УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ ТА БІОТЕХНОЛОГІЇ

Чернявська Тетяна Олексіївна

УДК 635.21.:631.442./4+633

ЕКОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ БІОХІМІЇ ВТОРИННОГО ОБМІНУ РОСЛИН КАРТОПЛІ

03.00.16 - екологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

КИЇВ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Сумському національному аграрному університеті

Міністерства аграрної політики України

Науковий керівник - кандидат біологічних наук, доцент

Чіванов Вадим Дмитрович,

Сумський національний аграрний університет

завідувач відділом біохімії Інституту проблем

картоплярства північно-східних регіонів

України в складі СНАУ

Офіційні опоненти: академік УААН, доктор біологічних наук, професор

Прістер Борис Самуїлович,

головний науковий співробітник лабораторії

контрзаходів і реабілітації забруднених земель

Українського науково-дослідного інституту

сільськогосподарської радіології Мінагрополітики

кандидат біологічних наук

Петюх Григорій Павлович,

заступник директора Інституту агроекології

та біотехнології УААН

Провідна установа – Полтавська державна аграрна академія Мінагрополітики України

Захист відбудеться “ 19 ” червня 2002 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01 в Інституті агроекології та біотехнології УААН за адресою: 03143, м.Київ, вул. Метрологічна, 12.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту агроекології та біотехнології УААН за адресою: 03143, м.Київ, вул. Метрологічна, 12.

Автореферат розісланий “ 16 ” травня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Заякіна Г.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження біохімічних характеристик сільськогосподарських рослин в умовах агроекологічних систем “абіотичні та біотичні фактори навколишнього середовища > рослина > продукція рослинництва” і характер змін зазначених характеристик унаслідок впливу ксенобіотиків техногенного походження, фітопатогенів і шкідників набувають останнім часом особливої актуальності. Обумовлено це тим, що сукупність різноманітних абіотичних і біотичних факторів навколишнього середовища (погодно-кліматичні умови, комахи-шкідники, фітопатогени, ксенобіотики антропогенного походження) впливає на параметри вторинного метаболізму рослин. У свою чергу, вторинні метаболіти, зокрема стероїдні глікоалкалоїди рослин картоплі (Solanum tuberosum L.), багато в чому визначають як біологічні характеристики рослин (рівні їх резистентності щодо дії негативних факторів навколишнього середовища), так і якісні показники продукції рослинництва (підвищена кількість цих сполук надає бульбам картоплі токсичних властивостей).

Зв'язок роботи з науковими програмами. Дослідження виконувались згідно з державною тематикою Сумського національного аграрного університету: тема № 16 “Створити нові сорти картоплі, придатні для виготовлення високоякісних продуктів переробки і зберегти їх генетичний потенціал сучасними методами насінництва”, номер державної реєстрації 0195V010235 (1995-1997 р. р.); тема № 16 “Створити інтенсивні сорти картоплі і розробити сучасні технології виробництва, збереження і поглибленої переробки”, номер державної реєстрації 0198V003633 (1998-2000 р. р.), роботі в рамках проекту “М'якоіонізаційна мас-спектрометрія в агробіології” (грант Міжнародного Наукового Фонду № QSU084219, 1998 р.; керівник к.б.н., Чіванов В.Д.).

Мета: Метою досліджень є вивчення характеру впливу абіотичних і біотичних факторів навколишнього середовища, у тому числі і ксенобіотиків техногенного походження, на обмін вторинних метаболітів рослин картоплі різних сортів і гібридів, що культивуються в умовах північного сходу України, з наступною розробкою деяких попереджувальних заходів щодо оптимізації технологій одержання екологічно чистої картоплі в підданих дії ксенобіотиків агроекосистемах.

Для реалізації мети вирішувались такі завдання:

1. Розробка нових методичних підходів в галузі аналітичної біохімії вторинних метаболітів рослин картоплі, з використанням сучасних фізико-хімічних методів, зокрема біологічної м'якоіонізаційної мас-спектрометрії.

2. Вивчення в порівняльному аспекті напрямку і характеру впливу абіотичних та біотичних факторів навколишнього середовища на кількісні і якісні параметри вторинних метаболітів рослин та ферменти, які беруть участь в метаболізмі останніх, картоплі різних сортів.

3. Визначення характеру викликаних дією абіотичних/біотичних факторів навколишнього середовища змін параметрів активності ферментів гідролітичної деструкції СГА, а також встановлення того, чи можуть зміни зазначених параметрів служити індикаторами наявності і виразності “стресових умов” для рослин картоплі, що культивуються в конкретних умовах.

Об'єкт дослідження - селекційний матеріал картоплі та рослини картоплі районованих та місцевих сортів, що вирощуються в Лісостеповій зоні.

Предмет дослідження – метаболізм стероїдних глікоалкалоїдів в тканинах рослин картоплі та його зв'язок з умовами навколишнього середовища.

Методи дослідження. Визначення стероїдних глікоалкалоїдів в тканинах рослин картоплі проводили методами м'якоіонізаційної мас-спектрометрії.

Наукова новизна. Вивчені особливості вторинного обміну рослин картоплі в умовах Лісостепової зони та характер залежності параметрів вторинного обміну від дії абіотичних та біотичних факторів навколишнього середовища в агроекологічних системах. Вперше отримані результати, що свідчать про істотні розходження якісних і кількісних параметрів вторинних метаболітів, які синтезуються в рослинах картоплі різних сортів, внаслідок впливу фітостресових абіотичних і біотичних факторів. Вперше розроблений метод оцінки фізіологічного стану рослин картоплі в агроекологічних системах на основі мас-спектрометричного дослідження реактивності ферментативних систем гідролітичної деструкції вторинних метаболітів картоплі. Розроблено математичну модель для прогнозування вмісту вторинних метаболітів в бульбах продовольчої картоплі різних сортів, які вирощуються в умовах Лісостепової зони.

Практичне значення роботи. Розроблені методики визначення СГА в рослинах картоплі та картоплепродуктах за допомогою м'якоіонізаційної мас-спектрометрії, що визнані за офіційні Міністерством аграрної політики України. Отримані в рамках дисертаційної роботи результати використані при:

а) розробці і впровадженні комплексних планів розвитку рослинництва Лісостепової зони в аспекті запобігання ксенобіотичного і біоценотичного забруднення агроекологічних систем; б) оцінці якісних параметрів продовольчої картоплі в харчовій і переробній промисловості співробітниками контрольних установ, що контролюють якість харчових продуктів; в) прогнозуванні рівнів резистентності рослин картоплі різних сортів і перспективних гібридів до фітопатогенів і шкідників в умовах Лісостепової зони; г) доборі міжвидових гібридів (S.tuberosum x дикоростучі види роду Solanum) рослин картоплі як вихідного матеріалу для подальшого використання в селекційному процесі.

Особистий внесок здобувача. Полягає у проведенні польових та лабораторних досліджень, розробці методики аналізу СГА рослин картоплі мас-спектрометричними методами, отриманні результатів та аналізуванні експериментальних даних зі статистичною їх обробкою на ЕОМ. Висновки зроблені особисто здобувачем.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень були викладені на науково-практичній конференції “Нове в насінництві картоплі” (Мінськ, 2000); 15th International Mass Spectrometry Conference, (Barcelone, 2000), на річних наукових конференціях Сумського національного аграрного університету та Інституту проблем картоплярства Північно-Східного регіону України в складі СНАУ (Суми, 1997-2001).

Публікація результатів досліджень. За результатами досліджень опубліковано 13 наукових праць та авторське свідоцтво.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 178 сторінках комп'ютерного набору, ілюстрована 15 таблицями, 37 рисунками і складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, яка складається з 6 розділів, висновків, додатку, списку використаної літератури з 286 джерел, у тому числі 190 зарубіжних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

На основі аналізу наукової літератури обґрунтоване підвищення значущості в агроекологічному аспекті групи вторинних метаболітів рослин, оскільки саме вторинний обмін відрізняється підвищеним рівнем лабільності і чутливо “відгукується” на вплив фітостресових факторів навколишнього середовища різного генезису, у тому числі й антропогенних, шляхом оперативних змін кількісного/якісного складу зазначених метаболітів. Вторинним метаболітам, в тому числі стероїдним глікоалкалоїдам (СГА) рослин картоплі, належить істотна роль у забезпеченні рівнів резистентності рослин певних сортів щодо хвороб та шкідників, а також показників якості рослинницької продукції.

Матеріали, об'єкти і методи досліджень

Дослідження проведені в 1997-2001 р. р. з використанням 30 сортів та 80 дикоростучих видів картоплі, а також рослин картоплі районованих та місцевих сортів, характерних для Лісостепової зони на дослідних полях Сумської обласної сільськогосподарської дослідної станції, а також виробничих посівах картоплі господарств різних форм власності Сумської області.

Польові дослідження здійснювали згідно з методичними рекомендаціями щодо проведення досліджень з картоплею (Київ, 1983). Вторинні метаболіти в зразках рослин картоплі визначали за допомогою як загальноприйнятих, так і оригінальних методик, розроблених за участю здобувача, на основі різних видів біологічної м'якоіонізаційної мас-спектрометрії: часопролітної плазмено-десорбційної мас-спектрометрії з іонізацією осколками розподілу 252Cf (PDMS) (мас-спектрометр біологічний “МСБХ”, ВАТ SELMI, Україна; лазерної мас-спектрометрії (MALDI-MS) (VG Instruments, Великобританія і мас-спектрометрії з іонізацією електророзпилюванням (ESI-MS) (“Mariner”, США). Токсикологічні параметри СГА рослин картоплі визначали за Туржовою Є.Б., та ін., 1993. Математичне моделювання залежності змін реакцій метаболізму СГА від впливу факторів навколишнього середовища проводили відповідно до робіт Насонової А.А. і Мухамбетова Л.Х., 1992 і Мудрого І.В. та ін., 2000. Статистичну обробку експериментального матеріалу проводили на основі пакетів Statistica v.5.11 for WIN95/NT і S-PLUS v.4.5 Pro, для побудови графічних компонентів використовували пакети Sigma Plot 4.01 for WIN95/NT та Curve Expert.

Результати досліджень та обговорення

Розробка нових методичних підходів в сфері аналітичної біохімії вторинних метаболітів рослин картоплі

На основі сучасних різновидів МІ-МС: плазмено-десорбційної мас-спектрометрії (PDMS), мас-спектрометрії з лазерною десорбцією/іонізацією і використанням органічних матриць (MALDІ-MS) і електророзпилювальної мас-спектрометрії “Electrospray” (ESІ-MS) розроблені оригінальні методики визначення СГА, антоціанових пігментів і інших вторинних метаболітів картоплі (рис.1).

Використання МІ-МС дозволило уперше вирішити задачу визначення і однозначної ідентифікації як основних (б-соланін і б-чаконін), так і “мінорних” (лептини I, II, III і IV, лептиніни I, II, III і IV, a, b-соламарин, комерсонін, демісин, томатин) СГА в одному зразку без попереднього очищення. Оскільки технології МІ-МС дозволяють проводити вимірювання кінетичних параметрів (зокрема, час напівдеструкції t1|2 СГА) ферментативної деструкції СГА в рослинних тканинах і модельних системах, на цій основі розроблені нові методики для проведення екотоксикологічної оцінки стану рослин картоплі в агроекологічних системах, визначення ступеню резистентності рослин картоплі різних сортів до фітопатогенів, комах-шкідників, промислових забруднювачів, а також прогнозування ефективності нових фунгіцидів стосовно збудників захворювань картоплі. Основою цих методик є мас-спектрометричне вимірювання активності ферментів гідролітичної деструкції СГА та проведення корелювання величин зазначеної активності з потужністю впливу фітостресових абіотичних/біотичних факторів навколишнього середовища.

Оцінка ступеню резистентності сортів картоплі до збудників хвороб та шкідників

Основу даного розділу склали матеріали з екологічної фітохімії вторинних метаболітів картоплі різних сортів і груп стиглості, які вирощувались у господарствах північного сходу України. Досліджувались змішані сорти, характерні для Сумської області, умовно розділені (на підставі характеристик вторинного обміну) на три групи: А (з високим вмістом антоціанів: Вольтман, Світанок київський, Зарєво, Українська рожева, Чарівниця, Фуксинка, Заводський, Чугунка); Б (з середнім вмістом: Луговська, Рання троянда, Рожевий з Мілет, Сотка, Синьовічка); В (Гатчинська, Темп, Невська, Агрономічна, Лорх, в яких антоціани практично відсутні). Зазначені сорти складають до 85-90% усіх сортів, культивованих в особистих підсобних господарствах Сумської області. Зразки бульб для дослідження відбирали в індивідуальних, фермерських і державних господарствах.

Дослідження, проведені нами на ряді стійких і чутливих до фітопатогенів рослин картоплі показали, що кожна група рослин характеризується визначеним типом відповідних реакцій на зараження фітопатогенами в аспекті вторинних метаболітів, зокрема СГА. Біохімічні аспекти взаємодії фітопатогенних грибів із клітинами рослин картоплі включають як ключовий компонент детоксифікуючий вплив спеціалізованих ферментних систем грибів на "захисні" біомолекули вражених рослин, до яких зокрема належать СГА. Так, Phytophthora infestans (Mont.) de Bary і Fusarium oxysporum spp. індукують інтенсивну гідролітичну деструкцію СГА картоплі в процесі інвазії, викликаючи в такий спосіб утрату ними фунгіцидних властивостей. Якщо негативний вплив фітопатогенів “накладається” на характерну для конкретного сорту картоплі підвищену активність рамнозидази і родинних ферментів, то підсумовування зазначених факторів створює оптимальні умови для повної нейтралізації фунгіцидної активності СГА за короткий проміжок часу. Навпаки, сорти картоплі, що характеризуються низькою активністю гідролітичних ферментів, протистоять фітопатогенам протягом більш тривалого проміжку часу, і є, таким чином, порівняно стійкими до фітопатогенів. Виходячи з того, що показані достовірні розходження між рівнями активності гідролітичних ферментних систем рослин картоплі різних сортів (Чіванов В.Д., 1999; Chivanov V.D.et al., 2000), здавалася припустимою наявність зв'язку між швидкістю деструкції молекул СГА в тканинах рослин, обумовленою сумарною активністю ферментних систем рослин і фітопатогенів і ступенем резистентності сортів картоплі до зазначених фітопатогенів. Чим більше активність внутрітканинної рамнозидази картоплі конкретного сорту, тим менше резистентність рослин цього сорту стосовно фітопатогенів, оскільки частина деструкованих за час Т СГА на одиницю маси тканини (SСГАт) дорівнює сумі СГА, деструкованих фітопатогенами і прийнятих за константу в даних умовах (СГАф) і СГА, деструкованих рамнозидазою і спорідненими ферментами, активність яких є функцією від сорту (СГАр).

Таким чином, визначаючи активність рамнозидази тканин картоплі конкретного сорту можна орієнтовно визначити ступінь резистентності зазначеного сорту до фітопатогенів (Кожушко Н.С., Чіванов В.Д., 1998).

Розроблено метод на основі МІ-МС, що дозволяє проводити прогнозування ступеня стійкості нових чи районованих сортів картоплі стосовно розповсюдженого шкідника картоплі колорадського жука, базуючись на якісних і кількісних показниках фракції СГАmin листя, зокрема лептину І.

Наші дослідження показали, що пріоритетним фактором, відповідальним за підвищений ступінь резистентності рослин стійких сортів картоплі до колорадського жука (Leptinotarsa decemlineata (Say.), є лептини і у першу чергу, лептин І. Як кількісний вміст лептину І у тканинах листів картоплі, так і стехіометричне співвідношення “Сумарні “мінорні” СГА / Лептин I” (Лептин I, % від СГАmin) тісно пов'язані зі ступенем резистентності рослин картоплі даного сорту до колорадського жука. Величина показника “лептин I, % від СГАmin”, характерного для відносно стійких стосовно шкідника сортів картоплі Світанок київський і Луговська складає 85,7% і 76,3%, відповідно. Для сортів, що сильно ушкоджуються колорадським жуком, Молодіжна і Фреско цей показник не перевищував 13,6% і 16,1%. Середньостійкі сорти Українська рожева, Жуковська рання і Невська характеризуються проміжними величинами показника “лептин I, % від СГАmin” - 54,2%, 58,9 і 54,6% відповідно.

Дослідження впливу факторів навколишнього середовища на параметри вторинних метаболітів і параметри активності деяких гідролітичних ферментів

З рис. 2 можна бачити, що вміст СГА в бульбах картоплі всіх трьох груп (А, Б, В) набуває тенденції до різкого підвищення в двох випадках:

1 - сполученні знижених температур протягом сезону вегетації з високим рівнем опадів і відповідно підвищеним рівнем вологості (1993 р.);

2 - сполученні підвищених температур протягом сезону вегетації, особливо травня, червня і липня з малою кількістю опадів (1998, 1999).

Характерно, що високий рівень опадів протягом першої половини вегетаційного сезону, що не супроводжується зниженням температури повітря, вірогідно не впливав на вміст СГА в бульбах картоплі (1996, 1997 р.).

Більш виражена відповідь на сполучення двох факторів – температури повітря і рівня атмосферних опадів характерна для картоплі групи В; рослини, умовно віднесені нами до групи А, навпаки, накопичують СГА в бульбах зі значно меншою інтенсивністю. Рослини картоплі, що належать до групи Б, характеризуються проміжними значеннями біохімічної “відповіді” на дію погодно-кліматичних факторів (рис.2).

Важливими у практичному відношенні є результати, що вказують на той факт, що рослини картоплі груп “Б” і “В” найбільшою мірою мають здатність накопичувати надлишкові кількості СГА в декількох (n=6-8) бульбах з вибірки (100 зразків), причому простежується явна залежність між кількістю “збагачених” СГА бульб і погодно-кліматичних факторів: сполучення прохолодної погоди і підвищеної кількості опадів збільшує можливість появи у вибірках бульб, що представляють небезпеку у токсикологічному аспекті. Дещо в меншій мірі сприяє формуванню окремих бульб із підвищеним вмістом СГА сполучення підвищеної температури і малої кількості опадів: кількість бульб, збагачених б-соланіном і б-чаконіном у небезпечних кількостях, не перевищує 5-6 на вибірку з 100 бульб.

Рослини картоплі групи “А”, навпаки, становлять найменшу небезпеку отруєння, оскільки кількість бульб з підвищеним вмістом СГА в аналогічній вибірці в середньому менше 4,0 (n<4,0).

Характер “відповіді” рамнозидази бульб на зміни погодно-кліматичних умов полягає в зміні активності ферменту: підвищена активність рамнозидази зареєстрована в тканинах рослин картоплі протягом сезонів вегетації 1993, 1998 і 1999 р., що характеризуються: а) сполученням зниженої температури і підвищеної вологості (1993 р.) і б) підвищеної температури і малою кількістю опадів. У тканинах рослин картоплі, що належать до групи В, активність рамнозидази під дією зазначених факторів підвищується на 30% в 1998, 1999 р. та на 40% в 1993 р. (в порівнянні з контролем). Відповідний параметр для рослин групи Б складає 10-12% в 1998, 1999 р., та 20% в 1993 р., а для рослин групи А: 2-5 (1998, 1999 р.) - 5 (1993 р.) % від контролю. У тканинах рослин групи А, і в дещо меншій мірі групи Б, активність рамнозидази знижується на 8-10% в порівнянні з контролем (1995-1997 рр.). За контроль тут і нижче приймали значення відповідного параметра, зареєстровані в 1991 р. Одне із пояснень у зміні метаболізму СГА, як функції від погодно-кліматичних умов полягає в тому, що біосинтез вторинних метаболітів рослинного походження в цілому, і СГА зокрема, істотно змінюється внаслідок впливу як абіотичних, так біотичних факторів навколишнього середовища. Метою зазначених змін на рівні вторинного обміну є адаптація рослин на біохімічному рівні до умов, що змінилися (Harborne J.B., 1993; 1999).

З іншого боку, вторинні метаболіти можуть бути індикаторними речовинами, зміна якісних/кількісних характеристик яких свідчить про фітострес (Генкель П.А., 1983) тієї чи іншої сили, якому піддана рослина. З фітостресом рослин пов'язана зміна в активності рамнозидази, яка, як правило, підвищується при стресі, що й відбивається на функціонуванні клітин і тканин (Немова Н.М., 2001).

Результати вивчення мінорних стероїдних глікоалкалоїдів (СГАmin) як найважливіших компонентів, включених у біохімічні механізми резистентності рослин до фітопатогенів і комах-шкідників картоплі, представлені на рис. 3, з якого легко бачити, що група сортів картоплі “А” містить більшу кількість СГАmin у бульбах у порівнянні з групами “Б” і, особливо “В”. Різке збільшення кількості СГАmin, характерне для бульб рослин групи “В”, отриманих протягом контрастних сезонів вегетації, не характерно для груп “А” і “Б”. Таким чином, кількість СГАmin в меншій мірі пов'язана зі змінами погодно-кліматичних умов. Важливими абіотичними факторами навколишнього середовища, що порушують вторинний обмін рослин, є деякі ксенобіотики: важкі метали, оксиди сірки, фториди і т.д.

Наведені дані докладно характеризують вплив оксидів сірки і фтористих сполук (джерело ВАТ “Сумихімпром”) Доведено, що радіус зони максимальної втрати врожаю картоплі варіює від 1,9 до 4,2 км. Чільним фактором, відповідальним за зниження врожаю є оксид сірки SO2 у концентраціях 0,10-0,30 мг/м3. У наших експериментах отримані дані свідчать про те, що, по-перше, врожай картоплі вірогідно знижується тільки за умови культивування рослин у безпосередній близькості від джерела техногенного забруднення і, по-друге, ступінь зазначеного зниження залежить від сорту.

Рівняння регресії (1), що зв'язує врожайність картоплі сортової групи “А” (Y, ц/га) з відстанню від джерела забруднень атмосферного повітря (ВАТ “Сумихімпром”, км, (x1); вмістом сумарних СГА в бульбах; мг/100 г сирої маси тканини бульби, (x2); вмістом СГАmin у бульбах; % від маси сумарної фракції СГА, (x3); показником б-чаконін:б-соланін (Ч:С) (бульба), (x4); показником Ч:С (листя), (x5); активністю рамнозидази, % від контролю, (x6); вмістом проліну в листі, % від контролю, (x7) і активністю пероксидази, % від контролю, (x8) має такий вигляд:

Y=543,26+0,70x1-0,84x2-0,73x3+0,79x4+0,85x5-0,75x6-0,91x7-0,58x8 (1)

F=172,628; p=0,0051; R2=0,9819

Рівняння регресії, що пов'язує врожайність картоплі сортової групи “Б” з відстанню від того ж джерела забруднень атмосферного повітря, має подібний вигляд (2).

Y=423,13+0,86x1-0,85x2-0,89x3+0,81x4+0,84x5-0,71x6-0,90x7-0,63x8 (2)

F=115,221; p=0,0042; R2=0,9975

Відповідне рівняння регресії для картоплі сортової групи “В”:

Y=562,42+0,92x1-0,89x2-0,90x3+0,82x4+0,88x5-0,84x6-0,95x7-0,87x8 (3)

F=128,328; p=0,00049; R2=0,9993

Дуже значущою в практичному аспекті є виразна тенденція до падіння врожайності сортів картоплі, що належать до груп “Б” і “В”, на відстанях 7-10 км від джерела забруднення в порівнянні з відповідним показником, характерним для рослин картоплі тих же сортів, але вирощених в умовно-чистих зонах. Розрахунки показали, що недобір врожаю картоплі, обумовлений використанням сортів, чутливо реагуючих на вплив полютантів атмосферного повітря, складає 8-10% від потенційного.

Метод фізіологічної оцінки стану рослин картоплі в агроекосистемах

Метод базується на дослідженні методом МІ-МС кінетичних параметрів ферментативної деструкції СГА гідролітичним ферментом рослин картоплі-рамнозидазою і полягає в проведенні порівняння кінетичних параметрів ферментативної деструкції основних і мінорних СГА рослин картоплі, культивованих: а) у контрольованих умовах (у закритому ґрунті) і б) в умовах даної агроекологічної системи (Кожушко Н.С., Чіванов В.Д., 1998). На підставі експериментальних даних роблять висновок про фізіологічний стан рослин картоплі, культивованих в умовах конкретної агроекосистеми і підданих стресовим впливам тієї чи іншої сили. Так, якщо крива активності рамнозидази, отримана при дослідженні дослідної рослини картоплі збігається з аналогічною кривою, характерною для контрольної рослини картоплі тієї ж сортової групи, підданої стресовому впливу, наприклад, переохолодженню або впливу посухи, можна зробити висновок про те, що дана дослідна рослина також переживає стрес у даних умовах вирощування.

Прогнозування ступеня токсичності бульб картоплі для ссавців і рівнів резистентності рослин щодо хвороб і шкідників

Нами отримані експериментальні матеріали, що дозволили сформулювати загальну тенденцію змін орієнтованої середньолетальної дози СГА (ЛД50) як функції від фітохімічних параметрів рослин картоплі і погодно-кліматичних умов поточного сезону вегетації. Показник ЛД50 бульб картоплі всіх груп сортів знижується паралельно з підвищенням вмісту сумарних СГА і СГАmin у бульбах, падінням активності рамнозидази і підвищенням кількості опадів. Зниження середньодобової температури призводить до підвищення токсичності бульб. Найбільшу потенційну небезпеку в токсикологічному аспекті представляють бульби картоплі сортових груп “Б” і “В”, отримані протягом несприятливих сезонів вегетації (підвищена вологість у сполученні з низькою середньодобовою температурою, чи навпаки, посуха в сполученні з високою середньодобовою температурою); (група сортів “Б”: 1993 50 мг/500 г маси бульб: група сортів “В” 1993, 1994, 1998, 1999 - 97,00, 52,25, 61,65 і 73,55 мг СГА на 500 г маси бульб, відповідно) (рис.4).

Характерно, що СГА різної хімічної природи істотно розрізняються за ступенем мембранолітичної активності. Так, на рис. 5 приведені результати експериментів по визначенню мембранолітичної активності фракції СГА стосовно загальноприйнятого як модельних об'єкти - еритроцитів. Найвищий показник зазначеної активності притаманний фракції СГА, отриманої з бульб картоплі дикоростучого виду S.demissum, що містять у великій кількості СГА демісин. Трохи менший вплив роблять СГА б-, в-, г-чаконіни, отримані з бульб дикоростучих видів S.chacoense і S.andigenum (рис. 5).

Фракціям СГА, отриманим з бульб сучасних високопродуктивних сортів картоплі Світанок київський, Луговської і Невської, виведених за участю згаданих дикоростучих видів, також притаманна мембранолітична активність (55-65% від відповідного показника активності СГА дикоростучих видів). Навпаки, для СГА, отриманих з бульб картоплі сорту Лорх, виражена мембранолітична активність не характерна (рис. 5).

Таким чином, токсичний ефект СГА рослин картоплі стосовно ссавців багато в чому обумовлений мембранолітичною дією сумішей основних і “мінорних” СГА, які присутні в рослинах картоплі у визначених стехіометричних відношеннях, що залежать, у свою чергу, від абіотичних/біотичних факторів навколишнього середовища.

Математична модель прогнозування вмісту вторинних метаболітів у бульбах картоплі різних сортів, культивованих в умовах Лісостепової зони

Отримані рівняння регресії, виходячи з яких можливе проведення розрахунків кінцевих ефектів для будь-якого поєднання абіотичних/біотичних факторів, що впливають на інтенсивність накопичення СГА в бульбах продовольчої картоплі з наступним упорядкуванням факторів за ступенем їх впливу на інтенсивність накопичення СГА в бульбах (Y). Зазначеними факторами є: середньодобова температура повітря (х1); водопостачання (х2); освітленість (х3); азот (N) (х4); калій (K) (х5); фосфор (P) (х6); гербіциди (х7); інсектициди (х8); фунгіциди (х9); механічне ушкодження листя рослин картоплі (х10); ушкодження листя личинками колорадського жука; важкі метали (х12).

Отримані такі рівняння регресії:

ранньостиглі сорти

Y=- 523,97+3,46x1+3,46x2+0,45x3+0,19x4+0,20x5+0,46x7+…

… +0,39x8+0,34x9+0,52x11+0,21x12 (4)

F=21,12 p=0,000043 R2=0,96

середньоранні сорти

Y=- 476,17+3,63x1+3,14x2+1,92 x3+0,57x8+0,19x4+0,20x5+0,66x7+…

… +0,19x9+0,83x11+0,20x12 (5)

F=26,82 p=0,000079 R2=0,95

середньостиглі сорти

Y=-519,59+3,29x1+3,33x2+0,415x3+0,412x8+0,36x7+0,16x9+…

+0,45x11+0,16x12 (6)

F=27,16 p=0,00005 R2=0,96

середньопізні сорти

Y=-425,81+3,13x1+3,19x2+0,38x3+0,33x8+0,41x11 (7)

F=28,219 p=0,00003 R2=0,94

пізні сорти

Y=-357,53+3,54x1+3,51x2+1,24x3+0,13x11 (8)

F=22,211 p=0,00027 R2=0,93

Найбільшу небезпеку в токсикологічному відношенні являють ранньостиглі і середньоранні сорти картоплі, оскільки на інтенсивність накопичення сумарних СГА в бульбах рослин зазначених груп сортів робить виражений вплив найбільша кількість абіотичних/біотичних факторів.

Для ранньостиглих і середньоранніх сортів значущими факторами, що збільшують вміст СГА в бульбах, є, поряд із пріоритетними для всіх груп сортів погодно-кліматичними умовами: температурою (x1) і водопостачанням (x2), а також рівень освітленості (х3), вміст у ґрунті азоту (х4), калію (х5), гербіцидів (х7), інсектицидів (х8) і важких металів (Cd) (х12).

Особлива роль серед перерахованих факторів належить такому потужному стресовому впливу на рослини картоплі, як механічне і хімічне ушкодження листів личинками колорадського жука (х11).

Для середньоранніх сортів картоплі дуже важливе значення має також вміст гербіцидів у ґрунті. Відносно середньостиглих сортів картоплі слід зазначити відсутність впливу на вміст СГА в бульбах азоту (х4) і калію (х5) при одночасному збереженні значимості інших вищенаведених факторів. Середньопізні сорти картоплі є в ще більшій мірі “резистентними” до факторів, що індукують накопичення сумарних СГА: крім азоту (х4) і калію (х5) втрачають значимість також типові ксенобіотики - гербіциди (х7), фунгіциди (х9) і важкі метали (х12).

Нарешті, пізні сорти картоплі накопичують підвищені кількості сумарних СГА лише у випадках впливу на рослини протягом сезону вегетації екстремальних величин факторів наступних факторів: температури (x1), водопостачання (x2), рівня освітленості (х3) і механічного та хімічного ушкодження листів личинками колорадського жука (х11).

ВИСНОВКИ

1. Розроблено нові методичні підходи в аналітичній біохімії вторинних метаболітів рослин картоплі на основі сучасного фізико-хімічного методу дослідження - біологічної м'якоіонізаційної мас-спектрометрії (МІ-МС).

2. Використання МІ-МС дозволило вперше в Україні та країнах СНД вирішити задачу визначення і однозначної ідентифікації в одному зразку як основних (б-соланін і б-чаконін), так і “мінорних” (лептини I, II, III і IV, лептиніни I, II, III і IV, б, в-соламарин, комерсонін, демісин, томатин) СГА, а також антоціанових пігментів в рослинах картоплі.

3. За допомогою МІ-МС вивчені напрямок і характер впливу абіотичних та біотичних стресорних факторів навколишнього середовища на кількісні і якісні параметри стероїдних глікоалкалоїдів (СГА) бульб рослин різних сортів картоплі.

4. Експериментально доведено, що вміст СГА в бульбах картоплі досліджених сортів, різко підвищується в умовах знижених температур протягом сезону вегетації при поєднанні з підвищеним рівнем вологості, а також при поєднанні підвищених температур протягом сезону вегетації з пониженим рівнем вологості.

5. Показано існування негативного корелятивного зв'язку (r=-0,78--0,97) між ступенем резистентності картоплі різних груп сортів до стресорних факторів навколишнього середовища і рівнями активності ферментів гідролітичної деструкції СГА, локалізованих у тканинах рослини.

6. Встановлено, що найбільш значимими стресовими факторами навколишнього середовища, які інтенсифікують процеси нагромадження СГА в бульбах картоплі, є (по низхідній): погодно-кліматичні умови сезону вегетації а ушкодження листків рослин колорадським жуком а фітопатогени а ксенобіотики.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

Результати досліджень можуть бути використані в НДІ, що спеціалізуються на проблемах агроекології, селекції картоплі із залученням дикоростучих видів або із застосуванням методів генетичної інженерії та державних контрольних установах, що займаються сертифікацією та стандартизацією продуктів харчування (Держстандарт, СЄС). Пропонується, за зразком відповідних служб країн Західної Європи, починати процедуру стандартизації продовольчої картоплі з оцінки вмісту в бульбах токсичних вторинних метаболітів, згідно з методичними рекомендаціями (Чіванов В.Д., Чернявська Т.О. Токсичні метаболіти рослин картоплі: еколого-біохімічні аспекти. – Суми, 2001.-103 с.), схваленими науково-методичною радою Міністерства аграрної політики України (секція виробництва, переробки і збереження продукції рослинництва; протокол №16 від 26 червня 2001 р.)

Матеріали досліджень можна використовувати в навчальному процесі у ВНЗах сільськогосподарського профілю ІІІ-IV рівнів акредитації (курси фізіології і біохімії рослин, ветеринарної токсикології, стандартизації продукції рослинництва, основ переробки продукції рослинництва).

Вдячність. Автор роботи висловлює вдячність Лауреату державної премії, заслуженому діячеві науки і техніки України, д.с.-г.наук, професору М.Д.Гончарову, д.с.-г.н., професору Н.С.Кожушко, д.с.-г.наук А.А.Підгаєцькому, пост-доку Університету шт. Арізона, к.ф.-м.н. С.О.Аксьонову та аспіранту ІПФ НАНУ О.М.Калінкевичу за консультативну та експериментальну допомогу.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Чернявська Т.О. Метаболізм стероїдних глікоалкалоїдів та нематодостійкість картоплі // Вісник аграрної науки.-2001.-№4.-С.77-79.

2. Чернявська Т.О. Глікоалкалоїди трансгенних сортів картоплі: особливості метаболізму в умовах Північно-східної України // Вісник Сумського державного аграрного університету. Серія “Агрономія і біологія”. Вип. 5. Суми, 2001.- С.130-133.

3. Чернявська Т.О., Чіванов В.Д. Вплив фунгіцидів на глікоалкалоїди картоплі // Вісник Сумського державного аграрного університету: Серія: Агрономія і Біологія. -1999. - № 3. - С.117-121 (Участь у проведенні досліджень, узагальненні та аналізі експериментальних даних, формулюванні висновків і пропозицій).

4. Чернявська Т.О., Чіванов В.Д., Калінкевич О.М. Особливості метаболізму глікоалкалоїдів у квітках рослин картоплі різних сортів // Вісник аграрної науки. – 2000.- №3. – С.28-30 (Участь у проведенні досліджень, узагальненні та аналізі експериментальних даних, формулюванні висновків і пропозицій).

5. Chivanov V.D., Aksionov S.A., Kalinkevitch A.N., Kabanetz V.M., Cherniavskaya T.A. / The use of ESI-MS, MALDI-MS and PDMS soft-ionization mass spectrometry to study the glycoalkaloids in potato breeding // Book of abstracts of the XV International Mass Spectrometry Conference, Aug.-Sept., 2000. – Barcelone.– PA-C10-02 (Узагальнення та аналіз експериментальних даних, проведення розрахунків, формулювання висновків).

6. Чиванов В.Д., Чернявская Т.А., Калинкевич А.Н., Аксенов С.А. Изучение “минорных” гликоалкалоидов картофеля методом электрораспылительной масс-спектрометрии (MS-ESI) в аспекте идентификации сортов картофеля / Материалы научно-практической конференции “Новое в семеноводстве картофеля” (11-14 июля 2000, Самохваловичи) Минск, 2000.- С.53-54 (Узагальнення та аналіз ескпериментальних даних).

7. Чиванов В.Д., Чернявская Т.А. Увеличение концентрации гликоалкалоидов в клубнях картофеля разных сортов вследствие повреждения вегетирующих растений колорадским жуком (Leptinotarsa decemlineata Say.) / там же, С.102-103 (Проведення польових досліджень, участь в проведенні лабораторних досліджень, узагальненні та аналізі експериментальних даних, формулюванні висновків і пропозицій).

8. Чиванов В.Д., Чернявская Т.А., Калинкевич А.Н. Активность рамнозидазы в цветках растений картофеля разных сортов и ее связь с уровнем резистентности к фитопатогенам / там же, С.103-104 (Проведення польових досліджень, участь в проведенні лабораторних досліджень, узагальненні та аналізі експериментальних даних, проведенні розрахунків та формулюванні висновків).

9. Чернявська Т.О., Чіванов В.Д. Активність рамнозидази в квітках рослин картоплі різних сортів та її зв'язок з рівнем резистентності щодо фітопатогенів // Вісник Сумського державного аграрного університету. Серія “Агрономія і біологія”. Вип. 4. Суми, 2000.-С.257-265 (Проведення польових досліджень, участь в проведенні лабораторних досліджень, узагальненні та аналізі експериментальних даних, формулюванні висновків і пропозицій).

10. Чернявська Т.О., Чіванов В.Д. Вміст глікоалкалоїдів в листках картоплі різних сортів та його зв'язок зі ступенем пошкодження рослин колорадським жуком // Картоплярство: Міжвідомчий тематичний науковий збірник – К.: Урожай, 2000. - Вип. 30. – С.215-226 (Проведення польових досліджень, участь в проведенні лабораторних досліджень, узагальненні і аналізі експериментальних даних та формулюванні висновків).

11. Чіванов В.Д., Чернявська Т.О. Біохімія вторинних метаболітів рослин картоплі в умовах Лісостепу // Вісник аграрної науки. – 2001.- №5. – С.25-27 (Участь в проведенні лабораторних досліджень, узагальненні та аналізі експериментальних даних, формулюванні висновків та підготуванні тексту для друку).

12. Чіванов В.Д., Чернявська Т.О. М'якоіонізаційна мас-спектрометрія в дослідженні вторинних метаболітів картоплі // Вісник Сумського державного аграрного університету. Серія “Агрономія і біологія”. Вип. 5. Суми, 2001.- С.115-119 (Участь в проведенні лабораторних досліджень, узагальненні та аналізі експериментальних даних, формулюванні висновків та підготуванні тексту для друку).

13. Бердіна І.В., Чіванов В.Д., Чернявська Т.О. Дослідження впливу типів грунтів та їх техногенного забруднення радіонуклідами на вторинний обмін рослин картоплі // Вісник Сумського державного аграрного університету. Серія “Агрономія і біологія”. Вип. 5. Суми, 2001.- С.139-141 (Участь в проведенні польових та лабораторних досліджень, узагальненні та аналізі експериментальних даних, формулюванні висновків та підготуванні тексту для друку).

14. Чіванов В.Д., Чернявська Т.О. Токсичні метаболіти картоплі: еколого-біохімічні аспекти (Методичні рекомендації).-Суми: СОД “Козацький вал”, 2001.-100 с. (рекомендовані до впровадження НТР Міністерства аграрної політики України (протокол №16 від 26 липня 2001 р.).

15. “Мас-спектрометричний спосіб прогнозування ефективності фунгіцидів щодо хвороб картоплі”, Авторське свідоцтво 7A01C21/00, №2000063550 від 20.06.2000 р. (Україна).

Чернявська Т.О. Екологічні аспекти біохімії вторинного обміну рослин картоплі. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.16 – екологія. - Інститут агроекології та біотехнології НАНУ, Київ, 2002 .

Дисертація присвячена вивченню особливостей вторинного обміну рослин картоплі та характеру залежності параметрів вторинного обміну від дії абіотичних та біотичних факторів навколишнього середовища в агроекологічних системах. Роботу виконано з використанням сучасних методів м'якоіонізаційної мас-спектрометрії, які дозволяють досліджувати нелетючі, термолабільні біомолекули, зокрема стероїдні глікоалкалоїди. Проведена порівняльна оцінка якісних і кількісних параметрів вторинних метаболітів, які синтезуються в рослинах картоплі різних сортів, внаслідок впливу фітостресорних абіотичних і біотичних факторів, характерних для північного сходу України. Розроблені теоретичні та експериментальні засади методу екотоксикологічної оцінки стану рослин картоплі в агроекологічних системах на основі мас-спектрометричного дослідження реактивності ферментативних систем гідролітичної деструкції вторинних метаболітів картоплі. Побудована математична модель для прогнозування вмісту вторинних метаболітів в бульбах продовольчої картоплі різних сортів та груп стиглості.

Ключові слова: вторинні метаболіти, картопля (Solanum tuberosum L.), стероїдні глікоалкалоїди, стресорні фактори, мас-спектрометрія.

Чернявская Т.А. Экологические аспекты биохимии вторичного обмена растений картофеля. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.16 – экология. - Институт агроэкологии и биотехнологии НАНУ, Киев, 2002 .

Диссертация посвящена изучению характера влияния абиотических и биотических факторов окружающей среды, в том числе и ксенобиотиков техногенного происхождения, на биохимические характеристики, в частности параметры обмена вторичных метаболитов, растений картофеля разных сортов и гибридов, культивируемых в условиях северо-востока Украины. Получены результаты, свидетельствующие о существенных различиях качественных и количественных параметров вторичных метаболитов, синтезируемых в растениях картофеля различных сортов, индуцируемых фитострессорными абиотическими и биотическими факторами окружающей среды, как неспецифическими, так и характерными для Лесостепной зоны. Впервые разработан метод экотоксикологической оценки состояния растений картофеля в агроэкологических системах на основе масс-спектрометрического исследования реактивности ферментативных систем гидролитической деструкции вторичных метаболитов картофеля на примере СГА. Исследование проведено с использованием новых методических подходов в аналитической биохимии растений, впервые разработанных автором и апробированных в лабораторных и производственных условиях. Разработана математическая модель для прогнозирования содержания вторичных метаболитов в клубнях продовольственного картофеля различных сортов, культивируемых в условиях северо-востока Украины. Содержание суммарных СГА в тканях клубней картофеля является, при условии идентичности всех элементов технологии выращивания культуры картофеля, переменной величиной, зависящей от: а) сортовых особенностей (генотипа) растений и б) влияния биотических/абиотических стрессорных факторов окружающей среды на протяжении сезона вегетации. Установлено, что наиболее значимыми стрессорными факторами окружающей среды, которые интенсифицируют процессы накопления СГА в клубнях картофеля, являются (по убывающей): погодно-климатические условия сезона вегетации (температура, влажность); повреждение листьев растений колорадским жуком Leptinotarsa decemlineata (Say.); фитопатогены; ксенобиотики техногенного происхождения (пестициды (сернистый газ, фториды); тяжелые металлы; элементы минерального питания растений (калий, азот); уровень освещенности; типы почв. Экспериментально доказано, что содержание СГА в клубнях картофеля районированных в Лесостепной зоне Украины сортов, резко повышается в условиях: а) сочетания пониженных температур на протяжении сезона вегетации с высоким уровнем осадков и, соответственно, повышенным уровнем влажности; б) сочетания повышенных температур на протяжении сезона вегетации, в особенности в мае-июле, с малым количеством осадков.

Ключевые слова: вторичные метаболиты, картофель (Solanum tuberosum L.), стероидные гликоалкалоиды, стрессорные факторы, масс-спектрометрия.

Cherniavskaya Т.А. Ecological aspects of the secondary metabolites of the potato. – Manuscript.

Dissertation for acquirement the master's degree on the specialized field 03.00.16 – ecology. – Institute of Agroecology and Biotechnology UAAS, Кyiv, 2002.

This thesis dealt with the studying the particularities of secondary metabolism of potatoes and nature of dependency of the parameters of secondary metabolism from the influence abiotic and biotic environmental factors in agroecological systems. The study is executed with using of modern methods of the soft-ionization mass spectrometry, allowing research thermolabile biomolecules, in particular steroidal glycoalkaloids. Conducted comparative evaluation of qualitative and quantitative parameters of secondary metabolites, which are synthesed in potato plants of different cultivars. Results obtained are discussed to influence abiotic and biotic stress factors on potato plants which were grown on the Northeast of Ukraine. Designed theoretical and experimental bases of method an ecotoxicological evaluation of potato plants in agroecological systems on the base of mass spectrometric studying of the enzymatic systems of hydrolytic destruction of the potato secondary metabolites. It has built mathematical model for the forecasting of contents of secondary metabolites in tuber tissues for different cultivars of food potatoes.

Key words: secondary metabolites, potato (Solanum tuberosum L.), steroidal glycoalkaloids, stressoric factors, mass spectrometry.