НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

КЕРОС ВІКТОРІЯ АНАТОЛІЇВНА

УДК: 615.361.631.013.014.413:616-089.843:57.085.2

КРІОКОНСЕРВУВУВАННЯ ФЕТОТЕСТИКУЛЯРНОЇ ТКАНИНИ ЛЮДИНИ

03.00.19 – кріобіологія і кріомедицина

Автореферат

диссертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії Наук України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук, професор,

Лауреат Державних премій СРСР та України

Грищенко Валентин Іванович,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини

Національної Академії Наук України, директор

Офіційні опоненти: Доктор медичних наук, професор

САНДОМИРСЬКИЙ БОРИС ПЕТРОВИЧ,

Зав. відділом експериментальної кріомедицини

Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Доктор біологічних наук, професор

ГЛАДКОВА АЛЛА ІВАНІВНА,

зав. лабораторією репродуктивної ендокринології

Українського НДІ фармакотерапії ендокринних захворювань

ім. В.Я. Данилевського

Провідна установа: Харківський державний медичний університет МОЗ України,

кафедра урології

Захист відбудеться “_24__” квітня 2001 р. о __13.30__годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при

Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,

61015, м. Харків - 15, вул. Переяслівська, 23

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКіК НАН України

61015, Харків – 15, вул. Переяслівська, 23

Автореферат розісланий “_23_” березня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор мед. наук, професор ГОЛЬЦЕВ А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Чоловічa неплідність залишається актуальною медичною проблемою, що має соціальне та державне значення. Кількість неплідних шлюбів у світі досягає 10-35 % [Грищенко В.И. и др., 1990], з них 35-50 % обумовлені чоловічим фактором [Ворник Б.М., 1995, Корякин М. И др., 1995]. Показник розповсюдження чоловічї безплідності в регіонах України складає 17,4% [Павлова Л.П., Сайдакова Н.О., 1995]. Актуальною продовжує залишатись ця проблема для осіб, які брали участь у ліквідації наслідків аварії на Чорнобильській АЕС, а також для населення, що проживає в районах, які підлягали впливу іонізуючого випромінювання.

На цей час досягнення в галузі медико-біологічних наук, зокрема, кріобіології і кріомедицині, прикладній ембріології, клітинній і молекулярній біології розширили можливості медиків, надав такий полівалентний метод лікування як сучасна клітинна та тканинна терапія [Грищенко В.И. и др., 1998-2000, Васильев Н.В. и др., 1996, Oopen I., 1994 ]. Відомо, що трансплантація тканини яєчка може справляти стимулюючу дію на чоловічу статеву систему, на потенцію. На думку ряду авторів, трансплантовані сім'яники значною мірою стимулюють та частково компенсують ендокринну функцію пошкоджених або повністю втрачених статевих залоз [Гоциридзе О.А., 1981, Божедомов В.А. и др., 1994, 1996].

В андрологічній практиці розроблені та втілені методики лікування чоловічої секреторної неплідності, порушення статевої функції, чоловічого гіпогонадизму з використанням клітинних гомогенатів, ліофілізатів яєчок, екстрактів тестикул тварин [NikolowskiW., 1956, Camerer W., 1978], культури клітин Лейдіга та тестикулярної тканини [Вартапетов Б.А. и др., 1978, Зыбин Д.В. и др.,1992, Турчин И.С. и др., 1989,1995].

У ранніх експериментальних дослідженнях описані трансплантації сім’яників без попереднього консервування. Сучасні методи низькотемпературного консервування призводять до зменшення потреби клітин у кисні, зниження енергетичних витрат, зменшення накопичення метаболітів, що створюють сприятливі умови для збереження життєздатності тканини, що знаходиться в анабіозі. У ряді робіт [Гоциридзе О.А., 1981, Шак П.К., 1981] наявні дані щодо розробки різних способів консервування неонатальних та статевозрілих сім'яників людини, що доводять принципову можливість їх більш тривалого, ніж в умовах гіпотермії, зберігання із збереженням життєздатності та гормонального статусу трансплантату. Однак у доступній літературі нами не виявлено даних про способи тривалого зберігання фетальних тестисів людини.

Потреба клініки в гормонпродукуючому матеріалі з метою корекції порушення гормональної та генеративної функцій, обумовлених тестикулярною недостатністю, особливо у хворих з непереносимістю синтетичних гормональних препаратів, вимагає удосконалення існуючих методів лікування та створення надійного способу тривалого зберігання ендокринної тканини сім’яників плоду в біологічно повноцінному стані для алогенної трансплантації хворим з вищезазначеною патологією.

Зв'язок роботи з науковими темами. Цей напрямок досліджень пов'язаний з науковою темою Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАН України 2.2.6.66 "Вивчити механізм підвищення фертильності гамет та стійкості фетальних клітин людини та тварин при дії низьких температур у поєднанні з іншими фізичними та хімічними факторами". Усі етапи роботи: операції переривання вагітності, одержання матеріалу, дослідження впливу факторів кріоконсервування та ішемії на структурні та функціональні характеристики сім’яників плодів людини, операції трансплантації кріоконсервованої фетотестикулярної тканини людини (ФТТЛ) та обстеження пацієнтів до та після операції, були виконані дисертантом самостійно

Мета та задачі дослідження. Метою роботи є розробка режиму кріоконсервування фетотестикулярної тканини людини, що зберігає морфологічну та функціональну повноцінність ФТТЛ, створення низькотемпературного банку ФТТЛ для подальшого застосування її в клінічній трансплантології.

Об'єктом дослідження є кріоконсервування, тривале зберігання та клінічне застосування фетотестикулярної тканини людини.

Предметом дослідження є вивчення структурно-функціональної організації ФТТЛ при дії факторів ішемії та кріоконсервування, впливу трансплантації кріоконсервованої ФТТЛ на функціональний стан репродуктивної системи при деяких формах чоловічого непліддя.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

1)

2)

3)

4)

Методи дослідження. Дослідження об’ємних процесів, що відбуваються у зразках ФТТЛ у під час заморожування-відігріву було проведено методом диференційної тензоділатометрії. При використанні методу світлової мікроскопії було проведено оцінку морфології зразків. Дослідження функціонального збереження КФТТЛ було проведено методом органотипового культивування з визначенням здатності тканини до зростання та виділення тестостерону в культуральне середовище. Вплив трансплантації КФТТЛ в амніотичній оболонці було оцінено за допомогою вивчення еякуляту та зміни рівня вмісту гормонів у сироватці крові пацієнтів методом імуноферментного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведені тензоділатометричні дослідження об'ємних процесів, що відбуваються при заморожуванні-відігріві ФТТЛ, і на основі одержаних результатів запропонований спосіб кріоконсервування фетотестикулярної тканини людини, який забезпечує максимальне збереження її біологічних властивостей.

Уперше вивчено стан функціональної повноцінності ФТТЛ, що визначається за здатністю клітин до проліферації в умовах органотипового культивування та секреції гормонів у культуральну рідину на етапах кріоконсервування, відзначено стимулюючий вплив ембріональних нервових клітин, введених у фідерний шар при культивуванні, на синтез тестостерону (Т) ФТТЛ після кріоконсервування. Досліджено вплив факторів кріоконсервування на структуру тканини сім'яників плодів людини.

Уперше в клінічній практиці була використана кріоконсервована ФТТЛ з терапевтичною метою. В роботі представлені дані, які свідчать про те, що алотрансплантація кріоконсервованої ФТТЛ в амніотичній оболонці позитивно впливає на рівні тестостерону, лютеінізуючого гормону (ЛГ) та фолікулостимулюючого гормону (ФСГ) сироватки крові, сперматогенну функцію та загальний стан чоловіків з андрогендефіцитними станами.

Практичне значення одержаних результатів. Запропонований спосіб кріоконсервування тестикулярної тканини плодів людини, використаний в ІПКіК НАН України з метою створення низькотемпературного банку ФТТЛ на базі Українського банку біологічних об'єктів для експериментальних досліджень та клінічного застосування. Розроблені, затверджені Координаційним центром трансплантації органів, тканин та клітин при Міністерстві охорони здоров'я України та впроваджені в практику методичні рекомендації з кріоконсервування та клінічного застосування фрагментів фетотестикулярної тканини людини після кріоконсервування. Алотрансплантація кріоконсервованої ФТТЛ в амніотичній оболонці застосована при лікуванні безплідності у осіб чоловічої статі з андрогендефіцитними станами у відділі кріобіології систем репродукції Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України на базі 5-го спеціалізованого пологового будинку м. Харкова. Дані фіксуються в протоколах досліджень і в амбулаторних картках пацієнтів. Розроблені методики кріоконсервування і трансплантації ФТТЛ можуть бути рекомендовані для вивчення та використання в лікувальних закладах, які займаються діагностикою та лікуванням захворювань чоловічої репродуктивної системи, в лабораторіях з лікування безплідності із застосуванням методів допоміжних репродуктивних технологій, у науково-дослідних закладах, що вивчають функції ендокринних органів і займаються проблемами трансплантації органів і тканин з тим, щоб поліпшити результати лікування чоловічої неплідності.

Особистий внесок дисертанта. Представлені для захисту наукові результати одержані дисертантом особисто. Сумісні дослідження були проведені під керівництвом академіка НАН України В.І. Грищенка. Співавтори окремих публікацій к.б.н. Г.С. Лобинцева та к.б.н. І.А. Вотякова сприяли проведенню експериментів з кріоконсервування та культивування ФТТЛ. Сумісно з к.мед.н. В.О. Бондаренком була підібрана група пацієнтів для алотрансплантації КФТТЛ та здійснювалось клінічне спостереження за станом пацієнтів після операції. Усі хірургічні маніпуляції проведені дисертантом особисто. У сумісних дослідженнях дисертанту належить ідея планування експериментів, проведення власне експерименту, обговорення наукових результатів та підготовка матеріалів до друку. Самостійно проведено аналіз одержаних результатів, зроблено висновки щодо проведеної роботи, а також дані рекомендації щодо їх подальшого застосування.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на конференції, присвяченій андрологічним аспектам неплідності подружньої пари та актуальним питанням сексології (Луцьк, 1998), симпозіумі з міжнародною участю "Бесплодие: вспомогательные репродуктивные технологии 2000" (Київ, 1999), науково-практичній конференції "Актуальні проблеми фармакотерапії ендокринних захворювань" (Харків, 1999), щорічній конференції молодих вчених ІПКіК НАН України разом з Міжнародною кафедрою кріобіології під егідою ЮНЕСКО (Харків, 1999, 2000).

Публікації. За матеріалами дисертації надруковано 7 робіт, 4 з яких у центральних профільних журналах.

Структура дисертації. Робота викладена на 144 сторінках, має традиційну структуру подання і складається з вступу, основної частини: огляд існуючої на сьогодні літератури за темою дисертації (Розділ 1); матеріали і методи дослідження (Розділ 2); одержані результати та їх обговорення (Розділ 3), заключення, висновки і список використаних джерел (240 найменувань на 25 сторінках). Дисертація містить 34 рисунки і 5 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Загальна методика та основні методи дослідження. Матеріалом для дослідження були фрагменти тканини сім’яників, одержаних від 78 плодів чоловічої статі 16-27 тижнів гестації. Операції переривання вагітності пізніх термінів за соціальними показаннями проводили в стаціонарі гінекологічного відділення 5-го клінічного пологового будинку м. Харкова. При визначенні гестаційного терміну плоду враховувались дані анамнезу, результати ультразвукового дослідження: біпариєнтальний діаметр (БПД), довжина стегна (ДС) та середній діаметр живота (ДЖ) плоду. Переривання вагітності зазвичай відбувалось через 8-14 годин після введення стандартної суміші лікарських речовин у складі 10 ЕД окситоцину, 5 мл 2% розчину граміцидіну, 10 мл 40% розчину глюкози. Ішемія при даному методі зазвичай складає від 20 хвилин до 1,5 годин. Тестиси витягали із дотриманням правил асептики і антисептики на рівні підвздошої ямки або черевної частини пахового кільця, вміщували у бакпечатки із стерильним розчином Хенкса з гентаміцином або канаміцином (50 од/мл) і транспортували в лабораторію ІПКіК НАН України при температурі 4С. В стерильних умовах сім’яники тричі промивали в чашках Петрі новим розчином, розрізали на фрагменти 2х2х3-4 мм, переносили в поліетиленові ампули ємкістю 1мл і доливали кріозахисним середовищем до 0,8 мл. Як кріопротектори використовували диметилсульфоксид (ДМСО) та поліетиленоксид з молекулярною масою 400 (ПЕО-400) різних концентрацій, які пройшли очистку в лабораторії кріопротекторів ІПКіК НАН України за відповідними методами [Гордон А., Форд Р., 1976, Панов В.П., 1978]. Перед початком роботи кріопротектори розводили в стерильних флаконах розчином Хенкса до одержання 5% та 10% концентрацій ДМСО і 12% концентрації ПЕО-400.

Заморожування проводили на універсальному програмному заморожувачі УОП-6000000 виробництва СКТБ з ДВ ІПКіК НАН України. Швидкість охолодження реєстрували за допомогою мідь-копелевої термопари із записом на самописному пристрої КСП-4. Для заморожування використовували дві програми охолодження: швидка - шляхом занурення ампул із зразками ФТТЛ у рідкий азот (-196С) після 30-ти хвилинної еквілібрації в середовищах з 5% і 10% концентраціями ДМСО, а також триетапна - з розчинами кріопротекторів ДМСО 5 і 10% концентрацій та 12% розчину ПЕО-400 на середовищі Хенкса. Зберігання ампул з кріоконсервованою ФТТЛ при -196С здійснювали у сховищі біопродуктів (ХБ-50) ємкістю 500 літрів. Відігрів заморожених зразків проводили на водяній бані при температурі 37-40С до появи рідкої фази.

Методом диференційної тензоділатометрії, із застосуванням диференційного тензоділатометричного комплексу для кріобіологічних досліджень (ТДК), вимірювали зміну об’єму фрагментів тканини тестису в процесі її заморожування до -80С зі швидкістю 1С/хв і наступного відігріву зі швидкістю 0,5С/хв [Осецкий А.И., Аненко В.И., 1984].

Гістологічні препарати готували згідно із загальноприйнятою методикою [Меркулов Г.А., 1960]. Методом світлової мікроскопії були вивчені постійні препарати культури ФТТЛ та зразки ФТТЛ після гіпотермічного зберігання, 30-хвилинної еквілібрації з 5% і 10% розчинами ДМСО, 12% розчином ПЕО-400 та після кріоконсервування. Перегляд препаратів здійснювали під окуляром х3, х7 та об’єктивом х10, х40, х100 в мікроскопі БІОЛАМ.

Оцінку функціональної повноцінності ФТТЛ на етапах низькотемпературного консервування проводили методом культивування в двошаровому агаровому середовищі [PikeRobinson W.F., 1970] у нашій модифікації стосовно ФТТЛ. Як фактор, що стимулює гормонсинтезуючу активність фетального сім’яника, використовували поживне середовище (фідер), яке містить клітини ембріональної нейротканини 1-1,5х106/мл. Для культивування застосовувалось модифіковане для ФТТЛ середовище RPMJ-1640. Культивування проводили при 37С в умовах абсолютної вологості і вмісті 7,5% СО2 у повітрі. Перегляд культур та приготування постійних препаратів проводили на 7, 14 і 20-ту добу культивування.

Для дослідження гормональної активності ФТТЛ in vitro органотипове культивування здійснювали в пробірках Лейтона. Заміну поживного середовища проводили на 7, 14 і 21-у добу. Кількість гормону, що виділився в культуральне середовище, визначали за допомогою ІФА-набору для визначення тестостерона за тестом Bio-Rad Testosterone test (кат. №4012115).

Трансплантацію кріоконсервованої ФТТЛ 16-20 тижнів гестації в амніотичній оболонці проводили із дотриманням прийнятих стандартних нормативів стерильності. В обов’язковому порядку зразки ФТТЛ тестували на наявність бактеріальної забрудненості. Вірусологічний контроль біопрепаратів на відсутність ВІЛ, цитомегаловірусу, токсоплазмозу, гепатиту В і С, вірусу краснухи, герпесу був проведений із використанням методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЦР).

Одержання, кріоконсервування, зберігання та відігрів амніотичної оболонки проводили відповідно до раціоналізаторської пропозиції щодо способу зберігання амніотичної оболонки №34 від 12.06.1986 р., розробленому в ІПКіК НАН України.

У всіх пацієнтів у передопераційному періоді, через 1 тиждень, 1 і 2 місяці після операції трансплантації кріоконсервованої ФТТЛ в амніотичній оболонці методом імуноферментного аналізу (ІФА) оцінювали динаміку зміни концентрації Т, ФСГ і ЛГ в периферичній крові. Комплексний аналіз еякуляту пацієнтів проводили відповідно до критеріїв ВОЗ перед операцією, через 1 і 2 місяці після неї.

Статистичну обробку експериментальних даних проводили за методом Стьюдента-Фішера на ПЕОМ IBM PC Pentium з використанням пакету програм Excel. При рівні значимості Р<0,05 відмінності вважали достовірними.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Метою першої серії експериментів було визначення оптимального режиму кріоконсервування ФТТЛ методом диференційної тензоділатометрії. Було проведено порівняльне дослідження ділатограм розчинів кріопротекторів ДМСО і ПЕО-400 різних концентрацій на середовищі Хенкса і тих самих розчинів у присутності фрагментів тканини тестиса при заморожуванні та відігріванні. Заморожування фрагментів ФТТЛ проводили після експозиції у 5%, 10%, 15% розчинах ДМСО і 12% розчину ПЕО-400 на середовищі Хенкса зі швидкістю 1С/хв до -80С, а відігрів - зі швидкістю 0,5С/хв. До початку дослідження матеріал зберігався в розчині Хенкса при 4С до 12 годин. З одержаних результатів випливає, що перепади об’єму при кристалізації у фрагментах тканини мають значно менші , ніж у випадку чистих розчинів, значення і складають 1,10,35% після експозиції фрагменту тканини в 5% розчині диметилсульфоксиду на середовищі Хенкса протягом 15 хвилин (Рис.1), 1,150,35% після експозиції досліджуваного фрагмента тканини в 5% розчині протягом 30 хвилин (Рис. 2) і 1,50,3% після експозиції досліджуваного фрагмента тканини в 10% розчині протягом 30 хвилин (Рис. 3), що обумовлено істотно меншим вмістом води в тканині у порівнянні із зазначеним вище розчином.

Відносний об’єм заморожуваного зразка в 12% розчині ПЕО-400 на середовищі Хенкса збільшується на 2% більше, ніж 5% розчин ДМСО, що є менш сприятливим з точки зору механічних пошкоджень консервованого об’єкта, ніж заморожування в 5% розчині ДМСО. Зміна відносного об’єму фрагмента тестиса, попередньо експонованого в 12% розчині ПЕО-400 (Рис. 4), протягом 30 хвилин

Очевидно, що чим більше збільшується об’єм тканини при заморожуванні, тим більші внутрішні напруги виникають у зразку, і тим більшою є вірогідність пошкодження заморожуваного об’єкта за рахунок розтріскування. Збільшення об’єму при процесі докристалізації при відігріванні можна уникнути за рахунок підвищення швидкості відігрівання від 1С/хв до більш чим 5С/хв.

Таким чином, оптимальним є застосування 30-ти хвилинної експозиції фрагментів тканини тестиса в 5% розчині ДМСО на середовищі Хенкса до початку заморожування, повільне триетапне заморожування із подальшим зануренням у рідкий азот. Відігрівання замороженої тканини доцільно проводити зі швидкістю більше ніж 5С/хв.

Метою другої серії експериментів було вивчення впливу факторів ішемії і кріоконсервування на гістологічну структуру ФТТЛ. Були вивчені морфологічні характеристики фрагментів зразків тканини 28 сім’яників плодів 16-27 тижнів гестації з терміном ішемії до і більше 6-ти годин. Відзначено, що залежно від термінів ішемії, які пройшли з моменту загибелі плоду, в клітинах тестисів з’являються зміни, які на препаратах можна охарактеризувати у вигляді змінення тинкториальних властивостей ядер, розширення клітин епітелію канальців, розмитості мембран. Особливо це було виражено у зразках тестисів, заготовлених у перші 2 години після загибелі плоду, що відповідає часовому інтервалу, протягом якого відбувається компенсаторно-пристосовницька перебудова тканини як віддзеркалення адаптаційного синдрома до ішемії. Препарати, зафіксовані в інтервалі від 2-х до 6-ти годин, мали нормальну морфологію без патологічних змін клітин, і їх можна охарактеризувати як найбільш придатні для кріоконсервування об’єкти. При ішемії більше 6-ти годин у зразках ФТТЛ спостерігалось збільшення деструктивних змін, і вони набували неповоротного характеру. Також було відмічено, що у термінах гестації 16-20 тижнів спостерігалась найбільша кількість клітин Лейдіга в інтерстиціальній тканині. В тестисах плодів 21-22 тижневого віку збільшується кількість сім’яних канальців і зменшується площа інтерстиціальної тканини. Протягом 24-27 тижня розвитку збільшується кількість сім’яних канальців.

При розморожуванні ФТТЛ згідно з розробленою програмою було відзначено, що експозиція тканини протягом 15-30 хвилин з 5% розчином ДМСО особливих змін у морфології тестисів не викликала. При застосуванні 12% розчину ПЕО-400 після експозиції протягом 30 хвилин спостерігали зневоднювання клітин, більш виражене по периферії зразка, що після процесу замороження-відтавання призводило до невеликих відшарувань фібробластів від сім’яних канальців. Однак різкі деструктивні зміни не спостерігались. Після заморожування тканини тестисів, які зберігались при 4С протягом 16-20 годин, спостерігали цілий ряд морфологічних змін, які можна було б віднести до неповоротних деструктивних пошкоджень.

Гістологічне дослідження зразків, заморожених шляхом швидкого занурення у рідкий азот незалежно від використованого кріозахисного середовища і часу еквілібрації, показало наявність глибоких порушень структурних взаємовідносин у тканинах, що свідчать про неповоротні пошкодження тканини і ставлять під сумнів доцільність застосування методу швидкого заморожування фрагментів ФТТЛ для трансплантації.

Метою третьої серії експериментів було визначення функціональної повноцінності ФТТЛ, яку оцінювали за здатністю виділення тестостерона в культуральне середовище фрагментами тканини тестисів при органотиповому культивуванні на агаровій підложці нативної тканини та після кріоконсервування. В залежності від терміну гестації одержані фетальні тестиси були розподілені на 3 групи: перша - 16-20 тижнів, друга - 21-24 тижні, третя - 25-27 тижнів внутрішньоутробного розвитку. У кожній віковій групі були вивчені сім’яники з ішемією до і після 6 годин. Як контроль використовували нативну тканину тестиса 16-ти тижневого плоду і тканину яєчок дорослого чоловіка. Ішемія в обох випадках складала 3 години. Зразки були заморожені згідно з розробленою нами програмою.

З метою дослідження гормональної активності ФТТЛ після кріоконсервування брали фрагменти тестисів, заморожені з кріопротекторами ПЕО-400 12% концентрації і 5% розчином ДМСО на середовищі Хенкса. Для стандартизації умов експерименту було поставлено по 3 зразки культури на одному донорському матеріалі. Усього був досліджений 81 фрагмент ФТТЛ і 9 фрагментів сім’яників дорослої людини. Для стимуляції синтезу тестостерону у щільний фідерний шар додавали 1-1.5х106/мл ембріональних нервових клітин. При порівняльній оцінці вмісту тестостерону в середовищі культивування нативних сім’яників (Рис.5) на 7, 14 і 21-у добу культивування було відзначено, що порівняно з тестисами дорослої людини, кількість тестостерону, що виділяється тканиною тестиса 16-ти тижневого плоду, у декілька разів вища (0,8630,050 і 6,2330,170 нМ/мг відповідно). Згідно з методикою досліджень, на 7-у добу культивування ми знімали надосадову рідину та використовували її для визначення гормона, а в пробірки Лейтона додавали таку ж кількість нового культурального середовища. На 14-у добу весь тестостерон, виявлений у пробі, видимо, був синтезований de novo і виділений у середовище у досить високій кількості плодовими тестисами (4,1670,094 нМ/мг тканини) і знизився майже вдвічі в середовищі культивування дорослого яєчка (0,4800,016 нМ/мг тканини). На 21-у добу кількість гормона в культуральному середовищі з 16-ти тижневим фетальним тестисом склала 3,7330,205 нМ/мг тканини, а в середовищі із сім’яником дорослої людини - 0,3470,021 нМ/мг тканини. Тестиси плоду, культивовані на агарі з додаванням ембріональних нервових клітин, на 7-у добу за кількістю виділеного тестостерону достовірно не відрізнялись від вихідних (6,0000,163 нМ/мг тканини), на 14-у добу відмінності в показниках були нижчими, ніж у тому ж варіанті при культивуванні на середовищі без нервових клітин, однак на 21-у добу вміст тестостерона збільшувався і був достовірно вищим у порівнянні зі значеннями, одержаними в тому ж варіанті, але без нервових клітин (4,630,236 нМ/мг тканини). Кількість тестостерона, виділеного тканиною дорослої людини, на 14-у добу знизилась з 0,8630,50 нМ/мг тканини до 0,4800,016 нМ/мг тканини, а на 21-у добу вміст гормона складав 0,3470,021 нМ/мг тканини. Додавання нервових клітин у фідер практично не впливало на виділення гормона в середовище при культивуванні яєчок дорослої людини. Після кріоконсервування з 5% розчином ДМСО (Рис. 6) і 12% розчином ПЕО-400 (Рис. 7) за оптимальною програмою і тривалого зберігання в рідкому азоті, розморожена тканина 1-ої вікової групи за виділенням тестостерона в культуральне середовище практично не відрізнялась від нативної при культивуванні на фідері з додаванням нервових клітин.

У другій віковій групі вихідні показники виділення тестостерону на 7-у добу були нижчими, ніж у першій, підвищення рівня виділення гормона на 14-у і 21-у добу не спостерігали. У третій віковій групі вміст тестостерона на 7-у добу був достовірно нижче (p<0,05), ніж у перших двох, на 14-у добу кількість тестостерона знижувалась, а також було відсутнім збільшення гормона в культуральному середовищі на 21-у добу як з кріопротекторами ДМСО (5%) і ПЕО-400 (12%).

Тканина тестиса, заморожена з 12% розчином ПЕО-400, незважаючи на наявність деструктивних змін у вигляді відшарування клітин навкруги сім’яних канальцев і невеликого зневоднення, зберігає здатність виділяти тестостерон при органотипичному культивуванні, що свідчить про те, що подібні зміни не є летальними і функціональні властивості клітин після кріоконсервування з 12% розчином ПЕО-400 різко не порушуються, однак збільшення секреції тестостерона в культурі на 21-у добу менше виражено, ніж при культивуванні фрагментів плодових сім’яників після кріоконсервування у 5% розчині ДМСО. При порівняльній оцінці функціональної активності ФТТЛ трьох вікових груп в залежності від часу ішемії спостерігаються очевидні переваги зразків фетальних тестисів з ішемією не більше 6 годин. Результати, одержані при культивуванні кріоконсервованих у 5% розчині ДМСО на середовищі Хенкса тестисів 16-20 тижнів гестації представлені на рис. 8.

Таким чином, проведені дослідження довели, що тканина тестисів плодів 16-20 тижневих теермінів гестації, заморожена за оптимальною програмою, після розморожування зберігає здатність синтезувати тестостерон протягом 21-го дня культивування (час спостереження).

Дослідження фрагментів тестисів, які знаходяться в органотиповій культурі, показало, що на 7-у добу культивування кріоконсервованих тестисів спостерігалось невелике збільшення клітинної маси в місцях розриву покровної оболонки фрагментів сім’яників, як і при культивуванні нативної тканини. На 14-у і 21-у добу клітинна маса збільшувалась, однак вираженої міграції клітин із шматочка на агар не спостерігалось, що, видимо, можна пояснити особливостями росту в культурі плодової тканини.

Одержані нами результати визначають можливість застосування кріоконсервованої ФТТЛ для клінічної трансплантації.

Нами було досліджено вплив трансплантації КФТТЛ в амніотичній оболонці на функціональний стан репродуктивної системи при деяких формах чоловічої неплідності. Під нашим спостереженням знаходились 10 чоловіків у віці 22-39 років (середній вік 28,41,8 років), які звернулись у Центр репродукції людини “Імплант” в м. Харкові у зв’язку з неплідністю в шлюбі більше 2-ох років. При вивченні анамнестичних даних, параметрів андрологічного статусу було виявлено: у двох хворих препубертатний гіпогонадизм з вираженою гіпоплазією сім’яників (один гіпергонадотропний і один нормогонадотропний), у одного - постпубертатну гіпоплазію лівого яєчка, як наслідок перенесеного орхоепідідіміта з облітерацією сім’яника праворуч, у одного - стан після перенесеного оперативного лікування з приводу лівостороннього варікоцеле і у шести обстежуваних - ідіопатична неплідність.

У всіх хворих після трансплантації КФТТЧ в амніотичній оболонці через 1 тиждень, 1 і 2 місяці вивчався вміст показників ЛГ, ФСГ і Т в сироватці крові. Динамічне дослідження кількісних та якісних характеристик спермограм виконувалось згідно з загальноприйнятою методикою перед імплантацією і через 1 і 2 місяці після неї. Контрольною була група, що складалась з 20-ти практично здорових чоловіків у віці 23-35 років, які мають у шлюбі дітей, які пройшли таке ж саме повне клініко-лабораторне обстеження в лабораторії андрології Українського НДІ фармакотерапії ендокринних захворювань при виконанні планових наукових тематик.

Основною метою застосування трансплантації КФТТЛ є заповнення недостатньої кількості чоловічого статевого гормона в організмі хворого. З рис. 9 видно, що вже через один тиждень після трансплантації КФТТЛ спостерігалось достовірне (p<0,02) підвищення середніх значень тестостерона (10,41,3 нмоль/л) по відношенню до вихідних показників (6,650,77 нмоль/л), яке досягає свого максимума через 1 місяць (15,32,7 нмоль/л) із незначним зниженням під кінець другого місяця (14,81,44 нмоль/л). При цьому середні величини тестостерона через 1 місяць після трансплантації не відрізнялись (p>0,05) від контрольних значень (19,11,1 нмоль/л), а через 2 місяці вони були достовірно вищими (p<0,001), ніж вихідні показники.

Усе це свідчить про те, що як мінімум протягом 2-ох місяців спостерігається андрогенкомпенсуючий та стимулюючий вплив трансплантата КФТТЛ на організм чоловіка. Враховуючи це, було б цікаво простежити, яким чином збільшення основного регуляторного гормона сперматогенезу тестостерона впливає на показники спермограм у обстежуваних нами хворих. Сперматологічне обстеження перед трансплантацією виявило у 4 хворих азооспермію, у 4 - олігозооспермію ІІІ ступеня і у 2 - олігозооспермію ІІ ступеня.

Проведена трансплантація КФТТЛ не змінила параметри спермограм у осіб з азооспермією, на що було важко сподіватись, враховуючи наявність вираженої гіпоплазії сім’яників, а також обтураційної неплідності. У зв’язку з цим ми з’ясовували динаміку спермограм у 6-ти осіб з ідіопатичною олігозооспермією. При аналізі характеру змін рівнів Т, ФСГ і ЛГ у даного контингента осіб, а також показників спермограм (Табл. 1), спостерігалась така ж сама тенденція зміни рівня Т, як і в загальній групі з максимальним його підвищенням в сироватці крові через один місяць після трансплантації і збереженням цього рівня до двох місяців (час спостереження). Середні значення ФСГ і ЛГ протягом усього періоду спостережень істотно не відрізнялись від вихідних даних і відповідали контролю. Така динаміка гормональних показників дає підстави зробити припущення, що трансплантація КФТТЛ особам чоловічої статі сприяє нормалізації тестостеронемії, не впливаючи при цьому істотно на гонадотропну функцію гіпофіза, що характерно для класичної андрогенотерапії.

Аналіз показників спермограм у осіб з нормогонадотропною олігозооспермією через 1-2 місяці після трансплантації КФТТЛ виявив певну їх динаміку. Через 1 місяць не спостерігалось істотного збільшення кількості сперматозоїдів у 1мл еякулята, хоча при цьому збільшувався відсоток середніх значень їх рухливих форм (p<0,01). Через 2 місяці після трансплантації статистично достовірно збільшувались середні значення кількості сперміїв в 1 мл еякулята (p<0,05), відсотка як усіх рухливих (p<0,001), так і активно рухливих форм (p<0,02). Через 2 місяці після трансплантації КФТТЛ спостерігалось істотне зменшення відсотку патологічно змінених форм сперматозоїдів по відношенню до їх вихідних величин (p<0,05).

Післяопераційний період у 100% спостережень проходив рівно. Відторгення трансплантата не відбулося в жодному випадку. У 70% хворих через 1-2 тижні після трансплантації спостерігалось підвищення працездатності, поліпшення загального стану, зниження схильності до вірусних інфекційних захворювань. Практично всі пацієнти спостерігали підсилення лібідо, збільшення частоти та тривалості статевих актів, підсилення ерекції. Поліпшення загального стану і сексуальної функції було також відзначено у хворих з гіпогонадизмом і у хворого з односторонньою гіпоплазією яєчка.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Керос В.А. Кріоконсервування фетотестикулярної тканини людини.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина.- Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України, Харків, 2001.

У роботі вивчався вплив факторів ішемії, кріоконсервування і низькотемпературного зберігання на морфологію і функціональну активність фетотестикулярної тканини людини. За допомогою методу диференційної тензоділатометрії розроблений раціональний режим кріоконсервування фрагментів тканини сім'яників плодів. Проведено порівняння залежності гормонпродукуючої активності фетальних сім'яників від гестаційного терміну, ішемії, виду кріопротектора і режиму заморожування. Показана можливість і доцільність застосування кріоконсервованої ФТТЛ в амніотичній оболонці для алотрансплантації в клініці андрологічних захворювань при лікуванні гіпогонадизму і чоловічої неплідності.

Ключові слова: фетальні сім'яники, кріоконсервування, диференційна тензоділатометрія, морфологія, культивування, алотрансплантація.

Керос В.А. Криоконсервирование фетотестикулярной ткани человека.-Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.19 - криобиология и криомедицина.- Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной Академии наук Украины, Харьков, 2001.

В работе изучалось влияние факторов ишемии, криоконсервирования и низкотемпературного хранения на морфологию и функциональную активность фетотестикулярной ткани человека. При помощи метода дифференциальной тензодилатометрии разработан рациональный режим криоконсервирования фрагментов ткани семенников плодов. Проведено сравнение зависимости гормонпродуцирующей активности фетальных семенников от гестационного возраста, ишемии, вида криопротектора и режима замораживания. Показана возможность и целесообразность применения криоконсервированной ФТТЧ в амниотической оболочке для аллотрансплантации в клинике андрологических заболеваний при лечении гипогонадизма и мужского бесплодия.

Ключевые слова: фетальные семенники, криоконсервирование, дифференциальная тензодилатометрия, морфология, культивирование, аллотрансплантация.

Keros V.A. Cryopreservation of Human Fetotesticular Tissue. – Manuscript.

Thesis for obtaining the scientific degree of candidate of medical sciences (PhD equivalent) on the speciality 03.00.19 – cryobiology and cryomedicine. – Institute for Problems of Cryobiology & Cryomedicine of the National Academy of Sciences of the Ukraine, Kharkov, 2001

The thesis comprises a theoretical summary and new solving of scientific task, concerning the treatment of male infertility and consisting in the elaboration of the cryopreservation regimen for testicular tissue of human fetuses, which is capable to keep morphological and functional integrity of the tissue to create the low temperature bank of human fetotesticular tissue (HFTT) for further application for transplantation in hospitals of andrological pathology profile. In the work the effect of the factors of ischemia, cryopreservation and low temperature storage on morphology and functional activity of HFTT was studied. By means of the method of differential tensodylatometry a cryopreservation regimen for fetal testes was worked-out. The dependence of the change in volume of the fragments of fetotesticular tissue on time of the samples’ ischemia, type and concentration of cryoprotectant, freezing and thawing rate was shown. The application of 5% DMSO solution as the cryoprotectant, three-stage freezing of fetal testes with immersing for a prolong storage into liquid nitrogen and thawing of the preparations on a water bath with the rate higher than 5C/min.

When studying the morphological characteristics of HFTT it was noted that the testes from 16 to 20 gestation weeks were the most suitable for transplantation for correcting a hormonal status of patients, since within this period in the tissue there were a big number of Leydig cells, actively secreting androgens. Under ischemia from 2 to 6 hrs in morphology of testes there were no considerable destructive changes in tissue. When increasing the time of ischemia more than 6 hrs in fetal testes preparations the destructive changes appear. The usage of testes of long-term storage terms (more than 6 hrs) for cryopreservation is not expedient, because the disorders occurred in the structure of tissue and cells can result in the aggravation of damages under cryopreservation factors.

The study of testes morphology of various gestation terms after the storage under hypothermic conditions and following cryopreservation demonstrated that the damages aggravated with the effects of cryopreservation factors. It was noted, that under testes freezing without visible morphological impairments on the developed program a structural integrity of tissue elements was kept. Histological study of the samples frozen by a rapid immersion into liquid nitrogen, not depending on the used cryoprotective medium and equilibration time in it, showed the