АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ НЕЙРОХІРУРГІЇ

імені академіка А.П.Ромоданова

БАЮН ЮРІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ

УДК 616.833-001-089.12:612.017.1:616-091-092.9:259

ДИНАМІКА ІМУНОЛОГІЧНИХ ТА МОРФОЛОГІЧНИХ ПОКАЗНИКІВ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ УШКОДЖЕННІ ПЕРИФЕРИЧНИХ НЕРВІВ ТА ВИКОНАННІ РЕКОНСТРУКТИВНИХ ХІРУРГІЧНИХ ВТРУЧАНЬ

14.01.05 – нейрохірургія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

КИЇВ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті нейрохірургії імені академіка А.П.Ромоданова АМН України та на кафедрі нейрохірургії Національного медичного університету імені О.О.Богомольця МОЗ України

Науковий керівник - член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук, Заслужений діяч науки і техніки, Лауреат державної премії України, професор Цимбалюк Віталій Іванович, Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця, завідувач кафедри нейрохірургії; Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П.Ромоданова АМН України, заступник директора з наукової роботи

Офіційні опоненти - член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук, Заслужений діяч науки і техніки, професор Поліщук Микола Єфремович, Київська медична академія післядипломної освіти ім.П.Л.Шупика МОЗ України, завідувач кафедри нейрохірургії

- доктор медичних наук Сташкевич Анатолій Трохимович, Інститут травматології та ортопедії АМН України, Республіканський спінальний нейрохірургічний центр, клініка хірургії хребта, провідний науковий співробітник

Провідна установа

Одеський державний медичний університет ім.М.І.Пирогова МОЗ України, кафедра факультетської хірургії з курсом нейрохірургії, м.Одеса

Захист дисертації відбудеться 25.06.2002 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.557.01 при Інституті нейрохірургії ім.акад. А.П.Ромоданова АМН України за адресою: 04050, м.Київ, вул.Мануїльського, 32.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту нейрохірургії ім. акад.А.П.Ромоданова АМН України (04050, м.Київ, вул.Мануїльського, 32)

Автореферат розісланий 22.05.2002 року

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради доктор медичних наук __________________________ Чеботарьова Л.Л.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Численні статистичні дані свідчать про збільшення кількості травматичних уражень нервів кінцівок за останні 10-15 років, що призводить не тільки до порушення функції останніх, але й часткової або повної втрати працездатності. При цьому у осіб молодого, працездатного віку частота таких травм перевищує 6%, що є не тільки клінічною, а й соціальною проблемою (Цымбалюк В.И., 1996; Чеботарева Л.Л., 1998; Лузан Б.Н., 2001). В зв'язку з цим велика увага приділяється методам відновно-хірургічного лікування даної патології. В хірургічному лікуванні травматичних ушкоджень периферичних нервів є багато нерозв'язаних проблем, до яких, зокрема, відноситься проблема відновлення нервів при їх значних ураженнях на великому протязі, де крім накладання шва необхідно проводити і трансплантацію ауто- або алогенного фрагменту нерва. Відмічено значне покращення результатів хірургічного лікування ушкоджених периферичних нервів при використанні різноманітних методів невролізу, аутопластики (Шевелев И.Н. 1990), а також трансплантації ембріональної нервової тканини (ТЕНТ) в ушкоджений периферичний нерв (Цымбалюк В.И., 1997; Сулий Н.Н.,1998; Лузан Б.Н., 2001). Водночас залишаються маловивченими зміни імунологічного статусу організму при травмі периферичного нерва, а також вплив різних ланок імунної системи на процеси відновлення функцій нервово-м'язового апарату. Крім того, практично не досліджувались імуно-морфологічні особливості посттравматичного періоду при різних видах хірургічних втручань, включаючи методи трансплантації периферичного нерва при його реконструкції. Все вищевказане дає підставу для подальшого пошуку шляхів, направлених на більш ефективне відновлення функції ушкоджених периферичних нервів.

В зв'язку з цим, тема дисертаційної роботи має як теоретичне, так і практичне значення, а впровадження результатів експериментальних наукових досліджень в клінічну практику може значно покращити результати лікування і якість життя даної категорії хворих.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Дисертаційна робота пов"язана з виконанням науково-дослідної теми Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П.Ромоданова АМН України 1999-2001 рр за № держреєстрації 0196И006537 "Розробити нові методи прискорення регенерації ушкоджених нервів шляхом поєднання хірургічних втручань з біотрансплантацією та фізико-хімічним впливом", яка була присвячена вивченню процесів регенерації ушкоджених периферичних нервів і розробці нових методів стимуляції процесів регенерації.

Мета і задачі дослідження. Метою даного дослідження є експериментальне обгрунтування нових методів лікування хворих з травматичним ушкодженням периферичної нервової системи та ролі імунореактивних процесів при різних видах трансплантації.

Поставлена мета дослідження визначила вирішення наступних задач:

1. Вивчити зміни імуно-морфологічних показників в динаміці розвитку процесу відновлення структурної цілісності ушкодженого нерва з наступною нейрорафією.

2. Вивчити зміни імуно-морфологічних показників в динаміці процесу регенерації після ушкодження нерва з наступною нейрорафією і одночасною трансплантацією ембріональної нервової тканини в зону шва субепіневрально.

3. Вивчити зміни імуно-морфологічних показників в динаміці розвитку процесу відновлення структурної цілісності ушкодженого нерва з використанням аутотрансплантації та алотрансплантації.

4. На підставі електрофізіологічних показників провести порівняльний аналіз ефективності відновлення функції нервово-м'язового апарату при різних видах хірургічних втручань.

5. На підставі отриманих даних комплексного імуно-морфо-електрофізіологічного дослідження визначити найефективніший метод відновного хірургічного лікування і визначити доцільність його використання в клінічній практиці.

Об'єкт, предмет і методи дослідження. Об'єктом дослідження є регенерація периферичних нервів при різних видах реконструктивних операцій на ушкоджених нервах.

Предметом дослідження є особливість протікання процесів регенерації ушкодженого нерва при різних видах реконструктивних хірургічних втручань з урахуванням імунного статусу організму.

В дисертаційній роботі був використаний комплекс методів: морфологічні -- електронна мікроскопія ; імунологічні ; електрофізіологічні -- стимуляційна електронейроміографія.

Статистичну обробку результатів досліджень виконували за допомогою програми математичного аналізу та обробки статистичних даних Mathcad .0™ (зареєстрована торгівельна марка компанії MathSoft CorporationСША) з визначенням середнього значення, середнього квадратичного відхилення, помилки середнього значення, довірчого інтервалу. Оцінка вірогідності отриманих даних та суттєвості відмінностей між різними групами спостережень виконувалася за допомогою критерію Стьюдента та непараметричного критерію відмінностей Уайта (Минцер О.П. 1991).

Наукова новизна отриманих даних. Вперше на підставі комплексного імунологічного, електронномікроскопічного та електрофізіологічного досліджень були встановлені закономірності змін клітинного і гуморального імунітету при експериментальному ушкодженні периферичного нерва та виконанні різних видів реконструктивних хірургічних втручань. На підставі даних імунологічного дослідження було встановлено наявність активації Т-клітинної ланки імунітету при зшиванні периферичного нерва кінець в кінець, В-клітинної ланки ѕѕ при аутотрансплантації, стерту різнонаправлену реакцію імунокомпетентних клітин ѕѕ при алотрансплантації, активацію імуносупресорної ланки імунітету та ранній розвиток нейроаутоімунної відповіді ѕѕ при використанні трансплантації ембріональної нервової тканини. Доведена найбільша ефективність відновлення функції ушкодженого нерва при використанні мікрохірургічного шва нерва з трансплантацією ембріональної нервової тканини.

Практичне значення отриманих даних. Отримані в роботі характеристики змін клітинного і гуморального імунітету можуть бути використані при розробці клініко-імунологічних показників для визначення динаміки змін імунного статусу хворих з порушенням функції периферичного нерва і контролю перебігу післяопераційного періоду при даних видах хірургічних втручань. Отримані імунологічні характеристики при різних видах відновного хірургічного лікування периферичних нервів дозволяють прогнозувати ефективність відновних процесів при використанні різних видів реконструктивних втручань з приводу ушкодження периферичних нервів. Результати дисертаційної роботи свідчать, що застосування мікрохірургічного шва нерва з трансплантацією ембріональної нервової тканини забезпечує найбільш ефективне відновлення нервово-м"язового апарату і є одним з основних методів лікування хворих з травматичними ушкодженнями периферичних нервів.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною закінченою науково-дослідною роботою. Автором був зроблений пошук та аналіз наукової літератури по темі дисертації, в тому числі і в електронних базах даних. Автор самостійно виконав хірургічні операції на лабораторних тваринах: мікрохірургічний шов нерва, ауто- та алотрансплантації периферичного нерва та субепіневральне введення ембріональної нервової тканини в ділянку шва нерва, провів забір матеріалу для морфологічного та імунологічного дослідження периферичного нерву на різних етапах післяопераційного періоду. При виконанні дисертаційної роботи автор співпрацював із співробітниками Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова: доктором мед. наук, професором А.Т. Носовим; канд. біол. наук В.А. Руденко; доктором мед. наук, професором М.І. Лісяним; доктором мед. наук Л.Л. Чеботарьовою; канд. мед. наук Б.М. Лузаном. Статистична обробка результатів дослідження виконана самостійно. Аналіз результатів та висновки обговорювалися з науковим керівником член- кореспондентом АМН України, доктором мед. наук, професором В.І. Цимбалюком. Всі розділи дисертації написані автором особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були оприлюднені на конференціях молодих вчених (Київ, 2000р., 2001р.). Дисертація пройшла апробацію на спільному засіданні Спеціалізованої вченої ради Інституту нейрохірургії імені академіка А.П.Ромоданова АМН України з кафедрами нейрохірургії Національного медичного університету імені О.О.Богомольця та Київської медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика, членами Української асоціації нейрохірургів ( 07.09.2001р.)

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані в 3 статтях у фахових наукових журналах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, п'яти розділів (огляд літератури, матеріали та методи лосліджень, результатів електронейроміографії, результатів імунологічних показників, результатів ультраструктурної будови), підсумків, висновків, списку літератури. Дисертація виконана на 135 сторінках машинопису, ілюстрована 13 таблицями та 37 рисунками. Таблиці і рисунки займають 27 сторінок.

Список літератури викладений на 24 сторінках і включає 236 джерел, із них кирилицею – 97, латиницею – 139.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи дослідження

Експериментальна робота була проведена на 170 білих щурах, самцях масою 200±±25 г. Об'єктом дослідження були сідничі нерви щурів. Згідно поставлених завдань тварин було розподілено на 4 групи.

Тваринам першої групи виконували перетин нерва на межі верхньої та середньої третини стегна з подальшою нейрорафією.

Тваринам другої групи також проводили перетин нерва з подальшою нейрорафією та трансплантацією ембріональної нервової тканини в зону шва нерва супепіневрально з 2х боків.

Тваринам третьої групи здійснювали перетин нерва у 2х місцях з виконанням аутопластики.

Тваринам четвертої групи здійснювали перетин нерва у 2х місцях як і в попередньому наведеному випадку з виконанням алопластики.

Всі види оперативних втручань виконувалися в стерильних умовах, під перитонеальним наркозом сумішшю каліпсола та реланіума на 0.9% розчину хлориду натрію в дозі 5мг/100г та 1мг/100г відповідно. Доступ до нерва виконувався в середній-верхній-нижній третині стегна по проекційній лінії, відповідно до виду пластики нерва в кожній з груп.

Після обробки операційного поля проводився розтин шкіри, потім тупо розшаровували м'які тканини за допомогою пластмасового та скляного інструментарію та виділяли сідничий нерв.

Гострим лезом виконували перетин нерва на межі верхньої та середньої третини стегна у тварин 1 та 2 груп, а у тварин 3 та 4 груп виконували перетин нерва у 2х місцях: на межі верхньої та середньої третини і нижньої та середньої третини стегна на віддалі 5 мм від першого розрізу.

Тваринам 1 групи накладалися епіпериневральні шви нерва з використанням операційного мікроскопа у кількості 3-4 атравматичною голкою з ниткою 10/0.

Тваринам 2 групи в зону шва з 2х боків субепіневрально здійснювали трансплантацію ембріональної нервової тканини з подальшою нейрорафією.

Для приготування трансплантату використовувалася тканина спинного мозку 7-8-добових щурячих ембріонів, отриманих шляхом кесарського розтину вагітної самки. В стерильних умовах у ембріонів виділявся спинний мозок із застосуванням операційного мікроскопа (збільшення у 32 рази) з використанням мікрохірургічного інструментарію. Після виділення спинний мозок ретельно звільняли від оболонок, розрізали на фрагменти розмірами 0,25-0,3мм3, відмивали в ізотонічному розчині хлориду натрію і розміщували в стерильних чашках Петрі, заповнених середовищем №199 в термостаті при температурі 37,5°°С.

Введення трансплантатів виконувалося за допомогою пристрою, що складався з градуйованої мікроподачі, мікрогвинт якої жорстко зчеплений з поршнем мікрошприца Гамільтона. До шприца приєднана поліхлорвінілова трубочка, кінець якої з'єднано зі скляною канюлею L-подібної конфігурації, що потоншувалася в дистальному напрямку. Вся система заповнюється культуральним середовищем №199. За допомогою мікрогвинта шматочок ембріональної нервової тканини об'ємом приблизно 0,25-0,3 мм3 засмоктується в кінчик скляної канюлі і поступовим зворотнім обертанням мікрогвинта "вичавлюється" в зону шва нерва. Кількість трансплантатів становила 1-2 шматочки в залежності від розміру, а об'єм трансплантації становив 0,5±±0,1 мм3 .

Контроль за регенерацією виконувався через 5, 15 та 30 діб після операції, використовували електронну мікроскопію, електронейроміографію та імунологічні дослідження. Розподіл лабораторних тварин за групами залежно від термінів та методів дослідження представлено у таблиці (табл.1).

Таблиця 1.

Розподіл лабораторних тварин за групами залежно від термінів дослідження

Експериментальні групи Термін дослідження Всього

5 діб 15 діб 30 діб

Мікрохірургічний шов нерва 10 15 15 40

Мікрохірургічний шов нерваТЕНТ 10 15 15 40

Аутотрансплантація 10 15 15 40

Алотрансплантація 10 15 15 40

Інтактні тварини 10 10

Всього 50 60 60 170

Для гістологічного дослідження нерв було умовно поділено на три ділянки: зона шва нерва, проксимальний та дистальний відділ, кожний відповідно на протязі приблизно 0,5см.

Електронномікроскопічне дослідження виконано на 60 тваринах. Для електронномікроскопічного дослідження фрагменти тканини периферичного нерва експериментальних тварин розміром близько 1х1мм3 забираються відразу після декапітації тварин, фіксуються в суміші 4% параформальдегіда, 2,5% глютаральдегіда і 4% сахарози на 0,1 молярному фосфатному буфері рН=7,4 з наступною дофіксацією в 1% розчині чотирьохокису осмію (Palladi, 1957), зневоднюються в зростаючих концентраціях етанола і оксіпропілена і заливаються в суміш епоксидних смол (епон-аралдит) за стандартними методиками електронної мікроскопії. Ультратонкі зрізи товщиною 600 А виготовляються на ультратомах ЛКБ (Швеція) і Рейхардт(Австрія). Для підвищення контрастності проводилося забарвлення по Рейнтгольдсу (1963) і препарати проглядалися в електронному мікроскопі ЕМ-400Т фірми "Philips". Для прицільного ультратомування і більш поглибленої оцінки одержаних даних з епоксидних блоків виготовляються напівтонкі зрізи товщиною 800-1000 А, забарвлюються метиленовим синім- піронином і проглядалися в світлооптичному мікроскопі Axiophot фірми "OPTON" (ФРН).

Електрофізіологічне дослідження виконано у 40 тварин, використовували комп'ютерний аналізатор біопотенціалів "B.A.S.I.S. EPM" (Італія) фірми "OTE Biomedica". Електрофізіологічне дослідження у тварин проводили за методикою, описаною раніше ( Чеботарьова Л.Л., 1998; Лузан Б.М., 2001).

Стимуляцію проводили з катода (в деяких випадках з анода) поодинокими прямокутними імпульсами постійного струму тривалістю 0,05–0,1 мс, частотою 1/с. Інтенсивність стимуляції підбиралася індивідуально, виходячи з того рівня, при якому досягали максимальної амплітуди ПД нерва та ПД м'яза і становила в середньому 25±±5 мА (30±±5 мВ). Реєстрація електрофізіологічних показників (ПД нерва та ПД м'яза) здійснювалася паралельно: одночасно на кожний стимул використовували по два канали відведення (перший — для нерва, другий — для м'яза), усереднювали по 4 відповіді. Швидкість розгортання становила 0,01 с на поділку, чутливість підсилювача — від 100 до 2000 мкВ для ПД нерва і від 100 до 10  мкВ для ПД м'яза. Смуга перепускання частот становила від 10 до 10  Гц.

Аналіз функції нервово-м'язового апарату лабораторних тварин здійснювали на підставі таких показників: латентний період ПД нерва (ЛП ПДН); амплітуда ПД нерва (амплітуда ПДН); латентний період ПД м'яза (ЛП М–відповіді); амплітуда ПД м'яза (амплітуда М–відповіді).

Імунологічне дослідження проведено на 60 тваринах. Для імунологічних досліджень тваринам проводили інгаляційний наркоз за допомогою етилового ефіру і в стерильних умовах брали для аналізу кров (приблизно 4,0 мл), котра у подальшому опрацьовувалася за стандартними методиками. Для оцінки стану імунітету у експериментальних тварин вивчали: функціональну активність Т- та В-лімфоцитів периферичної крові в реакції бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ) на конканавалін А (Кон А), декстран (Дек), активність супресорів моноцитарного ряду за показником індометацинчутливої супресії (індекс ІЧС), клітинну сенсибілізацію до антигену периферичного нерва (АгПН). В сироватці крові експериментальних тварин вивчали гуморальні аутоімунні реакції за вмістом аутоантитіл до нейроспецифічних білків (НСБ): основного білка мієліну (ОБМ), маркера глії S-100, та нейроспецифічної єнолази NSE методом твердофазного ІФА (Черенько Т.М., 1987).

Числові результати електрофізіологічного та імунологічного досліджень зводилися у таблиці. Надалі по тексту в усіх випадках, крім означених окремо, вірогідність результатів дослідження та суттєвість відмінностей в різних групах спостережень складала Р ,05.

Забій експериментальних тварин виконували згідно міжнародних нормативів гуманного ставлення до тварин, шляхом передозування тіопенталу-натрію.

Мікрохірургічний шов нерва

Згідно отриманим в роботі даним при накладанні мікрохірургічного шва найбільш виражені морфологічні зміни спостерігаються на 5-15 добу після операції в ділянці шва нерва і дистальному відділі нервового волокна. Ці зміни характеризуються вираженими дистрофічно-деструктивними змінами загальної маси аксонів з їхнім розпадом за типом валерівської дегенерації і вогнищевою деструкцією шванівських клітин за типом вакуольної або ліпідної дистрофії. При цьому в периваскулярних ділянках наявна нерізко виражена запальна лімфоїдно-клітинна інфільтрація, що співпадає з даними імунологічного дослідження, яке засвідчило зростання майже в 2 рази спонтанної проліферативної активності лімфоцитів на 5-15-ту добу після операції, в основному, за рахунок збільшення Т-клітинної ланки імунітету, оскільки проліферативна активність В-лімфоцитів в ці терміни дослідження знижувалась відносно контролю майже в 2 рази. Дещо збільшеною в ці терміни була і супресорна активність моноцитів. На 5-15 добу після експерименту відбувається і активація гуморальної ланки імунітету. Перш за все, відносно контролю зростає рівень аутоантитіл до НСБ, і зокрема до ОБМ, де рівень аутоантитіл до даного антигена збільшується на 5-ту добу після операції майже в 4 рази по відношенню до контролю, а до NSE майже в 2 рази. Все це свідчить про те, що після хірургічного втручання на периферичному нерві в перші 5-15 діб відмічаються виражені дистрофічно-деструктивні зміни в структурі периферичного нерва з переважанням процесів демієлінізації і порушенням структурної цілісності нервового волокна, що узгоджується з даними імунологічного дослідження , отриманими в роботі. Підтвердженням цьому є і вивчення порушення і відновлення функції ушкодженого нерва електронейрофізіологічними методами дослідження. Згідно отриманим електофізіологічним даним, швидкість проведення імпульса по нервовому волокну (ЛП ПДн) знижується відносно контролю майже в 2 рази і становить 51,3% від вихідного рівня, а амплітуда ПД нерва зменшується відносно контролю майже в 3 рази, що підтверджує наявність досить виражених процесів дистрофічного характеру в перші 5-15 діб після хірургічного втручання на периферичному нерві. Через 30 діб після накладання мікрохірургічного шва, згідно отриманим морфологічним даним, спостерігається відновлення структурної цілісності ушкодженого нерва з посиленням фібробластичної активності і формуванням сполучно-тканинного рубця в зоні ушкодженого нерва. При цьому спостерігаються зміни і з боку імунологічного статусу організму. Зокрема, відбувається нормалізація показника спонтанної проліферативної активності лімфоцитів, оскільки показник проліферативної активності останніх на 30-ту добу повністю відновлюється. Дещо підвищеним залишається показник активності індометацинчутливих супресорів, а також проліферативна активність лімфоцитів на антиген периферичного нерва, що свідчить про процеси репаративного характеру, котрі відбуваються в периферичному нерві. Про це свідчить і підвищення рівня аутоантитіл до ОБМ, що вказує на відновлення структурної цілості мієлінових оболонок, оскільки згідно даним електронно-мікроскопічного дослідження в численних шванівських клітинах досить інтенсивно проходять процеси внутрішньоклітинної репаративної регенерації. Підтвердженням цьому є і електронейроміографічні показники функціональної активності ушкодженого нерва. Зокрема, на 30-у добу після накладення мікрохірургічного шва, швидкість проведення імпульса по нерву на 15-ту добу після операції, збільшується в1,3 рази і складає 65,5% від контрольного рівня, а амплітуда ПД нерва, яка вказує на рівень відновлення функції нерва, збільшується відносно даного терміну дослідження більш ніж в 1,6 рази. Важливим є те, що згідно отриманим електрофізіологічним даним амплітуда М-відповіді, зростає відносно 15-тої доби після операції, більш ніж в 3,5 рази і складає 71,3% відносно контрольного рівня.

Все вищевказане свідчить про те, що при накладанні мікрохірургічного шва на ушкоджений периферичний нерв в перші 15 діб після операції спостерігається активація як клітинної, так і гуморальної ланки імунітету, переважно за рахунок Т-субпопуляції лімфоцитів, що пов'язане з наявними деструктивними змінами структури периферичного нерва. До 30-тої доби після операції спостерігається відновлення морфофункціонального стану і структурної цілості ушкодженого периферичного нерва в середньому на 65-70% відносно вихідного рівня. При цьому нормалізується клітинна ланка імунітету на тлі підвищення активності гуморальної ланки імунітета.

Мікрохірургічний шов нерва з трансплантацією ембріональної нервової тканини

Імплантація ембріональної нервової тканини в зону шва при травматичному ушкодженні периферичного нерва має ряд характерних особливостей в порівнянні з проведенням операції накладання мікрохірургічного шва кінець в кінець. Перш за все, при морфологічному дослідженні встановлено, що на відміну від накладання шва нерва без трансплантації ембріональної нервової тканини (перша група) уже на 15-ту добу після операції в зоні шва і дистальному відділі нервового волокна спостерігалося зниження периневрального набряку, а також помітні вогнища демієлінізації окремих аксонів при наявності вогнищевої запальної інфільтрації, де переважають лімфоцити і макрофаги, які розміщуються не тільки біля мікросудин, але і вздовж нервових волокон.

При електронномікроскопічному дослідженні встановлено, що вже на 15-ту добу після введення ембріональної нервової тканини у всіх відділах нервового волокна спостерігається гіперплазія шванівських клітин як в зоні рубця, так і в дистальному відділі ушкодженого нерва. Було встановлено, що відростки шванівських клітин проникають по периневральним просторам і оточують окремі нервові волокна. В значній кількості зустрічаються гіпертрофовані шванівські клітини з явищами внутрішньоклітинної репаративної регенерації. При цьому при дослідженні імунологічного статусу організма в перші 15 діб після трансплантації ембріональної нервової тканини спостерігається активація спонтанної проліферативної активності лімфоцитів, що і визначається підвищенням більш ніж в 4 рази. Досить високою є супресорна активність моноцитів (зростає в 1,5 рази), а також проліферативна активність лімфоцитів на антиген периферичного нерва (в 3,1 рази).

Щодо гуморальної ланки імунітету, то тут також спостерігається збільшення рівня аутоантитіл в крові до НСБ, і зокрема, до ОБМ і S-100 майже в 1,5 рази, а рівень аутоантитіл до NSE ѕѕ майже в 2 рази, порівняно з контролем. Ці імунологічні показники частково корелюють з наявними процесами дистрофічного і відновного характеру і процесами проліферації в структурі периферичного волокна в перші 15 діб після введення ембріональної нервової тканини і щільно пов'язані з процесами де- і ремієлінізації нервового волокна, оскільки, згідно морфологічним даним, уже, починаючи з 5-тої доби після введення ембріональної нервової тканини, спостерігається процес ремієлінізації нервових волокон. Щодо функціональної активності ушкодженого периферичного нерва, то згідно даним електроміографічного дослідження, в цей термін дослідження швидкість проведення імпульса по нерву (ЛП ПДн) складає 60,8% від контрольного рівня, що майже в 1,2 рази вище, ніж в попередній групі дослідження, що також свідчить про протікання в нерві процесів репаративного характера, що підтверджується і електрофізіологічними показниками амплітуди ПД нерва. Вже на 15-ту добу після введення ембріональної нервової тканини цей показник складає 46,2%, що також в 1,2 рази вище, чим при накладанні мікрохірургічного шва без трансплантації ембріональної нервової тканини. При введенні ембріональної нервової тканини в 1,4 рази збільшується швидкість проведення імпульса по руховим нервовим волокнам і в 1,16 рази збільшується амплітуда М-відповіді, що вказує на наявність репаративних процесів в м'язових волокна, зв'язаних з реінервацією останніх. На 30-ту добу після трансплантації ембріональної нервової тканини у всіх відділах нервового волокна, що вивчаються (шов нерва, проксимальний і дистальний відрізки), спостерігалося посилення процесів регенерації з проліферацією шванівських клітин і відновленням мієлінової оболонки. Морфологічно в зоні шва численні активовані шванівські клітини утворюють тяжі, між якими наявні новоутворені осьові циліндри.

При введенні ембріональної нервової тканини дещо знижується проліферативна активність фібробластів, ніж в попередній групі дослідження, що запобігає розвитку грубого сполучно-тканинного рубця в зоні шва. В зоні шва спостерігається виражена гіперплазія шванівських клітин. В цей термін дослідження практично повністю відновлюється структурна цілість проксимального відрізка нервового волокна, а в дистальному відрізку ще наявні поодинокі деструктивно змінені нервові волокна.

Проведені імунологічні дослідження засвідчили зниження проліферативної активності Т- і В-лімфоцитів на 30-ту добу при наявності досить високої спонтанної проліферації лімфоцитів. Мало чим відрізняється від контрольного рівня супресорна активність, практично до вихідного рівня знижується активність гуморальної ланки імунітета в порівнянні з 15-тою добою після трансплантації ембріональної нервової тканини. Таким чином, отримані в дослідженні імунологічні показники клітинної і гуморальної ланки імунітета, свідчать про те, що введення ембріональної нервової тканини викликає посилення процесів регенерації ушкодженого нерва а також активації проліферативних процесів в імунній системі, пригнічення проліферативної активності Т- і В-субпопуляцій лімфоцитів, змінює активність супресорів моноцитарного ряду, знижує розвиток аутоімунних реакцій (останнє, безперечно є наслідком проліферації клітин сполучно-тканинного ряду), і є однією з причин швидшої регенерації та відсутності в зоні шва грубого сполучно-тканинного рубця.

Доказом останнього є дані електронейроміографічного дослідження функціональної активності нервового волокна. Так, на 30-ту добу після трансплантації ембріональної нервової тканини швидкість проведення імпульса по нерву (ЛП ПДн) досягає 81,6% від вихідного рівня, підвищуючись в порівнянні з 15-тою добою більш ніж в 1,3 рази і згідно даним статистичної обробки результатів, недостовірне в порівнянні з контролем. Про процеси відновного характеру, що мають місце в ушкодженому периферичному нерві в зв'язку з введенням ембріональної нервової тканини, на відміну від попередньої групи дослідження, свідчить наявне збільшення амплітуди ПДн відносно 15-тої доби після операції в 1,6 рази, а в порівнянні з попередньою групою дослідження (шов нерва без трансплантації ембріональної нервової тканини) ѕѕ в 1,2 рази. При введенні ембріональної нервової тканини процеси репаративного характеру відбуваються і в денервованих м'язових волокнах, оскільки електрофізіологічний показник амплітуди М-відповіді на 30-ту добу складає 80,1% від вихідного рівня, що майже в 3,5 рази вище, чим на 15-ту добу після трансплантації ембріональної нервової тканини, а швидкість проведення імпульса по руховим нервам складає 80,6%, на відміну від 50,2% в попередньому терміні дослідження, тобто зростає в 1,6 рази.

Таким чином, імплантація ембріональної нервової тканини в зону шва ушкодженого нерва по всім показникам, що вивчалися (морфологічне, імунологічне, електронейроміографічне дослідження), посилює репаративно-відновні процеси в ушкодженому нерві і, тим самим, сприяє якнайшвидшому і ефективнішому відновленню функціональної активності ушкодженого нерва кінцівки. Це обумовлено тим, що трансплантація ембріональної нервової тканини, згідно отриманим нами даним, сприяє повноцінному відновленню мікроциркуляторного судинного русла в ділянці ушкодження, посиленню процесів регенерації з пригніченням проліферативної активності сполучно-тканинних клітин в нерві та пригнічення функції Т- і В-лімфоцитів, що сприяє зменшенню розміру сполучно-тканинного рубця, що в тій чи іншій мірі узгоджується з рядом проведених раніше дослідженнь (Лосева Е.В., 1996; Отелин В.А., 1999; Полежаев Л.В., 1986; Цимбалюк В.І., 1996; Brundin P., 1986; Kozlova E.N., 1997; Misiewicz B., 1997; Nonner D., 1996; Tsymbaliuk V.I., 1996).

Аутотрансплантація периферичного нерва

Метод аутотрансплантації периферичного нерва, який досить часто використовується в клінічній практиці, згідно отриманим в дослідженні даним, має свої характерні морфологічні особливості, оскільки при його використанні накладається 2 шви ѕѕ в проксимальному і дистальному відділах ушкодженого нерва. В зв'язку з цим морфологічно визначаються 5 ділянок периферичного нерва: проксимальний відрізок нерва, проксимальний шов, аутотрансплантат, дистальний шов, дистальний відрізок периферичного нерва. На підставі проведеного дослідження встановлено, що якщо в зоні проксимального шва процеси регенерації нерва пов'язані з проліферацією шванівських клітин, починаються на 15-ту добу після аутотрансплантації, то в ділянці дистального шва і аутотрансплантата дані процеси спостерігаються лише на 30-ту добу. Характерним для дистального шва є підвищена проліферація клітин сполучно-тканинного ряду з наявністю лімфоїдноклітинної запальної інфільтрації і формуванням до 30-тої доби після аутотрансплантації сполучно-тканинного рубця з наявністю великої кількості колагенових волокон, котрі проникають по периневральним просторам. При цьому в зоні дистального шва найбільш виражені процеси деструкції нервових волокон з утворенням мікроневром, які практично відсутні в зоні проксимального шва. Таким чином, на підставі морфологічного дослідження встановлено, що при аутотрансплантації як в ділянці проксимального, так і в зоні дистального шва, спостерігаються різного ступеня вираженості процеси периневрального фіброза.

Показники клітинного імунітету при аутотрансплантації периферичного нерва характеризувалися наростаючою спонтанною проліферацією лімфоцитів, яка досягала найвищих показників лише на 30-ту добу після аутотрансплантації, при цьому підвищуючись відносно контрольного рівня в 3,3 рази. Найбільш різке підвищення СПЛ спостерігалось на 15-ту добу після операції. При цьому проліферативна активність як В-, так і Т-лімфоцитів була найбільш вираженою на 15-ту добу після аутотрансплантації (збільшувалась відповідно в 1,4 і 1,6 рази), з наступною нормалізацією показників до 30-тої доби. Щодо супресорної активності моноцитів, то остання підвищувалась лише на 5-ту добу після аутотрансплантації, а на 15-ту і 30-ту добу була нижчою ніж у контрольній групі. В гуморальній ланці імунітету мають місце зміни, аналогічні клітинній ланці імунітету. Тобто найвищі показники рівня аутоантитіл до ОБМ і S-100 визначалися на 15-ту добу після аутотрансплантації, що свідчить про ранню активацію аутоімунних процесів. Щодо титра аутоантитіл до NSE, то даний показник зростає відразу ж після аутотрансплантації, практично не знижуючись до 30-тої доби після хірургічного втручання. Таким чином, слід вважати встановленим, що при аутотрансплантації активність як клітинної, так і гуморальної ланки імунітету і особливо спонтанної проліферації лімфоцитів виявлялася лише на 15-ту добу після хірургічного втручання і залишалася практично незмінною до 30-тої доби, що свідчить про запізнілий початок процесів регенерації лише після двотижневого післяопераційного періоду, та значні дегенеративні зміни. Ці дані узгоджуються з даними електрофізіологічних та морфологічних досліджень. Останні також вказують на активацію репаративно-відновних процесів на 15-ту добу після аутотрансплантації периферичного нерва. Електрофізіологічні дослідження засвідчили, що показник амплітуди ПД нерва, тобто активність виникаючих в нерві процесів репаративного характеру, зростає з 15-тої до 30-ї доби на 26% із збільшенням швидкості проведення імпульса по нерву (ЛП ПДн) більш ніж на 10%, що безперечно є свідченням наявних в периферичному нерві процесів репаративного характеру. Показник амплітуди М-відповіді, який вказує на активність репаративних процесів у м'язових волокнах після денервації останніх, на 15-ту добу після аутотрансплантації досить різко зростає (з 12,5% до 59,8%, тобто майже в 5 разів), що свідчить про високу активність процесів регенерації в денервованих м'язових волокнах, а швидкість проведення імпульса по руховим волокнам збільшується в дещо меншій мірі (12%), що свідчить про деяку невідповідність наявних в нерві і м'язі процесів регенерації.

Таким чином, отримані морфологічні, імунологічні і електрофізіологічні дані щодо динаміки та інтенсивності процесів репаративного генеза при аутотрансплантації периферичного нерва засвідчили, що найінтенсивніше дані процеси проходять досить пізно, лише після двотижневого післяопераційного періода з поступовим зростанням до 30-тої доби після хірургічного втручання на 15-20% відносно попереднього терміну дослідження. В порівнянні з контролем функціональна активність ушкодженого нерва відновлюється до 30-тої доби, в основному, на 50-55%, що значно нижче, ніж у попередніх групах тварин.

Алотрансплантація периферичного нерва

Морфологічно встановлено, що в перші 5 діб після алотрансплантації, виявлені структурні зміни в нервовому волокні майже не відрізняються від попередньої групи дослідження (аутотрансплантація). На 15-ту добу після алотрансплантації спостерігаються досить виражені зміни деструктивного характеру, зокрема, тромбування загальної маси мікросудин, в просвіті яких часто наявні лімфоцити. Загальна маса нервових волокон демієлінізована, а вздовж деструктивно змінених нервових волокон виявляється лімфоїдноклітинна запальна інфільтрація. При цьому імунокомпетентні клітини знаходяться в стані підвищеної функціональної активності. При електронно-мікроскопічному дослідженні відмічена деструкція шванівських клітин. На 30-ту добу після алотрансплантації, як в дистальному, так і в проксимальному шві спостерігається майже повна демієлінізація осьових циліндрів з розпадом останніх. Повсюдно зустрічаються вогнища лімфоїдноклітинної запальної інфільтрації з включенням амілоїда. Проведені імунологічні дослідження засвідчили, що проліферативна активність лімфоцитів, переважно за рахунок Т-клітинної субпопуляції, визначається лише на 15-ту добу після алотрансплантації з різким падінням цього показника на 30-ту добу. Щодо проліферативної активності В-лімфоцитів, то на відміну від Т-лімфоцитів, на 15-ту добу після алотрансплантації остання знижується майже в 1,6 рази, з наступним зростанням до 30-тої доби. Супресорна активність моноцитів підвищується лише на 30-ту добу. Аналогічні дані були отримані і за показником проліферації лімфоцитів на мозковий антиген периферичного нерва. Щодо гуморальної ланки імунітету, то при алотрансплантації нерва до 30-тої доби збільшується рівень аутоантитіл до гліального білка S-100 і NSE майже в 2 рази в порівнянні з контрольним рівнем. Все вищевказане свідчить про переважання процесів деструктивного характеру над відновними, що підтверджується даними морфологічного дослідження, що вказує на стійкі прогресуючі деструктивні зміни в алотрансплантованому периферичному нерві, і електроміографічним дослідженням, за даними якого на 15-ту добу після алотрансплантації електрофізіологічні показники нервового імпульса і амплітуди ПД нерва знижувались в 7 разів, а амплітуди ПД м'язу ѕѕ в 12 разів відносно контрольних величин, а на 30-ту добу дані показники не були зареєстровані, що свідчить про порушення цілісності периферичного нерва.

ВИСНОВКИ

1. Експериментальне вивчення різних відновних методів лікування, а саме, шов нерва, трансплантація ембріональної нервової тканини, ауто- та алопластики за даними морфологічних, електрофізіологічних та імунологічних досліджень показало, що найбільш ефективним є накладання мікрохірургічного шва з трансплантацією ембріональної нервової тканини, хороші показники отримані при накладанні мікрохірургічного шва без трансплантації ембріональної нервової тканини, задовільні показники отримані при аутотрансплантації нерва.

2. Імунологічне дослідження встановило, що при травматичному ушкодженні периферичного нерва спостерігаються динамічні зміни в різних ланках імунної системи, характер яких залежить від виду хірургічного втручання та терміну дослідження; визначення характеру імунних зрушень при різних видах хірургічного втручання на периферичному нерві, дозволяє в певній мірі прогнозувати темп і ефективність відновних процесів

3. При ушкодженні периферичного нерва в імунній системі спостерігалися зміни як в загальній клітинній та гуморальній ланках імунітету, так і розвиток аутоімунних реакцій до антигенів периферичного нерва. Максимальні прояви змін в імунній системі відмічаються на 15 добу після ушкодження нерва і корелюють з морфологічними змінами в ушкоджених нервах.

4. Трансплантація ембріональної нервової тканини в зону ушкодженого нерва модулює прояви імунних змін, викликаючи гальмування Т- і В-клітинної проліферації та активування супресорної активності клітин і спонтанної проліферативної активності вже на 5 добу після ушкодження.

5. При інших видах нейрохірургічного втручання – шов нерва, ауто- та алопластика нерва, відбувається активація Т- і В-клітинної відповіді в дещо більш пізні терміни та відмічається високий рівень аутоантитіл до нейроспецифічних антигенів в різні терміни дослідження.

6. У всіх групах тварин, що вивчалися протягом перших 5-ти діб в зоні шва і дистальному відділі периферичного нерва переважають дистрофічно-деструктивні морфологічні зміни структури нервових волокон з порушенням цілісності шванівських клітин на тлі порушеного мікроциркуляторного кровообігу і невираженої лімфоїдноклітинної інфільтрації. Починаючи з 15-тої доби у дистальних та проксимальних відділах периферичного нерва, що досліджуються, виявлені процеси репаративного характеру у вигляді відновлення ультраструктури і активації шванівських клітин і відновлення структури нервового волокна на тлі відновлення мікроциркуляторного судинного русла і зниження лімфоїдноклітинної інфільтрації. До 30-тої доби в зоні шва формується сполучно-тканинний рубець, що складається з колагенових волокон.

7. При ТЕНТ після порушення цілісності нервового волокна в зоні шва і дистальному відділі наявні процеси відновного характеру, що виявляються вже на 5-ту добу, які характеризуються вогнищевою проліферацією шванівських клітин, що значно зростає до 15-тої доби після початку експерименту. При цьому в даний термін дослідження в зоні шва спостерігається регенерація осьових циліндрів на тлі вогнищевого, переважно безклітинного, склерозу, з наявністю невеликої кількості колагенових волокон.

8. При аутотрансплантації периферичного нерва найвираженіші зміни деструктивного характеру спостерігаються в зоні дистального шва, де на 30-ту добу після аутотрансплантації наявні як досить виражені дистрофічно-деструктивні зміни, так і процеси регенеративного характеру. В проксимальному відрізку шва в цей термін структурна цілісність ушкодженого нерва практично відновлюється, проте і в дистальному, і в проксимальному шві наявна досить виражена колагенізація шва і запальна лімфоїдноклітинна інфільтрація.

9. Оцінюючи ефективність відновних процесів в нервово-м'язовому апараті ушкодженого периферичного нерва при різних видах хірургічного втручання на підставі електронейроміографічних показників можна констатувати, що найвищий ступінь відновлення спостерігався при накладанні мікрохірургічного шва з трансплантацією ембріональної нервової тканини

10. На підставі проведеного комплексного дослідження для впровадження в клінічну практику можна рекомендувати накладання мікрохірургічного шва з використанням трансплантації ембріональної нервової тканини, а для прогнозування ефективності відновних процесів можна рекомендувати визначення показників імунного статусу з урахуванням нейроаутоімунних реакцій.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Цимбалюк В.І., Носов А.Т., Баюн Ю.В., Васлович В.В. Ультраструктурна характеристика ушкодженого периферичного нерва при ауто- і алотрансплантації // Шпитальна хірургія.—2001.—№3.—С.96—99.

2. Цимбалюк В.І., Лісяний М.І., Руденко В.А., Баюн Ю.В. Зміна клітинного імунітету при експериментальному травматичному ушкодженні периферичної нервової системи // Ліки України.—2001.-- №9.—С.58—61.

3. Цимбалюк В.І., Носов А.Т., Баюн Ю.В., Лузан Б.М., Васлович В.В. Ультраструктурна характеристика ушкодженого периферичного нерва при трансплантації ембріональної нервової тканини // Український нейрохірургічний журнал.—2001.--№4.—С.142-146.

АНОТАЦІЯ

Баюн Ю.В. Динаміка імунологічних та морфологічних показників при експериментальному ушкодженні периферичних нервів та виконанні реконструктивних хірургічних втручань.—Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.05—нейрохірургія. Інститут нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова АМН України, Київ, 2002.

Робота присвячена одній з найбільш актуальних та складних, однак мало вивчених проблем, пов'язаних зі зміною імунологічних показників при травмі периферичних нервів.