НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ЦВІЛОВСЬКИЙ ВОЛОДИМИР ВАЛЕРІЙОВИЧ

УДК 352.5:616.12-008.331.1

МЕХАНІЗМИ МОДУЛЮЮЧОЇ ДІЇ NO НА СКОРОЧЕННЯ

ТА К+-КАНАЛИ МЕМБРАНИ МІОЦИТІВ СОННОЇ АРТЕРІЇ ЩУРА

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2002

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі нервово-м'язової фізіології

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук Шуба Михайло Федорович Зав. відділом нервово-м'язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Федулова Світлана Анатоліївна вчений секретар Міжнародного центру молекулярної фізіології при НАН України, старший науковий співробітник кандидат біологічних наук Марченко Сергій Михайлович відділ загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, старший науковий співробітник

Провідна установа: Інститут біохімії ім О.В. Палладіна НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться “ 5 ” квітня 2002 р. о “14” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “5” березня 2002 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Як відомо, ендотелій регулює тонус судин шляхом вивільнення низки вазоактивних сполук. Серед них можна назвати такі вазодилаторні субстанції: розслаблюючий ендотеліальний фактор, гіперполяризуючий ендотеліальний фактор, та простагландини. Однією з важливих подій останнього часу була ідентифікація ендотеліального розслаблюючого фактору з молекулою NO. До його біологічних функцій можна віднести нейропередачу в різних ділянках нервової системи, контроль тонусу судин і клітинної адгезії (Furchgott 1980, Moncada 1991), регуляцію імунних відповідей.

Рецептором окису азоту в ефекторних клітинах є залізо активного центру гуанілатциклази (Moncada 1991, Stone 1994). Активація цього ферменту призводить до збільшення продукції циклічного гуанозин-3',5'-монофосфату (цГМФ). В основі цГМФ-залежного розслаблення гладеньких м'язів з одного боку лежить зменшення концентрації іонізованого внутрішньоклітинного вільного кальцію ([Ca2+]i), з іншого боку цГМФ здатен зменшувати чутливість скоротливого апарату до іонів Ca2+ (Karaki 1988, Nishimura 1989). Зменшення концентрації іонізованого кальцію може досягатися різними шляхами: (1) зменшенням надходження Ca2+ до клітини (пригнічення струму крізь потенціалкеровані канали L-типу, та активація калієвих каналів), (2) збільшенням витоку Ca2+ з клітини (активація Ca2+-АТФ-ази плазматичної мембрани та Na+/Ca2+ обміну), (3) шляхом стимулювання захоплення іонів Ca2+ саркоплазматичним ретикулумома (активація Ca2+-АТФ-ази СР), і (4) зменшенням вивільнення іонів Ca2+ із саркоплазматичного ретикулума (пригнічення агоніст-індукованого утворення IФ3)

Відносний внесок цих механізмів в розслаблення різних судинних препаратів при дії NO є слабо дослідженим. Окрім того, значний інтерес викликає порівняння фармакологічних властивостей судин різного типу. Робіт, в яких були досліджені відмінності в фармако-біофізичних характеристиках ГМК гілочок судин різного діаметру досить мало. Адже відомо, що артерії різного діаметру мають різну будову на тканинному рівні та відіграють різні функції в забезпеченні циркуляції крові. Ми дослідили механізми вазодилаторної дії NO на прикладі загальної та внутрішньої сонних артерій щура. Загальна сонна артерія є класичною кондуктивною артерією. Внутрішня сонна артерія за своїм діаметром не відноситься до артерій резистивного типу. Але особливістю мозкового кровообігу є значна васкулярна резистивність великих мозкових артерій (Faraci 1998). Ці артерії відіграють значну роль в регуляції судинного тиску у внутрішньомозкових артеріолах. Також вони забезпечують значну автономність мозкового кровопостачання і сталість мозкового кровотоку при різних фізіологічних станах організма (Ткаченко 1984).

Дослідження проводились відповідно до планів наукової роботи відділу нервово-м'язової фізіології Інституту фізіології ім О.О. Богомольця НАН України за темами “Механізми метаболічної регуляції іонних каналів та скорочення гладеньком'язових клітин”, “Мембранні та внутрішньоклітинні механізми регуляції скорочення і активності іонних каналів гладеньком'язових клітин нейромедіаторами”.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з'ясувати можливі механізми розслаблюючої дії NO на ГМК загальної та внутрішньої сонних артерій щура; та дослідити на їх прикладі фармакологічні та біофізичні відмінності ГМК крупних магістральних артерій та їх гілочок. Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

1. Дослідити вплив донорів окису азоту (нітрогліцерину та нітропрусиду натрію) на скорочення загальної та внутрішньої сонних артерій щура. Порівняти ефективність дії донорів NO на ці артерії.

2. З'ясувати можливі внутрішньоклітинні механізми розслаблюючого впливу донорів окису азоту, та причини наявних відмінностей між розглядаємими артеріями

3. Розробити методику отримання функціонально повноцінних ізольованих гладеньком'язових клітин a. carotis communis та a. carotis interna щура і застосувати до них метод фіксації потенціалу “patch-clamp”.

4. Дослідити фармакологічні та амплітудно-кінетичні характеристики трансмембраннго вихідного струму поодиноких клітин цих артерій

5. Дослідити дію NO на трансмембранний вихідний струм мембрани гладеньком'язових клітин a. carotis communis та a. carotis interna щура.

6. З'ясувати активність якого типу калієвих каналів модулюється через NO/цГМФ-залежний шлях.

Наукова новизна одержаних результатів Вперше досліджені внутрішньоклітинні механізми розслаблюючої дії NO на ГМК загальної та внутрішньої сонної артерії. Встановлено, що нітрогліцерин в високих концентраціях більш ефективно розслаблює гладеньком'язові смужки загальної сонної артерії ніж смужки внутрішньої сонної артерії щура. Виявлено, що вклад внутрішньоклітинних депо в активацію скорочення в цих двох артеріях фенілефрином суттєво не відрізняється. Показано, що під час тривалої фази скорочення, викликаного фенілефрином, у внутрішній сонній артерії внесок іонів кальцію, що надходять крізь кальцієві канали не L-типу, в підтримання скорочення помітно більший, ніж в загальній сонній артерії.

Вперше були досліджені фармакологічні та амплітудно-кінетичні характеристики трансмембранного вихідного струму гладеньком'язових клітин a. carotis communis та a. carotis interna щура Встановлено, що внесок кальцій-активованого калієвого струму в загальний трансмембранний вихідний іонний струм помітно більший в загальній сонній артерії в порівнянні із внутрішньою. Окис азоту збільшує кальцій-залежний калієвий струм міоцитів за рахунок збільшення імовірності знаходження кальцій-залежних калієвих каналів в відкритому стані, а не за рахунок збільшення провідності поодиноких каналів.

Теоретична та практична цінність роботи. Отримані результати перш за все мають фундаментальний інтерес. Встановлені фармако-біофізичні відмінності між ГМК внутрішньої та загальної сонної артерії дозволяють краще зрозуміти механізми регуляції мозкового кровотоку, фізіологічну роль в цьому процесі окису азоту, а також функціонування судинної системи як єдиного цілого. Проведене співставлення фармакологічних властивостей гладеньком'язових смужок з електричними властивостями мембрани їх поодиноких ГМК розкриває зв'язок між фармакомеханічним та електромеханічним спряженням збудження-скорочення гладеньких м'язів.

Отримані результати досліджень дозволяють зробити висновок про існування двох механізмів NO-залежного пригнічення скорочення гладеньких м'язів, викликаного стимуляцією a-адренорецепторів. Один з них пов'язаний з пригніченням вивільнення іонів Са2+ з внутрішньоклітинних інозитол-3-фосфат-чутливих внутрішньоклітинних кальцієвих депо; інший - з активацією Са2+-залежних К+ каналів, що веде до реполяризації клітинної мембрани і, як наслідок цього, до деактивації Са2+ каналів L-типу.

Деякі захворювання серцево-судинної системи пов'язані з порушенням синтезу та впливу NO на гладенькі м'язи, а донори окису азоту нітрогліцерин і нітропрусид натрію є відомими медичними препаратами. Дослідження механізмів їх дії може сприяти створенню нових фармакологічних препаратів - донорів NO, котрі пригнічують скорочення гладеньких м'язів і знижують тонус кровоносних судин.

Особистий внесок. Всі експерименти описані в дисертаційній роботі, розробка методики та виділення функціонально повноцінних міоцитів, аналіз та узагальнення експериментального матеріалу були виконані особисто автором.

В розробці концепції роботи та написання висновків активну участь приймали інші співавтори публікацій.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались та обговорювались на Міжнародній школі-семінарі “Мембрани та сигнали” (Киів, 2000), XVI Латиноамериканському фармакологічному конгресі (Сан-Пауло, Бразилія, 2000) 45-ому конгресі Американського біофізичного товариства (Бостон, США, 2001), ІІ Конференції Українського товариства нейронаук (Донецьк, 2001), на семінарах відділу нервово м'язової фізіології та інститутському семінарі Iнституту фізіології ім О. О. Богомольця НАН України (1999, 2000, 2001).

Публікації. Матеріали роботи опубліковані в шести наукових статтях та двох тезах доповідей

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методики досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновків та списку використаних джерел із 223 найменувань. Робота викладена на 122 сторінках (без списку літератури), ілюстрована 35 рисунками та 1 таблицею.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

В дослідах використовувались щури обох статей вагою 200-300г. Тварин присипляли за допомогою ефіру, а потім декапітували. Тензіометричні дослідження проводилося на деендотелізованих спіральних смужках з arteria carotis communis та arteria carotis interna щура 8 мм завдовжки і 1 мм завширшки. Смужка кріпилася в проточній (2 мл/хв.) термостатованій (36.5° С) експериментальній камері за допомогою шовкових лігатур. Об'єм камери складав 300 мкл. Скоротливу активність гладеньком'язових смужок реєстрували в режимі близькому до ізометричного за допомогою напівпровідникового ємністного механо-електричного перетворювача, до важілю якого кріпили лігатуру смужки. Після вміщення гладеньком'язової смужки у камеру їй надавалося пасивне напруження 800 мг. Експеримент починали через 30 – 60 хвилин після вміщення смужки в робочу камеру. В якості записуючого пристрою використовували автоматичний потенціометр КСП-4. Вихідний розчин Кребса мав такий склад: NaCl 120.7; NaHCO3 15.5; NaH2PO4 1.2; KCl 5.9; CaCl2 2.5; MgCl2 1.2; глюкоза 11.5; (pH=7.4)

Поодинокі клітини отримували методом ферментативно-механічної ізоляції. Очищені від сполучної тканини шматочки артерій розрізали вздовж та переносили в бюкс з 3-ма мл розчину для виділення, що містив 2 мг папаїну, та 2 мг бичачого сироваткового альбуміну. В цьому розчині шматочки тканини інкубували на протязі 3-5 годин при температурі 5 оС. Після інкубації в розчин додавали 0.5 мг дітіотриетолу і витримували в термостаті при температурі 36 оС 20 хвилин. Функціонально повноцінні ізольовані міоцити артерій отримували шляхом багаторазового пропускання шматочків артерій через пастерівську піпетку в свіжому розчині для виділення, який містив 0.03% бичачого сироваткового альбуміну.

Для дослідження К+ струмів застосовували классичну "whole cell" конфігурацію методу "patch clamp". Принцип цього методу полягає в отриманні гігаомного контакту та наступного проривання ділянки мембрани під піпеткою короткими імпульсами негативного тиску. В частині дослідів для утворення електричного контакту між піпетковим розчином та цитоплазмою клітини використовували антибіотик амфоторіцин Б ("perforated patch"). Принцип методу полягав у створенні щільного (гігаомного) контакту між стінками кінчика піпетки та мембраною клітини з наступним перфоруванням ділянки мембрани під піпеткою амфоторіцином Б. Мікропіпетки для вимірювання трансмембранних іонних струмів виготовлювали із м'якого молібденового скла за методикою описаною в роботі (Hamil 1981). Вихідний зовнішній розчин для реєстрації калієвих струмів містив (мМ): NaCl 135, KCl 5.9, MgCl2 1.2, CaCl2 2.5, глюкоза 5, HEPES 10, pН 7.4 (NaOH). Піпетковий розчин для реєстрації цих струмів мав такий склад: KCl 135, KH2PO4 5, MgSO4 1, EГTA 0.3, HEPES 10, MgATФ 1, pН 7.2 (KOH). В експериментах у конфігурації “perforated-patch” у зовнішньому розчині іони Са2+ заміщували на еквімолярну кількість іонів Мg2+ так, що залишкова концентрація іонів Са2+ складала 0.1 мМ, а з піпеткового розчину виключали MgATФ та EГTA. В експериментах по дослідженню поодиноких калієвих каналів в конфігурації “cell-attached” використовували симетричний зовнішній і піпеточний розчин (мМ/л): KCl 140; MgCl2 1.2; CaCl2 0.1; HEPES 10, pН 7.4 (KOH).

Фіксація потенціалу та реєстрація струмів здійснювилась за допомогою підсилювача PATCH-CLAMP L/M EPC 5 з опором зворотнього зв'язку перетворювача струм-напруга 500 МОм. Сигнал з виходу підсилювача потрапляв на аналого-цифровий перетворювач Digidata 1200A (Axon Instruments) та далі в комп'ютер ІВМ РС/АТ. Дані аналізувались за допомогою програм "pCLAMP 5.5" та “Origin 5.0”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вплив донорів окису азоту на скорочення сонних артерій, викликане фенілефрином. В якості донору NO ми використовували відомий вазодилатор нітрогліцерин (НГ). Попередня аплікація нітрогліцерину (тривалістю 10 хвилин) значно зменшувала амплітуду скорочення, викликаного фенілефрином. Так, скорочення смужок загальної сонної артерії зменшувалося на 81 ± 8 % (n=4), а скорочення смужок внутрішньої сонної артерії зменшувалося на 47 ± 10 % (n=4). Нітрогліцерин дозозалежно (0.1 – 100 мкМ) розслаблював смужки загальної сонної артерії щура, попередньо скорочені фенілефрином. Нітрогліцерин в концентрації 100 мкМ розслаблював смужки загальної сонної артерії майже повністю (на 91 ± 2 % (n=9)). Смужки внутрішньої сонної артерії розслаблювалися під дією цієї концентрації нітрогліцерину тільки частково (на 55 ± 19 % (n=4)). Дозозалежність розслаблюючого впливу нітрогліцерину на смужки загальної та внутрішньої сонних артерій представлено на Рисунку 1 (ліва панель). Як видно, різниця в чутливості до нітрогліцерину цих двох артерій помітно проявляється в межах високих концентрацій (10 – 100 мкМ).

Нітропрусид натрію (інший донор NO) ефективно розслаблював гладеньком'язові смужки сонних артерій, попередньо скорочені фенілефрином при набагато менших концентраціях в порівнянні з нітрогліцерином. Так, його ефект проявлявся при концентраціях вище 1 нМ, а концентрація 1 мкМ була вже насичуючою (Рис 1. права панель)). Криві концентрація-ефект добре описувалися рівнянням Міхаеліса-Ментен. Для дозозалежного розслаблення смужок загальної сонної артерії половинна дозова концентрація складала 25 ± 3 нМ (n=3), а для розслаблення смужок внутрішньої сонної артерії ця величина дорівнювала 21 ± 2 нМ (n=3). Коефіцієнт Хіла для смужок загальної сонної артерії складав 0.8 ± 0.1, а для смужок внутрішньої сонної артерії ця величина дорівнювала 1.1 ± 0.1.

Порівняння ступеня внеску в активацію скорочення внутрішньоклітинних ІФ3-чутливих Са2+-депо. Для цього ми спочатку викликали скорочення смужки фенілефрином (10 мкМ) в нормальному розчині Кребса, що містив 2.5 мМ Са2+, а потім - в номінально безкальцієвому розчині (див. Рис. 2). Про ступінь внеску кальцієвих депо в активацію скорочення судили, виходячи з відношення амплітуди скорочення в безкальцієвому розчині до амплітуди скорочення в нормальному розчині Кребса. Для загальної сонної артерії (ЗСА) цей коефіцієнт складав 0.44 ± 0.01 (n=3), а для внутрішньої сонної артерії (ВСА) - 0.45 ± 0.03 (n=3). Ці два значення статистично достовірно не відрізнялися (p<0.05).

Вплив нітрогліцерину на вивільнення іонів Са2+ з внутрішньоклітинних депо. Фенілефрин (10 мкМ) та кофеїн (20 мМ) викликали швидке фазне скорочення в номінально безкальцієвому розчині. Кофеїн використовували для того, щоб викликати вивільнення іонів Са+ з ріанодинчутливих Са2+ депо. М'язове напруження досягало свого максимального значення за ~ 15 секунд і далі спадало. У випадку фенілефрину спостерігався тонічний компонент, а у випадку кофеїну напруження спадало до рівня, нижчого за попередній.

На фоні дії нітрогліцерину на протязі 5 хвилин значно пригнічувалось скорочення на фенілефрин в безкальцієвому розчині (Рис.3). Амплітуда скорочення зменшувалася на 83 ± 15 % (n=5) (ЗСА) і 76 ± 11 % (n=4) (ВСА). Попередня аплікація нітрогліцерину помітно не впливала на скорочення, котре викликав кофеїн в безкальцієвому розчині (Рис.4). Амплітуда скорочення зменшувалася на 7 ± 5 % (n=3) (ЗСА) і 9 ± 6 % (n=3) (ВСА).

Аплікація ніфедипіну на фоні сталого тривалого компоненту скорочення, викликаного фенілефрином (1 мкМ), призводила до швидкого розслаблення смужок загальної та внутрішньої сонних артерій (Рис. 5.). Ніфедипін в концентрації 1 мкМ розслаблював смужки загальної сонної артерії на 88.4 ± 1.1 % (n=5), а смужки внутрішньої сонної артерії на 68.3 ± 2.6 % (n=5) (Рис. 5.). Аплікація 10 мкМ ніфедипіну призводила до розслаблення смужок загальної сонної артерії на 93.8 ± 0.6 % (n=5), і на 22.2 ± 1.7 % (n=5) смужок внутрішньої сонної артерії.

Участь кальцій-залежних калієвих каналів в розслаблюючому впливі нітрогліцерину на ГМК загальної та внутрішньої сонних артерій В якості блокатора Са2+-залежних калієвих каналів ми використовували іони тетраетиламонію (ТЕА), котрі в низьких концентраціях (1 мМ) здатні повністю блокувати цю провідність і майже не впливають на інші калієві провідності. Ми взяли дещо більшу концентрацію – 3 мМ, враховуючи, що дифузія цього препарату в товщу смужки уповільнена та обмежена. Попередня 10-ти хвилинна аплікація 3 мМ ТЕА призводила до змін амплітуди скорочення смужки на фенілефрин. При цьому розслаблення, викликане нітрогліцерином, уповільнювалося і ставало значно меншим (Рис. 6.). В присутності іонів ТЕА нітрогліцерин розслаблював смужки загальної сонної артерії на 48 ± 3% (n=5) (Рис. 6. (ліва панель)), а смужки внутрішньої сонної артерії на 38 ± 9% (n=3) (Рис. 6. (права панель)).

Загальна характеристика вихідних трансмембранних іонних струмів ГМК сонних артерій щура. В більшості досліджуваних клітин при деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу більш позитивних, ніж – 30 мВ, з'являвся вихідний струм. По мірі збільшення рівня деполяризації мембрани його амплітуда і швидкість активації різко наростала. При великих позитивних зсувах мембранного потенціалу на вихідному струмі з'являлися значні флуктуації. Струм активувався за 50 – 100 мс і далі на протязі 400 мс його величина не зменшувалася.

Вихідний струм ефективно блокувався низькими концентраціями іонів ТЕА+. Так в ГМК загальної сонної артерії при концентрації 1 мМ струм блокувався більше ніж на половину, при цьому зникали його флуктуації і при ступінчастих зміщеннях мембранного потенціалу до 20 – 60 мВ спостерігалася невелика часозалежна інактивація струму. Досліди з вивчення потенціалзалежної інактивації вихідного струму показали, що при додаванні в зовнішній розчин 1 мМ тетраетиламонію потенціал половинної інактивації зсувається в бік більш від'ємних значень.

Вихідний струм частково блокувався 4-амінопіридином в концентрації 5 мМ. Зменшувалася тільки величина струму, а його кінетика залишалася незмінною (флуктуації не зникали, та іноді ставали більш помітними). Якщо струми викликали деполяризацією від вищих підтримуваних потенціалів, то зменшувалася як амплітуда струму в контролі, так і відсоток блокування його 4-амінопіридином. Крім того, при додаванні до зовнішнього розчину 5 мМ 4-амінопіридину при дослідженні потенціалзалежності інактивації із застосуванням двохімпульсного протоколу величина компоненту, що не інактивувався значно зростала по відношенню до контролю.

Вихідний струм можна було заблокувати цілком при комбінованій аплікації 1 - 3 мМ тетраетиламонію і 5 мМ 4-амінопіридину. Також інтегральний вихідний струм ефективно блокувався високими концентраціями іонів ТЕА+. Так, в концентрації 10 мМ вихідний струм блокувався майже повністю (більше ніж на 90 %) в ГМК обох артерій. Але в межах низьких концентрацій ТЕА вихідний струм ГМК цих різних артерій блокувався по різному. Так, для ГМК загальної сонної артерії половинна дозова концентрація складала 0.53±0.06 мМ (Рис.7. (ліва панель)), а для ГМК внутрішньої сонної артерії ця величина складала 2.2±1.2 мМ (Рис. 7. (права панель)). Іони ТЕА в концентрації 1 мМ блокували інтегральний трансмембранний вихідний іонний струм ГМК загальної сонної артерії на 61±11 % (n=9) (Рис.7. (ліва панель)), а в ГМК внутрішньої сонної артерії тільки на 29±6 % (n=7) (Рис. 7. (права панель)) (струм був викликаний ступінчастим зміщенням мембранного потенціалу від підтримуваного потенціалу – 80 мВ до + 60 мВ).

В конфігурації “perforated-patch” аплікація нітрогліцерину (100 мкМ) призводила до збільшення інтегрального трансмембранного вихідного струму поодиноких ГМК загальної сонної артерії щура без зсуву порогу активації (Рис.8.) Так, наприклад, при ступінчастій деполяризації клітин від – 80 мВ до +60 мВ струм зростав на 84 ± 12 % (n=8) по відношенню до контрольних значень (див. Рис. 8.). Тетраетиламоній в концентрації 1 мМ повністю усував ефект нітрогліцерину. На фоні дії 4-амінопіридину (5 мМ) нітрогліцерин також значно збільшував вихідний струм. В умовах, коли кальцій-активовані калієві канали цитоплазматичної мембрани заблоковані за допомогою 1 мМ іонів ТЕА+, додавання нітрогліцериу (100 мкМ) в зовнішньоклітинний розчин не призводило до статистично достовірного зростання амплітуди вихідного струму.

Дослідження активності Са2+-залежних калієвих каналів цитоплазматичної мембрани поодиноких ГМК загальної сонної артерії щура здійснювалось в конфігурації “outside-out”. У такій конфигурації Са2+-залежні калієві канали спостерігались в усіх досліджених клітинах. Зазвичай на ділянці мембрани знаходилось від 3 до 6 каналів. Провідність Са2+-залежного калієвого канала, розрахована на ділянці потенціалів +20...+60 мВ ВАХ, складала 160±7 пСм (n=7)

Тетраетиламоній (1 мМ), доданий до зовнішнього розчину, призводив до блокування Са2+-залежних калієвих каналів, при цьму він впливав не на ймовірність знаходження каналів у відкритому стані, а майже до нуля зменшував амплітуду струму поодинокого каналу. На Рис. 9. представлено вплив тетраетиламонію (1 мМ) на струм Са2+-залежних калієвих каналів в конфігурації “outside-out” при потенціалі фіксації +40 мВ. Інший блокатор К+ каналів, 4-амінопіридин (5 мМ), при додаванні до зовнішнього розчину не призводили до змін амплітуди і активності Са2+-залежних калієвих каналів.

При дослідженні активності каналів великої провідності в конфігурації “cell-attached” вольтамперна характеристика К+ канала була лінійною в області потенціалів -60...-10 мВ. Середня провідність Са2+-залежного К+-канала, розрахована по нахилу лінійної ділянки ВАХ, складала 156±3 пСм (п=5). Це значння провідності мало відрізнялося від провідності канала в конфігурації “outside-out”; незначні відмінності можуть бути пов'язаними зі зміною концентраційного градієнту для іонів К+.

Для дослідження дії донорів NO на Са2+-залежні калієві канали в мембрані гладеньком'язових клітин загальної сонної артерії щура ми використовували конфігурацію “cell-attached”. За такої конфігурації клітина знаходиться в нативних умовах, зберігаючи незмінним іонний склад і усі внутрішньоклітинні компоненти. Однак при застосуванні цієї конфігурації клітини повинні знаходитись у гіперкалієвому зовнішньому розчині для усунення невизначеностей, пов'язаних зі змінною величиною мембранного потенціалу.

Додавання нітрогліцерину до зовнішнього розчину приводило до дозо-залежного і зворотнього збільшення активності Са2+-залежних калієвих каналів цитоплазматичної мембрани поодиноких ГМК загальної сонної артерії щура. На Рис. 10. представлено зміну активності Са2+-залежних К+-каналів під дією нітрогліцерину (100 мкМ) при потенціалі фіксації - 60 мВ. Нітрогліцерин (100 мкМ) приводив до збільшення nP0 каналу в 2.8 ± 0.3 рази (n=5). На Рис. 10. представлені амплітудні гістограми активності Са2+-залежноих К+-каналів в контролі і в присутності НГ (100 мкМ). Нітрогліцерин не викликав зміни амплітуди струму поодинокого каналу в області потенціалів -60...-10 мВ.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Дослідження відмінностей в дії окису азоту на судини різного діаметру ми проводили на прикладі загальної та внутрішньої сонних артерій. І хоч обидві артерії, в принципі, належать до кондуктивного типу, ми обрали їх, враховуючи особливості мозкового кровообігу. Магістральні мозкові артерії (внутрішні сонні та вертебральні) відіграють велику роль в регуляції судинної резистивності і, що можливо є більш важливим, регуляції тиску в мозкових мікросудинах (Faraci 1998). Так, відносний внесок в опір судинної системи головного мозку магістральних, піальних і внутрішньомозкових артеріол складає 39:21:40 (Ткаченко 1984). Тобто, не зважаючи на те, що магістральні артерії мають більший діаметр, ніж піальні артерії, їх опір більший. Це протиріччя може бути пояснено лише різними біофізичними властивостями стінок цих судин. А ці властивості визначаються, з одного боку, їх пасивними елементами – еластичними волокнами, а з іншого боку, активними елементами – гладеньком'язовими клітинами. Ми дослідили деякі фармако-біофізичні властивості цих артерій і, відповідно, відмінності між ними.

Вплив донорів окису азоту на скорочення сонних артерій, викликане фенілефрином В роботі ми використовували в якості донорів NO дві широковідомих в медичній практиці нітросполуки – нітрогліцерин та нітропрусид натрію. Ці речовини, різні за своєю хімічною структурою, викликають розслаблення різних типів гладеньких м'язів, що пов'язано з продукуванням NO.

Нітрогліцерин в високих концентраціях (10-100 мкМ) в більшій мірі розслаблював гладеньком'язові смужки загальної сонної артерії, скорочені фенілефрином (1мкМ) в порівнянні зі смужками внутрішньої сонної артерії. Це спостерігалося як при попередній аплікації нітрогліцерину, так і при його аплікації на фоні тривалого постійного компоненту скорочення. Подібні ефекти спостерігалися при використанні донорів NO і на інших артеріальних препаратах. Так, розслаблення на дію нітрогліцерину було більшим в спіральних смужках проксимальних сегментів середньої мозкової артерії собаки в порівнянні зі смужками дистальних сегментів (Toda 1984). Нітрогліцерин викликав більше розслаблення в кільцевих сегментах аорти у порівнянні з розслабленням сегментів резистивних артерій - ниркової та інтерлобарної (Verbeke 1995). Аплікація фізіологічного розчину, насиченого окисом азоту, викликала більше розслаблення в кільцевих сегментах кондуктивних легеневих артерій щура в порівнянні з сегментами резистивних легеневих артерій (Archer 1996). Донор NO - S-нітрозо-N-ацетил-пеніциламін призводив до значної вазодилації середньої мозкової артерії щура і невеликої вазодилації їх гілочок; на проникаючі артеріоли він майже не впливав (You 1999). Дослідження впливу іншого донор окису азоту – діетиламін NONO-ату на скорочення кільцевих сегментів коронарних артерій людини різного діаметру попередньо скорочених ендотеліном дало аналогічні результати. Цей донор NO призводив до повного розслаблення кондуктивних судин і тільки частково пригнічував скорочення в резистивних (Wiley 2001).

Отримані нами залежності доза-ефект для розслаблення спіральних смужок загальної та внутрішньої сонних артерій нітропрусидом натрію статистично достовірно не відрізнялися. Це спостерігали інші дослідники на інших препартах гілочок артерій різного діаметру. Зокрема, нітропрусид натрію викликав однакову вазодилацію базилярної артерії, її гілочок, та мозкових артеріол щура (Faraci 1991). Субепікардіальні коронарні судини свині: дрібні, середні, великі артеріоли, та маленькі артерії мали ідентичні криві концентрація-ефект розслаблення, викликаного нітропрусидом натрію (Kuo 1995).

Механізми активації скорочення сонних артерій фенілефрином. За даними наших експериментів ступінь відносного внеску вивільнення іонів Са2+ з внутрішньоклітинних ІФ3-чутливих депо в активацію скороченя в загальній і внутрішній сонних артеріях помітно не відрізняється. Це, можливо, пов'язано з тим, що в цій ділянці кровоносного русла відсутня закономірність, виявлена в мезентеріальних артеріях (Cauvin 1984) (зменшення внеску внутрішньоклітинних депо в активацію скорочення зі зменшенням діаметру судини), або з тим, що на рівні крупних судин таких, як магістральні артерії та гілки магістральних артерій ця закономірність ще не проявляється.

Ми виявили, що нітрогліцерин у великій концентрації не впливав на скорочення викликане кофеїном в безкальцієвому розчині, в той же час він дуже ефективно пригнічував скорочення, викликане аплікацією фенілефрину в безкальцієвому розчині. Це свідчить про те, що окис азоту не впливає на вивільнення іонів Са2+ з ріанодинчутливих депо, але ефективно пригнічує їх вивільнення з ІФ3-чутливих внутрішньоклітинних депо. Подібні результати були отримані і на інших об'єктах. Так, в базилярній артерії собаки 8-Br-цГМФ не модифікувіав скорочення, викликаного кофеїном (Sugawa 1993). В аорті щура нітропрусид натрію, як донор NO, значно пригнічував фазне скорочення на фенілефрин в безкальцієвому розчині і не впливав на кофеїніндуковане скорочення (Ji 1998). В коронарній артерії собаки нітрогліцерин пригнічував вивільнення іонів Са2+ з саркоплазматичного ретикулума в безкальцієвому розчині у відповідь на аплікацію PNU-46619 (Khan 1998).

В наших дослідах ніфедипін не повністю блокував тривалий сталий компонент скорочення, викликаного фенілефрином. Тих концентрацій, що ми використовували, було достатньо для повного блокування кальцієвого струму L-типу поодиноких гладеньком'язових клітин в дослідах в умовах фіксації потенціалу. Майже для всіх артерій характерною є наявність компонента агоніст-індукованого скорочення, що не пригнічується блокаторами кальцієвих каналів L-типу, але питання про шляхи надходження іонів Са2+, що забезпечують його підтримання залишається дискусійним. Існує робота, котра краще за все пояснює не тільки існування ніфедипін-витривалого компоненту скорочення, викликаного фенілефрином, але й той факт, що величина цього компоненту була помітно більшою у гладеньком'язових смужках внутрішньої сонної артерії. Японські вчені виявили в цитоплазматичній мембрані гладеньком'язових клітин термінальних гілочках мезентеріальної артерії мурчака ніфедіпін-витривалий потенціал-керований кальцієвий струм, фракція якого в загальному трансмембранному кальцієвому струмі зростала по мірі зменшення діаметру артерій; і в плазматичній мембрані ГМК периферичних артеріол реєструвався виключно цей струм (Morita 1999). Можливо, що саме канали, котрі переносять цей струм, обумовлюють надходження іонів Са2+ до клітини і активацію скорочення в умовах блокування входу іонів Са2+ крізь канали L-типу.

Загальна характеристика вихідних трансмембранних іонних струмів ГМК сонних артерій щура На основі наших даних можна зробити висновок про існування в цитоплазматичній мембрані ГМК загальної та внутрішньої сонних артерій щура двох компонентів вихідного калієвого струму кальцій-активованого (блокується 1 мМ ТЕА, має значні флуктуації та слабо виражену потенціалзалежну інактивацію) та потенціал-залежного (блокується 4-амінопіридином, має гарно виявлену потенціалзалежну інактивацію, не має значних флуктуацій). Фактично в усіх досліджених ГМК артерій саме ці два компонента складають переважну частину трансмембранних калієвих струмів.

Слід відмітити високу чутливість вихідного трансмембранного іонного струму ГМК внутрішньої та загальної сонних артерій до блокуючої дії іонів ТЕА. Так, в концентрації 10 мМ вихідний струм блокувався майже повністю в ГМК обох артерій. Але в межах низьких концентрацій ТЕА вихідний струм ГМК цих різних артерій блокувався порізному. Іони ТЕА+ в концентрації 1 мМ блокували інтегральний трансмембранний вихідний іонний струм ГМК загальної сонної артерії на 61±11 % (n=9), а в ГМК внутрішньої сонної артерії тільки на 29±6 % (n=7) (струм був викликаний ступінчастим зміщенням мембранного потенціалу від підтримуємого потенціалу – 80 мВ до + 60 мВ). Це концентрація, якої достатньо для повного блокування кальцій-залежних калієвих каналів (як це видно з Рис. 9), і котра майже не впливає на калієві канали інших підтипів. Тому ми дійшли висновку, що в ГМК загальної сонної артерії інтегральний вихідний трансмембранний іонний струм переноситься переважно крізь Са2+-залежні калієві канали, тоді як в ГМК внутрішньої сонної артерії цей струм переноситься переважно крізь потенціал-керовані калієві канали затриманого випрямлення. Зменшення внеску струму крізь Са2+-активовані калієві канали в загальний вихідний трансмембранний іонний струм ГМК по мірі зменшення діаметру судини було показано на легеневих артеріях щура (Archer 1996).

Участь кальцій-залежних калієвих каналів в розслаблюючому впливі нітрогліцерину на ГМК загальної та внутрішньої сонних артерій. Дані наших експериментів, проведених за допомогою методики тензометрії, дають нам непрямі свідчення того, що нітрогліцерин-індуковане розслаблення смужок загальної та внутрішньої сонних артерій в значній мірі обумовлено активацією калієвих каналів. Кількість непрямих свідчень участі кальцій-активованих калієвих каналів у розслаблюючому впливі окису азоту на гладенькі м'язи судин досить значна. Вони, як правило, базуються на зменшенні ефекту донорів NO при блокаді кальцій-залежної калієвої провідності іберіотоксином, карібдотоксином, чи низькими концентраціями іонів ТЕА+. Але існує декілька експериментальних робіт, котрі вказують на те, що NO активує канали затриманого випрямлення (Yuan 1996), або АТФ-чутливі калієві канали (Murphy 1995).

Існує ряд робіт, проведених на ГМК судин, у котрих також показано прямими методами активацію Са2+-залежних калієвих каналів окисом азоту та його донорами. Що стосується збільшення Са2+-залежного компоненту калієвого струму від цілої клітини, то для стабільного відтворення цього ефекту зі значними кількісними характеристиками автори робіт, як правило, використовували не класичну конфігурацію “whole-cell”, а її модифікацію “perforated patch” (Archer 1996, Carrier 1997, Bychkov 1998). Хоч одна з перших робіт (Archer 1994) була виконана в класичній конфігурації. У випадку, коли замість “perforated patch” використовувалась конфігурація “whole-cell”, збільшення вихідного калієвого струму, викликане SIN-1, проявляло значну варіабельність в амплітуді, спостерігалося не в усіх клітинах, і загалом було меншим (Mistry 1998). Тобто, спостерігалася та ж сама картина, що бачили в своїх дослідах і ми. Очевидно, це пов'язано з вимиванням ферментів та сигнальних молекул, що опосередковують досліджуваний ефект, з цитоплазми клітини в процесі внутрішньоклітинного діалізу в умовах класичної конфігурації.

Збільшення імовірності знаходження Са2+-залежних калієвих каналів у відкритому стані під впливом окису азоту, та його донорів також було продемонстровано на ряді судинних препаратів. При цьому провідність поодинокого каналу залишалася незмінною. В клітинах легеневих артерій окис азоту збільшував активність цих каналів в конфігурації “cell-attached”, та в конфігурації “outside-out” в перфорованих везикулах (Archer 1996). В ГМК мезентеріальної артерії щура SNAP, нітропрусид натрію, та 8-Br-цГМФ збільшували активність каналів у в конфігурації “cell-attached” (Carrier 1997). Цікаво, що в іншій роботі, проведеній на тому самому обєкті, окрім збільшення імовірності знаходження кальцій-активованих калієвих каналів у відкритому стані в конфігурації “cell-attached” під дією донорів NO, було продемонстровано той самий ефект в конфігурації “inside-out”. При чому сам окис азоту був більш ефективним ніж SIN-1 та нітропрусид натрію.

Активація Са2+-залежних калієвих каналів нітрогліцерином буде в більшій мірі впливати на мембранний потенціал (а отже, і на вхід іонів Са2+ крізь потенціалкеровані канали до клітини і відповідно на скорочення) в ГМК загальної сонної артерії оскільки доля струму крізь Са2+-активовані калієві канали в загальному трансмембранному вихідному струмі ГМК цієї артерії більша. Це може бути одним з пояснень того, що нітрогліцерин в високих концентраціях в більшій мірі розслаблює смужки загальної сонної артерії в порівнянні зі смужками внутрішньої сонної артерії.

ВИСНОВКИ

1. За допомогою тензіометричної методики було досліджено механізми дії донорів окису азоту (нітрогліцерину та нітропрусиду натрію) на скоротливу активність деендотелізованих м'язових смужок загальної та внутрішньої сонних артерій щура.

2. В межах високих концентрацій (>10 мкМ) нітрогліцерин викликає більше розслаблення попередньо скорочених фенілефрином смужок загальної сонної артерії в порівнянні зі смужками внутрішньої сонної артерії. Криві доза-ефект розслаблюючого впливу іншого донору окису азоту - нітропрусиду натрію, для цих двох артерій є ідентичними.

3. Внесок іонів кальцію, що вивільнюються з внутрішньоклітинних депо, в активацію скорочення при стимулюванні a-адренорецепторів є однаковим в обох артеріях. Нітрогліцерин пригнічує скорочення, викликане іонами Са2+, що вивільнюються з інозитол-трифосфат-чутливого депо СР, і не впливає на скорочення, яке активується іонами Са2+, що вивільнюються з ріанодин-чутливого депо.

4. Внесок іонів Са2+, що надходять до клітини крізь кальцієві канали не L-типу, в активацію тонічного компонента скорочення, викликаного стимулюванням a-адренорецепторів, більше у смужках внутрішньої сонної артерії порівняно зі смужками загальної сонної артеррії.

5. Блокування Са2+-активованих калієвих каналів, зменшує нітрогліцериніндуковане розслаблення смужок загальної і внутрішньої сонних артерій щура, що є непрямим свідченням активації каналів цього типу нітрогліцерином.

6. За допомогою методу фіксації потенціалу (“patch-clamp”) проведено дослідження фармако-біофізичних характеристик трансмембранного вихідного іонного струму ізольованих поодиноких ГМК загальної та внутрішньої сонних артерій щура. Виявлено два компоненти вихідного калієвого струму – потенціалкерованого (з потенціалом половинної інактивації -62±1 мВ, та коефіцієнтом крутизни -11±1 мВ), чутливого до блокуючої дії 4-амінопіридину, та кальцій-залежного, котрий блокується низькими концентраціями іонів ТЕА, з провідністю поодинокого каналу 160±7 пСм.

7. Внесок кальцій-залежного калієвого струму в загальний трансмембранний вихідний струм є помітно більшим в ГМК загальної сонної артерії в порівнянні з міоцитами внутрішньої сонної артерії.

8. Донор окису азоту нітрогліцерин збільшував кальцій-залежний калієвий струм міоцитів за рахунок збільшення імовірності знаходження кальцій-залежних калієвих каналів в відкритому стані, а не за рахунок збільшення провідності поодиноких каналів.

Список опублікованих робіт здобувача за матеріалами дисертації.

1. Tsvilovskiy V.V., Shuba M.F. Inhibitory effect of nitric oxide on arterial smooth muscle cells. // Neurophysiology. – 2000. – 32, № 3. – P.240–241.

2. Цвіловський В.В. Кальційактивовані калієві канали поодиноких міоцитів сонної артерії щура. // Архив клинической и экспериментальной медицины – 2001. – Том 10, № 2. – С. 230–231.

3. Тєлєжкін В. С., Цвіловський В. В., Дискіна Ю. Б., Давидовська Н. В., Шуба М. Ф. Дія блокаторів калієвих каналів і окису азоту на електричну та скоротливу активність гладеньких м'язів загальної легеневої артерії кроля. // Нейрофизиология.– 2001.– Том 33, № 5. – С. 321–328.

4. Метюк Я. М., Цвіловський В.В. Вплив нітрогліцерину на скоротливу активність гладеньком'язових клітин стегнової артерії щура. // Нейрофизиология.– 2000.– Том 32, № 3. – С. 246–247.

5. Метюк Я.М., Цвіловський В.В. Дія нітрогліцерину на скоротливу актвність інтактних та скінованих кільцевих сегментів основної гілки стегнової артерії щура. // Архив клинической и экспериментальной медицины – 2001. – Том 10, № 2. – С. 187.

6. Філіпов І. Б., Цвіловський В.В., Цицюра Я. Д., Шуба М.Ф. Окис азоту як модулятор іонних каналів і скорочення гладеньких м'язів. // Архив клинической и экспериментальной медицины – 2001. – Том 10, № 2. – С. 229.

7. Shuba M.F., Filipov I.B., Kharkhun M.I., Tsvilovsky V.V. Tsytyura Ya.D. Nitric oxide as a modulator of the ionic channels and of contraction in smooth muscles. // XVI Latinoamerican Congress of Pharmacology San Paulo, Brazil, September 13-17, 2000, C 05.

8. Tsvilovsky V.V., Shuba M.F. The differences in the inhibitory action of NO on smooth muscle cells of common and internal carotid artery. // 45-Annual Meeteng February 17-21, 2001 Boston, Biophysical Journal. - 2001. - 80, № 1 (Pt. 2). - P.649.

Цвіловський В. В. “Механізми модулюючої дії NO на скорочення та К+-канали мембрани міоцитів сонної артерії щура”. –Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня канадидата біологічних