Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна

СОКОЛ ОКСАНА АНАТОЛІЇВНА

УДК 577.152.1:[546.492+546.732]

ТРИПТОФАН-2,3-ДІОКСИГЕНАЗна АКТИВНІСТЬ І ВМІСТ ЦитохромУ Р-450 В ПЕЧІНЦІ ЩУРІВ ПРИ ДІЇ
хлоридУ ртутІ ТА хлоридУ кобальтУ

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті
ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник

доктор біологічних наук, професор

Каліман Павло Авксентійович

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України, завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Чечоткін Олексій Васильович

Харківський зооветеринарний інститут Міністерства аграрної політики України, завідувач кафедри хімії та біохімії

доктор медичних наук, професор

Жуков Віктор Іванович

Харківський державний медичний університет Міністерства охорони здоров'я України, завідувач кафедри біохімії

Провідна установа

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна (відділ біохімії коферментів) НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “ 5 ” вересня 2001 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, , ауд. 3-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “ 5 ” липня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук,
старший науковий співробітник Падалко В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Встановлено, що іони важких металів, у тому числі іони ртуті та кобальту, здатні активувати процеси вільнорадикального окислення в організмі, що призводить до розвитку оксидативного стресу, а також спричиняти значні зміни в метаболізмі гему та гемопротеїнів [Maines M.D., 1984; Yang M., 1993; Byung P.V., 1994; Huang Y.L. et al., 1996; Hochachka P.W. et al., 1996]. Крім того, проблема біологічної дії ртуті та кобальту є предметом досліджень у зв'язку з використанням цих металів у промисловості, сільському господарстві, медицині, а також у зв'язку з надмірним накопиченням ртуті і кобальту та їх сполук у навколишньому середовищі [Трахтенберг И.М., Коршун М.Н., 1990; Кучерявий В.П., 2000]. Мікросомальний цитохром Р-450 являє собою численне сімейство гемопротеїнів, що беруть участь в оксидоредуктазних реакціях, спрямованих на модифікацію хімічних речовин як ендогенного, так і екзогенного походження Арчаков А.И., 1982. Цитохром Р-450 є основним споживачем гему в клітині. На цей гемопротеїн доводиться близько 60-70синтезованого de novo гему печінки [Muller-Eberhard U., Vincent S.H., 1985]. Встановлено, що при оксидативному стресі, викликаному важкими металами, вміст цитохрому Р-450 знижується, що може призводити до зміни швидкості метаболізму ксенобіотиків і цілої низки ендогенних субстратів, а також до вивільнення гему з цього гемопротеїна [Sinclair J.F. et al., 1982; Arizono K., 1991]. Непов'язана молекула гему має прооксидантні властивості, що зумовлює подальше посилення вільнорадикального окислення в організмі [Grinberg L.N. et al., 1999].

Зміна вмісту в клітинах печінки нативного гему призводить до істотної зміни активності триптофан-2,3-діоксигенази (КФ 1.13.11.11) [Sardana M.K., Drummond G.S., 1986]. Триптофан-2,3-діоксигеназа (ТДО) – головний фермент катаболізму L-триптофану через кінуренин [Badawy A.A.-B., 1984]. У печінці щурів ТДО існує у вигляді каталітично активного холоферменту (пов'язана з гемом форма) та неактивного апоферменту (не пов'язана з гемом форма), причому співвідношення між формами змінюється в залежності від рівня вільного гему в гепатоцитах [Ren S., Correia M.A., 2000]. Не зважаючи на велику кількість робіт, присвячених вивченню механізмів регуляції ТДО, вплив солей важких металів на активність даного ферменту залишається недостатньо вивченим. Беручи до уваги прооксидантний ефект вільного гему [Grinberg L.N. et al., 1999], практично не досліджена роль ТДО як білка, що зв'язує гем, в обмеженні токсичної дії вільного гему в клітинах печінки в умовах оксидативного стресу. Все ще залишається не вивченим взаємозв'язок між ТДО активністю та вмістом цитохрому Р-450 в умовах впливу на організм солей важких металів.

Таким чином, з'ясування основних механізмів токсичної дії солей ртуті та кобальту на головний компонент мікросомальної монооксигеназної системи – цитохром Р-450 та встановлення взаємозв'язку між ТДО активністю та насиченням ферменту гемом і вмістом цитохрому Р-450 в умовах оксидативного стресу має як теоретичне, так і практичне значення.

Зв'язок даної роботи з науковими програмами. Дисертаційне дослідження було частиною держбюджетної теми НДІ біології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна “Клітинні та молекулярні механізми адаптації метаболізму при окисному стресі” (НДР № ДР U008188).

Мета і задачі дослідження. Метою цієї роботи було з'ясування механізмів дії хлориду ртуті та хлориду кобальту на триптофан-2,3-діоксигеназну активність і вміст цитохрому Р-450 в печінці щурів, а також дослідження можливості запобігання або обмеження токсичної дії HgCl2 і CoCl2 шляхом попереднього введення тваринам -токоферолу, білірубіну або L-триптофану. У зв'язку з метою дослідження були поставлені такі задачі:

1. Вивчити вплив HgCl2 і CoCl2 на ТДО активність і насичення ферменту гемом, вміст цитохрому Р-450 в печінці, а також вміст продуктів гемолізу, гемопексина та гаптоглобина в сироватці крові щурів.

2. Беручи до уваги участь цАМФ-залежних процесів в деградації мікросомального цитохрому Р-450 [Jansson I. et al., 1999], з'ясувати роль b-адренорецепторів в реалізації ефектів HgCl2 на вміст мікросомальних цитохромів Р-450 і b5 в печінці щурів.

3. Враховуючи дані літератури про антиоксидантну дію -токоферолу та білірубіну [Neuzil J. et al, 1994], вивчити вплив HgCl2 і CoCl2 на ТДО активність і насичення ферменту гемом, вміст цитохрому Р-450 в печінці щурів в умовах введення -токоферолу або білірубіну за 2 год до впливу HgCl2 або CoCl2.

4.

5. Враховуючи дані літератури про прооксидантний ефект тетрамізолу [Загайко А.Л., 1999], вивчити вплив останнього на ТДО активність і насичення ферменту гемом і вміст цитохрому Р-450 в печінці щурів після введення тетрамізолу.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що HgCl2 надає більш виражену і тривалу гемолітичну дію, в порівнянні з CoCl2; введення HgCl2 призводить до зниження вмісту гемопексина та гаптоглобина в сироватці крові, тоді як при введенні CoCl2 ці показники не змінюються. Виявлений різноспрямований характер дії HgCl2 і CoCl2 на ТДО активність. Показано збільшення ТДО активності і насичення ферменту гемом при введенні HgCl2, тоді як вплив CoCl2 супроводжується зниженням ТДО активності і насичення ферменту гемом, що свідчить про різні механізми дії HgCl2 і CoCl2 на даний фермент. Вперше встановлено, що попереднє введення -токоферолу або білірубіну повністю перешкоджає гемолітичній дії CoCl2 і запобігає гемолізу тільки через добу після введення HgCl2. Показано, що зниження вмісту цитохрому Р-450 під дією HgCl2 і CoCl2 повністю запобігається внаслідок попереднього введення -токоферолу і частково запобігається попереднім введенням білірубіну. Вперше показано, що попереднє введення L-триптофану запобігає зниженню вмісту цитохрому Р-450, що викликається HgCl2, при введенні L-триптофану і CoCl2 вміст цитохрому Р-450 продовжує знижуватися. Введення L-триптофану запобігає зниженню ТДО активності і насичення ферменту гемом, що викликається CoCl2. Встановлено залежність вмісту цитохрому Р-450 від здатності фермента ТДО зв'язувати надлишок гему в гепатоцитах, що розширює уявлення про взаємозв'язок між цими гемопротеїнами.

Теоретичне та практичне значення роботи. Представлені в роботі дані поглиблюють відомості про механізми дії сублетальних доз HgCl2 і CoCl2 на ТДО активність і вміст цитохрому Р-450. Отримані в роботі результати свідчать про залежність ТДО активності та вмісту цитохрому Р-450 від накопичення в клітині вільного гему і здатності іонів металів утворювати металопорфіринові комплекси. Такі дані свідчать про різноспрямований характер ефектів, що надаються впливом HgCl2 і CoCl2 відносно ТДО активності і насичення ферменту гемом. Встановлено залежність вмісту цитохрому Р-450 від здатності ТДО зв'язувати надлишок гему в гепатоцитах, що значно розширює уявлення про взаємозв'язок між цими гемопротеїнами. Виявлено деякі можливі засоби обмеження або запобігання токсичної дії HgCl2 і CoCl2 на організм, а саме шляхом попереднього введення тваринам пропранололу, -токоферолу, білірубіну та L-триптофану.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження виконано під науковим керівництвом доктора біол. наук П.А. Калімана, в співробітництві з канд. біол. наук І.В. Нікітченко, з якими автор має спільні публікації. Усі наведені в рукописі результати отримані здобувачем самостійно. Дисертантом особисто проведено експерименти та визначення вибраних для дослідження показників. Результати експериментів обговорювалися дисертантом спільно з І.В. Нікітченко і П.А. Каліманом.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи докладалися на засіданнях кафедри біохімії Харківського університету протягом 1997–2000 років, на науковій конференції "Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии", С.-Петербург, 1998 р., на міжнародній конференції "I Львівсько-Люблінська конференція з експериментальної та клінічної біохімії", Львів, 2000 р., на науковій конференції "Наукова спадщина академіка І.М. Буланкіна та її розвиток в сучасній біології", Харків, 2001 р.

Публікація матеріалів. За матеріалами дисертації опубліковано 6 статей та 2 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, трьох розділів результатів досліджень та їх обговорення, заключення, висновків, списку літератури та додатків. Робота викладена на 161 сторінці машинописного тексту і містить 33 рисунки та 10 таблиць. 5 рисунків винесено на окремі сторінки. Список літератури містить 266 джерел та розташований на 26 сторінках. Додатки містять 7 таблиць.

ОСНОВНИй ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі роботи подано огляд літератури за темою дисертації. У другому розділі описано матеріали та основні методи дослідження.

ОБЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Постановка експерименту. У роботі використані щури обох статей лінії Wistar вагою 150-250 г, які вирощувалися у віварії Харківського університету. Об'єктом дослідження виступали печінка та сироватка крові тварин. Тварини були розділені на групи в залежності від задач експерименту. 1.Тварини (контроль), яким вводили відповідний об'єм фізіологічного розчину. 2.Тварини, яким внутрішньочеревинно вводили HgCl2 (0,1% розчин в 0,9% NaCl) в дозі 0,7 мг на 100 г маси тіла [Maines M.D., Kappas A., 1977] і брали в дослід через 2 год або 24 год після введення HgCl2. 3.Тварини, яким підшкірно вводили CoCl26H2O (0,6% розчин в 0,9% NaCl) в дозі 3 мг на 100 г маси тіла Калиман П.А., Беловецкая И.В., 1986 і брали в дослід через 2 год або 24 год після введення CoCl2. 4.Тварини, яким внутрішньом'язово вводили -токоферолу ацетат в дозі 5 мг на 100 г маси тіла Дорошкевич Н.А. и др., 1991 і брали в дослід через 4 год або 26 год після введення -токоферолу. 5.Тварини, яким внутрішньочеревинно вводили білірубін в дозі 2,3 мг на 100 г маси тіла Mireles L.C. et al., 1999 і брали в дослід через 0,5 год, 1 год, 2 год, 4 год або 26 год після введення білірубіну. 6.Тварини, яким за 2 год до введення HgCl2 або CoCl2 внутрішньом'язово вводили -токоферолу ацетат і брали в дослід через 2 год і 24 год після введення HgCl2 або CoCl2. 7.Тварини, яким за 2 год до введення HgCl2 або CoCl2 внутрішньочеревинно вводили білірубін і брали в дослід через 2 год і 24 год після введення HgCl2 або CoCl2. 8.Тварини, яким внутрішньочеревинно вводили L-триптофан в дозі 20 мг на 100 г маси тіла Kaliman P.A., Manandhar S.P., 1991 і брали в дослід через 4 год або 26 год після введення L-триптофану. 9.Тварини, яким за 2 год до введення HgCl2 або CoCl2 внутрішньочеревинно вводили L-триптофан і брали в дослід через 2 год і 24 год після введення HgCl2 або CoCl2. 10.Тварини, яким внутрішньочеревинно вводили пропранолол (0,025% розчин в 0,9%в дозі 0,15 мг на 100 г маси тіла Bassukevitz Y. et al., 1989 і брали в дослід через 24 год після введення пропранололу. 11.Тварини, яким за 0,5 год до введення HgCl2 внутрішньочеревинно вводили пропранолол і брали в дослід через 24 год після введення HgCl2. 12.Тварини, яким внутрішньочеревинно вводили тетрамізол в дозі 2,5 мг на 100 г маси тіла Досон Р. et al., 1991 і брали в дослід через 0,5 год, 2 год, 17 год, 24 год після введення тетрамізолу.

Визначення триптофан-2,3-діоксигеназної активності. Визначення ТДО активності проводили за методом [Badawy A.A.-B., Evans M., 1973]. Вміст кінуренину визначали за його поглинанням при 365 нм. Вимірювання проводили на спектрофотометрі СФ-26. ТДО активність виражали в нмоль кінуренину/ 1 мг білку за 1 год інкубації. Про насичення ТДО гемом судили по відношенню активності холоферменту до загальної активності ТДО і виражали в процентах.

Визначення вмісту цитохрому Р-450 в гомогенаті печінки. Вміст цитохрому Р-450 визначали методом диференційної спектрофотометрії [Matsubara T. et al., 1976]. Визначення вмісту цитохрому Р-450 базується на вимірюванні величини поглинання комплексу відновленого цитохрому Р-450 з моноксидом вуглецю при 450 нм [Omura T., Sato R., 1964]. Вміст цитохрому Р-450 виражали в нмоль/ мг білку.

Виділення мікросом з печінки щурів. Мікросоми виділяли методом диференційного центрифугування [Kamath S.A., 1972], в модифікації [Лемешко В.В., 1980]. Отримана суспензія використовувалася для визначення вмісту цитохрому b5 і цитохрому Р-450.

Визначення вмісту цитохромів b5 і Р-450. Вміст цитохромів визначали за методом диференційної спектрофотометрії [Omura T., Sato R., 1964] як описано в роботі [Орехович В.Н., 1977]. Різниця поглинання між максимумом при 408 нм і мінімумом при 428 нм служила показником, що характеризує вміст мікросомального цитохрому b5. Різниця поглинання між максимумом при 450 нм і мінімумом при 490 нм служила показником, що характеризує вміст цитохрому Р-450 в мікросомах печінки. Вміст цитохромів виражали в нмоль/  мг білку.

Спектр поглинання сироватки крові реєстрували на двохпроменевому спектрофотометрі Specord UV-VIS при 37°С в 0,1 М Na-фосфатному буфері, рН ,0 [Hrkal Z., Muller-Eberhard U., 1971]. Оптичну густину розраховували за різницею максимуму і мінімуму поглинання у відповідній зоні [Рerkampus H.-H., 1992] і виражали в А/ мг білку. На підставі змін оптичної густини сироватки в Soret-зоні (поглинання гемопротеїнів: 380-450 нм) і при 280 нм робили висновок про вміст, відповідно геміну, гемопротеїнів (продуктів гемолізу) Smith A. et al., 1993; Yonetani T. et al., 1974, та гемопексину Takahashi N. et al., 1985.

Визначення вмісту гаптоглобину в сироватці крові проводили, як описано в роботі [Строев Е.А., Макарова В.Г., 1986]. Вимірювали екстинкцію проб на спектрофотометрі СФ-26 при 540 нм. Вміст гаптоглобину виражали в мг/ мл сироватки крові.

Визначення вмісту білку проводили за методом Лоурі та співавторів у модифікації Міллера [Miller G.L., 1959].

Статистична обробка даних. Статистична обробка експериментальних результатів і оцінка значущості відмінностей між групами отриманих даних проводилася з використанням непараметричного критерію U Манна-Уітні-Вілкоксона [Гублер Е.В., Генкин А.А., 1973].

У третьому, четвертому та пятому розділах дисертації наведено основні результати роботи та їх обговорення.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив хлориду ртуті або хлориду кобальту на триптофан-2,3-діоксигеназну активність і вміст цитохрому Р-450 в печінці щурів. Збільшення активності холоферменту ТДО після введення HgCl2 зумовлене підвищенням вмісту гему в клітинах печінки, що підтверджується підвищенням насичення ТДО гемом (табл.1). Цей фермент дуже чутливий до найменших змін вмісту гему в гепатоцитах [Ren S., Correia M.A., 2000]. В умовах оксидативного стресу, який спричинено важкими металами, існує декілька джерел поповнення вмісту вільного гему в печінці, в тому числі як за рахунок гему пошкоджених вільними радикалами внутрішньоклітинних гемопротеїнів [Maines M.D., 1984, так і за рахунок захоплених з кров'яного русла гему та гемоглобіну еритроцитів, що зазнали лізису [Wyman J.F. et al., 1986]. Так, HgCl2 і CoCl2 спричиняють гемоліз у перші години дії. Однак через добу після введення CoCl2 вміст у сироватці продуктів гемолізу не відрізняється від контролю, в той час як HgCl2 надає гемолітичну дію й через 24 год (табл.1,2), що пов'язано з різними механізмами токсичної дії цих металів на еритроцити. Нормалізація насичення ТДО гемом через добу після введення HgCl2, обумовлена як збільшенням вмісту апобелка цього ферменту, на це вказує підвищення загальної активності, так і підвищенням гемоксигеназної активності, що було показано в паралельних експериментах Каліман П.А. та ін., 2001. Зниження ТДО активності в умовах введення CoCl2 є наслідком зменшення вмісту нативного гему в печінці.

Таблиця .

ТДО активність і насичення ферменту гемом, вміст цитохрому Р-450 в печінці, оптична густина та вміст гаптоглобіну в сироватці крові щурів в різні терміни після введення HgCl2 і сумісного введення -токоферолу або білірубіну та HgCl2 (Mm; n=4-8)

Час після дії | Параметр, що вимірювался | Контроль | HgCl2 | -Токоферол+

+HgCl2 | Білірубін+HgCl2

ТДО холофермент a | 3,620,26 | 5,140,46* | 6,791,16* | 6,100,69*

ТДО загальна a | 9,250,54 | 9,710,88 | 11,792,58 | 10,281,18

2 год | ТДО насичення гемом b | 39,443,49 | 53,654,20* | 60,035,09* | 59,734,80*

Цитохром

Р-450 c | 0,320,004 | 0,310,007 | 0,320,02 | 0,340,02

Оптична густина Soret-зона d | 0,0230,002 | 0,0810,017* | 0,0970,01* | 0,120,04*

Оптична густина 280 нм d | 0,560,02 | 0,420,02* | 0,470,03* | 0,560,08

ТДО холофермент a | 5,880,50 | 17,552,17* | 7,781,02 | 8,211,30

ТДО загальна a | 17,511,01 | 44,231,76* | 27,443,84* | 25,651,99*

24 год | ТДО насичення гемом b | 33,581,86 | 39,574,12 | 28,892,55 | 32,294,67

Цитохром

Р-450 c | 0,380,02 | 0,230,01* | 0,350,02 | 0,290,01* **

Оптична густина Soret-зона d | 0,0330,006 | 0,0660,009* | 0,0360,007 | 0,0270,004

Оптична густина 280 нм d | 0,710,04 | 0,750,05 | 0,800,09 | 0,640,04

Гаптоглобин e | 4,050,18 | 3,290,15* | 3,900,14 | 4,080,15

Примітки: a - нмоль кінуренину/ 1 мг білку за 1 год; b - %; c - нмоль/ 1 мг білку; d - А/ мг білку; e - мг/мл;* - вірогідно до контролю (р0,05); ** - вірогідно до HgCl2 (р0,05);
- 0,05 р 0,1 відносно до контролю

Таблиця .

ТДО активність і насичення ферменту гемом, вміст цитохрому Р-450 в печінці, оптична густина та вміст гаптоглобіну в сироватці крові щурів в різні терміни після введення CoCl2 і сумісного введення -токоферолу або білірубіну та CoCl2 (Mm; n=4-8)

Час після дії | Параметр, що вимірювался | Контроль | CoCl2 | -Токоферол+
+CoCl2 | Білірубін+CoCl2

ТДО

холофермент a | 5,840,84 | 5,830,92 | 6,010,58 | 8,692,47

ТДО

загальна a | 12,680,81 | 14,422,47 | 11,810,99 | 27,527,75*

2 год | ТДО насичення гемом b | 45,664,81 | 41,312,06 | 50,992,45 | 31,403,62*

Цитохром

Р-450 c | 0,300,02 | 0,310,03 | 0,260,02 | 0,290,02

Оптична густина Soret-зона d | 0,0250,004 | 0,0440,004* | 0,0380,009 | 0,0380,01

Оптична густина 280 нм d | 0,550,05 | 0,480,03 | 0,570,04 | 0,630,09

Гаптоглобін e | 3,030,54 | 2,390,46 | 3,790,85 | 2,680,17

ТДО

холофермент a | 5,840,84 | 1,930,26* | 6,081,13 | 3,010,20*

ТДО

загальна a | 12,680,81 | 9,051,09* | 24,012,34* | 14,461,52

24 год | ТДО насичення гемом b | 45,664,81 | 22,173,28* | 25,343,86* | 21,392,41*

Цитохром

Р-450 c | 0,300,02 | 0,140,01* | 0,240,02 | 0,220,03* **

Оптична густина Soret-зона d | 0,0250,004 | 0,0320,016 | 0,0260,009 | 0,0350,009

Оптична густина 280 нм d | 0,550,05 | 0,560,1 | 0,610,04 | 0,600,05

Гаптоглобин e | 3,030,54 | 2,540,99 | 2,530,76 | 2,310,46

Примітки: a - нмоль кінуренину/ 1 мг білку за 1 год; b - %; c - нмоль/ 1 мг білку;d - А/ мг білку; e - мг/мл;* - вірогідно до контролю (р0,05), ** - вірогідно до СоCl2 (р0,05)

Таким чином, порівняння впливу HgCl2 і CoCl2 на ТДО активність і насичення ферменту гемом в печінці щурів виявило принципові відмінності в реакції у відповідь з боку ТДО, що вказує на різні механізми токсичної дії HgCl2 і CoCl2 на цей фермент.

Зниження вмісту цитохрому Р-450 (табл.1,2) після введення CoCl2 може відображати як деградацію цього гемопротеїну внаслідок активації ланцюгового переокислення ліпідів (ПОЛ), так і заміщення гему Со-протопорфіріном Hochachka P.W. et al., 1996; Загайко А.Л., 1999, тоді як падіння рівня цитохрому Р-450 при введенні HgCl2, в першу чергу, пов'язане з накопиченням у печінці надлишку гему та подальшою активацією вільним гемом вільнорадикальних процесів у гепатоцитах [Grinberg L.N. et al., 1999].

Вплив тетрамізолу на триптофан-2,3-діоксигеназну активність і вміст цитохрому Р-450 в печінці щурів. У роботах [Загайко А.Л., 1999; Калиман П.А. и др., 1998] був вивчений вплив тетрамізолу на стан ПОЛ, окремі показники антиоксидантного захисту та деякі ферменти вуглеводного, ліпідного і білкового обміну та показано, що введення щурам тетрамізолу спричиняє розвиток в організмі оксидативного стресу. Враховуючи цей факт, було цікаво використати дану сполуку для моделювання in vivo оксидативного стресу та з'ясувати чи є реакції у відповідь, які спостерігалися в експериментах з введенням HgCl2 або CoCl2, специфічними для цих стресових агентів.

Таблиця .

ТДО активність і насичення ферменту гемом, вміст цитохрому Р-450 в печінці і оптична густина сироватки крові щурів в різні терміни після введення тетрамізолу (Mm; n=4-8)

Параметр, що вимірювался | Контроль | Час після дії

0,5 год | 2 год | 17 год | 24 год

ТДО холофермент a | 4,370,51 | 3,320,71 | 5,930,67 | 2,530,41* | 3,750,64

ТДО загальна a | 12,651,28 | 10,211,72 | 15,291,49 | 9,301,33 | 10,081,36

ТДО насичення гемом b | 34,421,95 | 32,012,64 | 39,354,03 | 27,292,18* | 36,673,06

Цитохром Р-450 c | 0,220,01 | 0,220,01 | 0,220,01 | 0,230,03 | 0,210,03

Оптична густина Soret-зона d | 0,0150,003 | 0,020,01 | 0,010,002 | 0,0180,005 | 0,170,003

Оптична густина 280 нм d | 0,480,03 | 0,420,048 | 0,480,04 | 0,430,01 | 0,400,03

Примітки: a - нмоль кінуренину/ 1 год на 1 мг білку; b - %; c - нмоль/ 1 мг білку;d - А/ мг білку; * - вірогідно до контролю (р0,05); - 0,05 р 0,1 відносно до контролю

Як свідчать дані таблиці 3, введення тваринам тетрамізолу не спричиняє шкідливої дії на еритроцити у вказані терміни після введення цього агенту. У той же час вплив HgCl2 або CoCl2 призводить до гемолізу (табл.1,2).

Зниження активності холоферменту та насичення ТДО гемом після введення тетрамізолу (табл.3) може бути пов'язане з активацією, в умовах оксидативного стресу, головного ферменту деградації гему гемоксигенази-1, яка є стресовим білком [Smith A. et al, 1993; Eskew J.D. et al, 1999]. Зміни насичення гемом ТДО внаслідок введення HgCl2 або CoCl2, головним чином, пов'язані з потоком гему з кров'яного русла і з вивільненням гему з внутрішньоклітинних гемопротеїнів, а також з модифікацією гему Со2+ і утворенням Со-протопорфірину.

За нашими даними, введення тетрамізолу не впливає на вміст цитохрому Р-450 в печінці щурів, а в умовах оксидативного стресу, який спричинено як HgCl2, так і CoCl2 вміст цитохрому Р-450 знижується (табл.1,2).

Таким чином, порівняння впливу введення тетрамізолу з ефектами, що надаються впливом HgCl2 і CoCl2, виявило певні відмінності в реакції у відповідь з боку ТДО і цитохрому Р-450 в умовах оксидативного стресу, який спричинено HgCl2, CoCl2 та тетрамізолом.

Вплив попереднього введення пропранололу на вміст цитохрому Р-450 і цитохрому b5 в мікросомах печінки самиць щурів при введенні HgCl2. Найважливішу роль у розвитку стрес-реакції відіграє симпатоадреналова система [Меерсон Ф.З., 1988; Северин Е.С., 1991]. Встановлена участь цАМФ-залежних процесів в деградації мікросомального цитохрому Р-450 [Jansson I. et al., 1990]. Було цікаво з'ясувати роль -адренорецепторів у реалізації ефектів HgCl2 на вміст мікросомальних цитохромів Р-450 і b5 у печінці щурів.

Введення блокатору -адренорецепторів пропранололу за 0,5 год до введення HgCl2 запобігало зниженню вмісту як цитохрому Р-450, так і цитохрому b5 (рис.1). Беручи до уваги отримані в роботі дані, можна припустити, що хоч попереднє введення пропранололу запобігало зниженню вмісту цитохрому Р-450, цей факт не може розглядатися як доказ цАМФ-залежної інактивації даного білка, оскільки на стількі ж запобігається і зниження вмісту цитохрому b5, для якого такий шлях інактивації не встановлений [Jansson I. et al., 1990]. У паралельних експериментах, що були проведені в нашій лабораторії встановлено, що оптична густина сироватки крові щурів в Soret-зоні не перевищує контрольний рівень через 0,5 год після сумісного введення пропранололу та хлориду ртуті, що свідчить про запобігання гемолізу під дією хлориду ртуті попереднім введенням пропранололу [Бараннік Т.В., 1999]. Отже, пропранолол, перешкоджуючи гемолітичній дії HgCl2, тим самим може робити певний внесок в обмеження збільшення вмісту в клітинах печінки непов'язаного гему та сприяти зберіганню в мікросомах нормального вмісту цитохрому Р-450 і цитохрому b5. Певний вклад в інгібування ПОЛ в мікросомальних мембранах може вносити збільшення гемоксигеназної активності [Никитченко И.В. и др., 1998]. Таким чином, попереднє введення пропранололу запобігає зниженню вмісту цитохромів Р-450 і b5 у мікросомах печінки, що спостерігається після введення HgCl2.

Вплив -токоферолу або білірубіну на триптофан-2,3-діоксигеназну активність і вміст цитохрому Р-450 в печінці щурів.

Таблиця 4.

ТДО активність і насичення ферменту гемом, вміст цитохрому Р-450 в печінці, оптична густина та вміст гаптоглобіну в сироватці крові щурів в різні терміни після введення
-токоферолу або білірубіну (Mm; n=4-8)

Параметр, що вимірювался | Контроль | Вплив та час після дії

-токоферол | білірубін

4 год | 26 год | 4 год | 26 год

ТДО холофермент a | 5,840,84 | 4,290,54 | 3,841,29 | 7,801,15 | 2,990,43*

ТДО загальна a | 16,680,81 | 12,431,04 | 10,871,98 | 22,603,00* | 13,021,86

ТДО насичення гемом b | 45,664,81 | 34,422,84 | 33,034,88* | 34,894,61 | 23,532,65*

Цитохром Р-450 c | 0,300,02 | 0,310,02 | 0,280,02 | 0,320,02 | 0,270,02

Оптична густина
Soret-зона d | 0,0250,004 | 0,0260,006 | 0,0290,006 | 0,0340,01 | 0,0210,005

Оптична густина

280 нм d | 0,550,05 | 0,720,1 | 0,500,1 | 0,630,06 | 0,590,05

Гаптоглобін e | 3,030,54 | 0,310,02 | 0,280,02 | 0,320,02 | 0,270,02

Примітки: a - нмоль кінуренину/ 1 мг білку за 1 год; b - %; c - нмоль/ 1 мг білку; d - А/ мг білку; e - мг/мл; * - вірогідно до контролю (р0,05); - 0,05 р 0,1 відносно до контролю

Для з'ясування причин зміни ТДО активності, що спостерігається через 4 год і 26 год після введення тваринам білірубіну, нами були проведені додаткові експерименти, результати яких представлені в табл. .

Таблиця .

ТДО активність і насичення ферменту гемом, вміст цитохрому Р-450 в печінці, оптична густина сироватці крові щурів в різні терміни після введення білірубіну (Mm; n=4-5)

Параметр, що вимірювался | Контроль | Час після введення білірубіну

0,5 год | 1 год | 2 год

ТДО холофермент a | 3,620,26 | 4,980,64# | 4,040,46 | 8,012,80*

ТДО загальна a | 9,250,54 | 11,561,81 | 9,871,31 | 20,037,21*

ТДО насичення гемом b | 39,443,49 | 43,552,28 | 41,633,78 | 40,290,45

Оптична густина
Soret-зона с | 0,020,003 | 0,030,004 | 0,030,002* | 0,0360,009

Оптична густина 280 нм с | 0,670,05 | 0,520,008# | 0,510,06# | 0,520,1

Примітки: a - нмоль кінуренину/ 1 мг білку за 1 год; b - %; с - А/ мг білку; * - вірогідно до контролю (р0,05); - 0,05 р 0,1 відносно до контролю

Білірубін спричиняє гемолітичну дію в ранні терміни після введення (табл.5). Цей факт пояснює тенденцію до підвищення активності холоферменту ТДО вже через 0,5 год і різке підвищення останньої через 2 год після введення білірубіну. Нормалізація активності холоферменту ТДО і подальше зниження даного показника через 26 год пов'язано зі зменшенням вмісту гему в клітинах печінки (табл.4). Про це свідчить зниження насичення ТДО гемом через 26 год після введення білірубіну (табл.4). Останнє може бути зумовлене індукцією апобілка ТДО (табл.4), а також індукцією гемоксигенази-1, яка, ймовірно, здійснюється приєднанням до відповідних рецепторів на гепатоцитах комплексу гем-гемопексин [Smith A. et al, 1993; Eskew J.D. et al, 1999]. Як випливає з даних табл.5, протягом першої години після введення тваринам білірубіну зареєстровано зниження вмісту в сироватці крові гемопексину. Індукція апобілка ТДО може бути наслідком надходження в гепатоцити гему з кровяного русла. Беручи до уваги останні дані літератури [Ren S., Correia M.A., 2000], можна припустити, що гем еритроцитів, які зазнали лізису, бере певну участь в індукції ферменту глюкокортикоїдами та/або в стабілізації мРНК ТДО.

Вплив попереднього введення -токоферолу або білірубіну на ТДО активність і вміст цитохрому Р-450 в печінці щурів при введенні HgCl2 або CoCl2. Попереднє введення -токоферолу повністю запобігає зниженню вмісту цитохрому Р-450 в печінці щурів, що спостерігається через 24 год після введення HgCl2 або CoCl2 (табл.1,2). Попереднє введення білірубіну (табл.1,2) лише частково запобігає зниженню даного показника. Однак потрібно зазначити, що вміст цитохрому Р-450 в умовах попереднього введення білірубіну достовірно вищий, ніж в умовах введення лише одних металів. Останні дані є ще одним доказом того, що причиною падіння рівня цитохрому Р-450 при введенні важких металів є не зростання гемоксигеназної активності, а пошкодження цих гемопротеїнів вільними радикалами.

Як випливає з даних табл.1,2, попереднє введення -токоферолу або білірубіну не запобігає збільшенню вмісту продуктів гемолізу в сироватці крові, яке спостерігається в перші години дії HgCl2. Через 24 год після введення -токоферолу або білірубіну та HgCl2 вміст продуктів гемолізу, гемопексину та гаптоглобину в сироватці крові не відрізняється від контролю. Отже, активація вільнорадикального окислення не є основним фактором, що спричиняє гемоліз в перші години дії HgCl2. Вміст продуктів гемолізу при сумісному введенні -токоферолу або білірубіну та CoCl2 не відрізняється від контролю. Цей факт може служити доказом активації вільнорадикальних процесів уже в перші години після впливу CoCl2.

Через 2 год після сумісного введення -токоферолу та HgCl2 активність холоферменту ТДО збільшується, що пов'язано з підвищенням в гепатоцитах вмісту гему. Джерелом останнього можуть бути еритроцити, які зазнали лізису під дією HgCl2 (табл.1). На користь даного припущення говорить той факт, що через 2 год після сумісного введення -токоферолу та HgCl2 знижується рівень гемопексину в сироватці крові, а також збільшується насичення ТДО гемом у вказаний термін (табл.1). Через 24 год після сумісного введення -токоферолу і HgCl2 спостерігається нормалізація активності холоферменту та насичення ТДО гемом, на відміну від картини, яку виявлено через добу після введення тільки HgCl2 (табл.1). Ефект введення -токоферолу і CoCl2 на ТДО активність (табл.2) може бути пов'язаний зі зменшенням вмісту Со-протопорфірину в печінці. Разом з тим підвищення загальної активності ТДО через 24 год після сумісного введення -токоферолу та CoCl2 може також свідчити про наявність у печінці фактора, що викликає стрес.

Введення білірубіну за 2 год до введення HgCl2 не запобігає гемолізу. При цьому активність холоферменту та насичення ТДО гемом збільшується. Через 24 год після сумісного введення білірубіну і HgCl2 збільшення вмісту в сироватці продуктів гемолізу не зареєстровано. Ці дані можуть свідчити про реалізацію захисного ефекту білірубіну в мембранах еритроцитів. Однак білірубін може діяти як стресовий фактор, що викликає на ранніх етапах гемолітичний ефект (табл.5), внаслідок якого гемоксигеназа [Каліман П.А. та ін., 2001] і ТДО (табл.1) індукуються в більш ранні терміни. Таким чином, забезпечується швидке звязування і деградація надлишку вільного гему в умовах введення HgCl2. Через 24 год після введення білірубіну і HgCl2 не спостерігається статистично значущих змін ні в активності холоферменту, ні в насиченні ТДО гемом, що зумовлено частковою нормалізацією вмісту гему в гепатоцитах (табл.1), що може досягатися частково за рахунок підвищення загальної активності ТДО (табл.1). Не можна виключати участі інших цитозольних білків, що зв'язують гем, в нормалізації рівня вільного гему в гепатоцитах, наприклад, білка HBP23, індукція якого здійснюється паралельно з індукцією гемоксигенази [Ivahara S et al., 1995].

Ефект сумісного введення білірубіну і CoCl2 на ТДО активність та насичення ферменту гемом через 2 год після впливу зумовлений збільшенням загальної активності ферменту (табл.2). Підвищення рівня загальної активності ТДО може бути зумовлене наявністю в клітинах печінки фактору, що викликає стрес. Білірубін може діяти як стресовий фактор, надаючи гемолітичного ефекту, в результаті якого спостерігається індукція ТДО в ранні терміни. Зниження активності холоферменту та насичення ТДО гемом, що спостерігається через добу після сумісного введення білірубіну і CoCl2 (табл.2), може бути зумовлено зменшенням вмісту в гепатоцитах нативного гему.

Таким чином, попереднє введення -токоферолу запобігає зміні активності холоферменту ТДО в печінці щурів через добу після введення тваринам HgCl2 або CoCl2 та перешкоджає зниженню загальної активності ферменту через добу після впливу CoCl2. Попереднє введення білірубіну частково нормалізує активність холоферменту ТДО в печінці щурів через добу після введення HgCl2 і запобігає зміні загальної активності ТДО через добу після введення CoCl2.

Вплив попереднього введення L-триптофану на триптофан-2,3-діоксигеназну активність і вміст цитохрому Р-450 в печінці щурів після введення HgCl2 або CoCl2. Через 2 год після введення L-триптофану і HgCl2 (табл.6) виявлено збільшення активності холоферменту, загальної активності та насичення ТДО гемом, що може бути викликане такими причинами. По-перше, частково за рахунок надходження в гепатоцити гему з кров'яного русла. По-друге, з пошкодженням внутрішньоклітинних гемопротеїнів і вивільненням гему. По-третє, сам L-триптофан підвищує спорідненість апобілка ТДО до гему. Оскільки при введенні HgCl2 загальна активність ТДО не змінюється, збільшення даного показника в перші години дії L-триптофану та HgCl2, так само як після введення тільки L-триптофану, свідчить про підвищення в гепатоцитах рівня вільного апобілка, що, ймовірно, обумовлено стабілізацією ТДО субстратом.

Таблиця .

ТДО активність і насичення ферменту гемом, вміст цитохрому Р-450 в печінці, оптична густина сироватки крові щурів після введення HgCl2 і сумісного введення L-триптофану та HgCl2 (Mm; n=6-9)

Час після дії | Параметр, що вимірювался | Контроль | HgCl2 | L-триптофан 4 год або 26 год | L-триптофан+
+HgCl2

ТДО

холофермент a | 3,270,48 | 5,290,67* | 11,971,27* | 13,172,11*

ТДО

загальна a | 8,950,69 | 10,921,30 | 20,562,7* | 20,402,38*

2 год | ТДО насичення гемом b | 36,203,27 | 49,463,21* | 59,904,61* | 63,324,07*

Цитохром

Р-450 c | 0,250,02 | 0,290,04 | 0,260,02 | 0,260,03

Оптична густина Soret-зона d | 0,0230,003 | 0,0920,015* | 0,0260,005 | 0,060,009*

Оптична густина 280 нм d | 0,500,03 | 0,420,02 | 0,480,01 | 0,470,06

ТДО

холофермент a | 4,790,52 | 7,550,70* | 4,630,58 | 6,771,09

ТДО

загальна a | 11,110,95 | 17,981,64* | 10,791,39 | 18,412,05*

24 год | ТДО насичення гемом b | 43,503,81 | 42,772,83 | 42,980,89 | 36,352,52

Цитохром

Р-450 c | 0,310,01 | 0,250,02* | 0,320,02 | 0,290,02

Оптична густина Soret-зона d | 0,0230,002 | 0,0490,01* | 0,0310,005 | 0,0690,016*

Оптична густина 280 нм d | 0,560,02 | 0,560,03 | 0,580,02 | 0,610,01

Примітки: a - нмоль кінуренину/ 1 год на 1 мг білку; b - %; c - нмоль/ 1 мг білку; d - А/ мг білку; * - вірогідно до контролю (р0,05); - 0,05 р 0,1 відносно до контролю

Нормалізація активності холоферменту та насичення ТДО гемом, що спостерігається через добу після введення L-триптофану та HgCl2 (табл.6), може свідчити про зниження потоку вільного гему як з кров'яного русла, так і від внутрішньоклітинних гемопротеїнів. У разі сумісного введення L-триптофану та HgCl2, заздалегідь активований субстратом фермент ефективно зв'язує надлишок гему. Збільшення загальної активності ТДО пов'язано з індукцією синтезу ферменту de novo, оскільки L-триптофан не виявляє стабілізуючої дії на ТДО через 12 год після впливу Kaliman P.A., Manandhar S.P., 1991. Потрібно зазначити, що CoCl2 не викликає змін активності ТДО через 2 год після впливу (табл.7). У зв'язку з цим весь приріст активності ферменту після сумісного введення L-триптофану та CoCl2 зумовлений L-триптофаном. В той час, як введення CoCl2 через добу спричиняє зменшення насичення ферменту гемом, ймовірно, за рахунок утворення Со-протопорфірину, введення L-триптофану запобігає зниженню даного показника (табл.7).

Таблиця .

ТДО активність і насичення ферменту гемом, вміст цитохрому Р-450 в печінці, оптична густина сироватки крові щурів після введення CoCl2 і сумісного введення L-триптофану та CoCl2 (Mm; n=6-9)

Час після дії | Параметр, що вимірювался | Контроль | CoCl2 | L-триптофан
4 год або 26 год | L-триптофан+
+CoCl2

ТДО

холофермент a | 3,270,48 | 4,080,64 | 11,971,27* | 14,161,50*

ТДО

загальна a | 8,950,69 | 11,851,75 | 20,562,7* | 25,283,01*

2 год | ТДО насичення гемом b | 36,203,27 | 34,373,47 | 59,904,61* | 57,374,57*

Цитохром

Р-450 c | 0,250,02 | 0,240,02 | 0,260,02 | 0,210,006

Оптична густина Soret-зона d | 0,0230,003 | 0,0540,014* | 0,0260,005 | 0,0530,011*

Оптична густина 280 нм d | 0,500,03