 1986; 1998; Анохин К.В., 1997; Milner B. et al, 1998]. Це обумовлено тим, що памўять як фундаментальна властивість усього живого є найважливішою адаптивною реакцією організму до факторів навколишнього середовища [Анохин П.К., 1968; Ашмарин И.П. и др., 1987, Бехтерева Н.П. и др., 1988]. При цьому емоційна памўять, яка має самостійне значення серед різноманітних форм памўяті, є одним із вузлових механизмів адаптивної діяльності організму [Громова Е.А., 1980; Воробьева Т.М., 1969; 1987; Берченко О.Г., 1981; Чайченко Г.М., Макарчук Н.Е., 1982].

Морфофункціональним субстратом механізмів памўяті є структури лімбіко-неокортикальної системи мозку. Велике значення у структурній організації памўяті мають неокортекс [Беритов И.С., 1969; Беленков Н.Ю., 1980; Подольский И.Я., 1997], гіпокамп [Виноградова О.С., 1975], гіпоталамус [Судаков К.В., 1971], мигдалеподібний комплекс [Чепурнов С.А., Чепурнова Н.Е., 1981]. При цьому гіпокампу відводиться роль компаратора, який виділяє сигнали для запису до памўяті, тобто гіпокамп розглядається як ключова структура аналізу за критерієм новизни інформації, яка надходить [Виноградова О.С., 1975; Виноградова О.С. и др., 1997].

Зміни структурно-функціональної організації лімбіко-неокортикальної системи мозку та активності ії окремих структур призводять до порушення складних інтегративних функцій мозку у забезпеченні внутрішнього гомеостазу та процесів пристосовної діяльності [Майоров О.Ю., 1980, Самохвалов В.Г., 1993, 1998] у тому числі і механізмів памўяті [Громова Е.А., 1980]. Виявлено різноманітні порушення цих процесів при ушкодженні гіпокампу та септуму [Тартыгин Н.А., 1966; Меринг Т.А. и др., 1972; Саркисов Г.Т. и др., 1984; Milner B. et al, 1998], мигдалеподібного комплексу [Черкес В.А., 1978; Гамбарян Л.С. и др., 1981; Макарчук Н.Е., Ганжа Б.Л., 1986; Лоскутова Л.В., Гилинский М.А., 1987], неокортексу [Бехтерева Н.П. и др., 1988]. Ушкодження гіпокампу приводить до нездатності видобувати та відтворювати саме ту інформацію, що адекватна умовам зміненого середовища [Саркисов Г.Т. и др., 1984]. Особливої уваги заслуговують дані про зміну процесів памўяті при дії радіаційного опромінення [Штемберг А.С., 1987; Савченко Н.Я., 1990; Дупленко П.Ю., 1994]. У звўязку з цим пошук та розробка методів корекції та управління механізмами памўяті є актуальними.

Останнім часом отримані нові дані про відновлення порушених функцій організму методом трансплантації ембріональних тканин [Полежаев Л.В. и др., 1993, Сухих Г.Т., 1998; Петренко О.Ю. та ін., 2000]. Поліпшення мнестичних процесів і механізмів адаптації виявлено при гомотопічній трансплантації до мозку ембріональних тканин септуму, гіпокампу, блакитнуватої плями, неокортексу [Fine A. et al, 1985; Виноградова О.С., 1990; Ерениев С.И. и др., 1993; Sinden J.D. et al, 1995]. Встановлено, що трансплантована до мозку нервова тканина здатна забезпечувати ушкоджений мозок нейрогуморальними факторами, відновлювати ушкоджені нервові клітини, синаптичні процеси, стимулювати процеси реіннервації та сприяти функціональному відновленню [Dekker H.J. et al., 1994; Nikkrah G. et al.,1995; Воробйова Т.М. та ін., 1995; Цимбалюк В.І. та ін., 1998; Бабійчук Г.О. та ін., 2000].

На експериментальних моделях патології мозку показана можливість компенсації ушкоджених поведінкових функцій методом нейротрансплантації [Norman A.B. et al., 1989; Ермакова И.В., Жулин В.В., 1994; Кулаков В.И. и др., 1996; Угрюмов М.В., 1996], у тому числі є факти поліпшення мнестичних процесів при трансплантації у мозок ембріональних нервових тканин ділянок переднього мозку [Fine A. et al., 1985; Hodges H., 1995], блакитнуватої плями [Брагин А.Г. и др., 1984; Семенова Т.П. и др., 1988], області гіпокампу [Кичигина В.Ф. и др., 1984; Кичигина В.Ф., Виноградова О.С., 1988] та інших ембріональних тканин [Ерениев С.И. и др., 1993; Семченко В.В. и др., 1996].

Виявлено ефекти позитивного впливу на функції мозку і при дистантній трансплантації ембріональної нервової тканини, коли імплантація провадиться не у головний мозок, а під шкіру та внутрішньомўязово [Воробйова Т.М. та ін., 1996; Гринио Л.П. и др., 1996; Берченко О.Г., Тіткова А.М., 1998].

Але, не дивлячись на численні літературні дані про можливість корекції порушень процесів навчання і памўяті методом нейротрансплантації ембріональних тканин, такі аспекти проблеми, як специфічність ефектів нейротрансплантації, вплив оточуючих тканин на реалізацію генетичної програми розвитку нейротрансплантату, потребують поглибленого вивчення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослiдження проведенi в лабораторiї нейрофiзiологiї та iмунологiї Інституту неврологiї, психiатрiї та наркології АМН України у рамках комплексних НДР: "Розробити нові методи тканинної терапії для лікування нервових та психічних захворювань на основі вивчення нейробіологічних механізмів її впливів на ЦНС та адаптивні процеси організму" (шифр ЦФ 485, № державної реєстрації 0194U0347); "Вивчити нейробіоло-гічні механізми терапевтичних ефектів транс- і ксеноімплантації ембріональних мозкоспецифічних тканин, на цій основі розробити нові методи лікування хворих із розладами центральної нервової системи"(шифр ВН 5.21.97; № державної реєстрації 0197U018429), "Дослідження впливів ало- та ксеноімплантації ембріональних нейроспецифічних тканин та їх сполук із потенційованими мозкоспецифічними білками та антитілами до них на психофізіологічні функції при порушеннях ЦНС (моделі, механізми)" (шифр 4.23.2000, № державної реєстрації 0100U001633), - та в рамках комплексної НДР кафедри фізіології людини та тварин біологічного факультету Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна "Фізіолого-біохімічні та структурно-функціональні механізми адаптації біологічних систем до екстремальних чинників довкілля в онтогенезі" (№22.16.00, № державної реєстрації 0100U003268).

Мета i задачi дослiдження. Метою дослiдження була корекція емоційної пам'яті трансплантацією ембріональних тканин гіпокампу та блакитнуватої плями в умовах деструкції гіпокампу та радіаційного опромінювання щурів.

У вiдповiдностi з метою дослiдження вирiшувалися наступнi задачi:

1. Вивчити вплив трансплантації у сенсомоторну кору мозку ембріональної тканини гіпокампу на процеси пам'яті у щурів із деструкцією гіпокампу.

2. Вивчити вплив дистантної (підшкірної) трансплантації ембріональної тканини гіпокампу на процеси пам'яті у щурів із деструкцією гіпокампу.

3. Вивчити вплив деструкції гіпокампу, внутрішньомозкової і дистантної трансплантації ембріональної тканини гіпокампу на морфофункціональні характеристики деяких лімбіко-неокортикальних структур мозку щурів із деструкцією гіпокампу та внутрішньомозковою і дистантною трансплантацією ембріональної тканини гіпокампу.

4. Вивчити вплив внутрішньомозкової трансплантації ембріональної тканини блакитнуватої плями на процеси навчання у опромінених щурів.

Об'єкт дослідження. Навчання і пам'ять.

Предмет дослідження. Визначення кількісно-часових показників умовнорефлекторного стереотипу реакції уникання при пошкодженні гіпокампу та внутрішньомозковій і дистантній нейротрансплантації ембріональної тканини гіпокампу, а також формування умовнорефлекторної емоційної реакції у щурів після радіаційного опромінення і внутрішньомозкової нейротрансплантації ембріональної тканини блакитнуватої плями.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше показано коригуючий вплив ембріональних тканин гіпокампу і блакитнуватої плями при внутрішньомозковій гетеротопічній локалізації трансплантата і дистантній підшкірній імплантації на нейрофізіологічні механізми навчання і пам'яті в умовах ушкодження гіпокампу і радіаційного опромінення.

Одержано нові дані про залежність ефектів нейротрансплантації від типологічних особливостей тварин. У щурів збудливого типу внутрішньомозкова трансплантація ембріональної тканини гіпокампу зберігає стереотип умовнорефлекторної реакції уникання як безпосередньо після пошкодження гіпокампу, так і у відставленому періоді. У щурів гальмівного типу внутрішньомозкова трансплантація ембріональної тканини гіпокампу викликає тимчасове підвищення загальної фізіологічної активності та покращення умовнорефлекторної діяльності, тим часом як у відставленому періоді позитивний вплив на умовнорефлекторну діяльність не виявляється.

Дистантна імплантація ембріональної тканини гіпокампу щурам як збудливого, так і гальмівного типу надає коригуючого пролонгованого впливу на викликані деструкцією дорсального гіпокампу порушення умовнорефлекторної діяльності.

Показано морфофункціональні особливості життєдіяльності ембріональної тканини гіпокампу при гетеротопічній внутрішньомозковій трансплантації в сенсомоторну кору. Встановлено вплив внутрішньомозкової і дистантної нейротрансплантації на адаптаційно-компенсаторні процеси нейронів гіпокампу, гіпоталамусу та неокортексу і репараційні процеси тканини мозку реципієнта.

Вперше показана протекторна дія ембріональної тканини блакитнуватої плями при внутрішньомозковій трансплантації на процеси навчання у щурів, що піддавалися радіаційному опроміненню.

Практичне значення отриманих результатів. Результати досліджень є експериментальним обгрунтуванням застосування методу нейротрансплантації ембріональних тканин гіпокампу і блакитнуватої плями для корекції мнестичних порушень при патології мозку.

Одержані дані про те, що в умовах гетеротопічної локалізації трансплантату відбувається реалізація його генетичної програми з позитивним впливом на пам'ять та поведінкові реакції щурів, роблять внесок у розвиток клінічної нейротрансплантології.

Дані про позитивні ефекти дистантної підшкірної імплантації ембріональної тканини гіпокампу на процеси навчання і пам'яті підтверджують перспективність використання цього методу в клінічній практиці.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми дисертаційної роботи, встановлення мети та задач, вибір об'єкту дослідження, а також методів, адекватних вирішенню задач дослідження, проведено спільно з науковим керівником.

Автор самостійно провів інформаційний пошук і аналіз наукової літератури за даною проблемою. Експериментальні дослідження: моделювання порушень пам'яті, трансплантація ембріональних тканин, умовнорефлекторний та морфологічні методи дослідження, - проведені автором самостійно.

Інтерпретація отриманих даних проведена спільно з науковим керівником.

Апробація результатів. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на XV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998), конференції молодих вчених Харківського державного медичного університету "Медицина третього тисячоліття"(Харків, 2001), міській науково-практичній конференції "Актуальні проблеми сучасної науки у дослідженнях молодих вчених м. Харкова" (Харків, 2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 6 наукових робіт (4 статті та 2 тез).

Обсяг та структура дисертації. Матеріали викладено на 142 сторінках друкарського тексту і містять: вступ, огляд літератури (1 розділ), власні дослідження (2 розділ), висновки. Матеріали дисертації проілюстровано 50 рисунками і 9 таблицями. Список літератури складається з 244 джерел.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводилися у хронічному експерименті на 65 білих нелінійних щурах самцях статевозрілого віку. Емоційну пам'ять вивчали на моделі умовнорефлекторної емоційної реакції уникання. Умовним сигналом був звук метроному 300 уд/хв протягом 15с, після чого надавали безумовне підкріплення - вплив електричним струмом (пороговим значенням від 20 до 45В) протягом наступних 5с. Критерієм стійкої виробки умовної емоційної реакції уникання вважали реалізацію 5 умовних рефлексів із 6 пред'явлених умовних подразників. Після цього вводили диференційний умовний сигнал - звук метроному частотою 120 уд/хв. Критерієм формування умовнорефлекторного стереотипу була наявність високого відсотку повних диференціювань. За 100% прийнята наявність повних диференціювань в умовнорефлекторному стереотипі.

Моделями порушень пам'яті були: деструкція дорсального гіпокампу і тотальне радіаційне опромінення. Білатеральне ушкодження дорсального гіпокампу одержували у тварин під тіопенталовим наркозом електролітичним пошкодженням протягом 10-15 с струмом силою 1-3 мА (діаметр неізольованого кінчика ніхромового електроду складав 200 мк). Розрахунок стереотаксичних координат дорсального гіпокампу [АР-2.0, L-2.0, H-3.5] проводили за допомогою атласу мозку щура Фіфкової та Маршала.

Контрольну групу складали тварини з білатеральним пошкодженням дорсального гіпокампу. Тваринам першої групи ембріональну тканину гіпокампу щурів 18-19-денного віку вводили за допомогою металевої канюлі через трепанаційний отвір у область сенсомоторної кори. Тваринам другої дослідної групи проводили дистантну нейротрансплантацію ембріонального гіпокампу через шкірний надріз у області II-III шийних хребців під місцевим наркозом (новокаїн у дозі 1,0-1,5 мл).

Дослідження емоційної пам'яті у тварин контрольної та дослідних груп проводили через 10 днів після пошкодження гіпокампу та нейротрансплантації протягом наступних 6 днів та через 45 днів.

Стан мнестичних процесів у щурів оцінювався по визначенню кількісно-часових показників умовнорефлекторного стереотипу: кількості позитивних умовнорефлекторних відповідей, кількості негативних умовнорефлекторних відповідей (диференціювань), значенням середнього латентного періоду позитивних умовнорефлекторних відповідей. Ці показники виражалися у відсотках і секундах відповідно.

Морфологічне дослідження мозку тварин проводили через 1,5 місяці після деструкції гіпокампу та нейротрансплантації ембріонального гіпокампу. Гістологічні серійні зрізи завтовшки 8-10 мкм фарбували за методом Нісслю та ван Гізон.

Радіаційне опромінення було одноразовим, тотальним, дозою 0,5 Гр. Процеси навчання вивчали на 4 групах щурів: 1 групу склав інтактний контроль, 2 група – дослідна - тварини, опромінені у віці 3 місяців; 3 група - дослідна - тварини, які піддавалися "несправжньому" опроміненню у віці 3 місяців та операції внутрішньомозкової нейротрансплантації блакитнуватої плями у сенсомоторну кору у віці 7 місяців; 4 група - дослідна - тварини, які піддавалися опроміненню у віці 3 місяців та операції внутрішньомозкової нейротрансплантації блакитнуватої плями у сенсомоторну кору у віці 7 місяців. У всіх тварин у 9-ти місячному віці проведено дослідження формування емоційної пам'яті на моделі умовної емоційної реакції уникання.

Статистичну обробку проводили за методом Вілкоксона-Манна-Уітні з використанням програми Statistica.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив внутрішньомозкової трансплантації ембріональної тканини гіпокампу на емоційну пам'ять щурів в умовах пошкодження дорсального гіпокампу. Під час формування умовнорефлекторного стереотипу контрольних та дослідних тварин було розділено на групи збудливого та гальмівного типів. Основу такого розділення склали тривалість середнього латентного періоду позитивних умовнорефлекторних відповідей, швидкість організації умовних рефлексів, а також такі характеристики поведінки як емоційні і рухові реакції.

Тварини груп збудливого типу характеризувалися коротким латентним періодом позитивних умовнорефлекторних відповідей, який складав 5,2±0,8 с у контролі та 5,4±0,4 с у досліді. Формування перших умовних рефлексів у цих щурів у середньому відбувалося від 2 до 4 дня експерименту. У поведінці переважали виражена орієнтовно-дослідницька реакція, відносно підвищена рухова активність, активно-захисні реакції.

Групи тварин гальмівного типу характеризувалися довгим латентним періодом позитивних умовнорефлекторних відповідей, який складав 8,3±0,8 с у контролі та 8,8±0,2 с у досліді. У цих щурів у поведінці переважали пасивно-захисні реакції страху, завмирання. Тварини були малорухомими. Формування умовних рефлексів було уповільненим у порівнянні з тваринами збудливого типу і відзначалося в середньому від 6 до 9 дня експерименту.

Через 10 днів після деструкції гіпокампу у щурів контрольної групи збудливого типу (5 щурів) відбулося посилення виразності орієнтовно-дослідницьких реакцій, які мали невгасаючий характер, що особливо різко виявлялося на 11, 13 і 15 дні дослідження. У цих тварин у поміжсигнальних паузах відзначались реакції випробувань. В усі дні дослідження, крім 12, спостерігалося достовірне зниження кількості позитивних умовнорефлекторних відповідей у порівнянні з фоном (p<0,05) (pис.1). Тварини часто не реагували на умовний подразник, у поміжсигнальних паузах відзначався грумінг, дослідження вже знайомої дослідної обстановки клітки.

Латентний період позитивних умовнорефлекторних відповідей у контрольній групі збудливого типу на 11 і 14 дні експерименту підвищувався (p<0,05) і складав 11,8±1,4 с и 8,8±1,8 с відповідно.

Відзначалося розгальмування диференціювань. Кількість негативних умовнорефлекторних відповідей зменшилася у порівнянні з періодом до деструкції гіпокампу і на 11, 13, 14 і 16 дні була вірогідно менше фонових значень (p<0,05) (pис.2).

У цих тварин через 1,5 місяці після деструкції гіпокампу кількість позитивних умовних рефлексів вірогідно знизилася (p<0,05) (pис.1). Їхні латентні періоди не відрізнялися від показників фону. Кількість негативних умовнорефлекторних відповідей знизилася у порівнянні з фоновими значеннями цього показника (p<0,05) (pис.2). У цілому по групі орієнтовно-дослідницька реакція була вираженою. Число реакцій випробувань підвищилось у порівнянні з фоном у декілька разів.

Рис.1. Динаміка позитивних умовнорефлекторних відповідей у щурів контрольної та дослідної груп збудливого (А) та гальмівного (Б) типів після деструкції гіпокампу та внутрішньомозкової трансплантації.

Примітка: фон – кількість позитивних умовнорефлекторних відповідей до впливів;

по осі ординат: кількість позитивних умовнорефлекторних відповідей;

* - p<0,05 у порівнянні з контролем.

Рис.2. Динаміка негативних умовнорефлекторних відповідей у щурів контрольної та дослідної груп збудливого (А) та гальмівного (Б) типів після деструкції гіпокампу та внутрішньомозкової трансплантації.

Примітка: фон – кількість негативних умовнорефлекторних відповідей до впливів;

по осі ординат: кількість негативних умовнорефлекторних відповідей;

* - p<0,05 у порівнянні з контролем.

В умовнорефлекторному стереотипі щурів дослідної групи збудливого типу через 10 днів після деструкції гіпокампу та внутрішньомозкової трансплантації ембріональної тканини гіпокампу визначалося незначне зниження кількості позитивних умовнорефлекторних відповідей у порівнянні з періодом до впливу (pис.1). Вірогідної різниці між цими показниками не виявлено. Значення їхніх латентних періодів підвищувались, вірогідне збільшення (р<0,05) помічено на 14, 15 і 16 дні після впливів. Кількість диференціювань не змінилася. Супровідні поведінкові реакції в умовнорефлекторній діяльності під впливом нейротрансплантації відповідали їх рівню у фоні.

При порівнянні даних, отриманих у дослідних та контрольних тварин збудливого типу, виявлено збереження умовнорефлекторного стереотипу під впливом внутрішньомозкової трансплантації. Це визначалося підвищенням кількості позитивних умовних рефлексів та покращенням диференціювань у порівнянні з контрольною групою (pис.1, 2).

Через 1,5 місяці після деструкції гіпокампу та внутрішньомозкової трансплантації ембріональної тканини гіпокампу було виявлене відновлення кількості позитивних умовнорефлекторних відповідей до рівня фону. А у порівнянні з показниками тварин контрольної групи виявлене їх вірогідне підвищення (pис.1) (р<0,05).

Деструкція дорсального гіпокампу у тварин контрольної групи гальмівного типу (5 щурів), як і у щурів збудливого типу, призводить до посилення рухової та орієнтовно-дослідницької активності, що зумовлено послабленням гальмівного впливу гіпокампу на ретикулярні активуючі механізми. Орієнтовно-дослідницькі реакції у щурів були досить тривалими й одноманітними, рухи – повторюваними, що викликано, на думку О.С. Виноградової (1975), порушенням при пошкодженні гіпокампу селективної можливості переключення з одного стимулу на інший, формування сліду.

В умовнорефлекторному стереотипі цих тварин спостерігалися випадання позитивних умовнорефлекторних відповідей, особливо на 15 день експерименту. Значення їхніх латентних періодів та кількість негативних умовних рефлексів через 10 днів після деструкції гіпокампу мали тенденцію до збільшення.

Через 1,5 місяці після деструкції гіпокампу кількість позитивних умовнорефлекторних відповідей залишилася низькою у порівнянні з періодом до впливу. Значення середнього латентного періоду позитивних умовнорефлекторних відповідей вірогідно не відрізнялися від фонових значень. Відзначалася тенденція до збільшення кількості диференціювань у порівнянні з фоновими. Кількість безумовних реакцій уникання у щурів контрольної групи гальмівного типу збільшилася.

У тварин дослідної групи гальмівного типу із пошкодженням дорсального гіпокампу та внутрішньомозковою трансплантацією ембріональної тканини гіпокампу (11 щурів) прояви орієнтовно-дослідницької активності через 10 днів після впливу не відрізнялися від рівня фонових значень. Кількість реакцій випробувань та уникання відповідала фоновим значенням. Кількість позитивних і негативних умовнорефлекторних відповідей, а також значення латентного періоду вірогідно не відрізнялися від фонових значень. У порівнянні з контрольною групою щурів гальмівного типу нейротрансплантація ембріональної тканини гіпокампу у тварин гальмівного типу з пошкодженням гіпокампу призводить до підвищення кількості позитивних умовнорефлекторних відповідей, зберігає стійкість диференціювань.

Через 1,5 місяці після впливів у більшості тварин цієї групи рівень орієнтовно-дослідницької активності відповідав показникам фону. Кількість позитивних умовнорефлекторних відповідей у дослідній групі щурів гальмівного типу була меншою, ніж до впливу (р<0,05) (pис.1). Значення латентних періодів, а також кількість негативних умовнорефлекторних відповідей не змінилися у порівнянні з фоновими значеннями. Порівняння з контролем як через 10 днів, так і через 1,5 місяці після впливів, не виявило вірогідної різниці у показниках умовнорефлекторної діяльності.

Таким чином, під впливом внутрішньомозкової трансплантації ембріональної тканини гіпокампу стереотип умовнорефлекторної реакції уникання у щурів збудливого типу повністю зберігається як через 10 днів після деструкції гіпокампу та нейротрансплантації, так і у відставленому періоді через 1,5 місяці. У щурів гальмівного типу внутрішньомозкова трансплантація ембріональної тканини гіпокампу викликає тимчасове підвищення загальної функціональної активності та покращення умовнорефлекторної діяльності, у той же час у відставленому періоді через 1,5 місяці після деструкції гіпокампу та нейротрансплантації у цих тварин відбуваються порушення умовнорефлекторного стереотипу, які проявляються у зниженні кількості позитивних умовнорефлекторних відповідей, відбувається пригнічення рухових реакцій.

Вплив дистантної імплантації ембріональної тканини гіпокампу на емоційну пам'ять щурів в умовах пошкодження дорсального гіпокампу. У щурів дослідної групи збудливого типу з дистантною трансплантацією через 10 днів після деструкції гіпокампу та дистантної імплантації ембріональної тканини гіпокампу рівень орієнтовно-дослідницької діяльності не змінився у порівнянні з фоном. Кількість позитивних умовнорефлекторних відповідей (pис.3), значення їхніх латентних періодів та кількість диференціювань (pис.4) не змінилися і відповідали фоновим значенням.

Рис.3. Динаміка позитивних умовнорефлекторних відповідей у щурів контрольної та дослідної груп збудливого (А) та гальмівного (Б) типів після деструкції гіпокампу та дистантної трансплантації.

Примітка: фон – кількість позитивних умовнорефлекторних відповідей до впливів;

по осі ординат: кількість позитивних умовнорефлекторних відповідей;

* - p<0,05 у порівнянні з контролем

Отже, у тварин збудливого типу з деструкцією гіпокампу та дистантною трансплантацією ембріональної тканини гіпокампу відбувалося збереження позитивних і негативних умовних рефлексів, і показники умовнорефлекторного стереотипу (латентний період позитивних умовнорефлекторних відповідей, кількість умовнорефлекторних відповідей) відповідали показникам фону.

Через 1,5 місяці після пошкодження гіпокампу та дистантної імплантації ембріональної тканини гіпокампу рівень орієнтовно-дослідницької активності у всіх щурів групи відповідав фоновим значенням. Поведінка тварин у поміжсигнальних паузах була такою ж, як і у фоні. Кількість позитивних умовнорефлекторних відповідей (pис.3), їхні латентні періоди та диференціювання (pис.4) через 1,5 місяці після впливів не відрізнялися ані від фонових значень, ані від показників, зареєстрованих через 10 днів після впливів.

Рис.4. Динаміка негативних умовнорефлекторних відповідей у щурів контрольної та дослідної груп збудливого (А) та гальмівного (Б) типів після деструкції гіпокампу та дистантної трансплантації.

Примітка: фон – кількість негативних умовнорефлекторних відповідей до впливів;

по осі ординат: кількість негативних умовнорефлекторних відповідей;

* - p<0,05 у порівнянні з контролем.

Порівняння результатів спостережень за умовнорефлекторною діяльністю щурів контрольної та дослідної груп збудливого типу показало, що під впливом дистантної нейротрансплантації відбувається збільшення кількості позитивних та негативних умовних рефлексів (р<0,05) (pис.3, 4).

У тварин дослідної групи гальмівного типу з дистантною трансплантацією ембріональної тканини гіпокампу через 10 днів після впливі виявлено зниження рівня орієнтовно-дослідницької активності щурів. Кількість позитивних та негативних умовнорефлекторних відповідей, значення латентних періодів у цей час вірогідно не збільшилися в порівнянні з фоновими значеннями.

Через 1,5 місяці після деструкції гіпокампу та дистантної трансплантації у тварин дослідної групи гальмівного типу орієнтовно-дослідницька активність у середньому залишилася на колишньому рівні. Кількість позитивних умовнорефлекторних відповідей, їхні латентні періоди та кількість диференціювань вірогідно не відрізнялися від фонових значень.

Порівняння кількісно-часових показників умовнорефлекторного стереотипу щурів контрольної та дослідної груп гальмівного типу виявило, що через 10 днів після впливів різниці у кількості позитивних умовнорефлекторних відповідей, а також у кількості диференціювань між групами не було (рис.3, 4), значення латентного періоду між групами не відрізнялися.

Результати, одержані через 1,5 місяці у цих щурів свідчили про те, що дистантна трансплантація запобігає зниженню кількості позитивних умовнорефлекторних відповідей після пошкодження гіпокампу (рис.3, 4) і підвищенню рівня орієнтовно-дослідницької активності. Латентний період позитивних умовнорефлекторних відповідей та кількість диференціювань під впливом дистантної трансплантації не змінилися (рис.4).

Таким чином, дистантна імплантація ембріональної тканини гіпокампу у тварин як збудливого, так і гальмівного типу надає коригуючого пролонгованого впливу на викликані деструкцією дорсального гіпокампу порушення та запобігає порушенню орієнтовно-дослідницьких і рухових реакцій, процесів пам'яті, що, очевидно, зумовлено впливом нейротрофічних факторів трансплантату на центральні і периферичні процеси нейромедіації [Акоев Г.Н. и др.].

Морфологічна характеристика структур головного мозку щурів при внутрішньомозковій та дистантній трансплантації ембріональної тканини гіпокампу в умовах його електролітичного пошкодження. Морфофункціональні дослідження мозку щурів контрольної групи показали, що електролітична деструкція гіпокампу призводила до некрозу у області пошкодження у вигляді кіст, які заміщували та деформували поля гіпокампу.

Нейрони гіпокампу у прилягаючих ділянках були розріджені або згруповані у конгломерати. При цьому виявлено ознаки периваскулярного та перицелюлярного набряку тканини гіпокампу. У сенсомоторній корі цих тварин знайдені порушення її стратифікації у вигляді дезінтегрованості колончастих структур внаслідок хаотичної орієнтації нейронів. У гіпоталамусі знайдено спорожнення та "танення" нейронів із формуванням клітинних конгломератів.

Морфологічне дослідження мозку щурів дослідної групи з деструкцією дорсального гіпокампу і внутрішньомозковою трансплантацією ембріональної тканини гіпокампу у 96% тварин виявило приживлення, розростання і розвиток тканини трансплантату, яка мала складну будову. Центральна його частина була утворена дрібними округлими, гіперхромними, переважно низько диференційованими нервовими клітинами, тобто нейробластами. Серед них визначалися клітини, які знаходилися на різних стадіях диференціювання до утворення зрілих форм.

Виявлено також шар росту, у якому серед дрібних округлих клітин визначалися волокнисті клубки, де виділялися великі клітини з відростками, що згідно з уявленням О.А. Лущокіної (1990), є віддзеркаленням процесів дендритного спраутингу, спрямованого на встановлення синаптичних звўязків з мозком реципієнту, і, очевидно, складає структурну основу відновлення памўяті.

Межу між тканиною трансплантату та шарами сенсомоторної кори було складно розрізнити, тобто відбулася морфологічна інтеграція трансплантату ембріонального гіпокампу із мозком реципієнту. У молекулярному шарі сенсомоторної кори безпосередньо під трансплантатом суттєво збільшено кількість гліальних клітин та капілярів, що свідчить про підвищення інтенсивності трофічних процесів у оточуючих тканинах.

У щурів дослідної групи з деструкцією гіпокампу та дистантною трансплантацією ембріональної тканини гіпокампу виявлено регенерувальну, трофічну, протизапальну дію дистантної нейротрансплантації на процеси мозку реципієнта. Це проявлялося у компактності гліо-мезодермального рубцювання у області електролітичного пошкодження без грубих деформацій шарів гіпокампу та кіст, проліферативній активності глії, значній кількості макрофагів. Поза зоною пошкодження структура гіпокампу зберігається, нейрони гіпокампу чітко структуровані.

Дослідження впливу внутрішньомозкової трансплантації ембріональної тканини блакитнуватої плями на процеси навчання у щурів після радіаційного опромінення. У опромінених щурів у порівнянні з інтактними тваринами подовжується I стадія виробки умовних рефлексів та знижується кількість умовнорефлекторних відповідей (табл.1).

У групі несправжньоопромінених тварин під впливом нейротрансплантації тканини блакитнуватої плями час організації умовних рефлексів (I стадія) був менше, ніж у інтактних тварин та у опромінених тварин. Кількість умовнорефлекторних відповідей не відрізнялася від інтактних та опромінених щурів.

Внутрішньомозкова нейротрансплантація ембріональної тканини блакитнуватої плями опроміненим тваринам наблизила час організації умовних рефлексів до цього показника у інтактних тварин. При цьому число умовнорефлекторних відповідей у цій групі на II стадії було вірогідно більше, ніж у опромінених щурів, крім того число умовних рефлексів за один дослідний день у опромінених тварин із трансплантацією ембріональної тканини блакитнуватої плями було більше, ніж у опромінених щурів.

Таблиця 1

Вплив опромінення та трансплантації на основні показники виробки умовнорефлекторної емоційної реакції уникання у щурів

Показники умовнорефлекторної діяльності Інтактні Опромінені "Несправж-ньо-опро-мінені" з трансплан-тацією Опромінені з трансплан-тацією

Швидкість виробки умовнорефлекторної реакції (число сполучень) I стадія 19.0±4.9 26.8±5.8* 13.0±2.0 17.9±2.7

II стадія 44.5±9.8 40.5±9.4 48.7±8.0 44.4±6.2

Латентний період умовно-рефлекторної реакції (с) II стадія 6.1±0.6** 8.4±0.7 6.2±0.7 8.9±0.6

III стадія 6.7±0.8 6.7±0.7 6.3±0.8 8.3±0.6

Число умовних рефлексів (% від числа сполучень) Усього 52.4±6.1 43.8±7.9 52.0±6.1 51.4±6.0

II стадія 37.2±5.9 28.3±4.1*** 34.8±4.7 41.7±4.1

III стадія 77.8±7.0 77.3±2.7 76.4±6.1 80.5±5.5

Примітки: * - різниця вірогідна (p<0.05) у щурів 2 та 3 груп

** - різниця вірогідна (p<0.05) у щурів 1 та 2 груп і 1 та 4 груп

*** - різниця вірогідна (p<0.05) у щурів 2 та 4 груп.

Покращення показників умовнорефлекторної діяльності у опромінених щурів із трансплантацією ембріональної тканини блакитнуватої плями пов'язано з неспецифічним, адаптогенним впливом трансплантату блакитнуватої плями, який містить норадреналінсинтезуючі нейрони. Також не виключена можливість і специфічного впливу тканини блакитнуватої плями, що продукує норадреналін, який відіграє важливу роль у нейромедіаторному забезпеченні процесів навчання.

ВИСНОВКИ

1. На експериментальній моделі порушення памўяті, викликаного електролітичним пошкодженням дорсального гіпокампу, показано специфічні ефекти впливу внутрішньомозкової та дистантної трансплантації ембріональної тканини гіпокампу на процеси памўяті; а також їх активація при внутрішньомозковій трансплантації ембріональної тканини блакитнуватої плями у щурів, що піддавалися радіаційному опроміненню.

2. Деструкція дорсального гіпокампу у тварин збудливого та гальмівного типів призводить до порушення фізіологічної активності: орієнтовно-дослідницької та рухової поведінки, порушенню стереотипу умовнорефлекторної емоційної реакції уникання, що проявляється у зниженні кількості умовнорефлекторних відповідей, розгальмуванні диференціювань. При цьому виявлено необоротні структурно-функціональні зміни нейронів у області пошкодження дорсального гіпокампу з розвитком дистрофічних і некробіотичних процесів та деформацією його шарів, змінює стратифікацію сенсомоторної кори, призводить до дистрофії нейронів гіпокампу, гіпоталамусу та сенсомоторної кори.

3. Трансплантація ембріональної тканини гіпокампу у область сенсомоторної кори надає коригуючих ефектів на кількісні показники умовнорефлекторної діяльності щурів із деструкцією гіпокампу, залежні від типологічних особливостей тварин.

4. У тварин збудливого типу внутрішньомозкова трансплантація ембріональної тканини гіпокампу викликає стійкі пролонговані (упродовж 1,5 місяці) позитивні ефекти на фізіологічну активність і памўять: підвищує кількість позитивних умовнорефлекторних відповідей, покращує диференціювання в умовнорефлекторному стереотипі емоційної реакції уникання.

5. У тварин гальмівного типу внутрішньомозкова трансплантація ембріональної тканини гіпокампу викликає короткочасне підвищення фізіологічної активності мозку та покращує памўять, зберігаючи умовнорефлекторний стереотип.

У відставленому періоді через 1,5 місяці у цих щурів виявлено порушення умовнорефлекторного стереотипу, які проявляються у зниженні кількості позитивних умовнорефлекторних відповідей з пригніченням загальної рухової активності.

6. Виявлено морфофункціональні особливості приживлення ембріональної тканини гіпокампу, трансплантованої у сенсомоторну кору мозку: наявність зони росту, диференціювання нейробластів, підсилення васкуляризації з позитивним впливом на цитоархітектоніку гіпокампу та сенсомоторної кори з підсиленням синтетичної активності їхніх нейронів та активацією репаративних процесів у вигляді компактності гліо-мезодермального рубцювання у області електролітичного пошкодження гіпокампу.

7. Дистантна (підшкірна) трансплантація ембріональної тканини гіпокампу щурам як збудливого, так і гальмівного типів із деструкцією гіпокампу запобігає порушенню фізіологічної активності (орієнтовно-дослідницьких та рухових реакцій) і механізмів памўяті; зберігає кількісно-часові характеристики стереотипу умовної реакції уникання. Це супроводжувалося стимуляцією компенсаторно-відновних процесів у гіпокампі та гіпоталамусі з активацією репаративних процесів.

8. Трансплантація блакитнуватої плями до області сенсомоторної кори щурів, які піддавалися тотальному радіаційному опроміненню, покращує процеси навчання у порівнянні з опроміненими тваринами, надає протекторної дії на I та II стадіях формування умовного рефлексу, наближаючи його кількісно-часові показники до рівня інтактних тварин.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Гончарова А.В. Коррекция эмоциональной памяти у облученных крыс трансплантацией эмбрионального голубоватого пятна // Биологический вестник. – 1998. – Т.2, №2. – С.28-30.

2. Гончарова А.В., Берченко О.Г. Влияние дистантной имплантации эмбриональной ткани гиппокампа на механизмы памяти у крыс с повреждением гиппокампа // Биологический вестник. – 1999. – Т.3, №1-2. – С.41-45.

3. Гончарова А.В. Влияние трансплантации в мозг эмбриональной ткани гиппокампа на мнестические процессы у крыс // Вісник проблем біології і медицини. – 1999. - №13. – С.72-76.

4. Гончарова А.В. Эффекты влияний внутримозговой и дистантной трансплантации эмбриональной ткани гиппокампа на процессы памяти у крыс при повреждении гиппокампа // Вісник Харківського університету. – 2001. - №506. – С.263-265.

5. Гончарова А.В. Дослідження емоційної памўяті у щурів, що зазнали впливу радіаційного опромінювання, та її корекція трансплантатом тканини голубої плями. // Тези доповідей XV з'їзду Українського фізіологічного товариства. - Фізіологічний журнал.-1998.-Т.44, №3.-С.83.

6. Гончарова А.В. Влияние внутримозговой трансплантации на память и морфофункциональные характеристики головного мозга крыс в условиях повреждения гиппокампа // Конф. молодых ученых Харьк. гос. мед. университета "Медицина третьего тысячелетия". Тез. докл. – Х., 2001. - С.13-14.

АНОТАЦІЯ

Гончарова А.В. "Нейрофізіологічні особливості відновлення пам'яті у щурів під впливом трансплантації тканин гіпокампу та блакитнуватої плями ембріонального мозку". – Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13. – фізіологія людини і тварин. – Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків 2001.

Дисертація присвячена вивченню впливу внутрішньомозкової та дистантної гетеротопічної нейротрансплантації ембріональних тканин гіпокампу та блакитнуватої плями на умовнорефлекторну діяльність щурів із деструкцією гіпокампу та в умовах радіаційного опромінення. Отримані в роботі результати дозволяють зробити висновок про те, що внутрішньомозкова і дистантна нейротрансплантація ембріональних тканин гіпокампу коригують умовнорефлекторний стереотип емоційної реакції уникання у тварин із пошкодженням гіпокампу, підвищують у них кількість позитивних і негативних умовнорефлекторних відповідей до рівня фону, а також активують адаптаційно-компенсаторні процеси у лімбіко-неокортикальних структурах мозку. Внутрішньомозкова трансплантація блакитнуватої плями здійснює протекторний вплив на процеси навчання у опромінених щурів.

Ключові слова: умовний рефлекс, внутрішньомозкова нейротрансплантація, дистантна нейротрансплантація, ембріональна тканина, гіпокамп, блакитнувата пляма, емоційна пам'ять.

АННОТАЦИЯ

Гончарова А.В. "Нейрофизиологические особенности восстановления памяти у крыс под влиянием трансплантации тканей гиппокампа и голубоватого пятна эмбрионального мозга" – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13. – физиология человека и животных. – Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков 2001.

Диссертация посвящена исследованию влияния гетеротопической внутримозговой и дистантной нейротрансплантации эмбриональных тканей гиппокампа и голубоватого пятна на процессы обучения и памяти у крыс с деструкцией гиппокампа, радиационным облучением крыс.

Процессы обучения и памяти изучали на модели условнорефлекторной реакции избегания. Трансплантацию эмбриональной ткани гиппокампа крысам с деструкцией дорсального гиппокампа осуществляли в сенсомоторную кору и подкожно. Трансплантацию эмбриональной ткани голубоватого пятна облученным животным проводили в сенсомоторную кору.

Показано, что деструкция дорсального гиппокампа у животных возбудимого и тормозного типов приводит к нарушению физиологической активности: ориентировочно-исследовательского и двигательного поведения, нарушению стереотипа условнорефлекторной эмоциональной реакции избегания, что проявляется в снижении количества условнорефлекторных ответов, растормаживании дифференцировок; вызывает необратимые структурно-функциональные изменения нейронов в области повреждения дорсального гиппокампа с развитием дистрофических и некробиотических процессов и деформацией его слоев, изменяет стратификацию сенсомоторной коры, приводит к дистрофии нейронов гиппокампа, гипоталамуса и сенсомоторной коры.

Трансплантация эмбриональной ткани гиппокампа в сенсомоторную кору оказывает коррегирующее действие на показатели условнорефлекторной деятельности крыс с деструкцией дорсального гиппокампа. Такое действие эмбриональной ткани гиппокампа зависело от типологических особенностей животных.

У крыс возбудимого типа с деструкцией дорсального гиппокампа трансплантация эмбриональной ткани гиппокампа в сенсомоторную кору сохраняет уровень ориентировочно-исследовательской и двигательной активности. Оказывает пролонгированное действие (в течение экспериментального периода 1,5 месяцев) на условнорефлекторную деятельность крыс, что проявляется в повышении количества положительных условных рефлексов, улучшении дифференцировок в условнорефлекторном стереотипе эмоциональных реакций избегания.

У крыс тормозного типа с деструкцией дорсального гиппокампа трансплантация эмбриональной ткани гиппокампа в сенсомоторную кору оказывает временное (через 10 дней после нейротрансплантации) повышение общей функциональной активности и улучшение условнорефлекторной деятельности. В то время как в отставленном периоде (спустя 1,5 месяца) количество положительных условных рефлексов в условнорефлекторном стереотипе крыс снижается с угнетением двигательной активности и усилением безусловных пассивно-оборонительных реакций страха.

При морфогистологическом исследовании мозга крыс с деструкцией гиппокампа и трансплантацией эмбриональной ткани гиппокампа в сенсомоторную кору обнаружено приживление трансплантата в 96% случаев, развитие ткани трансплантата с наличием зоны роста на конвекситальной поверхности мозга, дифференцировкой нейробластов, васкуляризацией. Положительное влияние жизнеспособного трансплантата на цитоархитектонику гиппокампа и сенсомоторной коры проявляется в сохранении нормальной слоистой организации гиппокампа и стратификации сенсомоторной коры с усилением синтетической активности нейронов и активации репаративных процессов в гиппокампе.

Дистантная нейротрансплантация эмбриональной ткани гиппокампа, осуществленная подкожно животным с деструкцией гиппокампа, предотвращает нарушение количественно-временных показателей условнорефлекторного стереотипа как у животных возбудимого, так и тормозного типов спустя 10 дней и через 1,5 мес после нейротрансплантации. Это сопровождается стимуляцией компенсаторно-восстановительных процессов в гиппокампе и гипоталамусе, усилением трофических и репаративных процессов в мозгу крыс.

У крыс, подвергшихся радиационному тотальному облучению в дозе 0,5 Гр, внутримозговая трансплантация эмбриональной ткани голубоватого пятна в область сенсомоторной коры, проведенная спустя 4 месяца после облучения, улучшает процессы обучения, что проявляется в восстановлении количественно-временных показателей условнорефлекторной деятельности до уровня интактных животных - в сокращении времени организации первого условнорефлекторного ответа, повышении количества условнорефлекторных реакций в сравнении с облученными животными .

Ключевые слова: условный рефлекс, внутримозговая нейротрансплантация, дистантная нейротрансплантация, эмбриональная ткань, гиппокамп, голубоватое пятно, эмоциональная память.

SUMMARY

Gоnchаrоvа А.V. Nеurоphysiоlоgical peculiarities of the restoration of memory under the influence of embryonic brain hippocampus and locus coeruleus tissues transplantation. – Manuscript.

Thesis for a candidateўs degree by speciality 03.00.13. – physiology of human and animals. – V.N. Karasin Kharkov national university.

The dissertation is devoted to investigation of the effects of heterotopical intrabrain and distant neurotransplantation of embryonic hippocampus and locus coeruleus tissues on the conditional reaction activity of the rats