НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

ГОРНИЦЬКА Ольга Володимирівна

УДК 577.151.6:612.115

ОДЕРЖАННЯ, ХАРАКТЕРИСТИКА ТА ВИКОРИСТАННЯ ФЕРМЕНТІВ ОТРУТИ ЩИТОМОРДНИКА ЗВИЧАЙНОГО (Agkistrodon halys halys)

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Науковий керівник – доктор біологічних наук

ВОЛКОВ Георгій Леонідович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

заступник директора з наукової роботи

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

ВЕРЕМЕЄНКО Кузьма Микитович,

Інститут отоларингології ім. О.С. Коломійченка

МОЗ України,

головний науковий співробітник лабораторії біохімії

доктор біологічних наук, професор

КІБІРЄВ Володимир Костянтинович

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України

завідувач відділу хімії білка

Провідна установа – Київський національний університет

імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії

Захист відбудеться „23” грудня 2002р. о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (01601, Київ-30, вул.. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий 22 листопада 2002р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми.

Сукупність функціонально-морфологічних та біохімічних механізмів, що забезпечують зупинку кровотечі і підтримують кров у рідкому стані, складають систему гемостазу. При виникненні патологій порушується рівновага між ланками зсідання крові та фібринолізу, що викликає розвиток внутрішньо-судинного зсідання крові (ВЗК-синдром), який створює загрозу тромбоутворення або геморагій. У клінічній практиці для діагностики, профілактики та лікування ВЗК-синдрому застосовують різні фізіологічні та нефізіологічні антитромботичні та тромболітичні агенти (гепарини, низькомолекулярні гепарини, гірудин, стрептокіназа, тканинний активатор плазміногена). Разом зі стандартними препаратами використовуються препарати, створені на основі ферментів зміїної отрути (Козинець, Макаров, 1997).

До складу отрути змій входять білкові сполуки, які мають ефективний вплив як на систему зсідання крові, так і на систему фібринолізу. До них відносяться тромбіноподібні, фібрин(оген)олітичні ферменти, активатори та інгібітори протеїназ. Створені на їх основі ферментні препарати (Анкрод, Арвін, Атроксин, Рептилаза, Protac) використовуються в зарубіжній, а в останні роки і у вітчизняній клінічній практиці для діагностики стану системи гемостазу. Перевага нефізіологічних реагентів полягає в їх унікальній специфічності, у відсутності в крові людини їх інгібіторів – речовин, які проявляють гальмуючу дію, у резистентності до високої іонної сили та присутності іонів Са2+ (Markland, 1998).

Для діагностики тромботичних ускладнень широко використовуються функціональні та імунологічні клінічні лабораторні тести, при виконанні яких застосовуються ферментні препарати, одержані з отрути змій. Оскільки ці ферменти не інгібуються гепарином, основна область їх використання – діагностика стану системи зсідання крові та фібринолізу при гепаринотерапії: визначення рівня фібриногену, продуктів деградації фібрину. До таких реагентів відносяться препарати тромбіноподібних ферментів.

Для виявлення порушення рівноваги між системами зсідання крові та фібриноліза необхідно контролювати рівень інгібітора процесу зсідання крові – протеїна С, який вважається маркером ВЗК-синдрому. Дефіцит цього білка створює загрозу тромбоутворення. Для визначення вмісту функціонально активного протеїну С використовується Protac – препарат активатора протеїна С, виділений з отрути Agkistrodon contortrix contortrix. Переваги цього ферменту (на відміну від тромбіну, який у комплексі з тромбомодуліном у присутності кофактора активує протеїн С) полягає у високій швидкості активації протеїну С без участі кофакторів; активатор протеїна С застосовується при визначенні вмісту протеїну С з використанням хромогенного субстрата у випадках, коли функціональний тест не дає відповідної інформації.

Фібрин(оген)олітичні ферменти, що діють безпосередньо на фібриноген, можуть бути використані при дослідженні процесу полімеризації фібрину, білок-білкових взаємодій. Деякі автори вважають, що препарати, створені на основі цих ферментів, у подальшому можна буде використовувати в клінічній практиці для дефібринування плазми крові при деяких патологіях.

Препарати ферментів з отрути змій, які можна використовувати для діагностики стану системи гемостазу, в Україні не виробляються. У зв'язку з цим існує необхідність розробки методів їх одержання з отрути змій, що знаходяться в серпентаріях України, для наукових та клінічних досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі структури та функції білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України протягом 1995-2002 рр. Дисертація безпосередньо зв'язана з плановими дослідженнями відділу за бюджетними темами: "Вивчення структурної організації та функції тромбоцитарного інтегрину GPIIbIIIa та інших білків системи гемостазу" (1995-1997 рр.), №ДР 0195U002946; "Вивчення механізму активації ключових проферментів системи фібринолізу та гемостазу активаторами непрямої дії" (1998-2000 рр.), № ДР 0198U00345; "Вивчення молекулярних механізмів регуляції активації проферментів систем зсідання крові та фібринолізу в нормі та при патології" (2001-2003 рр.), № ДР 0101U000103.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було виділити та охарактеризувати ряд ферментів з отрути щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys), що мешкає на території Середньої Азії та Далекого Сходу, для використання їх як інструменту при вивченні систем зсідання крові та фібринолізу, а також для розробки умов визначення рівня протеїну С у плазмі крові.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

1) Проаналізувати вміст отрути щитомордника звичайного на присутність в ній ферментів, що діють на систему гемостазу.

2) Розробити методи виділення й очищення фібрин(оген)олітичного ферменту активатора протеїну С та інгібітора агрегації тромбоцитів.

3) Дослідити фізико-хімічні властивості отриманих ферментів та визначити їх дію на компоненти системи гемостазу.

4) Дослідити процес активації протеїну С активатором протеїну С та на його основі розробити умови діагностичного тесту для визначення рівня протеїну С в плазмі крові при порушенні функціонування системи гемостазу.

Наукова новизна одержаних результатів. Досліджено отруту щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys). Виявлено, виділено, очищено та охарактеризовано не описані раніше фібриногенолітичний фермент, активатор протеїну С та інгібітор агрегації тромбоцитів.

Розроблено умови виділення зазначених ферментів: замість трьохстадійного очищення на сефадексі G-100, G-75, іонообміннику типу DEAE-целюлоза, СМ-сефадекс А-50, TSK DEAE-650, Mono Q запропоновано метод іонообмінної хроматографії на Q-сефарозі в один етап при використанні ступінчатого градієнту NaCl.

Досліджено фізико-хімічні і біологічні властивості виділених ферментів, їх субстратну специфічність.

Проведено порівняння виділених ферментів з аналогічними компонентами, отриманими з отрути інших видів змій. Показано, що фібриногенолітичний фермент за своїми властивостями подібний до –фібриногеназ, які виявлені в отруті щитомордника інших видів; активатор протеїну С є аналогічним фірмовому препарату “Рrotac” (“Pentapharm”, AG, Швейцарія), виділеному з отрути Agkistrodon contortrix contortrix; з'ясовано, що інгібітор агрегації тромбоцитів відноситься до класу дезінтегринів і уповільнює агрегацію тромбоцитів, блокуючи тромбоцитарні рецептори фібриногену, зокрема, глікопротеїн IIb/IIIa

Практичне значення одержаних результатів. На основі ферментних препаратів отрути щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys) розроблено ряд діагностичних тестів для характеристики стану системи гемостазу. Так, активатор протеїну С використовується в тесті для визначення рівня протеїну С у плазмі крові. Висока швидкість активації протеїну С, відсутність у плазмі крові інгібіторів, а також резистентність активатора протеїну С до високої іонної сили і присутності іонів кальцію дає можливість використовувати отриманий препарат для визначення рівня протеїну С in vivo; тромбіноподібний фермент Анцистрон-Н використовується для характеристики заключного етапу системи зсідання крові та визначення вмісту фібриногену в плазмі крові при гепаринотерапії; для виявлення аномальних форм протромбіну служить активатор протромбіну, який виділений з отрути ефи багатолускової (Echis multisquamatus). Застосування тестів, що розроблені на основі ферментних препаратів зі зміїної отрути, дозволило створити алгоритми діагностики стану системи гемостазу при серцево-судинних захворюваннях (інфаркт міокарда), хірургічних ускладненнях (абдомінальні кровотечі при виразці шлунку, при регматогенному відшаруванні сітківки ока), цукровому діабеті. Тести, що запропоновано, є інформативними, високочутливими, простими у використанні, не потребують додаткового обладнання.

Зростаючий інтерес дослідників до класу фібрин(оген)олітичних ферментів обумовлений можливістю використовувати їх як для дослідження структурних взаємодій з іншими білками і ферментами, так і в якості прокоагулянтів для розчинення фібринових згустків при венозних тромбозах, інфаркті міокарда, інсультах, легеневій емболії.

Характеристика інгібітору агрегації тромбоцитів припускає, що блокада IIb/IIIa може бути використана як ефективна терапія при тромботичних ускладненнях. Таким чином, дезінтегрини можуть служити структурними прототипами агентів для розвитку антитромботичної терапії. Засновані на структурі дезінтегринів антитромботичні агенти можуть бути використані для збільшення реперфузії у пацієнтів, що проходять курс антитромботичної терапії при гострому інфаркті міокарда.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота – завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 1995-2002 рр. Експериментальна частина роботи виконана дисертантом особисто. Аналіз та обговорення проведено спільно з науковим керівником. У наукових працях, написаних у співавторстві, автор приймав безпосередню участь.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були повідомлені на семінарі лабораторії Oxford bioresearch (м. Оксфорд, Великобританія, 1995 р.), наукових семінарах Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (2001 р., 2002 р.), VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 9 друкованих праць, з них 7 статей, 1 тези доповіді в періодичних наукових спеціальних виданнях України, що включені в перелік, затверджений ВАК України. Опубліковано 1 патент.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури (1 розділ, 2 підрозділа), експериментальної частини (2 розділа, 4 підрозділа), заключення, висновків, списку використаної літератури (160 найменувань). Роботу викладено на 100 сторінках друкованого тексту, проілюстровано 19 рисунками, 18 таблицями, 1 схемою.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

В огляді літератури представлено, що серед компонентів отрути змій особливий інтерес для гематологів мають ферменти-активатори та інгібітори, які впливають на різні етапи зсідання крові та фібринолізу. Представлено класифікацію ферментів отрути змій, характеристику прокоагулянтних, антикоагулянтних та фібрин(оген)олітичних ферментів, а також інформацію про використання компонентів отрути змій в наукових дослідженнях та практичній медицині.

Матеріали і методи

Кристалічну отруту щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys) надано серпентарієм Трипільського біохімічного заводу (Золотухін).

Фібриноген бика (98%-не згортання) одержували з плазми крові шляхом висолювання 16% розчином сульфату натрію з наступним відділенням кріофібриногена за методом Варецької (1960).

Тромбін бичачий, 10 NIH /мг білка, Каунас, Литва.

Плазмін одержували з Глу-плазміногена, виділеного за методом афінної хроматографії на лізин-сефарозі (Deutch, Mertz, 1970), з наступною активацією урокіназою у співвідношенні Пг:Ук = 1:1250 у 0,05 М трис-НСl буфері, рН 7.4, що містить 25% гліцерину (за об’ємом). В таких умовах 95% плазміногена активується в плазмін, активність якого складає 22 к.е./мг. Зберігали в 0,05 М трис-НСl буфері, рН 7.4, що містить 50% гліцерин (за об’ємом) при 4оС.

Пул плазми крові одержували з крові 10 донорів. Кров брали пункцією ліктьової вени, натще, і негайно змішували з 3,8% розчином цитрату натрію в пропорції 9:1. Для одержання плазми кров центрифугували при 1,5 тис. g.

Естеразну активність визначали спектрофотометрично, вимірюючи збільшення поглинання при довжині хвилі 253 нм, використовуючи ефіри амінокислот ВАЕЕ (N–бензоїл-L-аргініл-етиловий ефір), ВАМЕ (N–бензоїл-L-аргініл-метиловий ефір), BAPNA (N–бензоїл-L-аргініл-пара-нітроанілід), ТАМЕ (N-тозил-L-аргініл-метиловий ефір) в кінцевій концентрації 10 мМ (Hummel, 1959).

Амідолітичну активність визначали, використовуючи хромогенні субстрати плазміну - S2251, тромбіну - S2238, фактора Ха - S2765. Швидкість вивільненого під дією ферменту пара-нітроаніліна (p-NA) визначали в двопроменевому режимі при 405 - 492 нм на ридері Titertec Multiscan MC (“Titertech”, Фінляндія), приймаючи коефіцієнт поглинання 1М розчину пара-нітроаніліна при 405 нм рівним 10500 (Hutton, 1987).

Фібриногенолітичну активність виділених з отрути щитомордника ферментів визначали шляхом інкубації їх з фібриногеном (2мг/мл) протягом 20 хвилин при кімнатній температурі в 0,05 М трис-НС1 буфері рН 7.4, що містить 0,13 М NaCl. Співвідношення фібриноген: фермент дорівнює 250:1. Через 20 хв інкубації додавали 1 NIH/мл тромбіну, що є значним надлишком відносно кількості фібриногену в пробі. Утворений протягом декількох секунд фібриновий згусток видаляли центрифугуванням. Абсорбцію надосадової рідини вимірювали на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 280 нм. За одиницю активності приймали кількість частково розщепленого фібриногену в хвилину на 1 мг ферменту, з огляду на те, що Е280 1% розчину фібриногену складає 15,067.

Фібринолітичну активність визначали методом фібринових пластин (Astrup P., Mullertz S., 1952), наносячи зразок, що тестується, на поверхню пластини з наступним визначенням величини ділянки лізису фібрину. Ковалентне прошивання фібринових пластин здійснювалося активованим фактором ХІІІ системи зсідання крові, що присутній у препаратах фібриногену як домішок.

Дію ферментів на біологічні субстрати (протромбін, гемоглобін, протеїн С, плазміноген, фібриноген, фактор Х) перевіряли шляхом інкубації ферментів з очищеними білками, відбираючи через визначені проміжки часу аліквоти для електрофоретичного аналізу. Реакцію зупиняли додаванням ДS-Nа до 2% і –меркаптоетанола до 5% з наступним нагріванням зразків при 60оС протягом 10 хв.

Тромбіновий час зсідання плазми крові (ТЧ) визначали відповідно до розробленої методики. До 0,2 мл прогрітої до 37оС плазми крові додавали 0,1 мл тромбіну (0,7 NIH/мл) і визначали час утворення згустку.

Визначення активності протеїну С в плазмі крові в тесті „активований частковий тромбопластиновий час” (АЧТЧ) проводили відповідно до розробленої нами методики. Суміш, що включає 0,1 мл плазми крові, 10мкл (0,2 мг/мл) РСА, 0,1 мл АРТТ-реагента інкубували протягом 3 хв при 37оС, потім додавали 0,1 мл 25 мМ СаСl2 і визначали час зсідання плазми крові. Як реагент АРТТ використовували кефалін з мозку кроля в 0,1 мМ елаговій кислоті (bioMerieux, Франція).

Амінокислотний склад визначали на автоматичному амінокислотному аналізаторі Т-339 (“Microtekno”, Чехія) у літій-цитратному буфері в одноколоночному циклі. Гідроліз білків проводили в 6 М HCl у запаяних ампулах при температурі 120оС протягом 4 год, після чого гідролізат багаторазово випаровували на водяній бані для видалення кислоти.

Хроматографічні дослідження проводили із застосуванням системи для рідинної хроматографії високого тиску – FPLC (Pharmacia, Швеція). У роботі використовували Q-сефарозу для іонно-обмінної хроматографії, суперозу 12В, сефакріл S-300 для гель-фільтрації, цибакрон-сефарозу для афінної хроматографії та алкіл-сефароза для гідрофобної хроматографії.

Електрофорез у поліакриламідному гелі (ПААГ) в присутності DS-Na проводили за методом Леммлі (1970) на приладі для вертикального гель-електрофорезу (Bio-Rad, США) у пластинах товщиною 0,75 або 1 мм. Як маркери використовували суміш білків Low Molecular Weigt Calibration Kit фірми Pharmacia (Швеція) з відомою молекулярною масою, кДа: фосфорилаза Б - 94; альбумін – 67; овальбумін – 43; карбоангідраза – 30; соєвий інгібітор трипсину – 20,1; лактальбумін – 14,4 (“Pharmacia”, Швеція).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Виділення і вивчення властивостей ферментів отрути щитомордника звичайного

Процес виділення ферментів зі зміїної отрути досить громіздкий: включає трьохстадійне хроматографічне очищення білків на сефадексі G-100, G-75, іонообміннику типу DEAE-целюлоза, СМ-сефадекс А-50, TSK DEAE-650, Mono Q. Подібне одержання препаратів вимагає великої витрати часу, матеріалів. Крім того, на кожному етапі очищення відбувається часткова втрата активного матеріалу. Тому перед нами стояла задача розробити простий і ефективний метод виділення матеріалу.

Для дослідження було взято отруту щитомордника звичайного (Agkisrodon halys halys).

При розробці умов одержання фібриногенази основним завданням було скорочення кількості етапів очищення шляхом видалення з цільної отрути матеріалу, що коагулює. Для цього ми використовували цибакрон-сефарозу (блакитна агароза) – хроматографічний носій, що містить іммобілізований барвник цибакрон голубий F3GA. Цей сорбент, що має широку специфічність до різних груп білків, застосовується при очищенні різних ферментів. Крім того, барвник цибакрон F3GA дешевий, синтез сорбентів на його основі дуже простий, а ємність такого сорбенту на порядок вища, ніж у будь-яких інших афінних сорбентів.

Для цього 100 мг кристалічної отрути Agkistrodon halys halys розчиняли в 2 мл 0,02 М веронал-HCl буфері рН 7.5, що містить 0,13 М NaCl і 1.10-3 М NaN3, і після видалення центрифугуванням часток, що не розчинилися, наносили на колонку з цибакрон-сефарозою, врівноважену тим же буфером. Тромбіноподібний фермент, що зв'язався, елюювали лінійним градієнтом концентрації NaCl від 0 до 2 М у 0,02 М веронал-HCl буфері, рН 7.5, об’єм градієнту 50 мл, швидкість елюції 0,5 мл/хв. Із сорбентом зв'язувалося близько 10-12% від нанесеної кількості білків отрути (Соловйов, Угарова, 1993). У білковому матеріалі, що не зв'язався з колонкою (88-90% від вихідного), коагулюючої активності практично не було. Аналіз цього матеріалу методом зимографії показав наявність фібриногенолітичної активності. Подібна активність раніше була виявлена в отруті інших змій. З даних літератури відомо, що на одному з етапів одержання фібриногеназ використовується аніонообмінник. Виділення білкової фракції, що має фібриногенолітичну активність, ми проводили на Q-сефарозі, врівноваженій 0,05 М трис-HCl буфером рН 8,2. Вибір цього носія був обумовлений його високою ємністю, стійкістю гелю при зміні умов: через наявність поперечних зшивок гель сефарози має значну твердість (на відміну від іонообмінників на основі декстрана). Щоб уникнути змін величини рН і іонної сили, через що сорбція може бути низькою, для зниження концентрації білкової суміші досліджуваний матеріал розбавляли в 7-10 разів і наносили на колонку із швидкістю 0,35 мл/хв. Білки, що сорбувалися на Q-сефарозі, елюювали лінійним градієнтом 0 – 0,2 М NaCl. Проведена робота дозволила визначити величину іонної сили, при якій елююється фракція білка, що має фібриногенолітичну активність.

Однак використання лінійного градієнту концентрації NaCl не привело до якісного розділення компонентів (рис. 1), тому наступним кроком було використання ступінчатого градієнта концентрації 0 – 0,2 М NaCl у тому самому буфері зі швидкістю 0,8-1 мл/хв. Було зібрано вісім білкових фракцій (рис. 2А). Матеріал фракції 5 виявляв фібриногенолітичну активність, про що свідчило істотне уповільнення часу згортання тромбіном фібриногену (2 мг/мл) або цільної плазми крові в тесті “тромбіновий час”.

Електрофоретичний аналіз матеріалу фракції 5 показав наявність високо- і низькомолекулярних домішок інших компонентів отрути. Рехроматографія виділеної фракції, а також гель-фільтрація на суперозі 12В не поліпшили гомогенність препарату. В зв’язку з цим наступним етапом очищення було використання методу гідрофобної хроматографії. Очищення препарату проводили на колонці з алкіл-сефарозою (HR 5/5). Зв'язування білкового матеріалу фракції здійснювали в 0,1 М фосфатному буфері, рН 7.0, що містить 2,0 М (NH4)2SO4. При такій високій концентрації солі немає необхідності в зміні буферу при нанесенні зразку і, крім того, білок елююється з хорошим виходом. Після нанесення матеріалу на колонку білки, що не зв'язалися, видаляли тим же буфером. Елюцію матеріалу, що зв'язався, проводили зворотним лінійним градієнтом у 0,1 М фосфатному буфері, рН 7.0, знижуючи концентрацію (NH4)2SO4 з 2,0 М до 0,1 М. В результаті розділення було отримано сім білкових фракцій. За допомогою тесту “тромбіновий час” матеріал з фібриногенолітичною активністю було виявлено у фракції 7 (рис. 2Б). Молекулярна маса ферменту, за даними DS-Na електрофореза в ПААГ, складає 28 кДа. Виділений фермент є глікопротеїном: фарбування реактивом Шиффа показало наявність вуглеводного компонента. Специфічність дії очищеного ферменту на фібриноген ми досліджували, аналізуючи продукти руйнування фібриногену після інкубації фібриногену (2 мг/мл) з ферментом у 0,05 М трис-НС1 буфері рН 7.4, що містить 0,13 М NaCl, при кімнатній температурі. Вагове співвідношення ферменту до фібриногену складає 1:250. Аліквоти відбирали через 2, 5, 10, 15, 20 хв, 24 години, реакцію зупиняли додаванням DS-Na до 0,2%. Електрофоретичний аналіз у 10% ПААГ у присутності DS-Na показав, що під дією ферменту в початковий період реакції руйнується Aa-ланцюг фібриногену. При більш тривалій інкубації фермент незначно руйнує Вb-ланцюг, але g-ланцюг залишається інтактним. Також було показано, що при дії фібриногенолітичного ферменту на фібриноген кінцевим продуктом розщеплення є фрагмент, по молекулярній масі відповідний пізньому Х-фрагменту фібриногену. Здатність згортання цього фрагмента порушена так само, як і в аналогічному по молекулярній масі продукті плазмінового гідролізу фібриногену. Перевірка дії ферменту на ДД-, Д- і Е-фрагменти фібриногену показала відсутність подальшого розщеплення.

Для з’ясування дії фібриногенолітичного ферменту на фібриноген у плазмі крові було створено модельну систему (рис. 3). Одержані результати показують, що швидкість розщеплення фібриногену в модельній системі вища, ніж у плазмі крові. Ми вважаємо, що це пов'язано з дією присутніх у плазмі крові інгібіторів серинових протеїназ, до яких відноситься фібриногенолітичний фермент. В обох випадках уповільнення часу згортання фібриногену під дією тромбіну пов'язано зі зменшенням у суміші під дією ферменту концентрації фібриногену. Отримані нами результати добре узгоджуються з даними літератури. Для визначення амідолітичної активності ферменту використовували хромогенні субстрати для плазміну, тромбіну і фактора Х. Швидкість розщеплення субстрату (вивільнення p-NA) визначали при довжині хвилі 405 нм. В результаті показано, що фермент розщеплював субстрат плазміну S2251 (0,175 мкМ pNA/хв/мг), субстрат тромбіну S2238 (0,325 мкМ pNA/хв/мг) і не діяв на субстрат фактора Ха (S2222). Одержані нами дані дозволяють припустити, що фермент руйнує пептидні зв'язки, утворені карбоксильними групами лізину та аргініну, тобто за специфічністю подібний до плазміну. Фермент виявляв естеразну активність, визначену по ТАМЕ: 23 мкмоля/хв/мг, і казеїнолітичну активність - 7,5 к.о./мг.

Активність по ВАЕЕ і ВАМЕ відсутня. Питома активність досліджуваного ферменту складала 15,6 мкмоля фібриногену/хв/мг. рН оптимум дії фібриногенолітичного ферменту складав 7,5-8,0.

Фібринолітичну активність очищеного ферменту визначали, використовуючи фібринову платівку. Активність ферменту розраховували, визначаючи кількість розщепленого фібрину 1-им мг ферменту за 1 хв на даній площині. Інкубація отриманого ферменту з фібрином показала наявність незначної фібринолітичної активності: 1 мг ферменту за 1 хв розщеплював 17,3.10-3 мкмоля фібрину.

Км фібриногенолітичного ферменту визначали, використовуючи фібриноген як субстрат у діапазоні концентрацій од 0,25 - 4 мг/мл. Потім додавали 2 NIH/мл тромбіну (значний надлишок відносно фібриногену, що приводить до швидкого утворення фібринового згустку). Фібринові згустки, що утворилися, видаляли одночасним викручуванням і віджиманням скляною паличкою. Абсорбцію частково деградованого фібриногену, що залишився в розчині, визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 280 – 320 нм. Для розрахунку Км використовували графік, побудований у координатах Лайнуівера-Берка. Отримане значення Км ферменту складало 5,6 мкМ.

Проведені нами дослідження впливу ферменту на індуковану АДФ агрегацію тромбоцитів показали, що в його присутності швидкість агрегації, у порівнянні з контролем, знизилася до 77.3%, максимум агрегації знижувався до 47%. Дезагрегація тромбоцитів, характерна для контролю, в присутності ферменту не спостерігалася (рис. 4). Порушення агрегації тромбоцитів у присутності ферменту, імовірно, пов'язане з розщепленням фібриногену, що відіграє важливу роль у процесі агрегації. Раніше було показано (Позднякова, Горкун, 1993), що фібриноген у ході його розщеплення плазміном втрачає здатність бути кофактором індукованої АДФ агрегації тромбоцитів у суспензії відмитих кров'яних пластинок. Фрагменти Х, що утворилися в процесі розщеплення фібриногену плазміном, менш активні, ніж фібриноген, а фрагменти У і Д зовсім неактивні. Це свідчить про те, що деградація С-кінцевої ділянки А-ланцюга (С-домена) послаблює кофакторну активність фібриногену.

Дослідження дії на фермент інгібіторів протеїназ - етилендіамінтетраацетат (ЕДТА), бензамідина, дітіотриетола, іодацетаміда, диізопропілфторфосфат (ДФФ), парахлормеркурбензоат (ПХМБ) - показало, що з вищевказаних інгібіторів тільки ДФФ і бензамідин у концентрації 20 мМ протягом 10 хв цілком пригнічували протеолітичну активність ферменту. При дії дитіотриетола (20-50 мМ) залишалося 70% активності. Очевидно, руйнування дисульфідних зв'язків не приводить до повної інактивації ферменту.

Інгібування активності ферменту ДФФ і бензамідином, які є інгібіторами серинових протеїназ, дозволяє віднести його до серинових протеїназ трипсинового ряду.

Фібриногенолітичний фермент термолабільний. Інкубація при 37оС протягом 2-х годин приводила до втрати 60% активності, однак молекулярна маса ферменту при цьому не змінювалася. При інкубації при 22оС фермент залишався активним протягом 5 год; при 4оС активність ферменту в розчині зберігалася до 48 год. Фермент нестабільний у розчині без стабілізатора, однак у 0,02% розчині БСА (бичачий сироватковий альбумін) у замороженому стані він зберігається без втрати активності протягом року.

Таблиця 1. Деякі фізико-хімічні характеристики фібриногенолітичного ферменту отрути щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys)

Властивості | A. acutus1 | A. rhodostoma2 | A.c. contortrix3 | A. c. mokasen4 | A. halys halys

Молекулярна маса, кДа | 24,108 | 25,360 | 25,000 | 22,900 | 28,000

Кількість аміно-кислотних залишків на молекулу фер-мента |

208 |

202 |

210 |

213 |

218

Інгібітори протео-літичної активності | ЕДТА

Цистеїн | ЕДТА

Цистеїн | ЕДТА

ДТТЕ | ЕДТА

ДТТЕ | ДФФ

бензамідин

Оптимум рН | 7,4 | Н.в. | 7,5 | 7,8 | 7,5-8,0

Термостабільність | Термолабіль-ний | Термолабільний | Н.в. | 43оС | Термолабільний

Специфічність | Фібриногенази, виділені з отрути змій зазначених видів, розщеплюють А -ланцюг

фібриногену

Питома активність, мг/хв/мг фібриногену | 35,3 | 33 | 20 | 36,6 | 15,6

Н.в. – не визначали; 1- Quang C., Huang T., 1976; 2- Quang C., 1983; 3 – Retzious A., Marcland F., 1990; 4 – Marcland F., 1988.

Таким чином, виділений з отрути Agkistrodon halys halys фермент відноситься до групи a-фібриногеназ, за виявленими властивостями подібний до фібриногенолітичних ферментів, виділених з отрути інших видів змій роду Agkistrodon (таб. 1).

Отриманий фермент може бути використаний при вивченні структурних і функціональних взаємодій систем зсідання крові і фібринолізу.

Виділення та очищення активатора протеїну С

За даними літератури (Kisiel, 1987, 1988; Klein, Walker, 1986; Choi, 1987; Esmon, 1988 та ін.) виділення препаратів активатора протеїну С включає 3-4 етапи із застосуванням методів іонообмінної, афінної хроматографії, гель-фільтрації, хроматографії високого тиску. Як адсорбенти використовують QAE-сефадекс А-50, апротинін-сефарозу, сефадекси G-75, G-100, Mono Q. Такий спосіб виділення й очищення є тривалим, вимагає дорогих матеріалів, на кожному наступному етапі втрачається значна частина активного матеріалу. У зв'язку з вищенаведеним, перед нами стояла задача розробити такий максимально простий і ефективний спосіб виділення й очищення білкового препарату, що дозволив би на основі отриманого ферменту створити препарат, придатний для використання в практичній медицині. Виділення й очищення активатора протеїну С проводили, використовуючи методи іонообмінної хроматографії і гель-фільтрації. Після видалення з цільної отрути тромбіноподібного фермента матеріал, що не зв'язався з носієм, піддавали подальшому розділенню за методом іонообмінної хроматографії на Q-сефарозі. Вісім отриманих фракцій були перевірені тестом „тромбіновий час” для виявлення фібриногенолітичного ферменту та тестом АЧТЧ, що використовується для визначення в плазмі крові рівня протеїну С. Згідно з тестом АЧТЧ в матеріалі фракції №1 було виявлено компонент, що подовжував час зсідання подібно активатору протеїну С – препарату „Protac” (Pentapharm AG, Німеччина), – виділеного з отрути A. contortrix contortrix. (див. рис. 2А). Електрофоретичний аналіз фракції №1 показав наявність білкових домішок. Видалити їх рехроматографією не вдалося, тому для подальшого очищення білка проводили гель-фільтрацію на суперозі 12 HR 10/30. Зразок (0,3% від об’єму колонки) у 0,05 М трис-НС1 буфері рН 8,2 наносили і елюювали зі швидкістю 0,4 мл/хв тим же буфером. Активатор протеїну С елюювався при іонній силі 0,4 М одним піком і був електрофоретично гомогенним (рис. 5).

Субстратну специфічність активатора протеїну С досліджували, використовуючи ефіри амінокислот, хромогенні субстрати, білки і проферменти. Фермент не виявляв БАПНА і ТАМЕ естеразну активність, але гідролізував БАЕЕ. Активність складала 520 мкмолей/хв на 1мг білка. Препарат не гідролізував хромогенні субстрати плазміногена (S2251), фактора Х (S2765), фактора Ха (S2222), урокінази (S2444), але виявляв незначну амідазну активність на субстраті тромбіну (S2238). Фермент не мав казеїнолітичної і фібринолітичної активності, не діяв на протромбін, фібриноген, плазміноген, тромбін, не впливав на агрегацію тромбоцитів, що подібно до властивостей активатора протеїну С, виділеного з отрути Agristrodon contortrix contortrix.

Активність ферменту пригнічувалась інгібіторами серинових протеїназ – ДФФ, бензамідином, ПМСФ, етилен-диамін-тетраацетатом (ЕГТА) і не інгібувалась гірудином, синтетичним інгібітором тромбіну, соєвим інгібітором трипсину (СІТ), гепарином. Не були ефективними також інгібітори цистеїнових і кислих протеїназ – 0,1 мМ ПХМБ, 10 мМ хлорацетамід (таб. 2). Ці дані дозволяють зробити припущення про наявність в активному центрі ферменту серина.

Отже, за даними DS-Na електрофореза отриманий білок є одноланцюговим, з молекулярною масою 341 кДа. Оптимум рН дії отриманого ферменту – при 8,0. Для активації протеїну С виділеним активатором не потрібні тромбін, тромбомодулін і кальцій. Фермент не втрачає активності при ліофілізації і наступному збереженні у замороженому стані при –20оС. Легко розчинний у воді.

Таблиця 2. Вплив інгібіторів серинових протеїназ на активність

активатора протеїна С

Інгібітори | Концентрація інгібіторів | Залишкова активність, %

Бензамідин | 10 мМ | 48

ЕДТА-Nа | 20 мМ | 97

ПМСФ | 200 мМ | 22,5

ПНГБ | 10 мМ | 30

ПНГБ | 100 мМ | 0

АТ-III/гепарин | 60 мкМ/4 од/мл | 100

СІТ | 1 мг/мл | 100

ДФФ | 10 мМ | 0

Виділення інгібітору агрегації тромбоцитів

Інгібітор агрегації тромбоцитів одержували на Q-сефарозі. Як і для фібриногенолітичного ферменту, активатора протеїну С, вихідним матеріалом була білкова фракція, що не зв'язалася з блакитною сефарозою при видаленні з отрути тромбіноподібного ферменту. При використанні ступінчатого градієнта NaCl з Q-сефарози при іонній силі 0,04 М і 0,08 М елюювались, відповідно, активатор протеїну С і фібриногенолітичний фермент. Інгібітор агрегації тромбоцитів елюювався при іонній силі 0,2 М (фракція 8, рис. 2А). За даними DS-Na електрофореза це одноланцюговий пептид з молекулярною масою 14 кДа. Дію на АДФ-залежну агрегацію тромбоцитів перевіряли, додаючи різні кількості отриманого препарату до збагаченої тромбоцитами фракції плазми крові. Швидкість агрегації реєстрували на агрегометрі Apact (Німеччина). Проведені дослідження показали, що під дією внесеного препарату швидкість агрегації знижується (рис. 6). Очевидно, отриманий білковий препарат блокує тромбоцитарний рецептор фібриногену – інтегрин IIbIIIa, однією з функцій якого є участь у взаємодії тромбоцит-тромбоцит і тромбоцит-стінка судини.

Вивчення порушень стану системи гемостазу

Система гемостазу, з фізіологічної точки зору, являє собою взаємодію двох протилежних систем – системи зсідання крові та фібринолітичної. Порушення цілісності гемостазу веде до виникнення внутрішньосудинного зсідання крові (ВЗК-синдром). Для лабораторної діагностики ВЗК, особливо його хронічної форми, важливо використання високочутливих діагностичних тестів, за допомогою яких можна виявити маркери ВЗК-синдрома і характеризувати ступінь порушення балансу між окремими ланками гемостазу.

Ферменти-активатори фібриногену, протромбіну, протеїну С, що виділені з отрути щитомордника звичайного і ефи багатолускової, можуть бути використані як для досліджень процесу тромбоутворення на модельних системах, так і для діагностичних цілей у клінічній практиці. Розроблений на їхній основі комплекс діагностичних тестів дозволяє характеризувати стан системи гемостазу при різних патологіях, а також вчасно виявити порушення рівноваги між окремими ланками гемостазу. Тести апробовані на плазмі крові хворих при захворюванні серцево-судинної системи, виразкової хвороби, нефритах, гестозах при вагітності та ін.; високочутливі, інформативні, легко здійсненні, не вимагають додаткового устаткування.

Застосування активатора протеїну С для визначення рівня протеїну С у плазмі крові

У клінічній практиці для встановлення рівня одного з основних фізіологічних інгібіторів процесу активації системи зсідання крові – протеїну С – у плазмі крові використовували функціональний тест „активований частковий тромбопластиновий час” (АЧТЧ) із застосуванням нефізіологічних активаторів протеїну С. Активований протеїн С інактивує Va і VІІІа фактори, внаслідок чого час зсідання в тесті значно подовжується. Рівень активності протеїну С визначають за калібрувальним графіком, побудованим з використанням дефіцитної за протеїном С плазми. При розробці умов тесту для визначення рівня протеїну С за допомогою ферменту-активатора, виділеного з отрути щитомордника експериментально визначали тривалість інкубації та оптимальну кількість ферменту, що повністю активує протеїн С у відповідному об’ємі плазми крові і викликає таке збільшення часу зсідання при використанні теста АЧТЧ, коли чутливість тесту максимальна. Оптимальний (контрольний) час зсідання плазми крові складає 180 с.

При деяких патологіях внаслідок накопичення в кровотоці патологічних інгібіторів зсідання крові час зсідання в тесті АЧТЧ значно подовжується. Крім того, у хворих зі схильністю до тромбозів виявляють спадкову або надбану форму резистентності фактора Va до дії активованого протеїну С (РАПС), що обумовлено крапковою мутацією гена фактора V (аномалія фактора V Лейден). Основою надбаної форми є порушення взаємодії фактора Vа, протеїну С з протеїном S на фосфоліпідній мембрані. Ця форма РАПС виявляється при вагітності, антифосфоліпідному синдромі (Sakata et al., 1986). В таких ситуаціях результати функціонального теста (АРТТ+активатор) будуть недостовірні. Лабораторна діагностика РАПС здійснюється при порівнянні даних про вміст функціонально активного протеїну С, отриманих при використанні теста АЧТЧ і тестів з використанням хромогенних субстратів

Розбіжність між даними тестів ми спостерігали у випадках нестабільної стенокардії, інфаркту міокарду, сепсисі, хвороби на виразку шлунку (таб. 3).

Таблиця 3. Визначення активності протеїну С за допомогою функціонального тесту АЧТЧ і хромогенного субстрату Хромозим 236. |

РФ, г/л | ТЧ, с | АЧ, с | АТ-III, % | АЧТЧ, с | Протеїн С, %

Контроль | 0 | 120,07 | 301 | 1002 | 360,4 | 1001,3

Інфаркт | 0,06 | 12 | 30 | 50 | 47 | *114 | **30

Нестабільна стенокардія | 0,015 | 11 | 27 | 84 | 48 | *100 | **70

Сепсис | 0,09 | 7 | 27 | 77 | 42 | *105 | **60

Виразка

шлунку | 0,09 | 10 | 26 | 85 | 36 | *110 | **50

* ступінь активності протеїну С, визначений за допомогою функціонального тесту

** ступінь протеїну С, визначений за допомогою хромогенного субстрату.

Як видно з таблиці, результати функціонального тесту (АРТТ + активатор) завищені. Тому для одержання достовірної інформації про вміст протеїну С та рівню його функціональної активності необхідно порівнювати дані обох тестів.

Виділений нами з отрути щитомордника звичайний активатор протеїну С апробований на плазмі крові хворих з такими патологіями, як порушення серцево-судинної діяльності (n=94), абдомінальні кровотечі при виразковій хворобі (n=100), гестози при вагітності (n=54), нефрити (n=24), сепсис (n=42). У всіх зазначених випадках виявлена гіперактивація системи зсідання крові, що приводить до зниження рівня протеїну С (рис. 7), накопичення розчинного фібрину. Комплексний аналіз виявив кореляцію між накопиченням розчинного фібрину та скороченням часу зсідання в тестах тромбіновий та анцистроновий час. Прикладом аналізу порушень механізмів регуляції функціонування системи зсідання крові є розроблений нами алгоритм характеристики стану системи гемостазу при цукровому діабеті: необхідно визначати вміст фібриногену та цитокінів (показників розвитку запального процесу), протеїну С, антитромбіну ІІІ, а також маркерів ВЗК-синдрому – розчинного фібрину та аномальних форм протромбіну. Потенціал фібринолітичної системи визначається за активністю тканинного активатора плазміногена.

Розроблені нами тести на основі препаратів з отрути змій можна застосовувати не тільки для діагностування стану системи гемостазу при патологіях, але і для прогнозування тромботичних ускладнень. Так, наприклад, є дані (Gleerup, Winther, 1991; Ros et al, 1989) про роль гемостатичних порушень у патогенезі тромбозів ретинальних судин, поразки судин сітківки ока. Накопичення субретинальної рідини є результатом розвитку патологічного процесу при регматогенному відшаруванні сітківки ока. Важливою проблемою є дослідження взаємозв'язку між активацією систем зсідання крові судин ока і ступені важкості відшарування сітківки, а також розвитком післяопераційних геморагічних і проліферативних ускладнень. Дослідження складу білків субретинальної рідини виявило накопичення в ній протромбіну, фактора Х, плазміногена, протеїну С, антитромбіну III. При важких формах відшарування сітківки ока рівень протромбіну підвищується, тоді як рівень активності специфічного інгібітору зсідання крові – протеїну С – знижується (таб. 4). Це свідчить про можливу локальну активацію компонентів системи зсідання крові.

Проведені дослідження розвитку післяопераційних ускладнень при важких формах відшарування сітківки ока важливі для розуміння патогенезу проліферативних процесів, що можуть виникати в післяопераційний період. На основі отриманих даних нами розроблено спосіб визначення вмісту протромбіну в субретинальній рідини, що дозволяє прогнозувати тромботичні ускладнення після операції при регматогенному відшаруванні сітківки ока.

Вивчено динаміку відновлення рівня протеїну С при проведенні тромболітичної терапії. При ефективному лікуванні відновлення рівня протеїну С відбувається швидко.

Таблиця 4. Вміст компонентів системи зсідання крові і фібриноліза, визначені в субретинальній рідині хворих з регматогенним відшаруванням сітківки ока (РВС).

Клінічні ознаки відшарування сітківки | Стат. показники | Антитромбін III, мкг/л | Фактор Х, % | Протромбін, мкг/мл | Плазміноген, мкг/мл | Протеїн С,%

Довжина

РІС | 1-2 квадранта | n

M

m | 5

13,72

5,66 | 7

0,91

0,80 | 7

0,13

0,08 | 5

0,56

0,14 | 7

4,94

1,64

3-4 квадранта | n

M

m | 7

21.45

10,94 | 11

1,55

0,89 | 11

0,78

0,24 | 10

0,79

0,17 | 11

3,17

1,09

Наявність післяопераційних ускладнень | немає | n

M

m | 8

11.29

4.15 | 12

1.53

0.92 | 12

0.43

0.14 | 9

0.63

0.15 | 12

4.93

0.80

є | n

M

m | 2

50.2

34.2 | 3

1.47

0.52 | 3

1.40

0.61 | 3

1.32

0.10* | 3

2.03

0.90**

Примітка: * - р 0,01; ** - р 0,05.

Таким чином, одержаний нами препарат активатора протеїну С може бути використаний для визначення рівня протеїну С в