ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ

АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

М’ЯСОЄДОВ Валерій Васильович

УДК 577.1:615.9:614.7:661.185

МОЛЕКУЛЯРНI МЕХАНIЗМИ БIОЛОГIЧНОЇ ДIЇ

СИНТЕТИЧНИХ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИХ РЕЧОВИН

03.00.04 – Біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківському державному медичному університеті

Міністерства охорони здоров’я України

Науковий консультант – доктор медичних наук, доктор біологічних
наук, професор ЖУКОВ Віктор Іванович,

Харківський державний медичний університет,

завідувач кафедри біохімії.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор, член-кор. АМН Укра-
їни ГУБСЬКИЙ Юрій Іванович, Національний
медичний університет ім.О.О.Богомольця, завідувач
кафедри біоорганічної, біологічної та фармацевтичної
хімії;

доктор медичних наук, професор МХІТАРЯН Лаура
Сократівна, Інститут кардіології АМН України ім.акад.
М.Д.Стражеска, завідувач відділу біохімії;

доктор біологічних наук, професор КАЛІМАН Павло
Авксентійович, Харківський національний університет
ім. В.Н.Каразіна, завідувач кафедри біохімії.

Провідна установа – Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України, відділ
біохімії коферментів.

Захист відбудеться “13” грудня 2001 року о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.551.01 в Інституті геронтології АМН України: 04114, Київ - 114, вул. Вишгородська, 67.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту геронтології АМН України (Київ, вул.Вишгородська, 67).

Автореферат розісланий “12” листопада 2001 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

к.мед.н. Р.І.Потапенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Актуальною проблемою медичної біохімії є вивчення механізмів впливу ксенобіотичних сполук на організм людини. Техногенні, зокрема хімічні, забруднювачі навколишнього середовища посідають провідне місце в ряду чинників, що негативно впливають на стан здоров’я населення (Г.И.Сидоренко, Е.А.Можаев, 1987; Ю.И.Губский и соавт., 1993; А.М.Сердюк, 1998). Розробка методів діагностики, лікування й профілактики наслідків несприятливого впливу на організм людини хімічних забруднювачів навколишнього середовища є актуальною соціальною та медико-біологічною проблемою (Д.П.Никитин, Ю.В.Новиков, 1986; И.М.Трахтенберг и соавт., 1987), вирішення якої можливе лише за умов вивчення механізмів біологічної дії хімічних речовин на теплокровні організми.

До речовин, з якими населення контактує повсякденно, належать синтетичні поверхнево-активні речовини (ПАР), що широко використовуються в різних сферах виробництва й побуту як миючі засоби, емульгатори, солюбілізатори, диспергатори, харчові добавки, бактерицидні засоби тощо (А.А.Абрамзон и соавт., 1988; О.И.Волощенко, О.И.Мудрый, 1988; И.Т.Полковниченко, 1989). Обсяги випуску й асортимент синтетичних детергентів щорічно збільшуються. Останнім часом з’явилися нові класи ПАР, які за основними компонентами їх синтезу розподіляються на азото-, фторо-, боро-, фосфоровмісні сполуки (Л.А.Бондаренко, Л.В.Дехтярь, 1992; В.В.Мясоедов, Р.И.Кратенко, 1999). Дані щодо біологічної активності цих речовин, механізмів її реалізації у теплокровних організмах нечисленні, а наявні дані свідчать про складний характер впливу ПАР на організм (О.И.Волощенко, И.А.Медяник, 1983; В.И.Жуков и соавт., 2000). Особливо це стосується таких нещодавно синтезованих речовин, як азото-, фосфоровмісні детергенти, неоноли.

Актуальною залишається проблема з розробки методів прогнозування потенційної небезпечності для людини та біосфери в цілому ксенобіотичних сполук, зокрема ПАР.

Великі обсяги виробництва, широкий контакт населення з поверхнево-активними речовинами ставлять перед медиками та біологами задачі обґрунтування донозологічних високочутливих експрес-методів визначення біологічної активності детергентів та методів оцінки стану здоров’я населення, що контактує з ПАР. Вирішення цих питань потребує глибокого вивчення молекулярних механізмів, які полягають в основі формування структурно-метаболічних порушень при дії на організм поверхнево-активних речовин.

Виходячи із зазначеного, у даний час питання розкриття й систематизації молекулярних механізмів дії синтетичних поверхнево-активних речовин на організм теплокровних тварин і людини, математичного прогнозування біологічних властивостей детергентів, визначення змістовних і феноменологічних проявів системи “ксенобіотик-організм” залишаються актуальними.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в Харківському державному медичному університеті в рамках проблеми “Біохімія і патохімія обміну речовин, механізми регуляції та медична ензимологія” Державної програми 0.10.04 (№ державної реєстрації 01860021125) й програми ДКНТ 020 “Нові хімічні матеріали”, затвердженої ДКНТ 30.10.85 р. №555. Результати роботи були складовою частиною при обґрунтуванні державних стандартів вмісту синтетичних детергентів у об’єктах навколишнього середовища.

Мета й задачі роботи. Метою роботи було розкриття молекулярних механізмів біологічної дії нових груп синтетичних поверхнево-активних речовин (азотовмісних імідазолінів, фосфоровмісних детергентів, неонолів) в організмі теплокровних тварин та людини, обґрунтування методів діагностики несприятливого впливу синтетичних детергентів на організм і розробка методів прогнозування небезпечності сполук даного класу для людини. Для реалізації поставленої мети вирішували такі задачі:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вивчено молекулярні механізми біологічної дії різних класів (іоногенних та неіоногенних) та груп ПАР (азотовмісних імідазолінів, фосфоровмісних детергентів, неонолів). Уперше на різних рівнях структурної організації біологічних об’єктів вивчено стан метаболічних процесів, інтенсивність вільнорадикальних процесів перекисного окиснення ліпідів, активність ферментів антиоксидатної системи, стан біологічних мембран, окислювально-відновні процеси, фонд мікро- та макроелементів за умов надходження до організму синтетичних детергентів.

Доведено, що регулярне надходження до організму детергентів-ксенобіотиків приводить до розвитку вільнорадикальної патології, в основі якої полягає інтенсифікація детергентами процесів вільнорадикального окиснення,зокрема перекисного окиснення ліпідів, лабілізація й деструкція біологічних мембран. Одержано нові дані щодо мембранотропного характеру дії поверхнево-активних речовин, що проявлялося в зміні складу біомембран, активності мембранних ферментів та рецепторів, проникності біологічних мембран для різних речовин. Установлено, що одним з провідних механізмів несприятливої дії поверхнево-активних речовин є розвиток комбінованої гіпоксії, порушення біоенергетичних процесів.

Дістали подальший розвиток уявлення про вплив поверхнево-активних речовин на системи біотрансформації ксенобіотиків. Установлено продукти біотрансформації досліджуваних детергентів в організмі теплокровних тварин і показано їхню роль у розвитку структурно-метаболічних порушень органів та тканин. Уперше дано оцінку стану системи гормональної регуляції та нейротрансмітерних процесів у тварин за умов регулярного надходження до організму детергентів-ксенобіотиків.

Одержано дані щодо ультраструктурних змін органів тварин під впливом ПАР. Уперше за допомогою багатофакторного статистичного аналізу встановлено кількісні кореляційно-регресійні залежності між дескрипторами фізико-хімічних параметрів детергентів та їхньою біологічною активністю. Це дало змогу розробити математичну модель прогнозу біологічної активності перспективних поверхнево-активних речовин на підставі їхніх фізико-хімічних властивостей. Визначено провідні фізико-хімічні константи, що зумовлюють біологічну активність ПАР: наявність певних гідрофільних та гідрофобних угруповань, силу міжмолекулярних та внутрішньомолекулярних зв’язків.

Проведені комплексні дослідження дозволили сформулювати всебічні уявлення стосовно впливу ПАР на метаболічні процеси, оцінити потенційну шкідливість детергентів для людини й обґрунтувати діагностичні критерії розвитку вільнорадикальної патології в організмі за умов регулярного надходження ПАР.

Обґрунтовано використання високочутливих інтегральних біофізичних методів – визначення біохемілюмінесценції, фосфоресценції біологічних рідин, електронегативності ядер клітин букального епітелію – в оцінці стану здоров’я населення, у визначенні ступеня порушення гомеостазу, реєстрації первинних процесів у біологічних мембранах.

Практичне значення одержаних результатів. Установлені закономірності механізму біологічної дії поверхнево-активних речовин, розроблені на цих підставах оціночні моніторингові показники стану здоров’я (інтенсивність вільнорадикального перекисного окиснення ліпідів, вміст фосфоліпідів у мембранах еритроцитів, активність ферментів сироватки крові) було використано при складанні комплексних програм профілактичних та лікувально-оздоровчих заходів на ВО “Капролактам” (м.Дзержинськ, Російська Федерація), НВО “Полімер-синтез” (м.Владимир, Російська Федерація), НВО “Синтез ПАР” (м.Шебекіно, Російська Федерація), ВО “Хімпром” (м.Первомайськ, Харківська область) (акти впровадження, додаток). Положення концептуальної моделі механізмів біологічної дії детергентів було покладено в основу розробки метаболічно-адаптованого антирадикального профілактичного харчування робітників виробництва ПАР та синтетичних миючих засобів (СМЗ).

Результати роботи, зокрема математична модель прогнозу біологічних ефектів ПАР, використані при обґрунтуванні державних стандартів вмісту азото-, фосфоровмісних ПАР, неонолів в об’єктах навколишнього середовища, для експрес-оцінки біологічної активності нових поверхнево-активних речовин і враховані при складанні методичних рекомендацій з обладнання, устаткування й експлуатації виробництв ПАР і СМЗ. Одержані результати було покладено в основу обґрунтування техніко-економічних розрахунків з перепрофілювання виробництва тетрагідрофуранів на Кіришському біохімзаводі Ленінградської області й Шебекінському хімзаводі Білгородської області.

Теоретичні положення й практичні рекомендації за наслідками досліджень впроваджено в практику навчання студентів медичних вищих навчальних закладів.

Особистий внесок здобувача. Особисто дисертантом визначено мету та задачі роботи. Проведено патентно-ліцензійний пошук. Обґрунтовано й реалізовано методологію комплексного підходу до вивчення системних механізмів структурно-метаболічних порушень в організмі за умов впливу синтетичних поверхнево-активних речовин.

Розроблено концепцію механізму біологічної дії синтетичних детергентів в організмі теплокровних тварин та людини, а на її підставі методи діагностики вільнорадикальної патології. Обґрунтовано використання інтегральних біофізичних методів для оцінки стану здоров’я населення, що контактує з ПАР та СМЗ.

Розроблено методику прогнозу біологічної активності детергентів на підставі їхніх фізико-хімічних констант (спільно с доцентом, к.б.н. О.В.Зайцевою, особистий внесок автора складає 50%).

Автором особисто здійснено аналіз результатів дослідження, проведено їх математичну обробку. Сформульовані всі положення та висновки роботи.

Автор висловлює подяку за консультативну допомогу в процесі виконання роботи професору, д.мед.н., д.б.н. В.І.Жукову.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень оприлюднено на науково-практичній конференції “Региональные проблемы охраны здоровья населения Центрального Черноземья” (м.Бєлгород, 2000), міжнародному симпозіумі “Біоетика на порозі III тисячоліття” (Харків, 2000), науково-практичній конференції “Поверхностно-активные вещества и сырье для их производства. Экологические аспекты и вопросы промышленной санитарии при производстве ПАВ и сырья для них” (м.Шебекіно, 1988), регіональній науково-практичній конференції “Епідеміологія, екологія та гігієна” (Харків, 1999), науково-технічній конференції “Экология и здоровье человека. Охрана водного и воздушного бассейнов. Утилизация отходов” (м.Щелкіно, АР Крим, 2000), регіональній науково-практичній конференції гігієністів та санлікарів “Медицинская экология, эпидемиология и гигиена окружающей и производственной среды” (м.Харків, 1996), засіданнях біохімічного товариства (Харків, 1995, 1997), підсумкових конференціях молодих науковців ХДМУ (Харків, 1994, 1996).

Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 36 робіт, в тому числі 4 монографії у співавторстві, 30 статей (21 з них у фахових виданнях, затверджених ВАК України), 2 тези доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, програми дослідження, 7 розділів власних досліджень, наукового обґрунтування моделі біологічної дії синтетичних детергентів, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел. Дисертація викладена на 336 сторінках машинопису та містить 51 таблицю і 61 рисунок. Список використаних джерел включає 352 найменування, з них 276 - українською та російською мовами, 76 – іншими мовами.

ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА Й ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ. Вибр групи дослджуваних ПАР був зумовлений х широким використанням в промисловост й побут, великими обсягами виробництва, належнстю х до рзних класв та груп ПАР, недостатністю вивчення механзму бологчно д перспективних класв ПАР, необхідністю прогнозування потенцйно небезпеки речовин для людини. У робот використано хмчно чист зразки ПАР, синтезован й надан ВНДI ПАР й НВО “ Синтез ПАР” (м.Шебекно, Росйська Федераця) (табл.1).

Досліджувані фосфоровмісні сполуки є сумішшю триетаноламінових солей алкілфосфатів й алкілполіфосфатів фракції С12-С18. Досліджувані азотовмісні
ПАР є сумішшю імідазоліну (основної діючої речовини), піперазину й аміноамідів у різних пропорціях. Неоноли, модифіковані етоксилати алкілфенолів, є сумішшю відповідних оксиетильованих алкілфенолів із сульфоетоксилатами в мольних співвідношеннях, зазначених у дужках.

Таблиця 1

Належність досліджуваних сполук до груп Для розкриття моле-

та класів ПАР кулярних механізмів бі-

Клас ПАР | Група ПАР | Речовини

Іоногенні |

Фосфоровмісні |

Поліфос-124 Тм

ФТЕА

ТЕА Синтафоп-7

Азотовмісні

імідазоліни | Амідолін 9 БС

Неіоногенні | Пеназолін 7-9 Б

Пеназолін 10-16 БД

Біпан 10 А

Неоноли | АФМ 9-10 (0,5)

АФМ 9-10 (0,9)

АФМ 9-12 (0,3)

ологчно д дослджуваних ПАР згідно з метою дослдження доцльним було проведення коротко- часних (одноразових) і тривалих експериментв на теплокровних твари-нах. Тварин (білих щурів лінії Вістар (WAG), білих мишей) піддавали щоденній одноразовій перораль- ній затравці водними розчи
нами досліджуваних речовин у дозах 1/10, 1/100, 1/1000 ДЛ50 протягом 30-60 діб. Розрахунок необхідної для введення кількості речовин проводили, виходячи з даних про параметри токсичності досліджуваних речовин (Л.А.Бондаренко и соавт., 1988; В.І.Жуков, В.В.М’ясоєдов, 1999).

Особливості клінічної картини, змін інтегральних показників (маси тіла, вагових кофіцієнтів внутрішніх органів, стану червоної та білої крові), на нашу думку, свідчили про мембранотропний характер дії досліджуваних азото-, фосфоровмісних детергентів, неонолів.

Програма досліджень включала вивчення стану біологічних мембран клітин теплокровних тварин за умов впливу синтетичних ПАР, стану перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ), антирадикальних й антиперекисних систем, дослідження стану біоенергетичних процесів, системи біотрансформації ксенобіотиків, стану системи гормональної регуляції та нейротрансмітерних систем.

При визначенні фосфоліпідного складу еритроцитів і гепатоцитів проводили екстракцію ліпідів (E.G.Bligh, W.D.Dyer, 1959), випарювання ліпідів здійснювали в тоці сухого азоту. Зразки аналізували методом двохмірно тонкошарової хроматографії на силікагелі (E.A.Vashovsky, T.A.Terekkive, 1979). Ідентифікацію фосфоліпідів проводили з використанням еталонних речовин і речовин для якісного визначення (Ю.Кирхнер, 1981).
Вміст дієнових кон’югатів молекул жирних кислот визначали за методами (Б.В.Гаврилов, 1983; А.Б.Каухин, Б.С.Ахметова, 1987). У сироватці крові визначали малоновий діальдегід (Т.Н.Федорова, Т.С.Коршунова, Э.Г.Ларский, 1983). Накопичення в організмі продуктів перекисного окиснення ліпідів також оцінювали за інтенсивністю біохемілюмінесценції (БХЛ). Рестрацію БХЛ біологічних об’єктів проводили на медичному біохемілюмінометрі ХЛМЦ-01 загальноприйнятими методами (Ю.А.Владимиров, А.И.Арчаков, 1972; Я.И.Серкиз и соавт., 1984).

Визначали активність супероксиддисмутази (В.С.Гуревич, К.Н.Конторидинова, С.В.Шапилина, 1990), каталази й пероксидази крові (М.Д.Подильчак, 1967; В.С.Асатиани, 1969). Активність церулоплазміну визначали за Rawin (1961) в модифікації Г.О.Бабенко (1968). Вміст глутатіону в крові визначали за методом W.W.Kay й співавт. у модифікації Р.С.Кузденбаєвої і співавт. (1980). Вміст сульфгідрильних груп у крові визначали методом амперометричного титрування (M.E.Murphy, H.Scholich, H.Sies, 1989). Активність глутатіонпероксидази визначали за методом А.Р.Гаврилової, Н.Ф.Хмари (1986). У наднирниках експериментальних тварин визначали вміст вітаміну С (T.W.Birch,L.J.Harries, S.W.Raw,1989).

У мембранах гепатоцитів тварин за умов впливу ПАР визначали активність Са2+- та Мg2+-АТФ-аз; активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази визначали спектрофотометрично в мембранах еритроцитів за утворенням НАДФН2 при 340-366 нм (Н.П.Мешкова, С.Е.Северин, 1979).

Методом радіорецепторного аналізу визначали стан мембранних рецепторів біологічно активних сполук у неокортексі тварин при впливі ПАР. Для цього визначали параметри зв’язування - (КД та Вmax) - високоселективного ліганду 1-адренорецепторів 3Н-WB4101(D.U’Prichard, D.Greenberg, S.H.Snyder, 1977), ліганду -адренорецеторів 3Н-дигідроалпренололу (D.B.Bylund, S.H.Snyder, 1979), селективного ліганду Д2 – дофамінорецепторів - 3Н-спіперону (A.E.Theodoron e.a., 1980; A.Bruinink, S.Bischoff, 1986; A.Davis, B.Madras, P.Seeman, 1986). Визначення параметрів зв’язування селективних лігандів С1- та С2-серотоніновими рецепторами неокортекса тварин проводили за методом S.J.Peroutka, S.H.Snyder, (1979). Білок у пробах визначали за Лоурі (1951). Кількість глюкокортикодних рецепторів неокортекса еспериментальних тварин визначали за методом M.Beato, P.Feigelson (1972).

Вміст біогенних елементів в органах та тканинах визначали атомно-абсорбційним методом (М.Э.Брицке, 1982). Вміст амінокислот у тканинах тварин за умов впливу ПАР визначали методом іонообмінно хроматографі на іонітах на автоматичному аналізаторі амінокислот ААА-339 (Чехословаччина).

Для якісної характеристики стану окислювально-відновних процесів в організмі експериментальних тварин визначали активність оксидоредуктаз: малатдегдрогенази (М.Д.Подильчак, 1967), сукцинатдегідрогенази (М.И.Прохорова, 1982), фосфофруктокінази
(Н.П.Мешкова, С.Е.Северин, 1979), цитохромоксидази (Г.П.Гудилова, И.Н.Сорокина, 1967). Активнсть ферментв креатинфосфокнази, лактатдегдрогенази, глутатонпероксидази, -гдроксибутиратдегдрогенази визначали унфкованими клнчними методами на напвавтоматичному аналзатор FР-901 фрми “Labsystems” (Фнляндя).

Стан мікросомального окиснення оцінювали за дихальною й ферментативною активністю, вмістом цитохромів b5 та Р-450. Мембрани ендоплазматичного ретикулума виділяли за методом (S.A.Komoth, K.A.Narayan, 1972). Споживання кисню суспензію рестрували за допомогою закритого платинового кисневого електроду Кларка (S.L.Clark, 1964).

НАДФН-цитохром С-редуктазну й НАДН-цитохром С-редуктазну активність рестрували на двопроменевому спектрофотометрі “Specord UV VIS” при довжині хвилі 550 нм за методом L.Ernster, Ph.Siekevitz, G.E.Palode (1962).

Кількісне визначення цитохромів b5 та Р-450 проводили в суспензі мікросом за методом T.Omura, R.Sato (1964). Вміст цитохромів визначали за допомогою двопроменевого реструючого спектрофотометру “Specord UV VIS”(НДР).

У печінці та головному мозку тварин, що були під впливом детергентів, визначали вміст адреналіну, норадреналіну, ДОФА, дофаміну, серотоніну, тирозину й триптофану. Для звязування біогенних моноамінів та їх попередників з гомогенатів використовували карбоксиметилцелюлозу (КМЦ) фірми “Reanal” (Y.Endo, Y.Ogura, 1975). Окиснення катехоламінів й ДОФА проводили за методом G.Slabo, G.L.Kovacs, G.A.Telegly, 1983. Визначення рівню біогенних моноамінів та попередників проводили на спектрофлюориметрі MPF-4 “Хітачі“ (Японія) після колонково хроматографі.

Вміст циклічних нуклеотидів (цАМФ та цГМФ) у неокортексі щурів проводили радіоімунними методами з використанням наборів реактивів фірми “Amersham” (Великобританія).

Дослідження гормонального статусу експериментальних тварин проводили радіоімунними методами за допомогою стандартних наборів для визначення гормонів. Активність аденілатциклази визначали за методикою, описаною Н.А.Юдаєвим і співавт. (1981) з незначними модифікаціями, гуанілатциклази за методикою Б.Є.Чиркова й співавт. (1987). Визначення активності фосфодіестерази циклічних нуклеотидів проводили за методами J.F.Kuo e.a.(1978), H.Uno e.a. (1975).

Гістологічному й гістохімічному дослідженню підлягали печнка, нирки, головний мозок, наднирники й селезнка експериментальних тварин. При гістохмчному дослдженні в зрізах органів визначали активність ЛДГ, СДГ, МАО, -ГФДГ, глюкозо-6-Ф-ДГ (Э.Пирс, 1962; L.Astaldi, L.Vergo, 1957). Визначали активність органоспецифічних ферментів у крові: холінестерази (В.С.Асатиани, 1969), аланіново та аспарагіново трансаміназ (В.С.Асатиани,
1969; М.И.Прохорова, 1982), лужної фосфатази (М.Д.Подильчак, 1967).

За допомогою інтегральних методів: дослідження біохемілюмінесценції, фосфоресценції біологічних рідин, визначення електронегативності ядер клітин букального епітелію (Ю.А.Владимиров, А.И.Арчаков, 1972; В.Г.Шахбазов, 1982) - оцінювали наявність вільнорадикальної патології у робітників, зайнятих у виробництві ПАР і СМЗ (ВО “Синтез ПАР”).

Для побудування математичної моделі прогнозу біологічної активності синтетичних ПАР використовували методи регресійного та багатофакторного аналізу (Г.Г.Харман, 1972; Дж.Драйпер, Г.Смит, 1986; М.Б.Славин, 1989), а також метод імовірносної оцінки біологічних ефектів та структурної обробки емпіричних даних (Э.М.Браверман, И.Б.Мичник, 1983). При обробці одержаних даних використовували параметричні й непараметричні статистичні методи (М.Б.Славин, 1989).

В експериментальній частині роботи було використано понад 1080 білих щурів, 600 білих мишей.

СТАН БІОЛОГІЧНИХ МЕМБРАН КЛІТИН ТЕПЛОКРОВНИХ ТВАРИН ПРИ НАДХОДЖЕННІ ДО ОРГАНІЗМУ СИНТЕТИЧНИХ ДЕТЕРГЕНТІВ. Порушення стабільності й проникності біологічних мембран, за даними багатьох авторів, є одним з головних шляхів у реалізації несприятливих ефектів ксенобіотиків (А.А.Покровский, 1976; Ю.И.Губский и соавт., 1993; N.Boyd, 1980). Виходячи з особливостей фізико-хімічних властивостей досліджуваної групи синтетичних детергентів, зокрема наявності гідрофільних та гідрофобних угрупувань у молекулах, відносно низької молекулярної маси, здатності до хімічних перетворень з утворенням активно діючих у відношенні біомолекул сполук, нами було висунуто припущення про мембранотропні ефекти синтетичних детергентів в організмі теплокровних тварин як центральну ланку біологічної дії детергентів-ксенобіотиків.

Фосфоліпідний склад мембран еритроцитів і гепатоцитів за умов впливу ПАР. Визначали зміни питомої ваги певних фракцій фосфоліпідів у мембранах клітин експериментальних тварин. Так, у мембранах еритроцитів спостерігали збільшення питомої ваги сфінгомієлінів (СМ) у щурів, які одержували фосфоровмісні та азотовмісні детергенти в середньому на 30%, а у тварин під впливом неонолів – у середньому на 20% порівняно з контрольною групою.

Більший рівень лізофосфатидилхоліну (ЛФХ) й зменшена відносна кількість фосфатидилсерину (ФС) були характерними для мембран еритроцитів експериментальних тварин порівняно з контролем. Склад фосфоліпідів мембран гепатоцитів у щурів, яким вводили досліджувані речовини, характеризувався зменшенням порівняно з тваринами контрольної групи вмісту сфінгомієлінів (у середньому на 28%), фосфатидилінозитолів (ФІ) (у середньому на 48%) і збільшенням вмісту лізоформ фосфоліпідів – лізофосфатидилетаноламіну (ЛФЕА) (у тварин під впливом фосфоровмісних та азотовмісних детергентів, більше ніж втричі по-
рівняно з контролем, а у тварин під впливом неонолів більше майже в 4,5 рази) і ЛФХ (у тварин, які одержували іоногенні фосфоровмісні та неіоногенні азотовмісні ПАР, - майже в 4,5 рази, а у тварин під впливом неонолів - у 3,7 рази) (табл.2).

Одержані результати свідчили про дестабілізацію мембран еритроцитів, гепатоцитів досліджуваними речовинами, причиною чого може бути безпосередній, “первинний” вплив детергентів-солюбілізаторів на біологічну мембрану, а також інтенсифікація під впливом досліджуваних речовин процесів вільнорадикального окиснення, зокрема перекисного окиснення ліпідів. Останнє припущення, на нашу думку, підтверджувалося збільшенням питомої ваги лізоформ фосфоліпідів у мембранах клітин. Підвищення вмісту лізоформ фосфоліпідів може приводити до змін функціональних характеристик мембран, зокрема функціонування пов’язаних з мембранами ферментних, рецепторних, канальних білкових комплексів, дезінтеграції мембран.

Перекисне окиснення ліпідів при впливі на організм синтетичних детергентів. У тварин експериментальних груп під впливом дослджуваних речовин визначали пдсилення процесв перекисного окиснення лпдв, про що свдчило накопичення днових конюгатв,

Таблиця 2

Фосфоліпідний склад мембран гепатоцитів білих щурів під впливом
поверхнево-активних речовин (1/100 ДЛ50 )

Речовини | Фосфоліпіди (Мm, %)

ФЕА | ФХ | СМ | ФС | ЛФЕА | ЛФХ | ФІ | КЛ

Поліфос-124 Тм | 22,6 1,7 | 39,8 2,9 | 10,3 1,4** | 11,5 0,8 | 6,3 0,8** | 5,2 ,4** | 4,2 0,8* | 0,7 0,3

ТЕА

Синтафоп-7

Контроль |

21,3 2,3

23,3 2,1 | 43,4 3,8

39,3 3,1 | 11,0 1,2**

16,0 0,9 | 10,3 0,6

9,0 1,2 | 4,4 ,7**

1,3 0,6 | 6,2 ,5**

1,0 0,4 | 3,8 0,6**

7,7 0,9 | 0,8 0,3

0,5 0,1

Пеназолін 7-9 Б | 20,40,8 | 43,63,7 | 11,70,8

** | 10,00,7 | 4,8

0,6** | 6,60,5** | 4,2

0,6** | 0,90,3

Біпан 10 А

Контроль | 23,40,9

23,32,1 | 40,71,2

39,33,1 | 13,40,3*

16,00,9 | 11,51,4

9,01,2 | 5,60,4**

1,30,6 | 4,80,6**

1,00,4 | 4,5

0,4**

7,70,9 | 0,60,15

0,50,11

АФМ 9-10 (0,5) | 23,6 1,3 | 42,0 2,4 | 10,2 1,1** | 8,8 1,3 | 5,8 0,6** | 5,9 0,4** | 3,2 0,2** | 0,5 0,1

АФМ 9-12 (0,3)

Контроль |

21,4 2,6

24,7 1,2 | 39,7 2,1

38,3 1,6 | 12,5 1,4*

17,1 0,8 | 7,5 1,7

7,9 1,1 | 6,5 0,6**

1,1 0,1 | 7,1 0,6**

1,4 0,2 | 4,8 0,2**

7,9 0,6 | 0,5 0,12

0,6 0,1

Примітка: * - р < 0,05; ** - р < 0,01 (достовірність порівняно з контролем); n = 7 – 9; КЛ-кардіоліпіни

малонового дальдегду в сироватц кров. Iнтенсивнсть бохемлюмнесценц сироватки експериментальних тварин перевищувала аналогчний показник контрольно групи. Рвень днових конюгатв сироватки кров тварин, які одержували неоноли, на 50% перевищував рвень контрольно групи. Фосфоровмісн сполуки приводили до збльшення рвня днових конюгатв у середньому на 62%. Для тварин, яким вводили азотовмісні мдазолни, характерним було перевищення даного показника контрольної групи на 79% (табл.3).

Таблиця 3

Накопичення продуктів перекисного окиснення ліпідів
під впливом поверхнево-активних речовин
( 1 / 100 ДЛ50 ) у сироватці крові ( M m, нмоль/мл) Значно вищим за

Речовини | Дієнові кон’югати | Малоновий діальдегід

Поліфос-124 Тм | 4,75 0,48** | 2,63 0,35**

ФТЕА | 3,80 0,22* | 2,14 0,37*

ТЕА Синтафоп-7

Контроль | 4,40 0,26**

2,67 0,32 | 1,67 0,25*

0,94 0,12

Амідолін 9 БС | 4,20 0,27** | 1,60 0,24*

Пеназолін 7-9 Б | 5,30 0,28** | 2,20 0,41**

Пеназолін

10-16 БД |

4,50 0,33** |

1,89 0,22**

Біпан 10 А

Контроль | 4,60 0,37**

2,6 0,24 | 1,70 0,17**

0,85 0,13

АФМ 9-10 (0,5) | 4,53 0,36** | 4,10 0,23**

АФМ 9-10 (0,9) | 2,60 0,17 | 3,20 0,37**

АФМ 9-12 (0,3)

Контроль | 5,32 0,36**

2,76 0,14 | 4,60 0,48**

0,93 0,11

рвнем вдмн вд контрольно групи показником нтенсивност ПОЛ був вмст малонового дальдегду, який характеризу кнцев етапи перекисного окиснення.

Iнтенсивнсть бохемлюмнесценц кров у тварин всх дослджуваних груп, яким вводили 1/100

Примітка: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; n = 8 – 9 ДЛ50 речовин, збль-
шувалася порвняно з контролем при замрах на 15 та 30 добу експерименту. При цьому вдмни мж експериментальною та контрольною групами стосувалися не тльки нтенсивност БХЛ, але й кнетики перебгу реакц. Характер хемлюмнограми свдчив про накопичення в органзм гдроперекисв, перекисв, а паралельно з ними днових конюгатв та малонового дальдегду, як приводять до виснаження антиоксидантно системи.

Одержані дані про вплив поверхнево-активних речовин на вільнорадикальні й перекисні процеси дозволили говорити про суттєву роль окислювального стресу (Н.К.Зенков и соавт., 1993; B.Halliwell, J.M.C.Gutteridge, 1989) й ПОЛ у механізмах біологічної дії синтетичних детергентів.

Стан механзмв антирадикального та антиперекисного
захисту. При дослдженн ферментативних і неферментативних антиоксидантних механзмв у тварин після введення детергентів (1/100 ДЛ50) протягом 30 діб встановлено напруження з наступним виснаженням системи антирадикального й антиперекисного захисту (табл.4).

Так, активнсть супероксиддисмутази на 15 добу затравки перевищувала показники контрольно групи в середньому на 29%, а на 30 добу активнсть ферменту була нижчою порвняно з контролем у середньому на 32%. Подібні ж зміни були характерними для активності каталази, пероксидази, церулоплазміну. У тварин пд впливом дослджуваних речовин визначали менший порвняно з контролем вмст SH-груп кров й зменшення показника в динамц експерименту (на 15, 30 добу).

Таблиця 4

Стан антиоксидантної системи під впливом поверхнево-активних речовин

(1/100 ДЛ50)

Речовини | Супероксиддисмутаза

(ум.од./1 мггод) | Каталаза крові

(показник каталази) | Церулоплазмін сироватки

(мкмоль/л)

15 доба | 30 доба | 15 доба | 30 доба | 20 доба | 40 доба | 60 доба

ФТЕА | 1,05 0,04** | 0,55 0,03** | 9,320,36* | 5,360,13** | 2,600,09** | 2,070,08

* | 1,580,07

**

ТЕАСинтафоп-7

Контроль | 0,99 0,03**

0,84 0,04 | 0,65 0,05*

0,79 0,02 | 6,950,24

7,310,67 | 4,220,07**

7,170,13 | 2,230,11

2,190,08 | 2,940,07

**

2,350,10 | 1,670,24

2,140,11

Амідолін 9 БС | 1,02 0,04** | 0,53 0,03** | 9,850,18* | 6,300,2** | 2,880,11** | 3,490,19

** | 1,890,07

**

Пеназолін 7-9 Б | 1,08 0,06** | 0,51 0,04** | 9,270,44 | 5,500,1** | 2,320,11 | 2,970,12

** | 2,250,07

Біпан 10 А

Контроль | 1,04 0,04

0,81 0,03 | 0,54 0,06**

0,82 0,05 | 9,520,31*

8,260,31 | 5,000,4**

9,800,3 | 2,600,11**

2,110,11 | 3,000,08

**

2,320,07 | 1,960,06

**

2,450,10

АФМ 9-10 (0,5) | 1,01 0,07 | 0,66 0,05** | 10,10,25** | 4,280,16** | 3,240,08** | 3,950,15

** | 1,350,12

**

АФМ 9-12 (0,3)

Контроль | 1,10 0,04*

0,85 0,04 | 0,60 0,04**

0,84 0,03 | 12,40,3**

7,460,4 | 4,10,22**

7,580,3 | 3,390,17**

2,250,16 | 3,700,13

**

2,530,13 | 1,360,09

**

2,410,07

Примітка: * - р < 0,05; ** - р < 0,01 (достовірність порівняно з контролем); n = 7 – 9

Представники всх класв досліджуваних ПАР приводили до зниження рвня глутатону порвняно з контролем на 15 добу введення й ще в бльшй мр на 30 добу, за винятком фосфоровмісних речовин, при введенні яких на 15 добу у тварин не виявили суттвих змн рвня глутатону. Особливост змн параметрв антиоксидантно системи у тварин за умов надходження представників рзних ПАР можуть пояснюватися інтенсифікацією під впливом детергентів процесів ПОЛ.

Активність мембранозв’язаних ферментів під впливом ПАР. Одержані в попередніх експериментах дані щодо інтенсифікації під впливом досліджуваних речовин процесів перекисного окиснення ліпідів мембран, накопичення в мембранах лізоформ фосфоліпідів були підставою для проведення експериментів з вивчення активності мембранозв’язаних ферментів. Активнсть Мg2+-АТФ-ази й Са2+-АТФ-ази в гепатоцитах тварин експериментальних груп пд впливом дослджуваних речовин була зниженою порвняно з контролем. У тварин під впливом неонолів активнсть Мg2+- та Са2+-АТФаз була нижчою по вдношенню до контрольно групи на 30% та 54% вдповдно; у тварин, яким вводили мдазолни, вдповдно на 37% та 20%; у тварин за умов введення фосфоровмісних ПАР - на 20% 29%. Знижена активність ферментів, що безпосередньо відповідають за вміст двохвалентних катіонів у клітинах та її компартментах, може бути причиною “катіонного дисбалансу” в тканинах експериментальних тварин.
Активнсть глюкозо-6-фосфатдегдрогенази мембран еритроцитів, ключового ферменту пентозного циклу, що постача НАДФН2, зокрема для вдновлення глутатону, також була нижчою у тварин, що піддавалися впливу дослджуваних речовин. Азотовмісн ПАР приводили до зниження рвня активност ферменту порвняно з контролем у середньому на 62% (30 доба експерименту), фосфоровмісн сполуки - у середньому на 55%, неоноли - на 28%. Знижена активність глюкозо-6-фосфатдгідрогенази й пов’язаний з цим дефіцит відновленого НАДФН2 і глутатіону можуть бути причиною нестабільності еритроцитарних мембран, гемолізу, що спостерігались у тварин під впливом детергентів. Знижена кількість еритроцитів, визначена в експериментальних тварин, є однією з причин гіпоксичного стану тканин. Причиною пригнічуючої дії поверхнево-активних речовин на мембранні ферменти можуть бути як безпосередні солюбілізаційні ефекти детергентів, так і зміна фосфоліпідного оточення мембранних ферментних комплексів внаслідок активації процесів вільнорадикального перекисного окиснення ліпідів.

Стан моноамінергічних і глюкокортикоїдних рецепторв. Функцональн властивост 1-адренорецепторв неокортекса тварин, що піддавалися впливу детергентів, характеризувалися збльшеною порвняно з контролем спордненстю до ліганду (зменшенням значення КД ) високо- й низькоафнного пулу рецепторв (рис.1).

Рис.1. Зміни параметрів зв’язування 3Н-WB4101 1-адренорецепторами неокортек-
са білих щурів під впливом ПАР (% порівняно з тваринами контрольної групи)

Визначали збльшення клькост високо- й низькоафнних -адренорецепторв у всх групах тварин, яким вводили детергенти. Спордненсть обох визначених пулв -рецепторв тварин під впливом азотовмісних ПАР та неонолів, була вищою, у той час, як спордненсть рецепторв до лганду у тварин, яким вводили фосфоровмісні ПАР, порівняно з контролем була нижчою.

При аналз звязування селективного лганду Д2-дофамінергічними рецепторами неокортекса тварин експериментальних та контрольних груп встановили наявнсть високо- та низькоафінного пулів рецептоторів.

Ус дослджуван речовини приводили до зростання спордненост обох пулв рецепторв, а кльксть мсць звязування достоврно зменшувалася у тварин, які одержували азотовмісні мдазолни. Пд впливом дослджуваних речовин спостерігалося збільшення спорідненост рецепторв до лганду (С1-рецепторв, високо- та низькоафінного пулів С2-рецепторів) й зменшення клькост мсць звязування.

Схожсть змни функцональних характеристик мембранних рецепторв у тварин під впливом детергентів, як не мають структурно аналог з ендогенними лігандами та мж собою, може свдчити про вплив дослджуваних речовин на конформацйний стан рецепторних молекул. Особливо це стосується іоногенних детергентів. Дя ксеноботикв-детергентв на рецепторн молекули може реалзуватися також через змни у фосфолпдному оточенн рецепторв, а також через ефекти “солюблзац“, “нтерналзац“ рецепторних комплексв (П.В.Сергеев, Н.Л.Шимановский, 1987; D.M.Chuang, E.Costa, 1979). Крм характеристик мембранних рецепторв дослджували стан цитозольних рецепторв, яким належить важливе мсце в регуляц метаболчних процесв. Кльксть дослджуваних глюкокортикодних рецепторв II типу в експериментальних тварин майже вдвч перевищувала аналогчний показник у тварин контрольно групи, що може бути пояснено ефектами ядерно транслокац рецепторв у комплекс зі стеродами. Крм того, можливим те, що компенсацйно-адаптивн механзми в тварин, які знаходилися під впливом ПАР, повязан з тривалим напруженням глюкокортикодно функц, приводять до залучення в адаптивн процеси глюкокортикодних рецепторв і генетичного апарату клтини. Таким чином, поверхнево-активн речовини суттво впливають на стан рецепторно ланки регуляторних систем органзму.

Зміни вмісту біогенних елементів в органах та тканинах тварин під впливом детергентів. Селективна проникність для різноманітних речовин є однією з важливих функцій біологічних мембран. Цим забезпечується компартменталізація й цілісність метаболічних процесів у клітині. Під впливом досліджуваних детергентів змінюється стабільність біомембран, а це спричиняє порушення розподілення пулів ключових метаболітів, речовин між секторами клітин, клітинами й міжклітинною рідиною, між органелами клітин. Ці положення були доведені експериментами з визначення фонду біогенних елементів, амінокислот у тварин, які піддавалися впливу досліджуваних детергентів різних класів та груп.

Визначення біогенних елементів проводили в серці, печінці, нирках, наднирниках, головному мозку, селезінці, м’язах, сироватці крові тварин, що одержували 1/100 ДЛ50 досліджуваних поверхнево-активних речовин протягом 30 діб. У тварин, яким вводили фосфоровмісні ПАР, встановлено перерозподлення елементв в органах тканинах порвняно з контролем (рис.2).

Рис. 2. Зміни вмісту біогенних елементів в органах та тканинах білих
щурів під впливом ТЕА Синтафоп-7 (1/100 ДЛ50, % порівняно з контролем)

Найбльш значущими були змни динамки мкроелементв у тварин, що одержували ТЕА Синтафоп-7, у яких пдвищувався в сироватц кров вмст калію, натрію, кальцію, магнію, міді, цинку, заліза. Визначали зниження порівняно з контролем калію, кальцію, магнію та міді в печнц досліджуваних тварин, зниження цинку - у наднирниках; встановлено зниження натрію й збільшення вмісту цинку та заліза - у нирках, зниження міді в серц, кальцію та цинку - у селезнц. Для сироватки досліджуваних тварин характерним було збільшення вмісту калію, кальцію, магнію. Змни, що спостергали у вмст біогенних елементв, свдчили про несприятливий вплив поверхнево-активних речовин, який може полягати в посиленн виведення біогенних елементв з органзму.

Подбний характер змни був притаманним і для нших представникв фосфоровмісних ПАР. У бльшй мр порушення фонду мкроелементв було притаманним печнц й сироватц кров.

При дослідженн тварин, що знаходилися під впливом неонолів, встановлено змни вмсту біогенних елементв практично в усх дослджуваних органах. Знайдені змни фонду макро- та мкроелементв у тварин можуть служити для прогнозування змін рзних бохмчних, клнчних показникв.

Подбнсть змн фонду біогенних елементів у тварин, що піддавалися впливу представників рзних класв ПАР, масштабнсть цих змн свдчать про загальн механзми бологчно д рзних класв поверхнево-активних речовин, зокрема про мембранотропн дестабілізуючі ефекти досліджуваних детергентів. Зміни фонду біогенних елементів можуть, крім того, пояснюватися здатністю досліджуваних детергентів до комплексоутворення з макро- та мікроелементами й наступного перерозподілення цих речовин у клітинах, тканинах та організмі в цілому. Порушення натрій-калієвого гомеостазу можуть призводити до змін електрохімічного градієнту й пов’язаних з ним клітинних процесів; гіперкаліємія може бути причиною пригнічення серцево-судинної системи, що є характерним для експериментальних тварин. З порушенням магнієвого гомеостазу може суттєво змінюватися ряд ферментативних процесів – окислювальне фосфорилювання, аденілатциклазний каскад, протеосинтез, що знайшло підтвердження в подальших дослідженнях. Порушення в гомеостазі міді в організмі відбиваються на активності мідьвмісних ферментів, зокрема антирадикальних ферментів – супероксиддисмутази, церулоплазміну, біоенергетичних ферментів – цитохромоксидази, ферментів – учасників метаболізму біологічно активних сполук – дофамін-бета-гідроксилази, аміноксидаз.

Стан амінокислотного пулу організму теплокровних тварин при регулярному надходженні синтетичних ПАР. Тварини, яким вводили досліджувані речовини, характеризувалися зниженням вмісту таурину, аспарагінової кислоти, треоніну, серину, аспарагіну та глутамінової кислоти, глутаміну, проліну, гліцину, валіну й лізину в плазмі крові порівняно з контрольною групою. Для цих тварин, крім того, було характерним підвищення вмісту цистеїнової кислоти, аланіну в плазмі крові.

Зазначені зміни в розподіленні амінокислотного пулу свідчать про серйозні метаболічні порушення, які викликаються досліджуваними детергентами. Ці порушення можуть стосуватися процесів протеосинтезу, біоенергетичного забезпечення обміну речовин, синтезу біологічно активних сполук та ін.

Зниження вмісту амінокислот у плазмі може бути результатом зміни проникності біомембран тканин, підсилення процесів утилізації амінокислот як енергетичних джерел. Підвищення вмісту цистеїнової кислоти можна розглядати як захисно-пристосувальну реакцію на ушкоджуючу дію перекисів, гідроперекисів, вільних радикалів, що є продуктами процесів ПОЛ, яке інтенсифікується під впливом досліджуваних детергентів. Підвищення вмісту аланіну, однієї з транспортних форм аміаку, є свідоцтвом підсилення катаболічних перетворень амінокислот у тканинах. Разом з тим зменшення рівня сечовини в плазмі може свідчити про порушення детоксикаційної функції печінки й реабсорбційних властивостей ниркових канальців.

Результати дослідження впливу ПАР на мембрани й мембранні процеси дозволили зробити висновок про мембранотоксичний характер дії синтетичних детергентів.

Дослідження стану біоенергетичних й інших окислювально-відновних процесів давало змогу надалі схарактеризувати структурно-метаболічні зміни у тварин під впливом різних класів поверхнево-активних речовин. Видлення СО2 дослджували у тварин, токсикованих представниками рзних груп ПАР (1/100 ДЛ50), на 20, 40 й 60 добу експерименту. Динамка видлення СО2 тваринами, що знаходилися під впливом неоногенних ПАР – азотовмісних імідазолінів та неонолів, характеризувалася збльшенням показника порвняно з контролем у середньому на 8% та 28% вдповдно на 20 добу, та на 22% й 48% - на 40 добу. Видлення СО2 на 60 добу тваринами, що одержували неоногенні ПАР, знижувалося порвняно з контрольними тваринами на 38% при введенні