МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

Харківський національний університет ім. В.Н.Каразина

Утєвська Ольга Михайлівна

УДК 575.17+639.54:636.082

ГЕНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ РЕПРОДУКТИВНИХ

ОЗНАК МЕДИЧНОЇ П'ЯВКИ

03.00.15 - генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті ім В.Н.Каразіна,

Міністерство освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Атраментова Любов Олексіївна

Харківський національний університет,

професор кафедри генетики і цитології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Бондаренко Юрій Васильович, НДІ птахівництва УААН, головний науковий співробітник;

кандидат біологічних наук Шаламова Оксана Олексіївна, Інститут шовківництва УААН, старший науковий співробітник.

Провідна установа

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра загальної і молекулярної генетики, Міністерство освіти і науки України, м. Київ

Захист відбудеться 11.12.2001 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 64.051.18, Харківський національний університет, Харків, майдан Свободи, 4

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського національного університету, м.Харків, майдан Свободи, 4.

Автореферат розісланий 10.11.2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради А.В.Некрасова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Актуальність генетичних досліджень медичних п'явок обумовлено необхідністю удосконалення технології їх розведення. Медичні п'явки розводяться в штучних умовах з метою використання в медичній практиці для лікування захворювань людини. Чисельність H. medicinalis у природних популяціях скорочується, цей вид занесений у Червоні книги багатьох європейських країн. Відомо, що відтворювальна здатність популяцій визначається характером генетичних процесів, що протікають у них, проте популяційно-генетичні дослідження, що могли б призвести до розуміння динаміки природних, а також штучних популяцій H. medicinalis, у даний час відсутні. Роботи з підвищення продуктивності медичних п'явок дотепер були спрямовані на пошук оптимальних умов їх утримання, але не торкалися проблеми поліпшення спадкових властивостей популяцій. Медичні п'явки раніше не були об'єктами генетичного аналізу, на них не здійснювалися селекційні заходи, які широко застосовуються при розведенні різноманітних цінних тварин, у тому числі і безхребетних. Необхідність підвищення ефективності розмноження медичних п'явок робить важливими дослідження в галузі популяційної генетики H. medicinalis, зокрема генетики кількісних ознак.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано на кафедрі генетики і цитології ХНУ в межах теми "Моніторинг біорізноманітності природніх комплексів і генетико-демографічних процесів в популяціях Лівобережної України" (? держреєстрації 0100UО03328). Спостереження проведени на базі Інституту неврології, психіатрії і наркології АМН України (тема "Розроблення технології одержання біологично активних з'єднань на основі природної сировини з метою використання в лікуванні хворих з нервово-психічними захворюваннями", ? держреєстрації 0194UО34343).

Мета і завдання дослідження. Мета досліджень - установити характер успадкування репродуктивних ознак медичних п'явок, розробити рекомендації щодо підвищення ефективності розмноження шляхом поліпшення спадкових властивостей штучних популяцій H. medicinalis. Відповідно до мети було поставлено такі завдання:

1) дослідити фенотипову мінливість кількісних ознак, цінних у репродуктивному відношенні;

2) визначити оптимуми життєздатності репродуктивно-цінних ознак;

3) провести генетичний аналіз кількісних ознак, цінних у репродуктивному відношенні;

4) встановити характер фенотипових і генотипових кореляцій між ознаками;

5) проаналізувати селекційні підходи щодо підвищення ефективності розмноження H. medicinalis.

У роботі використані біометричні методи і методи генетики кількісних ознак.

Наукова новизна одержаних результатів. Автором вперше проведено генетичний аналіз репродуктивних ознак H. medicinalis, отримано генетичні оцінки, що пояснюють характер спадкування ознак і дозволяють прогнозувати ефективність різноманітних методів добору.

Дано фенотиповий опис популяції H. medicinalis за репродуктивними ознаками з урахуванням генетичних і фенотипових кореляцій між ними, що дозволяє передбачити характер скорельованих відповідей одних ознак на зміни інших. На підставі аналізу смертності на різних стадіях онтогенезу встановлено оптимуми життєздатності репродуктивних ознак, що можуть бути прийняті за межі штучного добору.

Проведено комплескний аналіз генетичних, репродуктивних і екологічних оцінок п'явок, отриманих автором і приведених у літературних джерелах, на підставі чого розроблено практичні рекомендації щодо поліпшення спадкових властивостей штучних популяцій H. medicinalis.

Проаналізовано причини критичного стану і повільних темпів відновлення природних популяцій H. medicinalis.

Практичне значення роботи. Отримані теоретичні результати дозволяють доповнити сучасні погляди на характер спадкування ознак, пов'язаних з репродукцією, воні є внеском в генетику п'явок. Результати досліджень можуть бути використані в навчальному курсі "генетика кількісних ознак", а також при плануванні і проведенні природоохоронних заходів. Приведені схеми генаналізу можуть бути базовими для наступних генетико-селекційних робіт на медичних п'явках. Отримані висновки становять практичну цінність для підприємств з масового розведення H. medicinalis, відкриваючи нові перспективи удосконалення технологічного процесу.

Особистий внесок здобувача. Автором розроблено програму досліджень і схеми експериментів, проведено всі роботи з утримання і розведення H. medicinalis, отримано і математично оброблено експериментальні дані, проаналізовано і узагальнено результати роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації пройшли апробацію на міжнародній конференції з генетики і молекулярної біології (Львів, 2000), на конференції "Актуальні проблеми сучасної науки в дослідженнях молодих вчених м.Харкова" (Харків, 2000), на науково-практичній конференції "Сучасний стан медичної генетики в Україні" (Київ, 1999), на VI конференції Асоціації гірудологів (П'ятигорськ, 1999), на конференції "Актуальні проблеми сучасної науки в дослідженнях молодих вчених м.Харкова" (Харків, 1998), на I Національному конгресі невропатологів, психіатрів і наркологів України (Харків, 1996).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано десять наукових робіт.

Cтруктура дисертації. Дисертація викладена на 164 сторінках машинного тексту, містить 29 таблиць, 43 малюнка; складається з вступу, огляду літератури, розділу, присвяченому матеріалам та методам, розділу власних досліджень, розділу узагальнення результатів, висновків, списку літератури (бібліографічний показник містить 189 джерел літератури, з яких 47 іноземне).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В штучної популяції медичних п'явок H. medicinalis f. officinalis проаналізовано результати репродукції. Утримання і розведення медичних п'явок в штучних умовах здійснено по методиках, які наведені у працях М.В. Синевої (1944, 1949) і Д.В.Запкувене (1972).

З ознак, що визначають репродуктивну здатність медичних п'явок, розглянуто розмір кладки, кількість нитчаток у коконі, маса нитчаток. Підраховано кількість відкладених кожною п'явкою коконів і кількість нитчаток у кожному коконі. Вимірювано масу нитчаток після виходу з коконів і після першої годівлі. Через 6 місяців після виходу нитчаток для кожного кокону підраховано кількість молоді, що вижила, і оцінено смертність. Було досліджено структуру 140 сімей, що включає інформацію про 231 кладку, 734 коконів і 5131 нитчаток. Вплив негенетичних факторів на репродуктивні ознаки частково вивчено за даними Д.В.Запкувене (1972а).

Статистичне опрацювання результатів проведено загальноприйнятими методами (Г.Ф.Лакин, 1990, Плохинский, 1970). Для оцінки компонент дисперсії, коефіцієнтів успадковуваності, генетичних кореляцій застосовано методи генетичного аналізу кількісних ознак (Д.С.Фолконер, 1985, К.Мазер, Дж.Джинкс, 1985, Э.Х.Гинзбург, 1973б). Прогнозування результатів добору зроблено на основі теорії селекційних рішень (Д.С.Фолконер, 1985, Н.А.Соболєв, 1972а-г, Н.А.Кравченко, 1976, В.Л.Петухов і ін., 1989, Л.К.Эрнст, 1976)

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Фенотиповий опис популяції H. medicinalis: репродуктивні ознаки, смертність, приріст маси, кореляційні зв'язки. Розмір кладки складає 4,3 кокона, варіює від 1 до 9 і має нормальний розподіл. Кількість нитчаток в коконі складає 10,9, варіює від 2 до 26, розподіл має правобічну асиметрію. Маса нитчаток складає 32 мг і варіює від 2 до 122 мг. Крива розподілу маси характеризується правобічною асиметрією і позитивним ексцесом (табл.1).

Кокони відкладають біля 67% особин, значна частина коконів (до 33%) гине. З огляду на це, кожна початково узята доросла особина H. medicinalis за один період розмноження дає біля 21 нащадка. Смертність молоді за перші два місяці життя досягає 22%, за шість місяців - 30%. Невисока плодючість сполучається з тривалим терміном досягнення статевої зрілості, але компенсується тривалим життям і багаторазовим розмноженням. Існуючий баланс порушується антропогенним впливом на навколишнє середовище. Низька плодючість є причиною повільного відновлення природних популяцій, у яких різко знизилась чисельність п'явок.

Важливою характеристикою популяції є кореляційні зв'язки між ознаками, які відображують закономірності еволюційного процесу і приводять до корельованих відповідей на Таблиця 1.

Розподіл репродуктивних ознак H. medicinalis

Розмір кладки Кількість нитчаток у коконі Маса нитчаток

добір. Встановлено (табл.2), що між кількістю нитчаток у коконі і їхньою масою існує негативна нелінійна кореляція (r=-0,40, h=0,86). Зв'язок між ознаками "розмір кладки - кількість нитчаток у коконі" і "розмір кладки - маса нитчаток" відсутній. Сильна позитивна кореляція існує між початковою масою нитчаток і їхньою масою після першої годівлі (r=0,96), а також між масою нитчаток і приростом маси (r=0,69).

Оптимальні значення репродуктивних ознак як межі штучного добору. Для репродуктивних ознак виявлено оптимуми - значення, при яких спостерігаються найбільша чисельність дорослих нащадків та (або) найвища життєздатність молоді. За основний показник успішності розмноження було прийнято чисельність нащадків, що досягли 6-місячного віку. Вибір періоду в 6 місяців обумовлений тим, що за цей термін у сприятливих умовах п'явки виростають до розмірів, придатних для медичного використання (Д.В.Запкувене, 1972б, М.В.Синева, 1944).

Розмір кладки. При розгляді цієї ознаки було прийнято до уваги, що період між початком розмноження батьків і досягненням нащадками статевої зрілості включає декілька етапів - відкладку коконів, дозрівання коконів, вихід нитчаток, ріст молоді. На кожному етапі існують визначені втрати чисельності. Тому залежність чисельності 6-місячного потомства від розміру кладки укладалась з взаємодії таких компонентів, як кількість відкладених коконів, дозрівання коконів, кількість нитчаток у коконі і життездатність нитчаток.

В малих кладках (1-2 коконів) був знижений відсоток життєздатних коконів, невелика кількість утворених нащадків і знижена життездатність молоді, у результаті чого чисельність 6-місячного потомства була невисока і змінювалась в середньому від 0,2 до 7,6 нащадків на одну п'явку (табл.3).

Кладки середнього розміру (3-6 коконів) мали високий відсоток життєздатних коконів, середню (для 3-4 коконів) та високу (для 5-6 коконів) чисельність утворених нащадків, високу життездатність нитчаток, що обумовило високу чисельність 6-місячного потомства - у середньому від 14,2 до 40,5 нащадків на одну п'явку. Самими продуктивними виявились кладки з 5 коконів - у середньому 40,5 нащадків на одну п'явку (табл.3).

У великих кладках (7-8 коконів) високі відсоток життєздатних коконів і чисельність утворених нащадків не компенсували зниженої життездатності молоді, унаслідок чого чисельність 6-місячного потомства (у середньому від 14,5 до 21,0 нащадкив на п'явку) була нижче, ніж у кладках середнього розміру (табл.3).

Таким чином, розмір кладки є ознакою з проміжним оптимумом. Оптимальний у відношенні чисельності дорослого потомтства розмір кладки - 5 коконів - близький до середньопопуляційного розміру - 4,3 кокона. Крива залежності чисельності нащадків, що досягли 6-місячного віку, від розміру кладки має пік при значенні "5 коконів" і описується рівнянням,

Таблиця 2.

Зв'язок між репродуктивними ознаками H. medicinalis

Розмір кладки (x) - кількість нитчаток у коконі (y) Розмір кладки (x) - маса нитчаток (y) Кількість нитчаток у коконі (x) - маса нитчаток (y)

Таблиця 3.

Зв'язок між розміром репродуктивних ознак і показниками плодючості H. medicinalis

Розмір кладки (x)- Кількість нитчаток у коконі (x) - Маса нитчаток (x) -

чисельність нащадків (y) чисельність нащадків (y) життєздатність молоді (y)

Показники зв'язку 1 - середні значення, 2 - лінія регресії 1 - середні значення, 2 - лінія регресії 1 - середні значення, 2 - лінія регресії

r±mr 0,55±0,11 (p<0,001) 0,65±0,09 (p<0,001) -0,29±0,12 (p<0,05)

h±mh 0,73±0,09 (p<0,001) 0,75±0,07 (p<0,001) 0,52±0,11 (p<0,001)

g 0,22 (p<0,01) 0,14 (p>0,05) 0,18 (p<0,05)

Рівняння регресії y = -21,9 + 18,2x - 1,5x2 y = -1 + 1,1x - 0,02х2 y = 103,3 - 8,2x - 2,7x2 + 0,5x3

Примітка. x - ознаки, y - показники плодючості, r - коефіцієнт кореляції, mr - помилка репрезентативності коефіцієнта кореляції, h - коефіцієнт кореляційного відношення, mh - помилка репрезентативності коефіцієнта кореляційного відношення, g - критерій криволінійності, p - рівень значимості

наведеним у табл.3. Коефіцієнти характеризують цей зв'язок як сильну нелінійну.

Кількість нитчаток у коконі. Чисельність шестимісячного потомства пов'язана сильним нелінійним зв'язком з кількістю нитчаток у коконі і описується рівнянням, наведеним у табл.3. Кількість нитчаток у коконі - ознака, оптимальні значення якої близькі до фізіологічно максимальної межі. Незважаючи на те, що найбільша чисельність нащадків спостерігається в коконах з великою кількістю нитчаток, такі кокони малочисельні. Оптимальна кількість нитчаток у коконі значно перевищує популяційне середнє (10,9 нитчаток). У даному випадку перевага чисельності не підхвачена природним добором. Мабуть, збільшенню ознаки перешкоджали його кореляційні зв'язки з іншими, не менше важливими ознаками, наприклад, з масою нитчаток.

Маса нитчаток. Крива залежності життєздатності нитчаток від їхньої маси (нелінійний зв'язок середньої сили, що описується рівнянням у табл.3) мала песимум від 40 до 60 мг - нитчатки з такою масою мали найменшу життєздатність. Перша область високої життездатності формувалась за рахунок молоді з масою до 40 мг. У даній області знаходиться і середньопопуляційне значення маси нитчаток (31,9±0,3 мг). Формуюча її молодь масою до 40 мг чисельно переважає і складає біля 67% від усієї генерації. Друга область високої життєздатності формувалась за рахунок нитчаток з масою більш 60 мг. Молодь з такою масою була небагаточисельна і складала біля 12% від усієї генерації. Можна зробити висновок, що в популяції існує генетично детермінований поліморфізм по засобу розподілу ресурсів у коконі. Один з них складається у виробництві дрібної, але чисельної молоді, інший - крупної, але нечисельної. Такий поліморфізм, очевидно, є адаптивним, тому що підвищує стійкість популяції до селективного впливу різноманітних умов оточення.

Генетичний аналіз ознаки "розмір кладки". Встановлено, що значна частка мінливості розміру кладки в популяції обумовлена генотипово (40-45%). У складі генотипової дисперсії переважає аддитивна компонента (35-40%), на частку домінантної компоненти випадає біля 5% мінливості. Для загальної мінливості розміру кладки характерна висока частка середовищної варіації - 55-60%, уся середовищна дисперсія є міжсімейною. Найбільше важливими з середовищних факторів, що обумовлюють мінливість, є температура в період відкладки коконів, особливості харчування і розмір материнських особин, щільність утримання п'явок (Д.В.Запкувене, 1972, О.М.Утевская, 1998).

Показник успадковуваності розміру кладки у медичних п'явок дорівнює 0,35-0,40. Це значення є високим у порівнянні з аналогічними показниками інших тварин (Ф.Хатт, 1969).

На підставі отриманих результатів дано прогноз результатів масового добору по розміру кладки. Ознака має високе, близьке до одиниці, значення відносної спадкової стабільності, що дає високе значення можливості ефективного добору генотипів по фенотипу (табл.4). Низька, але відмінна від нуля, генетична гетерогенність по аналізованій ознаці вказує на те, що популяція генотипово неоднорідна, але в ній чисельно переважає один основний генотип. Розрахована інтенсивність добору генотипів по фенотипу дорівнює 0,05, тобто, щоб виділити по фенотипу всіх особин, що відрізняються від основного генотипу, необхідно відібрати 5% тварин (Н.А.Соболев, 1972а-г).

Таблиця 4.

Інтенсивність добору за репродуктивними ознаками H. medicinalis

Характеристики Розмір кладки Кількість нитчаток у коконі Маса нитчаток

Відносна спадкова стабільність ознаки 0,94 0,89 0,88

Критерій селекційної значимості 3,96 2,82 2,74

Потенційна можливість ефективного масового добору 0,80 0,74 0,73

Генетична гетерогенність 0,04 0,057 0,08

Інтенсивність добору 0,05 0,077 0,115

Мінімальне значення ознаки "розмір кладки" при 5% плюс-доборі дорівнює 8 коконам, максимальне значення при 5% мінус-доборі дорівнює 1 кокону (мал.1А). При розрахованому розмірі відповіді на добір очікуваний середній розмір кладки після першого покоління добору в плюс-напрямку дорівнює 5,7 кокона, у мінус-напрямку - 3,1 кокона. Таким чином, масовий добір серед медичних п'явок по ознаці "розмір кладки" може бути ефективний при високих значеннях селекційного диференціалу.

Прогнозування результатів сімейного, сибс- і внутрішньосімейного доборів подане на мал. 2А. Найбільшими за розміром є показники відповіді на добір при сімейному доборі і сибс-доборі при наявності великих сімейств. Сімейний добір стає ефективніше масового при розмірі родини не менше 4 особин, сибс-добір - не менше 12 особин. При використанні внутрішньосеімейного добору очікуються низькі результати.

Генетичний аналіз ознаки "кількість нитчаток у коконі". Встановлено, що для популяції характерно наявність значної частки мінливості, обумовленої генотипово (33-39%). У складі генотипової дисперсії переважає аддитивна компонента (33-36%). Домінантна компонента низька, біля 3 %. Велика частка середовищної дисперсії (61-67%) у загальній фенотиповій мінливості свідчить про сильну мінливість ознаки під дією умов середовища. Одним із факторів, що роблять вплив на кількість нитчаток у коконі, є маса материнських особин, порядковий номер репродуктивного циклу (Д.В.Запкувене, 1972а, Г.Г.Щеголев, 1948а). До випадкових чинників, що впливають на кількість нитчаток у коконі, можна також віднести успішність спарювання і різноманітні фактори, що впливають на процес сперматогенезу.

Ознака "кількість нитчаток у коконі" є показником плодючості і має невисоке значення успадковуваності - 0,35. Невисокий коефіцієнт повторювальності свідчить про неефективність проведення раннього добору на підставі даних про кількість нитчаток у перших коконах. А. Розмір кладки Б. Кількість нитчаток у коконі В. Маса нитчаток

Малюнок 1. Відносні кумулятивні частоти розподілів репродуктивних ознак H. medicinalis

А. Розмір кладки Б. Кількість нитчаток у коконі В. Маса нитчаток

Малюнок 2. Відповідь на різні типи плюс-добору за репродуктивними ознаками при збільшенні обсягу відібраних сімей: 1 - при масовому доборі, 2 - при сімейному доборі, 3 - при сибс-доборі, 4 - при внутрішньосімейном доборі

На підставі отриманих результатів дано прогноз результатів масового добору по кількості нитчаток у коконі. Ознака має високе, близьке до 0,9, значення відносної спадкової стабільності, що дає високе значення можливості ефективного добору необхідних генотипів по фенотипу - 0,74 (табл.4). Значення генетичної гетерогенності вказує на те, що популяція генотипово неоднорідна, в ній чисельно переважає один генотип. Розрахована інтенсивність добору генотипів по фенотипу - 0,077, тобто, щоб виділити по фенотипу всіх особин, що відрізняються від основного генотипу, необхідно відібрати 7,7% тварин (Н.А.Соболєв, 1972а-г).

Мінімальне значення ознаки "кількість нитчаток у коконі" при 7,7% плюс-доборі дорівнює 18 нитчаткам, максимальне значення при 7,7% мінус-доборі дорівнює 4 нитчаткам (мал.1Б). При розрахованому розмірі відповіді на добір очікувана середня кількість нитчаток у коконі після першого покоління добору в плюс-напрямку дорівнює 14,2, у мінус-напрямку - 8,2. Таким чином, масовий добір серед медичних п'явок по ознаці "кількість нитчаток у коконі" може бути ефективний при високих значеннях селекційного диференціалу.

Прогнозування результатів сімейного, сибс- і внутрішньосімейного доборів подане на мал.2Б. Найбільшими за розміром є показники відповіді на добір при сімейному доборі і сибс-доборі при наявності великих сімейств. Сімейний добір стає ефективніше масового при розмірі родини не менше 5 особин, сибс-добір - не менше 13 особин. При використанні внутрішньосімейного добору очікуються низькі результати.

Генетичний аналіз ознаки "маса нитчаток". Для популяції характерно наявність значної частки мінливості за ознакою "маса нитчаток", обумовленої генотипово (40-52%). У складі генотипової дисперсії переважає аддитивна компонента (40-44%). Домінантна компонента не перевищує 8 %. Частка середовищної варіації в загальній фенотиповій дисперсії ознаки складає 52-56. У негенетичній варіансі переважає загальносімейна компонента (52%), яка обумовлена впливом внутрішньококонного середовища. Внесок міжсімейної компоненти дисперсії, обумовлений дією зовнішніх причин, мало відрізнявся від нуля (0-4%), що почасти можна пояснити однорідністю зовнішніх умов у процесі експерименту.

Коефіцієнти успадковуваності маси нитчаток у вузькому (h2=0,42) і широкому (H2=0,46) розуміннях мало різняться. Вагові ознаки, як і плодючість, пов'язані з пристосованістю і загальним обміном речовин, вразливі до зовнішнього середовища, проте мають більш високі показники успадкоємності (Ф.Хатт, 1969).

На підставі отриманих результатів дано прогноз результатів масового добору по масі нитчаток. Ознака має близьке до 0,9 значення відносної спадкової стабільності, що дае високу можливість ефективного добору генотипів по фенотипу - 0,73 (табл.4). Значення генетичної гетерогенності вказує на генотипову неоднорідність популяції. Інтенсивність добору генотипів по фенотипу дорівнює 0,115, тобто, щоб виділити по фенотипу всіх особин, що відрізняються від основного генотипу, необхідно відібрати 11,5% тварин. (Н.А.Соболєв, 1972).

Мінімальне значення ознаки "маса нитчаток" при 11,5% плюс-доборі дорівнює 47 мг, максимальне значення при 11,5% мінус-доборі дорівнює 17 мг (мал.1В). При розрахованому розмірі відповіді на добір очікувана середня маса нитчаток після першого покоління добору в плюс-напрямку дорівнює 43,9 мг, у мінус-напрямку - 24,1 мг. Таким чином, масовий добір серед медичних п'явок по ознаці "маса нитчаток" може бути ефективний при високих значеннях селекційного диференціалу.

Прогнозування результатів сімейного, сибс- і внутрішньосімейного доборів подане на мал. 2В. Найбільшими за розміром є показники відповіді на добір при сімейному доборі і сибс-доборі при наявності великих сімейств. Сімейний добір стає ефективніше масового при розмірі родини не менше 8 особин, сибс-добір - не менше 24 особин. При використанні внутрішньосімейного добору очікуються низькі результати.

Генетичні кореляції між репродуктивними ознаками. Значення ознак "кількість нитчаток у коконі" - "маса нитчаток" в особин популяції корелюють негативно. Генетична кореляція цієї пари ознак має високий негативний розмір (r=-0,80), середовищна кореляція слабка і позитивна (r=0,22). Великі розходження між значеннями генетичної і середовищної кореляцій вказують на те, що генетичні і середовищні джерела мінливості впливають на ознаки за допомогою різних фізіологічних механізмів (Д.С. Фолконер, 1985, Э.Х.Гинзбург, 1973а, К.Мазер, Дж.Джинкс, 1985). У випадку ознак "розмір кладки" - "кількість нитчаток у коконі" спостерігаються низькі і недостовірні коефіцієнти всіх типів кореляцій, що говорить про відсутність загальних як генетичних, так і середовищних джерел мінливості.

У ході добору по одному з скорельованих ознак відбуваються зміни і по другому. Варто очікувати, що добір за ознакою "розмір кладки" не буде супроводжуватися помітними змінами за іншими ознаками; добір за ознакою "кількість нитчаток у коконі" не буде супроводжуватися змінами за ознакою "розмір кладки", але приведе до негативно скорельованої відповіді за ознакою "маса нитчаток"; добір за ознакою "маса нитчаток" не буде супроводжуватися змінами за ознакою "розмір кладки", але приведе до негативно скорельованої відповіді за ознакою "кількість нитчаток у коконі". Абсолютний розмір корельованої відповіді на добір збільшується з підвищенням інтенсивності добору за основною ознакою.

У випадках, коли досягається достатнє перевищення інтенсивності добору за непрямою ознакою над інтенсивністю по прямому, можливо більш швидке досягнення результату за рахунок непрямого добору. Очікувана негативно скорельована відповідь за ознакою "кількість нитчаток" перевищує очікувану пряму відповідь при інтенсивності прямого добору нижче 1,6 і інтенсивності добору за "масою нитчаток" вище 1,4. Очікувана негативно скорельована відповідь за "масою нитчаток" перевищує очікувану пряму відповідь при інтенсивності прямого добору нижче 1,4 і інтенсивності добору за "кількістю нитчаток" вище 2,0.

Дія негенетичних факторів на репродуктивну активність H. medicinalis. Показники, що визначають плодючість п'явок і якість нащадків, мають невисокі коефіцієнти успадковуваності і сильно варіюють під дією мінливих умов середовища. Показано, що до змін у репродуктивній активності п'явок призводять порушення температурного режиму. Зниження температури грунту в період відкладки коконів призвело до зменшення розміру кладки в 1,8 разів (із 4,3 до 2,41), що, очевидно, обумовлено більш низьким рівнем обміну речовин при знижених температурах. Достовірних відмінностей по кількості нитчаток у коконі при цьому не спостерігалося.

Показано тенденцію до збільшення розміру кладок у міру зростання маси п'явок. Варіювання розміру кладки на 87-91% визначається масою материнського організму (р<0,001). Для п'явок з низьких вагових категорій (до 5 г) було характерно малочисельність нитчаток у коконах. Варіювання кількості нитчаток у коконі визначається масою материнського організму на 26-67% (р<0,05). Спостерігається збільшення маси нитчаток у міру росту маси материнського організму від 10 до 20 г, та висока маса нитчаток у невеликих материнських п'явок (до 5 г). Маса нитчаток на 29-54% визначається масою материнського організму (р>0,05)

Описано незначне зниження плодючості при зростанні щільності популяцій. Встановлено, що характер утримання (спільний або роздільний) визначає розмір кладки на 6-9% (p>0,05), кількість нитчаток у коконі - на 3-7% (p>0,05), маса нитчаток - на 16-18% (p>0,05)

Селекційні засоби підвищення ефективності розмноження H.medicinalis. Значення успадковуваності репродуктивних ознак H. medicinalis свідчать про те, що масовий добір за ними може бути результативним лише при високих значеннях селекційного диференціалу. Проте, сильне скорочення частки особин, що відбираються на розмноження, може призвести до небажаних наслідків. Одним із таких наслідків є зростання ступеня інбрідингу, що звичайно призводить до зниження життєздатності і плодючості тварин. До того ж, належить враховувати баланс між бажаним поліпшенням ознаки і розмірами продуктивного стада.

Найбільш перспективними є сімейний добір і сибс-добір. Ці засоби добре застосовуються до багатоплідних тварин. Сімейний добір полягає у виявленні кращих сімей на основі значень сімейних середніх. Цей тип добору рекомендується використовувати у відношенні полігенних ознак з невисокими коефіцієнтами успадковуваності. Сибс-добір є окремим випадком сімейного добору, при якому відібрана особина не включається в розрахунок сімейного середнього. Низькі результати очікуються при використанні внутрішньосімейного добору, що заснований на доборі кращих фенотипів в окремих сім'ях. Внутрішньосімейний добір не виправдується у відношенні ознак з низькою успадковуваністю, тому що варіація значень ознаки в цьому випадку обумовлена середовищними чинниками в більшому ступені, ніж генотипом.

Найкращі результати очікуються при комбінованому типі добору, що сполучить у собі елементи перерахованих типів добору. Проте, цей підхід мало підходить до медичних п'явок. У ході комбінованого добору проводиться збір і аналіз різнобічної інформації про індивідуумів, що економічно невиправдано на біофабриках, які містять десятки тисяч тварин. За цієї причини утрудняється проведення одночасного добору за всіма трьома ознаками.

З огляду на існування негативної кореляції (фенотипової і генотипової) між кількістю нитчаток у коконі і їхньою масою, доцільно проводити добір по двох протилежних напрямках у різних групах п'явок. Перший напрямок - одержання чисельного дрібного потомства, друге - малочисельного крупного. Об'єктом прямого добору доцільно вибрати ознаку з більш високою успадковуваністю - масу нитчаток. Можливє проведення тандемного добору за кожній ознаці по черзі. При доборі на зменшення маси нитчаток варто очікувати збільшення середньої кількості нитчаток у коконах внаслідок корельованої відповіді. Невисока маса нитчаток і високі значення кількості нитчаток у коконі є оптимальними у відношенні життездатності молоді і чисельності дорослих нащадків. Результатом такого добору буде підвищення загальної чисельності потомства. При доборі на збільшення маси нитчаток варто очікувати, що середня кількість нитчаток у коконах буде зменшуватися. Загальна чисельність нащадків також зменшиться, але молодь буде мати високі темпи росту (Utevskауа, 1998) і оптимальну життєздатність. Результат такого добору - скорочення дорепродуктивного періоду і термінів досягнення п'явками медичної придатності.

Розмір кладки в медичної п'явки є ознакою з проміжним оптимумом. Оптимальне значення розміру кладки (5 коконів) при сприятливих средовищних умовах близько до середньопопуляційного (4,3 кокона). Великі кладки в умовах аквакультури виявляються невигідними в силу того, що кількість нащадків, що досягли статевої зрілості, у них виявляється нижче, ніж у кладках середнього розміру, а утримання і годівля великої кількості молоді, що загине, не досягнувши статевої зрілості та медичної придатності, потребує додаткових витрат. Селекційне збільшення розміру кладки вище встановленого оптимуму економічно невиправдане, тому добір за розміром кладки повинен бути спрямований на стабілізацію існуючого рівня і зменшення фенотипової дисперсії ознаки.

ВИСНОВКИ

1. Здійснено фенотиповий опис популяції Н. medicinalis за репродуктивними ознаками. Встановлено, що у відношенні загальної чисельності нащадків розмір кладки є ознакою з проміжним оптимумом, кількість нитчаток має оптимум в області високих значень, маса нитчаток f ознакою з проміжним песимумом. Між кількістю нитчаток у коконі і масою нитчаток існує негативна кореляція (г=-0. 40).

2. Проведено генетичний аналіз репродуктивних ознак Н. medicinalis. Встановлено, що в структурі загальної фенотипової дисперсії усіх вивчених ознак середова варіація переважає над генотиповою. Генотипова варіація обумовлена в основному аддитивною взаємодією генів. Показники успадкоємності у вузькому (h2) і широкому (Н2) розумінні рівні: для розміру кладки h2=0.35-0.40, Н2=0.40-0.45; для кількості нитчаток у коконі h2=0.33-0.36, Н2=0.Зб-0.39; для маси нитчаток h2=0.40-0.44, Н2=0.44-0.48.

3. Здійснено прогнозування результатів різноманітних типів добору за репродуктивними ознаками Н. medicinalis. Встановлено, що для всіх вивчених ознак найкращі результати очікуються при проведенні сімейного добору або масового добору з високим селекційним диференціалом.

4. Розроблено селекційну стратегію, яка спрямована на поліпшення репродуктивних властивостей штучних популяцій Н. medicinalis. Рекомендовано сполучення добору, що стабілізує, за розміром кладки з добором на збільшення або зменшення маси нитчаток.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гармаш Т.И., Утєвська О.М., Утєвський А.Ю., Утєвський С.Ю. Досвід виведення медичних п'явок у лабораторних умовах та їх використання для отримання біологічно-активних протизгортуючих з'єднань // Український вісник психоневрології. - Т. 4, Вип. 5, № 12. - Харків. - 1996. - С. 407-408.

2. Utevskaya O.M. Analysis of reproductive ability of the medicinal leech (Hirudo medicinalis) bred under laboratory conditions // Vestnik zoologii. - 1998. - V. 32, № 1-2. - Р. 119-122.

3. Утевская О.М. Генетический анализ признака "размер кладки" у медицинских пиявок // Медицина сегодня и завтра. - 1999. - № 3-4. - с.118.

4. Утевская О.М. Генетический аналіз признака "количество нитчаток в коконе" у медицинских пиявок // Вісник Харківського університету. - 2000. - № 456. - С. 107-109.

5. Утевская О.М. Оптимальные значения репродуктивных признаков медицинской пиявки в условиях искусственного разведения. Размер кладки // Вестник зоологии. - 2000.- Т. 34, № 4-5. - С. 65-72

6. Утевская О.М. Генетический анализ признака "масса нитчаток" у медицинских пиявок // Вісник Харківського університету. - 2001. - № 506. - С. 256-258.

7. Утевская О.М. Репродуктивные характеристики медицинской пиявки, разводимой в лабораторных условиях // Проблемы биотерапии. - Москва. - 1998. - С. 51-61.

8. Утевская О.М., Гармаш Т.И., Веселовская Е.В., Шляхова А.В. Оценка влияния неблагоприятных температурных условий на репродуктивные характеристики медицинской пиявки // Актуальные проблемы современной науки в исследованиях молодых ученых г.Харькова. - Харьков: АО "Бизнес Информ". - 1998. - С. 211-212.

9. Утєвська О.М. Перспективи використання медичних п'явок в лікуванні захворювань із спадковою схильностю // Матеріали науково-практичної конференції "Сучасний стан медичної генетики в Україні". - Київ. - 1999. - С. 142-143.

10. Utevskaya O.M. The inheritance of the reproductive characters of the medicinal leech // Materials of conference of genetics and molecular biology. - Lviv. - 2000. - P. 132.

Утєвська О.М. Генетичний аналіз репродуктивних ознак медичної п'явки. - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.15 - генетика / Харківський національний університет, Харків, 2000 р.

Вивчено фенотипова мінливість та успадкування репродуктивних ознак медичних п'явок - розміру кладки, кількості нитчаток у коконі, маси нитчаток. Між кількістю нитчаток у коконі та іхньою масою виявлено нелінійна негативна кореляція (r=-0,4). Встановлено, що в структурі фенотипової дисперсії вивчених ознак середова дисперсія переважає над генотиповою. Генетично обумовлена мінливість визначається в основному аддитивними взаємодіями генів і в незначному ступені - внутрішньолокусним домінуванням. Показник успадкоємності у вузькому розумінні h2 розміру кладки дорівнює 0,35-0,40, кількості нитчаток у коконі - 0,35, маси нитчаток - 0,42. Визначено і рекомендовано в якості меж штучного добору оптимальні значення репродуктивних ознак, що відповідають найбільшій чисельності нащадків. Показано можливість скорелірованих відповідей на добір у парі ознак "кількість нитчаток у коконі - маса нитчаток". Дано прогноз ефективності різноманітних засобів добору, розроблено комплекс селекційних заходів щодо підвищення ефективності розмноження H. medicinalis.

Ключові слова: медична п'явка, Hirudo medicinalis, розмноження, кокони, нитчатки, успадкоємність, добір.

Утевская О.М. Генетический анализ репродуктивных признаков медицинской пиявки. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика / Харьковский национальный университет, Харьков, 2000 г.

Представленная работа посвящена изучению наследования репродуктивных признаков медицинских пиявок и поиску путей их селекционного улучшения. Изучена фенотипическая изменчивость и получены параметры распределения размера кладки (=4.3±0.2, s=1.7, CV=40%, As=0.23±0.25, Ex=0.19±0.51), количества нитчаток в коконе (=10.9±0.3, s=4.6, CV=42%, As=0.31±0.15, Ex=0.23±0.30), массы нитчаток (=32.0±0.3, s=14.9, CV=47%, As=1.38±0.05, Ex=3.32±0.11). Установлено, что между количеством нитчаток в коконе и их массой существует нелинейная отрицательная корреляция (r=-0,40, h=0,86). Выявлена сильная положительная корреляция между первоначальной массой нитчаток и их массой после первого кормления (r=0,96), а также между массой нитчаток и прибавкой массы (r=0,69).

Установлено, что в структуре фенотипической дисперсии изученных признаков средовая дисперсия преобладает над генотипической. Генетически обусловленная изменчивость определяется в основном аддитивными взаимодействиями генов и в незначительной степени внутрилокусным доминированием. Факторами средовой изменчивости являются температура в период откладки коконов, плотность содержания пиявок, особенности питания и размер материнских особей.

В общей изменчивости размера кладки доля генотипической дисперсии составляет более 40%, средовой - до 60%. Аддитивный компонент генотипической дисперсии - 35-40%, доминантный - до 5%. Вся средовая дисперсия является межсемейной. В изменчивости количества нитчаток в коконе доля генотипической дисперсии составляет 33-39%, доля средовой дисперсии - 61-67%. Аддитивный компонент генотипической дисперсии - 33-36%, доминантный - 3%. В изменчивости массы нитчаток доля генотипической дисперсии составляет 40-52%, средовой - 52-56%. Аддитивный компонент генотипической дисперсии - 40-44%, доминантный - до 8%. Внутрисемейный компонент средовой дисперсии - 52%, межсемейный - до 4%. Показатели наследуемости в узком (h2) и широком (H2) смыслах равны: для размера кладки h2=0,35-0,40, H2=>0.40; для количества нитчаток в коконе - 0,35 и 0,36 соответственно; для массы нитчаток - 0,42 и 0,46 соответственно.

На основании полученных результатов сделан прогноз эффективности различных способов отбора. Для изученных признаков рекомендовано проведение семейного отбора при наличии больших семейств или массового отбора с высоким значением селекционного дифференциала. Массовый отбор по размеру кладки при 5% интенсивности дает ответ 0,8 стд. отклонений. При 5% отборе по количеству нитчаток ожидается ответ 0,6-0,7 стд. отклонений. Ответ на 11,5% отбор по массе нитчаток составляет 0,5-0,8 стд.отклонений. Семейный отбор становится эффективнее массового при следующих размерах семей: для размера кладки - не менее 4 особей, количества нитчаток в коконе - не менее 5, массы нитчаток - не менее 8.

Показана вероятность скоррелированных ответов на отбор в паре признаков "количество нитчаток в коконе"-"масса нитчаток". Генетическая корреляция этой пары признаков имеет высокую отрицательную величину (r=-0,80). Следует ожидать, что отбор по признаку "размер кладки" не будет сопровождаться заметными изменениями по другим признакам; отбор по признаку "количество нитчаток в коконе" не будет сопровождаться изменениями по признаку "размер кладки", но приведет к отрицательно скоррелированному ответу по признаку "масса нитчаток"; отбор по признаку "масса нитчаток" не будет сопровождаться изменениями по признаку "размер кладки", но приведет к отрицательно скоррелированному ответу по признаку "количество нитчаток в коконе". Показано, что при определенных условиях возможно более быстрое достижение результата за счет косвенного отбора в паре признаков "количество нитчаток в коконе - масса нитчаток".

Определены и рекомендованы в качестве пределов искусственного отбора оптимальные значения репродуктивных признаков, соответствующие наибольшей численности потомства. Установлено, что размер кладки является признаком с промежуточным оптимумом, оптимальное значение размера кладки - 5 коконов. Количество нитчаток в коконе является признаком, оптимальные значения которого близки к физиологически максимальному пределу. Масса нитчаток - признак с промежуточным пессимумом, оптимальные значения отвечают массе менее 40 или более 60 мг.

Разработана схема селекционных мероприятий по повышению эффективности размножения H. medicinalis. Учитывая существование отрицательной корреляции (фенотипической и генотипической) между количеством нитчаток в коконе и их массой, рекомендовано проводить отбор по двум противоположным направлениям в разных группах пиявок. Первое направление - получение многочисленного мелкого потомства, второе - малочисленного крупного. Объектом прямого отбора целесообразно выбрать признак с более высокой наследуемостью - массу нитчаток. Возможно проведение тандемного отбора по каждому из признаков по очереди. Оптимальное значение размера кладки близко к среднепопуляционному. Селекционное увеличение размера кладки выше установленного оптимума экономически неоправдано, поэтому отбор по размеру кладки должен быть направлен на стабилизацию существующего уровня и уменьшение фенотипической дисперсии признака.

Ключевые слова: медицинская пиявка, Hirudo medicinalis, разведение, коконы, нитчатки, отбор.

Utevskaya O.M. Genetical analysis of the reproductive characters of the medicinal leech. - Manuscript.

Theses for a biology candidate degree, speciality 03.00.15 - genetics / Kharkov National University, Kharkov, 2000

The phenotypic variation and inheritance of the reproductive characters of the medicinal leeches (Hirudo medicinalis) were studied. Parameters of distributions were obtained for the following characters: number of cocoons per a clutch, number of hatchlings per a cocoon, weight of hatchlings. It was found that