ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА

ПРОЦЬ

ІВАННА ОМЕЛЯНІВНА

УДК 577.35:593.711

РОЛЬ ГЛЮТАМАТНИХ ТА ГАМК-РЕЦЕПТОРІВ У ГЕНЕРАЦІЇ

ЕЛЕКТРИЧНОЇ АКТИВНОСТІ КЛІТИН HYDRA OLIGACTIS PALLAS

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біофізики та математичних методів у біології

Львівського національного університету імені Івана Франка

Науковий керівник: кандидат біологічних наук

Санагурський Дмитро Іванович,

Львівський національний університет

імені Івана Франка Міністерства освіти і науки

України, завідувач кафедри біофізики та

математичних методів у біології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор,

академік НАН України

Шуба Михайло Федорович,

Інститут фізіології імені О.О.Богомольця

НАН України, завідувач відділу нервово-м’язової

фізіології

доктор біологічних наук, професор

Зима Валентин Леонідович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка Міністерства освіти

і науки України, професор кафедри біофізики

Провідна установа: Харківський національний університет імені

В.Н.Каразіна Міністерства освіти і науки

України, м.Харків

Захист відбудеться “5” липня 2001 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського, 4, біологічний факультет Львівського національного університету імені Івана Франка, аудиторія № 333.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою:

79005, м.Львів, вул.Драгоманова, 17.

Авторефрат розісланий “31” травня 2001 р.

В.о. Вченого секретаря спеціалізованої

вченої ради, кандидат біологічних наук М.Б. Градюк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Використання методу внутрішньоклітинного відведення за допомогою скляних мікроелектродів дозволило дослідити електричну активність епітеліально-м’язових клітин ектодерми Hydra oligactis Pallas на цілісному організмі. Показано, що для цих клітин характерна електрична активність у вигляді періодичної генерації поодиноких потенціалів дії (ПД) та пачкової електричної активності (ПЕА) (Тизьо, Гойда, 1995; 1996; Тизьо, 1998). Встановлено також, що генерація ПД епітеліально-м’язовими клітинами відбувається за принципом “все або нічого” (Campball, 1976; Tyzio, Goida, 1996). Рядом авторів (Passano, McCullough, 1964; Robson, 1971; Жуков, 1974) показано, що м’язовий апарат у кишковопорожнинних активується сіткою нервових клітин. При цьому періодична спонтанна активність клітин виникає на основі пейсмекерного механізму.

Проте, дані про активність клітин гідри, яка регулюється нервовими клітинами, залишаються фрагментарними (Itayama, Sawada, 1995). Роль дифузної нервової системи у генерації електричної активності клітинами ектодерми гідри і, зокрема, взаємодія клітин на синаптичному рівні з епітеліально-м’язовими клітинами взагалі не досліджена. Наявність контактів між нервовими клітинами була доведена лише за допомогою електронно-мікроскопічних та біохімічних досліджень (Westfall et al., 1991; Koizumi et al., 1991; 1992).

У зв’язку з цим, отримання доказів існування ГАМК- та глютаматних рецепторів електрофізіологічними методами є актуальним для з’ясування ролі цих рецепторів у генерації ПЕА епітеліально-м’язовими клітинами ектодерми прісноводної гідри.

Дана робота розширює уявлення про механізми передачі збудження з нервових на епітеліально-м’язові клітини в ектодермі прісноводної гідри, що має значення для розвитку фундаментальних знань в галузі біофізики та фізіології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках науково-дослідної теми “Закономірності та тенденції розвитку гідробіоценозів антро-пофікованих водойм Західного регіону України і їх біологічний моніторинг”, № держреєстрації 0197U018079 (здобувачем проведено дослідження біоелектричних характеристик мембранозв’язаних процесів прісноводної гідри при альтерації Pb2+, Hg2+, Mg2+; Розділ БФ-711Б).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є виявлення ГАМК- та глютаматних рецепторів in vivo, та з’ясування їх ролі у генерації електричної активності епітеліально-м'язовими клітинами ектодерми гідри. Для досягнення поставленої мети у роботі вирішували такі завдання:

1. Аналіз динаміки електричних параметрів клітин ектодерми гідри за умов контролю.

2. Електрофізіологічне дослідження наявності ГАМК- та глютаматних рецепторів у клітинах ектодерми прісноводної гідри.

3. Виявлення існування щільних контактів між клітинами Hydra oligactis Pallas методом електронної мікроскопії.

4. З’ясування ролі ГАМК- та глютаматних рецепторів у генерації та регуляції ПЕА клітинами ектодерми прісноводної гідри.

5. Дослідження електричної активності клітин ектодерми Hydra oligactis P. під впливом катіонів свинцю, ртуті та магнію.

Об’єкт дослідження. Клітини ектодерми гідри.

Предмет дослідження. Роль глютаматних та ГАМК-рецепторів в генерації ПЕА клітинами ектодерми гідри.

Методи дослідження. Для досягнення мети використано електрофізіологічні, електронно-мікроскопічні та статистичні методи досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. За допомогою методу внутрішньоклітинного відведення МП, вперше одержано електрофізіологічні докази наявності ГАМК- та глютаматних рецепторів на плазматичній мембрані епітеліально-м’язових клітин ектодерми прісноводної гідри. З’ясовано, що бікукулін, конкурентний антагоніст ГАМК- рецепторів, спричинює розлад ПЕА і призводить до збільшення амплітуди ПД. Встановлено, що дія конкурентного антагоніста, N-метил-D-аспартат (NMDA)-рецепторів D-2-аміно-5-фосфонопентанат (Dl-APV), зумовлює часткове блокування генерації ПД; конкурентний антагоніст 6-ціано-мітроквіноксалін-2,3-діон (CNQX) -аміно-3-гідрокси-5-метил-4-ізоксалон-пропіонат (AMPA)-рецепторів, викликає повне блокування генерації ПД, з його наступною генерацією після відмивання. Проведено аналіз динаміки електричних параметрів клітин ектодерми гідри за умов культурального середовища та під дією Pb2+, Hg2+ та Mg 2+. Показано, що ПД клітин ектодерми гідри генеруються за участю катіонів Na+ ; транспорт іонів Ca+ 2 опосередковано діє на параметри ПЕА; формування фази реполяризації ПД, а також слідова післяпачкова гіперполяризація пов’язані з активацією К+ провідності плазматичної мембрани з клітин. З’ясовано, що катіони Pb2+ і Hg 2+ інгібують спонтанну електричну активність клітин ектодерми, що пов’язано із здатністю даних катіонів порушувати роботу Na+- K+ помпи. Під дією катіонів Mg2+ відбувається гіперполяризація мембрани та збільшення амплітуди ПД.

Науково-практичне значення роботи. Одержані результати мають значення для розвитку уявлень про передачу збудження через щільні контакти між нервовими та епітеліальними клітинами кишковопорожнинних та поглиблюють фундаментальні знання про явища генерації електричної активності клітин, характерні зміни під дією катіонів Pb2+, Hg2+ та Mg 2+. Дані результати використовуються у загальному курсі біофізики, спецкурсах з біофізики мембран, загальному курсі із зоології безхребетних у Львівському національному університеті імені Івана Франка, а також для токсикологічної оцінки біологічно активних речовин у лабораторіях фармакологічних та токсикологічних досліджень Державного науково-дослідного контрольного інституту ветпрепаратів та кормових добавок.

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні всього обсягу експериментальної частини дисертації, статистичній обробці одержаних результатів, підборі та обробці даних літератури, у формуванні основних висновків роботи та підготовці до друку публікацій за матеріалами дисертації.

У плануванні напрямку досліджень, аналізі та інтерпретації одержаних результатів та у формуванні висновків брали участь науковий керівник, консультанти та співавтори публікацій. У проведенні електронно-мікроскопічних досліджень брав участь старший науковий співробітник к.б.н. Кулачковський О.Р.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що внесені до дисертації доповідали на: щорічних наукових конференціях Львівського національного університету імені Івана Франка (1996-2001 р.р.), на 2-му з’їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998 р.) та на розширеному засіданні кафедри біофізики та ММБ у жовтні 2000 р.

Публікації. Результати дисертаційної роботи висвітлені у 3 статтях, опублікованих у наукових фахових виданнях, та тезах наукового з’їзду.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку літератури із 197 використаних джерел. Робота викладена на 114 сторінках, містить: 5 таблиць, 28 рисунків, 3 фотографії.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводили на епітеліально-м’язових клітинах ектодерми прісноводної гідри Hydra oligactis Pallas (тип Hydrozoa, ряд Hydrida, рід Hydra). Гідру культивували в акваріумі при температурі середовища 18-20 С. Для роботи відбирали дорослих особин віком до 7 днів.

Культуральне середовище містило (ммоль/л): NaСІ - 30, КС1 - 1,0, СаСІ2 - 1,5, MgС12 - 0,25, NaНСО3 - 1,0, ЕДТА - 0,25 (Loomis, Lenhoff,1976; Kass-Simon, Diesl, 1977).

Мембранний потенціал спокою (МПС) та спонтанну електричну активність відводили за допомогою скляних мікроелектродів з опором 10 2 МОм (Костюк, 1960; Первис, 1983), виготовлених із стандартних заготовок Clark Electromedical Instruments, реєстрували та опрацьовували з використанням програмно-комп’ютерного комплексу на базі ПК ІВМ 486DX з аналого-цифровим перетворювачем.

При дослідженні наявності та ролі ГАМК- і глютаматних рецепторів у регуляції електричної активності епітеліально-м'язових клітин прісноводної гідри були використані: блокатор NMDA-рецепторів – D-2-аміно-5-фосфонопентанату (Dl-APV) у концентрації 5, 10, 15 мкмоль/л, блокатор AMPA-рецептоів – 6-ціано-мітроквіноксалін-2,3-діон (CNQX) (5, 10, 15 мкмоль/л) та блокатор ГАМК-рецепторів бікукулін (5, 10, 15 мкмоль/л).

Електронно-мікроскопічні дослідження, перегляд та фотографування зразків проводили за допомогою електронного трансмісійного мікроскопа ПЕМ–100. Фіксацію зразків для електронно-мікроскопічних досліджень здійснювали за загальноприйнятими методиками (Luft, 1961; Reynolds, 1963).

При дослідженні зміни електричної активності під дією різних концентрацій катіонів свинцю, ртуті та магнію, до середовища додавали певну кількість 0.5 М розчину відповідної солі.

Отримані результати піддавали варіаційно-статистичній обробці, достовірність різниці порівнювальних показників встановлювали за допомогою критерія Стьюдента. Обробку результатів здійснювали на ПЕОМ ІВМ DX386 з використанням програмного забезпечення MathCAD, StatGRAPH та програмного пакету для персональних компьютерів Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Аналіз динаміки електричних параметрів клітин ектодерми за умов контролю. Показано, що специфічна електрична активність виникає при скороченні епітеліально-м'язових клітин ектодерми гідри і полягає у періодичній генерації спонтанних короткотривалих деполяризацій (відносно величини потенціалу спокою), які мають ритмічний характер. Під час ПЕА при значеннях МПС більш від’ємних, ніж -38 мВ, відбувалась деполяризація мембрани (рис.1), а при менш від’ємних - така деполяризація не виникала (рис.2). потенціалу спокою –40 мВ. Крапкою відмічено середнє значення потенціалу спокою

Мембранний потенціал спокою клітин ектодерми гідри складав в середньому -37 мВ (n=20). Перед початком пачки відбувалась деполяризація мембрани в межах 2-3 мВ. Пауза між сусідніми пачками тривала 150 ± 0,3 с. Тривалість окремої пачки станови-ла 25-35 с. В кінці пачки часто виникала незначна гіперполяризація (на 3-5 мВ) мембрани відносно величини МПС, яка переходила у повільну деполяризацію протягом міжпачкового інтервалу. Період спокою між пачками імпульсів становив 100 ± 5 с (n=15.). Серії складались в основному з 7-10 спайків (рис.3).

Незначна кількість електричної активності виявлялася у вигляді поодиноких ПД.

Таким чином, проведений нами аналіз електричної активності клітин ектодерми прісноводної гідри за умов нормального культурального середовища показав, що ця активність проявляється у вигляді скорочень епітеліально-м'язових клітин ектодерми Нуdга о1іgactis і має ступінчасту динаміку. За електричними параметрами це явище було охарактеризоване як спонтанно активована спайкова електрична активність (Тизьо, 1998).

На підставі проведеного аналізу змін параметрів ПЕА, де при різних концентраціях катіонів Na+, Ca2+, K+ використано специфічні блокатори іонних каналів даних катіонів, можна зробити висновок про те, що ПД клітин ектодерми генеруються за участю катіонів Na+; транспорт катіонів Ca2+ спричинює опосередковану дію на параметри ПЕА; формування фази реполяризації ПД, а також слідова післяпачкова гіперполяризація пов’язані з активацією калієвої провідності плазматичної мембрани клітин ектодерми.

Відомо, що для клітин ектодерми кишковопорожнинних характерна епітеліальна електрична провідність, яка координується завдяки нервовим клітинам (Itajama, Sawada, 1995). Використовуючи мікроелектродну техніку та метод петч-клемп показано, що нервові клітини Hydra atenuata, яким властивий від’ємний мембранний потенціал спокою (Hassel, Leitz, Miller, 1996), здатні спонтанно генерувати серії ПД (Koizumi et al., 1992). Оскільки невідомо, як ця активність передається на епітеліально-м’язові клітини ектодерми, доцільно було дослідити наявність ГАМК- та глютаматних рецепторів на епітеліально-м’язових клітинах ектодерми прісноводної гідри і з’ясувати роль цих рецепторів у нервовій регуляції ПЕА цих клітин ектодерми Hydra oligactis.

2. Функціональні дослідження для підтвердження наявності ГАМК-рецепторів на епітеліально-м’язових клітинах ектодерми Hydra oligactis Pallas. Вивчали вплив бікукуліну – блокатора ГАМКА-рецепторів, на зміну електричної активності клітин гідри, початково фіксуючи контроль серій пачкової електричної активності (n=7), при якому МПС становив –35,7 2 мВ, амплітуда ПД 19,4 0,5 мВ, кількість ПД в середньому становила 7 в пачці, а тривалість пачки 35 с, міжпачковий інтервал тривав 140 0,3 с. Як виявилось, дія на клітини гідри бікукуліну (5 мкмоль/л), призводила до значних змін перебігу спонтанної електричної активності. Протягом 10 хв від початку дії бікукуліну спостерігалась деполяризація мембрани від –39 0,2 до -32 0,4 мВ. Амплітуда ПД зростала від 18,8 0,3 до 28 0,2 мВ. Далі наставав розлад пачкової активності та відбувалась генерація, в основному, поодиноких ПД з частотою 7 на хв. Оскільки при такій дії бікукуліну МПС зменшувався на 7 мВ, можна припустити, що нервова система через ГАМКА-рецептори має тонічний гальмуючий і гіперполяризуючий вплив на епітеліально-м'язові клітини.

Звертає на себе увагу відсутність фази спокою між пачками ПД, яка становила у контролі 140 ± 0,3 с, що може бути наслідком блокування гальмівної або регулюючої дії ГАМКА-рецепторів на генерацію ПЕА епітеліально м’язовими клітинами гідри.

Дія бікукуліну в концентрації 10 мкмоль/л спричинювала розлад ПЕА та збільшувала амплітуду ПД. Спостерігалась деполяризація мембрани від -37 ± 0,2 до -25 ± 0,4 мВ, амплітуда ПД сягала від 19.5 ± 0,2 до 35 ± 0,3 мВ. Слід відзначити, що при цій дії бікукуліну зростала рухова активність гідри. Такий ефект дії бікукуліну можна усунути шляхом відмивання протягом 35 хв. Через 20 хвилин після початку відмивання бікукуліну спостерігалось відновлення ПЕА, кількість ПД при цьому зменшувалась у порівнянні з контролем. Через 30-35 хв наступало повне відновленя ПЕА.

Характерні зміни параметрів ПЕА спостерігались при дії бікукуліну в концентрації 15 мкмоль/л (рис.4). Через 5 хв від початку впливу бікукуліну було відмічене значне зростання

амплітуди ПД від 19,1 ± 0,2 до 39 ± 0,3 мВ та відсутність міжпачкового інтервалу. Нормальна пачкова електрична активність клітин з'являлась через 30-35 хв після їх відмивання.

Таким чином, оскільки аплікація бікукуліну спричинює розлад ПЕА та збільшує амплітуду ПД, можна стверджувати про наявність ГАМК-рецепторів, які відповідають за процеси гальмування електричної активності, на зовнішній поверхні плазматичної мембрани клітин ектодерми прісноводної гідри.

3. Зміна електричної активності клітин ектодерми гідри при дії конкурентних антагоністів глютаматних рецепторів. Метою проведення наступної серії досліджень було виявлення глютаматних рецепторів на поверхні мембрани епітеліально-м’язових клітин ектодерми Hydra oligactis Pallas з використанням їхніх специфічних блокаторів. Для виявлення глютаматних рецепторів in vivo у клітинах прісноводної гідри використали специфічний блокатор NMDA-рецепторів - Dl-АРV у концентраціях 5, 10 та 15 мкмоль/л та блокатор АМРА-рецепторів - CNQX у концентраціях 5, 10 та 15 мкмоль/л.

Дія блокатора CNQX у концентрації 5 мкмоль/л призводить до поступового припинення генерації пачкової електричної активності. МПС при цьому не зазнавав істотних змін. Повільні коливання МПС, які у контролі супроводжують ПЕА, також були від-сутніми під дією даної концентрації СNQХ. Однак, спостерігались поодинокі ПД з амплітудою 9,2 ± 0,4 мВ. Відновлення ПЕА з контрольними параметрами відбувалось через 25 хв від початку відмивання. CNQX у концентрації 10 мкмоль/л спричинює блокування генерації потенціалів дії повністю (рис.5).

Під час дії даного блокатора на клітини гідри рухова активність об'єкту досліджень суттєво не змінювалась. Пачкова електрична активність відновлювалась після відмивання через 20 хв. Під час відмивання спостерігалось зменшення кількості ПД від 7 до 4,1. При збільшенні концентрації CNQX до 15 мкмоль/л через 2 хв після введення розчину спостерігали миттєве зникнення пачкової електричної активності. Генерація ПД з'являлась через 30 хв після відмивання.

Отже, блокування ПЕА під дією CNQX дозволяє зробити припущення про наявність функціональних глютаматних рецепторів типу АМРА у системі, що генерує збудження епітеліально-м'язових клітин гідри. Повне припинення генерації ПД під впливом CNQX вказує на те, що активація АМРА-рецепторів на клітинах гідри є необхідною умовою виникнення та проведення збудження між епітеліально-м'язовими клітинами гідри.

Дія Dl-АРV у концентрації 5 та 10 мкмоль/л частково блокувала генерацію ПД (рис.6), однак, спостерігалась серія поодиноких ПД з амплітудою 16 ± 0,3 мВ. Відновлення нормальної пачкової електричної активності після початку відмивання відбувалось протягом 20 хв. Вплив Dl-АРV у концентрації 15 мкмоль/л, а також спільна дія з блокатором АМРА-рецепторів СNQX призводить до повного блокування генерації потенціалів дії з наступним відновленням після відмивання.

Проведені нами дослідження дозволяють стверджувати про наявність глютаматних рецепторів на поверхневій мембрані епітеліально-м’язових клітин прісноводної гідри. Отже, АМРА- та NMDA-рецептори гідри можуть брати участь у процесах збудження. Причому, NMDA-рецептори гідри у меншій мірі відіграють роль при процесах збудження.

4. Електронно-мікроскопічне підтвердження наявності синаптичних контактів між епітеліально-м’язовою та нервовою клітинами прісноводної гідри. Клітини гідри фіксували зразки в 1,5% розчині глютарового альдегіду приготованому в 0,2 М розчині кокадилату Na+ (pH=7,2) на протязі 2 год при температурі 4? С. Постфіксацію проводили в 2% розчині OsO4 на цьому ж буфері протягом двох годин. Зразки обезводнювали в зростаючих концентраціях етилового спирту і поміщали в епоксидну смолу Epon – 812 (Luft, 1961). Зрізи готували на ультрамікротомі УМТП–6 при допомозі алмазного ножа; контрастували солями свинцю по Рейнольдсу (1963). При перегляді та фотографуванні зразків були отримані зображення синаптичного контакту між закінченням нервової клітини та м’язовим волоконцем епітеліально-м’язової клітини.

Таким чином, можна припустити, що ГАМК- та глютаматні рецептори розміщені на постсинаптичній мембрані епітеліальних клітин гідри нервова система яких модулює та регулює електричну активність, а отже і скорочення епітеліально-м’язових клітин гідри, про що свідчать результати виконаних електронно-мікроскопічних досліджень.

5. Дія катіонів Мg2+ на електричну активність епітеліально-м'язових клітин ектодерми гідри. Відомо, що катіони Мg2+ відігріють важливу регуляторну функцію в живих системах, є антагоністами катіонів Ca2+, активаторами ряду ферментативних систем і, одночасно, їхніми інгібіторами, є активаторами ацетилхолінестерази (Tompson et al., 1980). Тому важливим було вивчити вплив магнію, що дозволило б краще оцінити механізми, які лежать в основі електричної активності клітин гідри.

При дії катіонів магнію в концентрації 1,6 ммоль/л спостерігалась слабка гіперполяризація мембрани (від -38,4 ± 0,5 до -42,1 ± 0,3 мВ) та збільшення амплітуди ПД на 50% (рис.7; рис.8). Тривалість міжпачкового інтервалу збільшувалась від 150 до 285 с. Кількість ПД та тривалість пачки зменшувались на 50%, і, таким чином, відбувалось пригнічення спонтанної електричної активності. При заміні культурального розчину на середовище з концентрацією катіонів Мg2+ 2,5 ммоль/л депресивний стан генерації електричної активності тривав 25-30 хв. Протягом цього періоду гіперполяризація мембрани зростала від -39,3 ± 0,4 до -51,7 ± 0,8 мВ. Спостерігалось збільшення амплітуди ПД на 100% порівняно з контролем, та зростала тривалість міжпачкового інтервалу (від 160 до 320 с). Кількість ПД та тривалість пачки зменшувалась на 65%.

Можливо, катіони Мg2+, блокуючи вхід катіонів Ca2+ в пресинаптичних нервових закінченнях, пригнічують виділення медіаторів ГАМК та глютамату і таким чином впливають на характер спонтанної активності клітин ектодерми.

6. Дія катіонів Рb2+ та Нg2+ на електричну активність епітеліально-м'язових клітин прісноводної гідри. Відомо, що свинець змінює проникність мембран, блокуючи активність транспортних систем (Venugopal et al., 1978). Крім того, зв’язуючись з карбоксильними, фосфатними та сульфгідрильними групами мембран, він збільщує їх жорсткість, одночасно блокуючи канали (Lasser et al., 1973). Особливо чутливими до негативних впливів свинцю є нейрони центральної та периферійної нервової системи (Ершов, Плетнёва, 1989). Катіони ртуті теж мають інгібуючий вплив і здатні утворювати стійкі комплекси з біологічно-важливими молекулами, наприклад, білками, інгібуючи їх активність (Mel, Reed, 1981), та змінюючи Na+- Ca 2+- обмін (Манько, 1998). Тому було важливим дослідити їх вплив на зміну електричної активності клітин ектодерми гідри у різних концентраціях, що в кінцевому рахунку дозволило б розширити знання про механізми збудливих процесів, які тут протікають.

Встановлено, що катіони свинцю в концентрації 0,1 ммоль/л спричинюють незначну деполяризацію мембрани (від -37,5 ± 0,5 до -35,3 ± 0,8 мВ), кількість ПД в пачках зменшувалась на 10%, тривалість міжпачкового інтервалу збільшувалась від 150 до 300 с. Однак найбільш вираженою була дія свинцю на амплітуду ПД, яка зменшувалась від 19,4 ± 0,7 до 5,3 ± 0,3 мВ. Під впливом іонів свинцю в концентрації 2,5 ммоль/л спостерігалась деполяризація мембрани від -37,5 ± 0,5 до -24,9 ± 0,8 мВ кількість ПД в пачках зменшувалась на 19,5%, тривалість міжпачкового інтервалу збільшувалась на 100% порівняно з контролем, а амплітуда ПД зменшувалась від 15,6 до 6,4 мВ (рис.8).

Застосування катіонів ртуті в концентрації 0,001 ммоль/л спричиняло тривалий (15-25 хв) депресивний вплив на генерацію електричної активності. Протягом цього періоду спостерігалась стійка деполяризація мембрани від -38,7 ± 0,5 до -23,3 ± 1,1 мВ. Генерація ПД протягом цього періоду зменшувалась. Даний ефект спостерігався при використанні концентрацій від 0,1 ммоль/л - деполяризація мембрани сягала від -38,1 ± 0,5 до -16,1 ± 1,2 мВ. Кількість ПД зменшувалась на 20%, а тривалість міжпачкового інтервалу збільшувалась - від 150 до 360 с. Найбільш вираженими були зміни параметрів пачкової активності, які виникали при дії катіонів Hg2+ в концентрації 2,5 ммоль/л. Спос-терігалась значна деполяризація мембрани (від -38,0 ± 0,5 до -5,3 ± 0.3 мВ) та зменшення амплітуди ПД (від 22,5 до 7,0 мВ). Тривалість міжпачкового інтервалу зменшувалась на 70% порівняно з контролем. Несуттєво змінювались такі параметри, як тривалість пачки (від 30 до 25 мс) та кількість ПД (від 6 до 5) (таб.1).

Таблиця 1

Зміни параметрів пачкової електричної активності клітин ектодерми гідри під дією катіонів Мg 2+, Нg2+ та РЬ2+ (M ± m)

Умови | Мембранний потенціал, | Амплітуда потенціалу | Кількість потенціалів | Тривалість пачки, | Тривалість міжпачкового | мВ | дії, мВ | дії у пачці | с | інтервалу, с | Контроль | -37,5 0,4 | 21,4 0,9 | 6,0 2 | 30 0,5 | 150 0,3

1,6 м М Мg2+ | -42,1 0,3* | 34,8 0,8* | 4,0 2 * | 20 0,4 | 210 0,3

2,5 мМ Мg2+ | -51,7 0,3* | 45,1 0,4* | 4,0 1 * | 25 0,5 | 320 0,8 | 0,001мМ Hg2+ | -23,3 1,1 * | 14,8 0,5 * | 5,0 1 * | 15 0,2 | 230 0,2

0,1 мМ Hg2+ | -16,1 1,2 ? | 6,5 0,5 * | 3,0 2 ? | 10 0,4 ? | 360 0,2? | 2,5 мМ Hg2+ | -5,3 0,3 ¦ | 7,0 2,0 ¦ | 5,0 1 * | 25 0,4 | 55 0,3 * | 0,1 мМ Pb2+ | -35,3 0,8 ¦ | 7,3 1,4 ? | 8,0 1 * | 50 0,7 ¦ | 300 0,4

2,5 мМ Pb2+ | -24,9 0,8 * | 6,4 1,4 ? | 7,0 2 * | 25 0,3 | 210 0,7 |

Примітки:

* - достовірність змін по відношенню до контролю з p < 0,05;

? - достовірність змін по відношенню до контролю з p < 0,01;

¦ - достовірність змін по відношенню до контролю з p < 0,001

Результати проведених досліджень вказують на інгібуючий характер впливу катіонів свинцю та ртуті на перебіг спонтанної електричної активності клітин ектодерми гідри. Дія катіонів магнію на електричну активність клітин ектодерми Hydra oligactis вказує на блокування нервово-м’язової передачі контакту, при якому епітеліально-м’язові клітини, очевидно, не збуджуються нервовими клітинами, які, в свою чергу, відповідають за поширення збудження по епітеліальних клітинах. Ці ефекти при дії Рb2+ та Нg2+ можуть бути пояснені, здатністю вказаних металів частково або повністю блокувати провідність натрієвих іонних каналів плазматичної мембрани клітин ектодерми, які беруть участь у генерації ПД. При цьому спостерігається чітка залежність ефекту від концентрацій катіонів у розчині.

Таким чином, отримані результати узгоджуються з даними літератури (Spenser, Schwab, 1980; Зигель, 1982; Филенко, 1988), згідно з якими катіони ртуті та свинцю спричинюють блокування спонтанної електричної активності епітеліально-м'язових клітин колоніального гідроїдного поліпа Согіорhога і викликають токсичне ушкодження при використанні їх у високих концентраціях, а дія катіонів магнію блокує синаптичну передачу у гідроїдів (Ball, Case, 1973; Spenser, 1975). В результаті цих досліджень встановлено концентрації даних катіонів у культуральному середовищі, що призводять до незворотніх змін, тобто викликають втрату рухової здатності і пошкодження клітин ектодерми.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

На даний час відомо, що електрична активність клітин гідри генерується в результаті контакту нервових та епітеліально-м’язових клітин (Westfall, et al., 1980; Nangia, Mookerjee, 1991; Roizumi et al., 1992; Minobe et al., 1995). Електрична активність нейронів є початковою ланкою, що призводить до вивільнення різних нейромедіаторів з нервових закінчень, які регулюють електричну і скорочувальну активність епітеліально-м’язових клітин. Присутність синаптичних контактів між даними клітинами була доведена лише за допомогою електронно-мікроскопічних досліджень та біохімічним шляхом (Westfall et al., 1978; 1991; Koizumi et al., 1990, 1991). У зв’язку з цим виникла необхідність дослідити існування ГАМК- та глютаматних рецепторів електрофізіологічними методами.

Нами одержано результати, які свідчать на користь наявності цих рецепторів на зовнішній поверхні плазматичної мембрани епітеліально-м’язових клітин гідри та вказують на їх роль у регуляції електричної активності цих клітин. Зміни електричної активності, які настають в результаті впливу бікукуліну – конкурентного антагоніста ГАМКА-рецепторів, та специфічних блокаторів глютаматних рецепторів – Dl-APV і CNQX, дозволили простежити події від активації рецептора до ролі іонтранспортних систем плазматичної мембрани клітин ектодерми гідри, яку показано на узагальнюючій схемі (рис. 9). Під впливом бікукуліну електрична активність генерувалась не у вигляді періодичних серій ПД (пачок), а безперервно. Це можна пояснити блокуванням гальмування та опосередкованою активацією ГАМК-рецепторів.

Таким чином, вперше були отримані електрофізіологічні докази наявності ГАМКА-рецепторів на постсинаптичній мембрані епітеліально-м’язових клітин гідри, що на підставі біохімічних досліджень, було припущено Конкасом та співавторами (1998). Про це також свідчать результати електронно-мікроскопічних досліджень, в яких отримано зображення синаптичного контакту між нервовою та епітеліально-м’язовою клітинами. Ми припускаємо, що ГАМК-рецептори можуть бути розміщені на нервових клітинах гідри, що може вказувати на наявність синаптичних контактів між нервовими клітинами гідри.

AMPAR – рецептори б-?міно-3-гідрокси-5-метил-4-ізоксалон пропіонату;

NMDAR – рецептори N-метил-D-аспартату

Під впливом конкурентного антагоніста NMDA-рецепторів Dl-APV (10 мкмоль/л) виявлено припинення генерації ПД, яке тривало протягом всього часу аплікації антагоніста. Це вказує на опосередковану участь NMDA-рецепторів в регуляції пачкової електричної активності клітин гідри. Отже, крім ГАМК-рецепторів ми припускаємо наявність у клітинах ектодерми гідри NMDA-рецепторів, які у ЦНС вищих тварин беруть участь у генерації збудження синаптичного потенціалу. Дані літератури даних про наявність глютаматних рецепторів у даного організму відсутні.

Важливо, що більш виражений гальмівний ефект на ПЕА виявлений під впливом конкурентного антагоніста AMPA-рецепторів – CNQX. Таким чином, нервова система гідри включає в себе як збуджуючі, так і гальмівні синаптичні механізми регуляції електричної активності епітеліально-м’язових клітин.

Наслідки впливу катіонів свинцю та ртуті вказують на їх інгібуючу дію на спонтанну електричну активність епітеліально-м’язових клітин ектодерми гідри. Дія катіонів магнію на електричну активність клітин ектодерми Hydra oligactis свідчить про блокування нервово-м’язової синаптичної передачі. Епітеліально-м’язові клітини, очевидно, при цьому не збуджуються і не гальмуються нервовими клітинами, які, в свою чергу, відповідають за поширення збудження в епітеліальних клітинах. Ефекти при дії РЬ2+ та Нg2+ можуть бути пояснені, здатністю цих металів частково або повністю блокувати провідність натрієвих іонних каналів плазматичної мембрани клітин ектодерми, які беруть участь у генерації ПД.

ВИСНОВКИ

У дисертації відповідно до поставленої мети та задач дослідження вперше отримано експериментальні дані про наявність ГАМКА- та глютаматних рецепторів в постсинаптичній мембрані епітеліально-м’язових клітин ектодерми прісноводної гідри. Ці рецептори можуть відповідати за процеси збудження та гальмування даних клітин.

1. Використання внутрішньоклітинного відведення за допомогою скляних мікроелектродів, дозволило проаналізувати динаміку електричної активності клітин ектодерми прісноводної гідри.

2. Отримано електронно-мікроскопічні докази існування синаптичних контактів між нервовими та епітеліально-м’язовими клітинами гідри.

3. Виявлені ГАМКА-рецептори на постсинаптичній мембрані епітеліально-м’язових клітин ектодерми гідри. Показано, що аплікація бікукуліну спричинює розлад ПЕА епітеліально-м’язових клітин ектодерми гідри та призводить до збільшення амплітуди ПД епітеліально-м’язових клітин гідри.

4. Виявлені AMPA- та NMDA- рецептори, в мембрані епітеліально-м’язових клітин гідри. Вони відповідають за процеси збудження цих клітин. З’ясовано, що CNQX спричинює повне блокування генерації ПД епітеліально-м’язових клітин повністю, а Dl-APV – часткове. Отже, в мембрані епітеліально-м’язових клітин переважають AMPA-рецептори.

5. Катіони Pb2+ та Hg2+ інгібують спонтанну електричну активність клітин ектодерми гідри. Таке пригнічення, очевидно, пов’язане із здатністю катіонів даних металів порушувати Na+ і K+ провідність та роботу іонної помпи плазматичної мембрани, що беруть участь у генерації ПД.

6. Встановлено, що катіони Mg2+ викликають гіперполяризацію мембрани і пригнічення спонтанної електричної активності.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Тизьо Р.В., Санагурський Д.І., Проць І.О., Баштовий Д.Ю. Зміни параметрів електричної активності клітин екто-дерми прісноводної гідри під впливом інгібіторів іонтранспортних систем // Експериментальна та клінічна фізіологія та біохімія.- Львів,1998 р.- N-2.- С. 8-9.

2. Проць І.О. Зміни електрофізіологічних параметрів клі-тин ектодерми Hydra oligactis Pallas при інгібуючій дії катіонів свинцю, ртуті та магнію // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної ме-дицини їм.С.З.Гжицького. - Львів, 1999 р.- Том 1(N-4).-С.46-51.

3. Проць І.О., Тизьо Р.В., Санагурський Д.І. Роль глютаматних та ГАМК- рецепторів у регуляції електричної актив-ності епітеліально-м'язових клітин Нуdга oligactis Pallas // Біофізичний вісник.- Харків, 2000 р.- № 488., випуск 1(6), С. 82-84

4 Санагурський Д.І., Тизьо Р.В., Проць І.0., Башто-вий Д.Ю., Демчук В.Л. Генерація спонтанної електрич-ної активності клітинами ектодерми прісноводної гід-ри. // Тези доповідей II з'їзду Українського біофізичного товариства, 29 червня – 3 липня 1998 р., м.Харків. - Харків, 1998. С. 73.

АНОТАЦІЯ

Проць І.О. Роль глютаматних та ГАМК-рецепторів в генерації електричної активності клітин Hydra oligactis Pallas. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів, 2001.

У роботі проведено аналіз динаміки електричних параметрів клітин ектодерми прісноводної гідри в умовах контролю та під дією катіонів металів. Отримано електрофізіологічні докази наявності ГАМК- та глютаматних рецепторів на постсинаптичній мембрані епітеліально-м’язових клітин ектодерми Hydra oligactis P. Виявлено, що ГАМК-рецептори гідри приймають участь у гальмуванні електричної активності епітеліально-м’язових клітин ектодерми Hydra oligactis Pallas. Показано, що аплікація бікукуліну спричинює розлад ПЕА епітеліально-м’язових клітин ектодерми гідри та призводить до збільшення амплітуди ПД епітеліально-м’язових клітин гідри. Встановлено, що AMPA- та NMDA-рецептори беруть участь у процесах збудження епітеліально-м’язових клітин, де переважають AMPA-рецептори. Виявлено, що катіони Pb2+ та Hg2+ спричинюють інгібуючу дію на спонтанну електричну активність клітин ектодерми гідри.

Ключові слова: прісноводна гідра, мікроелектродна техніка, глютаматні рецептори, ГАМК-рецептори, електрична активність, потенціал дії.

АННОТАЦИЯ

Проць И.О. Роль глютаматных и ГАМК-рецепторов в генерации активности клеток Hydra oligactis Pallas. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. Львовский национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2001.

Диссертация изучает актуальный вопрос современной биофизики – происходи ли активация эпителиально-мышечных клеток с помощью нервных клеток и каким образом возникает регулирование этого процесса у низших кишечнополых. Для изучения этой проблемы мы исследовали эпителиально-мышечные клетки эктодермы Hydra oligactis Pallas. В работе проведен анализ динамики эллектрических параметров клеток эктодермы гидры в условиях контроля и под воздействием катионов металлов. На основании электрофизиологических исследований получено подтверждения наличия ГАМК- и глютаматных рецепторов на эпителиально-мышечных клетках эктодермы Hydra oligactis Pallas. Изучено электрическую активность под воздействием бикукулина - блокатора ГАМК-рецепторов (5, 10, 15 мкмоль.л). Показано, что ГАМК-рецепторы гидры принимают участие в торможении электрической активности эпителиально-мышечных клеток эктодермы гидры. Также изучалось действие блокаторов NMDA-рецепторов - Dl-APV и блокаторов AMPA-рецепторов CNQX. Прекращение генерации пачковой электрической активности эпителиально-мышечных клеток эктодермы гидры под воздействием данных блокаторов (5, 10, 15 мкмоль.л) говорит о присутсвии функциональных глютаматных рецепторов, которые участвуют в процессах возбуждения. Показано действие ионов магния, которые блокируя вход катионов кальция в пресинаптические нервные окончания угнетают выделение медиаторов ГАМК и глютамата и таким образом влияют на характер спонтанной электрической активности клеток эктодермы. Результаты исследований под воздействием катионов Pb2+ и Hg2+ на електрическую активность клеток эктодермы гидры показали, что данные ионы частично или полностью блокируют натриевые и кальциевые ионные каналы, которые принимают участие в генерации ПД. Все вышеизложенное разрешает рассматривать механизмы передачи возбуждения с нервных клеток на эпителиально-мышечные клетки эктодермы Hydra oligactis Pallas в которых присутствуют ГАМК- и глютаматные рецепторы, принимающие участие в генерации ПЭА эпителиально-мышечными клетками эктодермы гидры.

Ключевые слова: гидра, микроэлектродная техника, глютаматные рецепторы, ГАМК-рецепторы, электрическая активность, потенциал действия

SUMMARY

Prots I.O. The role of Glutamate and GABA Receptors in the electrical activity generation of Hydra oligactis Pallas cells.- Manuscript-.

Thesis for receiving a degree of Candidate of Biological Sciences in the speciality 03.00.02 - Biophysics. - Ivan Franko National University of Lviv, Lviv, 2001.

Analysis of dynamics of electrical parameters of Hydra ectoderm cells the influence of heavy metals cations was carried out. Electrophysiological confirmation of presence of GABA and glutamate receptor on the postsynaptic membrane of epithelial-muscle cells of Hydra oligactis P. Ectoderm was achieved. The GABA receptors participate in the inhibition of electrical activity, while AMPA and NMDA - in excitation processes.

Key words: Hydra, microelectrode technique, Glutamate receptors, GABA receptors, electrical activity, action potential.

Підписано до друку 28.05.2001. Формат 60х90 1/16. Папір офсетний.

Друк офсетний. Обл.вид.арк. 0,9. Зам. 174. Тираж 100.

Виданичо-поліграфічний відділ ЛвЦНТЕІ.

79058, м.Львів, пр.В.Чорновола, 57