ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ЮРІЯ ФЕДЬКОВИЧА

Москалик Галина Георгіївна

УДК 577.151+577.175.1

АКТИВНІСТЬ КЛЮЧОВИХ ФЕРМЕНТІВ АЗОТНОГО МЕТАБОЛІЗМУ САЛАТУ ПОСІВНОГО (Lactuca sativa L.) ЗА ДІЇ НІТРАТНОГО І АМОНІЙНОГО АЗОТУ ТА СИНТЕТИЧНИХ ЦИТОКІНІНІВ

03.00.04 – біохімія

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Чернівці – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії і експериментальної екології Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича, Міністерство освіти і науки України

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

КОСТИШИН Степан Степанович

Чернівецький національний університет

імені Юрія Федьковича,

завідувач кафедри біохімії і

експериментальної екології

Офіційні опоненти – доктор біологічних наук, професор

ТЕРЕК Ольга Іштванівна

Львівський національний університет

імені Івана Франка,

завідувач кафедри фізіології та екології рослин

- доктор біологічних наук

ЯВОРСЬКА Вікторія Казимирівна

Інститут фізіології рослин і генетики

НАН України, завідувач відділу

фізіології росту і розвитку

Провідна установа – Дніпропетровський національний університет, кафедра біофізики і біохімії, Міністерство освіти і науки України, Дніпропетровськ

Захист відбудеться “ 5 ” грудня 2001 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76. 051. 05 при Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича за адресою: 58012, Чернівці, вул. Коцюбинського, 2

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича, м. Чернівці, вул. Л. Українки, 23

Автореферат розісланий 3 листопада 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Копильчук Г.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останні роки намітилось цілий ряд проблем, які доповнюють та розширюють класичні уявлення про метаболізм азоту в рослинних клітинах. Зокрема, в літературі є дані, що свідчать про наявність нітратів ендогенного походження, які утворюються шляхом окислення аміаку в тканинах рослинних організмів [Глянько А.К., 1990, Ягодин Б.А., 1992]. Відмічається існування двох самостійних шляхів асиміляції нітратів, які відбуваються на світлі і в темряві [Кондратьев М.Н., 1985]. Синтез глутамату здійснюється через глутаматсинтазу (ГОГАТ) [КФ 1.4.1.14] та глутамінсинтетазу (ГС) [КФ 6.3.1.2] [Садунишвили Т.А., 2000]. На зміну твердженню про те, що глутаматдегідрогеназа (ГДГ) [КФ 1.4.1.3] є основним асиміляторним ферментом, сформоване уявлення про існування двох шляхів засвоєння амонійного азоту: відомого вже ГДГ-шляху і нового ГС/ГОГАТ-шляху. Систему ферментів ГС/ГОГАТ-шляху вважають головною, відводячи ГДГ роль додаткового ферменту, значення якого зростає в екстремальних умовах. Одним із аргументів на користь головної ролі ГС/ГОГАТ-шляху у більшості рослинних організмів є висока активність ГС в порівнянні з низькою активністю ГДГ [Lea P.J., 1992]. Очевидно, у вищих рослин співвідношення активності ферментів, які забезпечують той чи інший шлях асиміляції азоту, залежить від багатьох фізіологічних факторів, віку рослин, функціональної ролі рослинної тканини, в якій відбувається перетворення азоту, складних взаємовідносин між частинами рослин, які виникають в процесі росту рослин [Кошкин Е.И, 1992].

В основі специфічного розвитку рослин та обміну речовин лежить гормональна індукція синтезу ключових ферментів азотного обміну, яка супроводжується включенням різних метаболічних шляхів [Кудоярова Г.Р., 1991]. Проте у питанні зв'язку гормональної регуляції та живлення рослин різними формами азоту існує багато невизначеності. Тому актуальним напрямком досліджень є подальше вивчення дії екзогенних фітогормонів в умовах живлення рослин різними формами азоту з урахуванням специфічності метаболізму рослин, а також специфічності метаболізму та можливої взаємно - підсиленої дії на рослини фітогормонів та факторів мінерального живлення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась з 1998 до 2001 року на кафедрі біохімії та експериментальної екології Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича і є частиною наукової тематики кафедри “Вплив стресових факторів (фізичних і хімічних) на стан гомеостазу та структуру геному рослинних організмів”, № держреєстрації 0198U002761.

Мета і завдання дослідження. Виявити особливості регуляції активностей ключових ферментів азотного обміну нітратом і амонієм окремо та сумісно з синтетичними цитокінінами.

Для досягнення мети поставлено наступні завдання:

1.Визначити активність нітратредуктази, глутамінсинтетази, глутаматдегідрогенази в органах салату посівного за дії різного рівня нітратного та амонійного азоту.

2. Вивчити метаболічний та запасний пули нітратів у клітинах різних органів салату посівного.

3. Виявити вплив різних форм та концентрацій азоту на особливості морфоанатомічної будови органів салату посівного.

4. Вивчити дію 6-бензиламінопурину і полістимуліну К на активність нітратредуктази, глутамінсинтетази, глутаматдегідрогенази та вміст нітратів у клітинах різних органів салату посівного.

Наукова новизна одержаних результатів. В роботі виявлено особливості регуляції активностей ключових ферментів азотного обміну нітратним та амонійним азотом разом з синтетичними цитокінінами. Встановлено активацію нітратредуктази (НР) [КФ 1.6.6.1] в коренях рослин за дії дефіциту нітратного азоту в середовищі на ранньому етапі розвитку. За дії різних концентрацій амонійного азоту показано низький сталий фоновий рівень активності НР.

При синтезі глутамату та його аміду – глутаміну проявлявся принцип альтернативності, який забезпечував пристосувальні реакції рослин до зміни форм та концентрацій азоту.

В роботі вперше проведено порівняльне дослідження впливу мономерної форми –6-бензиламінопурину та полімерного його аналога – полістимуліну К на активність ключових ферментів, компартментацію нітратів в органах рослин на фоні різного рівня нітратного та амонійного азоту. Встановлено однонаправлену дію синтетичних цитокінінів на вказані показники. Разом з цим, виявлено специфічність дії залежно від їх форми. Показано підвищення активностей ключових ферментів азотного обміну за дії мономерного аналога цитокінінів у фазі двох справжніх листків, а полімерного – у фазі технічної зрілості.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати та їх узагальнення доповнюють і поглиблюють існуючі уявлення про засвоєння азоту овочевими культурами при дії різних форм азоту та синтетичних цитокінінів на їх фоні.

Внаслідок проведеного дослідження впливу синтетичних цитокінінів на вміст нітратів в органах салату виявлено оптимальні концентрації фітогормонів та спосіб обробки рослин, які сприяють зниженню рівня нітратів в салаті. Це дає можливість використовувати отримані дані при розробці технологій вирощування цієї культури на високому рівні азотного живлення.

Результати досліджень використовуються при читанні нормативного курсу “Фізіологія рослин”, “Біохімія” та спецкурсів “Мінеральне живлення”, “Біологічно активні речовини” в Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження виконано під науковим керівництвом доктора біологічних наук, професора Костишина С.С. Дисертантом самостійно виконано експериментальну частину роботи, підібрано та опрацьовано літературні відомості, підготовлено до друку наукові роботи, що відображають основні результати дисертації. Аналіз та обговорення отриманого матеріалу проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи викладені на VII конференції молодих вчених “Проблеми фізіології рослин і генетики на рубежі третього тисячоліття” (Київ, 2000), Міжнародній науковій конференції “Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та метаболізм азоту” (Тернопіль, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 4 статті і 2 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, експериментальної частини, висновків та списку використаної літератури. Робота викладена на 121 сторінках машинописного тексту, ілюстративний матеріал включає 8 таблиць та 38 рисунка. Список літератури містить 215 найменувань, з них 75 латиною.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури дана структурно-функціональна характеристика ключових ферментів азотного обміну та їх регуляція. Показано механізми інтоксикації амонію та редукції нітратів в органах рослин. Висвітлено деякі аспекти фізіолого-біохімічної характеристики цитокінінів.

ОБ'ЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єктом дослідження обрано рослини салату посівного (Lactuca sativa L.) сорту Одеський кучерявий родини айстрових (Asteraceae). Насіння замочували протягом 24 год в дистильованій воді (І-ша серія експерименту) і в розчинах синтетичних цитокінінів (ІІ-га серія експерименту) – 6-БАП та полістимуліні К (ПСК) в концентрації 10-8 М за діючою речовиною. В експерименті з обприскуванням листків салату використовували наступні концентрації цитокінінів: 10-5М-10-6М для БАП і 10-6М - 10-7М для ПСК. Концентрації обрані як стимулюючі на основі результатів попередніх досліджень. Насіння пророщували в термостаті при температурі 25±1оС протягом трьох діб. Проростки вирощували методом піщаної культури і поливали модифікованим розчином Кнопа до 60% насичення від повної вологоємності піску. В першій серії експерименту проростки поливали розчином Кнопа, з Ca(NO3)2 - (нітратні варіанти) та (NH4)2SO4 - (амонійні варіанти). Концентрація азоту 12,2 мМ (що відповідає 1 нормі азоту) в розчині Кнопа – вибрана як контрольна, в інших дослідах вона становила – 3,05; 24,4; 48,8 мМ, що відповідало 0,25; 2,0; 4,0 нормам азоту.

Досліди морфоанатомічні та фізіолого-біохімічні проводили на різних етапах онтогенезу: у фазі сходів (6-8 день проростання), у фазі одного справжнього листка (10-15 день), у фазі двох справжніх листків (18-20 день), у фазі п'яти-шести справжніх листків (35-40 день), у фазі технічної зрілості (55-60 день). Датою початку чергової фенологічної фази вважали день, коли вступили до цієї фази 75% рослин варіанту.

Потенційну та реальну активності нітратредуктази визначали методом Мульдера [Mulder E.I, 1959], активність ГС - за методом [Пушкин А.В., Евстигнеева З.Г., 1980], активність ГДГ - спектрофотометричним методом по швидкості окислення NADН [Яковлєва В.И., 1964]. Визначення нітратів в органах експериментальних рослин проводили методом Гранваль-Ляжу [Баславская С.С., 1964]. Для визначення запасного пулу нітратів рослини вирощували в умовах трофічного стресу [Харитонашвили Е.В., 1993]. Кількість нітратів метаболічного пулу визначали шляхом перерахунку реальної активності НР. Результати дослідів оброблені статистично [Маслов Ю.И., 1978].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Активність ключових ферментів азотного метаболізму за дії нітрату та амонію. Відмічено зміну потенційної активності НР залежно від форми та концентрації азоту в середовищі. Максимальна редукція нітратів відбувалась в листках салату у варіантах з 24,4 мМ та 48,8 мМ азоту в поживному середовищі (рис. 1), а в коренях - з 3,05 мМ.

Показано аналогічну тенденцію розподілу реальної активності НР по органах рослин, варіантах досліду та фазах онтогенезу, як і потенційної лише з нижчим рівнем абсолютних показників.

Виявлено найбільшу різницю у варіанті з високою концентрацією нітрату (24,4-48,8 мМ), що свідчить про недоступність нітратів для редукції в клітинах рослин.

У рослин, які отримували амонійний азот (рис. 2), в якості єдиного джерела азотного живлення, відмічено низький фоновий рівень потенційної активності НР в листках та коренях салату, що свідчить про генетичну зумовленість.

Крім цього, показано низький рівень реальної активності НР в органах салату за даних умов росту, що вказує на наявність в клітинах деякої кількості ендогенних нітратів. Можливо, це є одним із механізмів детоксикації ендогенного аміаку, особливо його надлишкових кількостей.

Отже, активність НР змінювалась в органах салату внаслідок різних механізмів дії екзогенного нітрату та амонію. Різниця між реальною та потенційною активностями, яка з'являлась при нестачі ендогенних нітратів для розвитку максимальної активності НР свідчить про те, що не активність НР лімітує процес асиміляції нітратів, а недоступність їх для відновлення.

Подальша доля відновлених нітратів та екзогенного амонію залежала від метаболічної здатності коренів та листків салату. Застосовані концентрації азоту створювали різний фізіологічний “фон” для прояву активності ферментів асиміляції амонію в органах рослин.

При дослідженні процесу асиміляції азоту в органах салату, нашими дослідженнями показано різну зміну активності ГС та ГДГ. Відмічено, що залежно від концентрації нітратного азоту активність ГС в листках рослин була на рівні (24,4 мМ) або нижче (3,05 мМ, 48,8 мМ) за контрольний рівень (рис. 3). Відмічено зростання активності ферменту за знижених концентрацій нітрату в коренях салату на ранньому етапі росту рослин. У фазі технічної зрілості як в листках, так і в коренях показано вищі абсолютні показники активності ГС, порівняно до фази двох справжніх листків та слабку залежність її від концентрацій азоту.

За дії амонійного азоту активність ГС в листках салату в основному залишалась на рівні нітратних варіантів, а в коренях була навіть нижчою в усі досліджувані фази. Відмічено підвищення активності ферменту в листках та незмінність її в коренях салату у фазі технічної зрілості, порівняно із фазою двох справжніх листків. Разом з цим, активність ферменту змінювалась залежно від концентрації амонію в середовищі. В листках салату зафіксовано пряму залежність, а в коренях за умови дефіциту азоту в середовищі активність ГС зростала на 38% порівняно з контролем.

Отже, активність ферменту ГС регулювалась амонієм утвореним внаслідок редукції нітратів і поглинутого рослиною безпосередньо. Низькі концентрації азоту стимулювали активність ферменту в коренях рослин, а високі концентрації нітрату пригнічували.

Результати досліджень, які представлені на рис. 4 свідчать про відносно слабку чутливість ГДГ до різних концентрацій нітратного та амонійного азотів в поживному середовищі.

Збільшення активності ферменту у досліджуваних вегетативних органах спостерігалось у варіантах з 48,8 мМ нітратного азоту і 24,4 мМ - амонійного, що свідчить про інтенсивну асиміляцію амонію, утвореного як при відновленні нітратів, так і поглинутого екзогенного через ГДГ-реакцію до амінокислот. Це може бути пов'язано з різними причинами. З одного боку фермент володіє широкими адаптаційними можливостями в межах підвищених концентрацій субстрату. Опосередкованим доказом цього може бути факт підвищення активності НР за даних умов, як це показано нами в зазначених дослідженнях (рис. 1). З іншого боку при збільшенні кількості ендогенного субстрату асиміляція аміаку могла відбуватись одночасно ГДГ, ГС та ГС/ГОГАТ – шляхами.

Отже, головні шляхи, якими відбувалось засвоєння аміачного азоту рослиною представлені метаболічними каналами, які контролювались ГС і ГДГ. Внаслідок чого відбувалось утворення відповідно глутаміну або глутамату. В рослинній клітині функціонували обидва фермента. Проте властивості ГДГ проявлялись в інших фізіологічних умовах, ніж ГС, які складались в процесі росту рослин на фоні різних форм та концентрацій азоту. В цьому випадку проявлявся принцип альтернативності, який забезпечував пристосувальні реакції рослин до зміни умов вирощування.

Підсумовуючи вищезазначене можна прийти до висновку, що на фоні зростаючої, зниженої та незмінної активності НР в органах салату відбувалось розмежування функцій ГС та ГДГ з підвищенням активності ГДГ при дії високих концентрацій як нітратного, так і амонійного азоту. ГС-шлях характерний для коренів рослин, що використовують невисокі концентрації азоту в середовищі. При цьому, ймовірно, можлива як подальша асиміляція азоту по ГС/ГОГАТ- шляху до амінокислоти, так і його детоксикація у вигляді глутаміну.

Компартментація нітратів в органах рослин. Компартментацію нітратів на клітинному рівні розглядають як розподіл між цитозолем і вакуолею [Leigh A.R., 1994].

Нашими дослідженнями виявлено значний вплив форми азоту в поживному середовищі на нагромадження іонів NO3- та розподіл їх по компартментах. Кількість ендогенних, запасних та метаболічних нітратів в листках салату (табл. 1) в цілому була прямопропорційна концентрації екзогенного нітрату в поживному середовищі з коефіцієнтом кореляції 0,93-0,96. У коренях така тенденція характерна для загального та запасного нітрату з коефіцієнтом кореляції 0,89-0,91. Кількість метаболічного нітрату в коренях слабко змінювалась від концентрації нітрату в середовищі. Аналогічна тенденція відмічена на всіх досліджуваних етапах онтогенезу салату. Встановлено, що формування запасного пулу в листках та коренях салату відбувалось за дії нітратного та амонійного азоту при всіх концентраціях, навіть при зменшенні її до 3,05 мМ.

Отже, за умови високої забезпеченості рослин салату нітратами їх відновлення могло обмежуватись не нестачею субстрату, а генетично запрограмованою “жорсткістю” компартментації. Саме тому в середньому 80% нітратів, які надходили в клітини органів салату, не відновлювалися, а відкладалися в запас.

За дії амонійного азоту (табл. 2) в органах салату зафіксовано в 2 – 2,5 рази менше загального вмісту NO3-, порівняно з аналогічними нітратними варіантами досліду, причому їх кількість не змінювалась від концентрації амонію в середовищі.

Стосовно запасного пулу нітратів, то відмічено значні його розміри (78-90%), які навіть перевищували нітратні варіанти. Метаболічний пул в органах салату за дії різних концентрацій амонійного азоту зберігався у межах 1-13% з поступовим зменшенням в процесі росту рослин.

Таблиця 1

Вміст нітратів у органах салату за дії нітратного азоту

(мкмоль NO3-/100 г сухої маси)

М±m

Варіант досліду Листки Корені

загальний запасний метаболіч- ний загальний запасний метаболіч- ний

Фаза двох справжніх листків

Контроль 14,17±1,16 10,20±0,95 3,34±0,29 12,86±1,17 7,46±0,72 2,12±0,19

3,05 мМ 8,36±0,72 * 5,67±0,47 * 2,35±0,20 * 4,00±0,36 * 1,63±0,14 * 2,96±0,22 *

24,4 мМ 34,25±2,90* 26,45±2,21 * 6,53±0,50 * 22,37±2,01* 16,33±1,41* 2,18±0,18

48,8 мМ 63,95±5,88* 51,41±4,53 * 6,74±0,58 * 43,92±3,53* 32,94±2,86* 2,03±0,19

Фаза п'яти-шести справжніх листків

Контроль 34,50±2,94 23,47±2,00 1,68±0,12 22,95±2,05 13,99±1,12 0,54±0,05

3,05 мМ 15,54±1,31* 9,32±0,84 * 0,80±0,07 * 8,86±0,70 * 3,34±0,29 * 0,58±0,05

24,4 мМ 47,28±3,85* 34,06±2,90 * 3,69±0,27 * 39,58±3,40* 31,26±2,81* 0,57±0,04

48,8 мМ 61,78±5,99* 47,51±3,91 * 4,17±0,38 * 50,00±4,41* 40,12±3,86* 0,47±0,04

Фаза технічної зрілості

Контроль 35,04±2,82 30,83±2,70 0,99±,08 23,39±1,92 18,72±1,10 0,18±0,01

3,05 мМ 8,13±0,77 * 6,42±0,59 * 0,38±0,03 * 9,96±0,87 * 6,57±0,59 * 0,12±0,01

24,4 мМ 57,37±4,97* 44,15±3,63 * 0,73±0,06 38,22±2,91* 32,49±2,83* 0,17±0,01

48,8 мМ 58,98±4,55* 46,59±3,86 * 0,87±0,08 41,07±3,66* 35,32±2,38* 0,20±0,02

Примітка: * - достовірна різниця між дослідом і контролем, (р<0,05)

Одержані результати свідчать про специфічний вплив форм азоту в поживному середовищі на вміст у органах і компартментацію в клітинах іонів нітрату.

Таблиця 2

Вміст нітратів у органах салату за дії амонійного азоту

(мкмоль NO3-/ 100г сухої маси)

М±m

Варіант Досліду Листки Корені

загальний запасний метаболіч- ний загальний запасний метаболіч-ний

Фаза двох справжніх листків

Контроль 11,26±0,80 9,56±0,73 1,01±0,09 9,92±0,80 8,83±0,78 0,99±0,09

3,05 мМ 6,95±0,58* 6,05±0,57* 0,90±0,08 7,47±0,61 6,57±0,56 0,84±0,08

24,4 мМ 13,24±1,02 11,65±1,08 1,33±0,12 10,25±0,82 9,31±0,78 0,70±0,07

Фаза п'яти-шести справжніх листків

Контроль 16,05±1,30 13,00±1,15 0,67±0,06 9,73±0,81 8,49±0,77 0,22±0,02

3,05 мМ 13,53±1,12 11,37±0,99 0,69±0,07 8,18±0,69 6,95±0,53 0,18±0,02

24,4 мМ 15,92±1,38 12,42±0,97 0,82±0,07 12,42±0,98 10,31±0,87 0,20±0,02

Фаза технічної зрілості

Контроль 16,69±1,49 14,85±1,36 0,26±0,02 10,82±0,94 9,74±0,78 0,16±0,01

3,05 мМ 15,88±1,30 13,50±1,12 0,30±0,03 7,54±0,73 6,56±0,59 0,10±0,01

24,4 мМ 19,89±1,60 17,31± 1,61 0,22±0,02 13,16±1,19 11,32±1,10 0,17±0,01

Примітка: * - достовірна різниця між дослідом і контролем, (р<0,05)

Асиміляція азоту в органах салату за сумісної дії форм азоту та синтетичних цитокінінів. Дія синтетичних цитокінінів на активність НР в листках салату мала специфічний характер (рис. 5) і залежала від

фази онтогенезу, концентрації нітрату в середовищі, форми синтетичного цитокініну Зокрема, в результаті дії оптимальних та низьких концентрацій нітрату сумісно з БАП активність НР зростала у фазі двох справжніх листків. Дія ПСК на активність ферменту була стимулюючою в широкому діапазоні концентрацій екзогенного нітрату і проявлялась у всі досліджувані фази онтогенезу. В коренях салату не виявлено впливу синтетичних цитокінінів на активність НР. Порівняльний аналіз потенційної (рис. 5) та реальної (рис. 6)

активностей НР в листках салату за сумісної дії синтетичних цитокінінів та умов азотного живлення показав зниження різниці між активностями в більшості варіантів досліду, порівняно до варіантів з обробкою Н2О. Це, на нашу думку, свідчить про збільшення кількості білка НР, яке, ймовірно, відбувається за рахунок його синтезу de novo [Кузнецов В.В., 1979], і (або) індукції активності ензиму [Овчаренко Г.А., 1993].

При зміні форми живлення салату на амонійну в поживному середовищі (рис. 7) та дії БАП відмічено достовірне зростання активності НР в листках рослин у варіанті з 3,05 мМ амонію. При дії ПСК значення активності НР в органах рослин не відрізнялись від контролю. В роботі показано аналогічну закономірність зміни реальної активності ферменту внаслідок впливу синтетичних цитокінінів лише з меншими абсолютними показниками.

Отже, спостерігалась специфічність зміни активності НР в залежності від сумісної дії синтетичних цитокінінів та форм і концентрацій азоту в середовищі. Так, збільшення активності ферменту за дії нітратного азоту відбувалось в більш широкому діапазоні діючих концентрацій (3,05-24,4 мМ), ніж амонійного (3,05 мМ). Відмічено також стимулюючий вплив синтетичних цитокінінів на активність ферментів асиміляції амонію. Зокрема, показано зростання активності ГС в листках рослин в 1,5-1,7 рази та ПСК – в 1,4-1,6 рази (рис. 6) в результаті обробки БАП на фоні нітратного живлення.

Аналогічна тенденція зміни активності ферменту спостерігалась за дії цитокінінів та амонію.

Отже, аналіз отриманих результатів дозволяє зробити висновок, що вплив синтетичних цитокінінів на активність ГС в рослинах салату за дії нітратного азоту може бути опосередкованим (через індукцію НР), оскільки між активністю реальної НР та ГС існує спряженість при 3,05-24,4 мМ нітрату. Хоча не виключена можливість і безпосереднього впливу синтетичних цитокінінів на індукцію ГС, що супроводжувалось “включенням” процесу засвоєння амонію.

Показано вплив синтетичних цитокінінів і на інший фермент асиміляції амонію – ГДГ. Зокрема, за дії БАП виявлено зростання активності ферменту в листках рослин у 1,4-1,5 рази у варіантах 3,05 – 12,2 мМ нітрату (рис. 9). Вплив ПсК на показник не зафіксований. За дії аналогічних концентрацій амонійного азоту відмічено стимулюючий вплив ПсК на активність ГДГ. В коренях рослин активність ферменту не змінювалась за дії синтетичних цитокінінів.

Отже, аналіз отриманих результати дозволяє зробити наступне узагальнення: за умови мінімальної (3,05 мМ) і оптимальної (12,2 мМ) концентрації нітрату та дії синтетичних цитокінінів у фазі двох справжніх листків відбувалась активна редукція поглинутого нітрату, наслідком чого і було зростання активності як ГС, так і ГДГ. Така тенденція характерна в основному для листків рослин, в яких і відбувалось переважне засвоєння азоту. За умови 24,4 мМ нітрату на фоні зростаючої активності реальної НР асиміляція амонію відбувалась через ГС-шлях, так як показано нами достовірне зростання активності цього ферменту під впливом цитокінінів (рис. 8). За дії синтетичних цитокінінів при подальшому підвищенню концентрації нітрату (48,8 мМ) не відбувалось змін активності НР і асиміляція незначної кількості редукованих нітратів відбувалась по шляху як ГС, так і ГДГ реакції. Тобто, можна припустити, що впливу синтетичних цитокінінів підлягала в основному НР, а зміни активностей ферментів асиміляції амонію є наслідком цього впливу.

Таблиця 3

Вміст нітратів у органах салату після обприскування синтетичними цитокінінами (мкмоль NO3-/100 г сухої маси)

M±m

Варіант досліду Нітратний статус рослин БАП ПСК

Термін після обробки

3-й день 7-й день

10-6М 10-7М 10-6М 10-7М

Листки

Контроль 35,04± 2,52 26,44± 2,12** 25,34± 2,00** 25,82± 2,43** 22,34± 2,10**

3,05 мМ 8,13± 0,77* 8,21± 0,80* 9,05± 0,80* 9,00± 0,81* 6,94± 0,68*

24,4 мМ 57,37± 2,97* 39,25± 2,97*,** 42,21± 3,86*,** 40,28± 3,29*,** 38,01± 2,42*,**

48,8 мМ 58,98± 3,55* 40,17± 3,11*,** 44,07± 3,29*,** 41,14± 3,77*,** 36,22± 2,77*,**

Корені

Контроль 23,39± 1,92 22,58± 2,11 20,51± 1,89 22,36± 2,00 20,74± 1,86

3,05 мМ 9,96± 0,87* 8,15± 0,79* 8,41± 0,81* 8,15± 0,77* 8,86± 0,81*

24,4 мМ 38,22± 2,71* 36,18± 2,83* 31,08± 2,11* 37,56± 2,64* 33,16± 2,11*

48,8 мМ 41,07± 3,66* 39,55± 2,69* 47,51± 3,58* 46,98± 3,59* 41,21± 3,53*

Примiтка: 1.* - достовірна різниця між дослідом і контролем, 2. ** - достовірна різниця між дослідом і нітратним статусом рослин, (p<0,05)

Отже, синтетичні цитокініни виявляли стимулюючу дію на активність НР, ГС, ГДГ, що свідчить про наявність гормональної регуляції активності ключових ферментів азотного обміну.

Нами проведено дослідження вмісту нітратів в органах салату в

результаті обприскування його листків концентраціями водних розчинів синтетичних цитокінінів і з використанням різних термінів аналізу після обробки (табл. 3) Показано на 3-й день після обприскування зниження вмісту нітратів в листках салату на 25-32% за дії БАП і на 25-28% при використанні 10-7М ПСК. На 7-й день після обприскування відмічено ефективний вплив на показник лише ПСК. Так, кількість нітратів в листках салату зменшилась на 23-30% у концентрації 10-6М і при використанні 10-7М розчину ПСК - на 34-39%.

Отже, використання синтетичних цитокінінів шляхом обприскування рослин у практиці виробництва може призвести до зниження кількості нітратів в рослинній продукції та покращити якість продукції

ВИСНОВКИ

1. Встановлено динаміку активності ферментів азотного обміну: нітратредуктази, глутамінсинтетази і глутаматдегідрогенази в онтогенезі салату за умов різного живлення рослин.

2. Показано потенційну та реальну активність нітратредуктази, яка постійно виявлялась в органах салату не залежно від концентрації амонію в поживному середовищі, що свідчить про ендогенне утворення нітратів у рослин.

3. Встановлено, що активність глутамінсинтетази не змінювалась залежно від форми азоту в середовищі. Відмічено зростання активності ферменту в коренях рослин за дії 3,05 мМ нітратного і амонійного азоту.

4. Показано високий рівень активності глутаматдегідрогенази в листках і коренях рослин за умови 48,8 мМ нітрату і 24,4 мМ амонію в поживному середовищі.

5. Виявлено пряму залежність загального, запасного та метаболічного вмісту нітратів в органах салату від концентрації екзогенного нітрату, за дії амонійного азоту .показано зростання запасного пулу нітратів на 14-28% на фоні значного зменшення загального вмісту нітратів в органах салату, порівняно з аналогічними нітратними варіантами.

6. Встановлено, що сумісна дія 6-бензиламінопурину та низьких концентрацій нітрату (3,05-12,2 мМ) у поживному середовищі викликають збільшення активності НР в 2,8-3,3 рази, ГС – в 1,4 - 1,7 рази, а ГДГ – в 1,3 – 1,5 рази у фазі двох справжніх листків. Показано незначний приріст активності ферментів азотного обміну на досліджуваних етапах розвитку рослин за сумісної дії полістимуліну К та різних концентрацій нітрату і амонію.

7. Максимальне зниження загального вмісту нітратів встановлено при дії 6-бензиламінопурину в концентрації 10-6М на третій день після обприскування (на 25%) і полістимуліну К в концентрації 10-7М на сьомий день (на 35%).

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДИСЕРТАЦІЇ ОПУБЛІКОВАНІ В РОБОТАХ

1. Москалик Г.Г., Костишин С.С. Асиміляція нітратів проростками салату посівного (Lactuca sativa L.) на тлі різних доз азотного живлення //Фізіологія і біохімія культурних рослин. - 2001. – Т.33, №4. – С. 309-312.

2. Москалик Г.Г., Костишин С.С. Використання нітратного та амонійного азоту проростками салату посівного на ранніх етапах онтогенезу // Наукові записки тернопільського державного педагогічного університету ім. Володимира Гнатюка. Серія: Біологія, №1(4), 1999. – С. 63-67.

3. Москалик Г.Г. Активність нітратредуктази в проростках салату посівного за різних умов азотного живлення // Наукові записки Тернопільського державного педагогічного університету ім. Володимира Гнатюка. Серія: Біологія, №4 (7), 1999. – С. 28-32.

4. Москалик Г.Г., Костишин С.С., Должицька А.Г., Соколова В.М. Морфогенез проростків салату посівного за різних умов азотного живлення // Науковий вісник Чернівецького університету: Збірник наук. праць. Вип.77: Біологія. – Чернівці: ЧДУ, 2000. – С. 12-18.

5. Москалик Г.Г. Активність глутамінсинтетази проростків салату посівного за умов нітратного та амонійного живлення. // Проблеми фізіології рослин та генетики на рубежі третього тисячоліття. Тези доповідей VII конференції молодих вчених. (18-20 жовтня, 2000р., Київ). Київ 2000. – С. 20.

6. Москалик Г.Г., Костишин С.С. Регуляція активності ключових ферментів азотного метаболізму салату посівного (Lactuca sativa L.) синтетичними цитокінінами // Онтогенез рослин, біологічна фіксація азоту та азотний метаболізм (Матеріали Міжнародної наукової конференції, 1-4 жовтня 2001 р., Тернопіль.). - Тернопіль. – 2001. – С.170-173.

АНОТАЦІЯ

Москалик Г.Г. Активність ключових ферментів азотного метаболізму салату посівного (Lactuca sativa L.) за дії нітратного і амонійного азоту та синтетичних цитокінінів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Чернівецький національний університет ім. Ю. Федьковича, Чернівці, 2001.

В роботі показано особливості регуляції активностей ключових ферментів азотного обміну – НР, ГС, ГДГ нітратним та амонійним азотом окремо та разом з синтетичними цитокінінами. Встановлено активацію НР в коренях рослин за дії дефіциту нітратного азоту в середовищі на ранньому етапі розвитку. За дії амонійного азоту показано низький фоновий рівень потенційної та реальної активностей НР, який не змінювався з концентраціями амонію в середовищі.

Відмічено, що асиміляція амонійного азоту в органах салату відбувалась як ГС, так і ГДГ-шляхом і залежало від форми та концентрації азоту в середовищі. При синтезі глутамінової кислоти та її аміду – глутаміну проявлявся принцип альтернативності, який забезпечував пристосувальні реакції рослин до зміни умов вирощування.

Встановлено формування запасного пулу нітратів не залежно від форми та концентрації азоту в середовищі. Проведено порівняльне дослідження впливу мономерної форми цитокініну –6-БАП та полімерного його аналога – полістимуліну К на активність ключових ферментів. Встановлено однонаправлену дію синтетичних цитокінінів на показники проте виявлено специфічність дії залежно від їх форми та фону мінерального живлення. Показано вплив мономерного аналога цитокінінів на вказані параметри у фазі двох справжніх листків, а полімерного – у фазі технічної зрілості.

Ключові слова: Lactuca sativa (L.), нітратредуктаза, глутамінсинтетаза, глутаматдегідрогеназа, компартментація, асиміляція азоту, онтогенез, БАП, полістимулін К

АННОТАЦИЯ

Москалик Г.Г. Активность ключевых ферментов азотного метаболизма салата посевного (Lactuca sativa L.) при действии нитратного и аммонийного азота и синтетических цитокининов. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук за специальностью 03.00.04 – биохимия. – Черновицкий национальный университет им. Ю. Федьковича, Черновцы, 2001.

Исследовали особенности регуляции активностей ключевых ферментов азотного обмела – НР, ГС, ГДГ в органах салата, а также компартментацию нитратов при условии нитратного и аммонийного питания и действии синтетических цитокининов на их фоне. Выявлено, что потенциальная и реальная активности фермента прямо пропорциональны концентрации нитрата в среде, что свидетельствует о субстратиндуктивности фермента. Показатели реальной активности фермента были ниже, чем потенциальной, что указывает на не полную ассимиляцию нитратов в органах растений и о возможном их запасании в компартментах. В результате действия аммонийного азота у растений салата активности фермента имели низкие фоновые значения, которые не изменялись от концентрации аммония и обеспечивались конститутивными формами НР. Разница между реальной и потенциальной активностями была выше аналогичных нитратных вариантов.

Показано, что ассимиляция аммонийного азота в органах салата осуществляется ГС и ГДГ - путями. При условии низких концентраций (3,05 мМ) нитрата и аммония в корнях растений осуществлялся синтез глутамина. При действии высоких концентраций нитратного (48,8 мМ) и аммонийного азота (24,4 мМ) показано активацию процесса синтеза глутаминовой кислоты в листьях и корнях салата, что было, вероятно, результатом детоксикации избыточных количеств аммония в клетках растений.

В результате проведенного эксперимента показано прямую зависимость количества нитратов в органах салата от его концентрации в среде питания. Показано, что большая его часть составляла ЗП нитратов. При действии аммония общее количество нитратов в органах растений была ниже аналогичных нитратных вариантов, однако абсолютные и относительные размеры ЗП значительно превышали их.

В результате изучения действия синтетических цитокининов на отдельные показатели азотного обмена показано стимуляцию активностей НР, ГС, ГДГ БАП при условии низких концентраций азота и у фазу двух настоящих листьев, а при действии высоких концентраций и у фазу технической зрелости – ПСК. В следствии чего осуществлялось уменьшение абсолютного количества эндогенных и запасных нитратов, которое не изменяло соотношение размеров компартментов.

Ключевые слова: Lactuca sativa (L.), нитратредуктаза, глутаминсинтетаза, глутаматдегидрогеназа, компартментация, ассимиляция азота, онтогенез, БАП, полистимулин К.

SUMMARY

Moskalyk G.G. Activity of the Key Enzymes of Nitrogen Metabolism of Lettuce by Acting of Nitrogen and Ammonium Nitrate and Synthetic cytokinins. – Manuscript.

The thesis for gaining a scientific degree, a candidate of biological science on speciality 03.00.04 - biochemistry. Chernivtsi Yu. Fedkovych National University. Chernivtsi, 2001.

The peculiarities of the regulation of activities key enzymes of the nitrogen metabolism – nitrate reductase (NR), glutamine synthetase (GS), glutamate dehydrogenase (GDG) by nitrogen and ammonium nitrate separately and together with synthetic cytokinins are shown in the thesis work.

The activation of NR in the roots of the plants when there is a deficit of nitrate nitrogen in the medium at the early stage of the development has been determined. Under the action of ammonium nitrogen a low background level of potential and real activities of NR which doesn't change with ammonium concentrations in the medium has been shown.

It has been noted that ammonium nitrogen assimilation in the organs of lettuce took place both in GS and GDG way and depended on the form and concentration of nitrogen in the medium. The principle of alternative which ensured the adapting plant reaction to the changes of the growth conditions appeareal in the synthesis of glutamic acid and its amide.

The formation of the reserve pool of nitrates irrespective of the form and nitrogen concentration in the medium has been determined. A comparative investigation of the influence of the cytokinins monomer form – BAP and its polymeric analogue – polystimuline K on the activity of key enzymes has been done. A single – directed action of synthetic cytokinins on the indices has been determined but the specificity of the action depending on their forms and the background of mineral nutrition was revealed. The influence of monomer analogue of cytocinins on the shown parameters in the phase of two real leaves and polymeric in the phase of technical ripeness are shown there.

Key words: nitrate reductase, glutamine synthetase, glutamate dehydrogenase cytokinins, compartmentation, nitrogen assimilation, ontogenesis, 6-benzylaminopurine (BAP), polystimuline K.