КИЇВСЬКИЙ НАЦIОНАЛЬНИЙ УНIВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Лисиця Андрій Валерійович

УДК 577.3:619:615.07:543.8

ФІЗИКО-ХІМІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН ЗА ДАНИМИ ЧАСОПРОЛІТНОЇ ПЛАЗМОВО-ДЕСОРБЦІЙНОЇ МАС-СПЕКТРОМЕТРІЇ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті епізоотології

Української академії аграрних наук

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук

Мандигра Микола Станіславович,

доцент, зав. лабораторії лейкозів, директор

Інституту епізоотології УААН

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Зима Валентин Леонідович,

проф. кафедри біофізики Київського національного

університету імені Тараса Шевченка

доктор біологічних наук

Стародуб Микола Федорович, проф., зав. відділом біохімії

сенсорних та регуляторних систем Інституту біохімії

імені О.В.Палладіна НАН України, м.Київ

Провідна установа - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м.Київ.

Захист дисертації відбудеться " 25 " листопада 2002 р. о 16 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.001.38 при Київському національному

університеті імені Тараса Шевченка (м. Київ, Проспект акад. Глушкова, 2;

поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64,

біологічний факультет, ауд. 215).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського

національного університету імені Тараса Шевченка

(01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58).

Автореферат розісланий " 8 " жовтня 2002 року.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради Т.Л.Давидовська

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Актуальною проблемою для сучасної біофізики є вивчення і фізико-хімічне моделювання фармакологічних явищ і процесів на молекулярному рівні. Оцінка стану біологічно активних речовин (БАР) у сумішах різного походження, сумісність інгредієнтів та вивчення структурних змін, що відбуваються з ними у часі, важливі при аналізі існуючих і створенні нових препаратів (В.П. Георгієвський та ін., 1994; А.Л. Верткин та ін., 1997).

Для вирішення зазначених питань нами вперше в Україні запропоновано використати часопролітну плазмово-десорбційну мас-спектрометрію або ПДМС (tіme-of-flіght plasma desorptіon mass spectrometry /TOF-PDMS/) з іонізацією зразка уламками поділу ядер Cf–252 (R.D.Macfarlane & D.F.Torgerson, 1974). Певні труднощі при отримані чітких піків молекулярних (МІ) або квазімолекулярних іонів (КМІ) та при інтерпретації мас-спектрів спричинили необхідность детального вивчення особливостей іоноутворення в ПДМС. Поглиблення розуміння механізмів десорбції/іонізації, вивчення впливу модулюючих факторів на зміни енергетичного стану молекул та вихід КМІ, з подальшим використанням цих даних при аналізі БАР в експериментальних сумішах і субстратах різного походження, могли би прискорити темпи розробки, випробувань і впровадження нових препаратів для потреб ветеринарної медицини України.

У багатьох випадках стан молекул БАР у препаратах різних лікарських форм досить складно визначити, при цьому використовуються переважно непрямі методи. Недостатньо вивченним є питання одночасного застосування декількох лікарських речовин (Д.Станева-Стойчева и др, 1990). Ймовірність утворення в сумішах, в першу чергу у рідкому агрегатному стані, різноманітних асоціатів, комплексів, похідних та метаболітів може зміщувати лікувальний ефект в небажану сторону (Я.Б.Максимович, 1979). Процес постійного скринінгу оптимального складу інгредієнтів, зумовлює необхідність розробки експрес-методу визначення хімічної сумісності БАР. Також слабо вивчені біофізичні аспекти пролонгації дії окремих БАР у препаратах і методичні підходи до пошуку нових пролонгаторів, стабілізаторів, допоміжних компонентів та ін. (С.Н.Голиков и др., 1989; Е.Escudero et al., 1996). У біофізичному та фармацевтичному аналізі важливим є питання прямої ідентифікації окремих складових у багатокомпонентних біоорганічних субстратах різного походження, біодоступність окремих інгредієнтів (А.А. Полякова и др., 1989; H.Ohta et al., 1998; Р.Maurі et al., 2000).

Враховуючи сучасні світові тенденції до мінімізації використання тварин при фармакологічних випробуваннях, використання ПДМС в біофізичному модельному аналізі дозволить оперативно і об`єктивно характеризувати БАР на молекулярному рівні in vitro. Дані біофізичні дослідження сприяють розвитку теоретичних основ вирішення ряду медико-фармацевтичних завдань.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності до: завдання А01009818р НТП "Конструювання нових засобів профілактики та лікування сільськогосподарських тварин на основі дослідження фізико-хімічних властивостей біологічно активних речовин", завдання 05 проекту 14 “Ветеринарне забезпечення” програми УААН “Продовольство-95”, програми лабораторії диференційної діагностики Інституту епізоотології УААН № 0196U024149.01, тематичного плану Інституту епізоотології УААН на 1996-2000 рр.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було довести можливість ефективного застосування біофізичного аналізу молекулярної взаємодії біологічно активних речовин (БАР), з використанням плазмово-десорбційної мас-спектрометрії (ПДМС), для обгрунтування складу нових комплексних лікувально-профілактичних препаратів, випробування цих препаратів на живих об'єктах.

Для реалізації мети були визначені такі завдання.

1. Дослідити можливості використання біофізичного методу ПДМС для визначення стану і взаємодії молекул БАР у сумішах.

2. Для отримання інформативних мас-спектрів: а) дослідити вплив органічних кислот та речовин із радіопротекторними властивостями на стабільність молекул БАР при десорбції в ПДМС; б) знайти і випробувати нові органічні матриці для зменшення фрагментації молекул БАР при десорбції/іонізації; в) визначити можливу роль реакцій у газовій фазі при утворенні гомо- та гетерокластерних асоціатів іонів.

3. Розробити спосіб визначення хімічної сумісності інгредієнтів і використати його при теоретичному обгрунтуванні оптимального складу багатокомпонентних лікувально-профілактичних препаратів для потреб ветеринарної медицини України.

4. Провести випробування нових препаратів на біологічних об'єктах.

Об'єкт дослідження: міжмолекулярні взаємодії БАР у комплексних препаратах та дія цих препаратів на біологічні об'єкти.

Предмет дослідження: ідентифікація БАР, біофізична характеристика і моделювання стану їх молекул in vitro у сумішах різного походження за допомогою ПДМС для визначення хімічної сумісності інгредієнтів, теоретичне обгрунтування складу та клінічне випробування нових препаратів.

Методи досліджень. Для вивчення стану молекул, структурних змін і міжмолекулярних взаємодій БАР у рідких сумішах та біоорганічних субстратах в якості основного біофізичного методу використано ПДМС, також використано методи тонкошарової (ТШХ) і високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), колориметрії і УФ-спектрофотометрії. Клінічні випробування препаратів проводилися на різновікових групах тварин великої рогатої худоби, свинях, а також на культурах мікроорганізмів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено позитивний ефект сполук із радіопротекторними властивостями на вихід КМІ при їх додаванні до зразків антибіотиків-олігопептидів. Питання значення для оптимізації іоноутворення підбору оптимальних матриць і додавання органічних кислот дістало подальшого розвитку. Вивчено можливості застосування ПДМС для визначення окремих інгредієнтів у складних багатокомпонентних сумішах, серед яких вперше досліджено такі субстрати, як: екстракти з міцелію та культуральної рідини токсинопродукуючих мікроміцетів, СО2-екстракти з лікарських рослин, іхтіол та дьоготь березовий. Вперше показана правомірність і ефективність застосування біофізичного модельного аналізу, з використанням ПДМС, для вивчення стану молекул БАР в сумішах in vitro, ідентифікації та визначення хімічної сумісності окремих інгредієнтів при розробці нових лікувально-профілактичних препаратів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати дають пояснення процесам десорбції/іонізації в ПДМС і доводять ефективність застосування біофізичного мас-спектрометричного аналізу у фармакології. Практична цінність одержаних результатів полягає у створенні методичної бази для ідентифікації складових у багатокомпонентних сумішах, оцінки їх стану та визначенні хімічної сумісності БАР у розчинах. Отримані результати були використані при розробці, теоретичному обгрунтуванні складу і випробуванні ряду нових лікувально-профілактичних препаратів. Частина з них впроваджена у виробництво, зокрема: розчин аміридину 1%, бровадазол плюс, інсектозол, оксимікол, левомікол, тилозомікол. Державний департамент інтелектуальної власності видав деклараційні патенти на винаходи: “Спосіб визначення хімічної сумісності біологічно активних речовин за допомогою мас-спектрометрії” за № 47720 А і "Антибактеріальний препарат Тилозомікол М 5%, 20%"

за № 48458 А. Видано довідково-методичні матеріали “Мас-спектрометрія в ветеринарній медицині” (Рівне, 1998) та “Хімічна сумісність біологічно активних речовин” (Рівне, 1998).

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно виконані мас-спектрометричні, спектрофотометричні та хроматографічні дослідження. Аналіз, інтерпретація, теоретичне обгрунтування одержаної наукової інформації виконані дисертантом особисто. Експерименти з мікотоксинами проведено здобувачем спільно з лабораторією токсикології ІЕКВМ УААН, у випробуванні нових препаратів на тваринах приймали участь співробітники ІЕ УААН. В розробці концепції досліджень і аналізі отриманих результатів активну участь приймали співавтори друкованих робіт дисертанта.

Апробація роботи. Матеріали за результатами наукових досліджень доповідались на: міжнародній науковій конференції "Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы" (м. Харків, 1995 р.); міжнародній конференції "Asіgurarea stііntіfіca a sectoruluі zootehnіc sі medіcіnі veterіnare" (м. Кишинів, 1996 р.); міжнародній науково-практичній конференції "Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми" (м. Харків, 1997 р.); науково-методичному семінарі "Лабораторна ветеринарна медицина: фізико-хімічні методи досліджень" (м. Рівне, 1998 р.); міжнародній науковій конференції “Сучасна аграрна наука: напрямки, проблеми і шляхи їх вирішення” (м. Львів, 2001 р.); на засіданнях вчених рад Інституту епізоотології УААН (м.Рівне, 1995-2001 рр.) та Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини (м. Харків, 1995-1999 рр.).

Публікації. Результати роботи викладені у 23 друкованих роботах, в тому числі 4 статті у виданнях, що рекомендовані ВАК України, як фахові.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 145 сторінках, складається із вступу, чотирьох розділів, висновків і рекомендацій, списку використаної літератури, що нараховує 241 найменування, у тому числі 58 – іноземними мовами, та 4-х додатків. Робота містить 5 таблиць і 48 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Методи досліджень, обладнання та матеріали

Виходячи із особливостей об'єкту та предмету досліджень, в якості основного експериментального біофізичного методу використано мас-спектрометрію, зокрема у такому її варіанті, як ПДМС. Дослідження проводили на мас-спектрометрі біохімічному МСБХ-01 з іонізацією зразка уламками ділення ядер Cf-252 (ВАТ "SELMІ", Україна). В процесі роботи використовували прискорюючі напруги від +20 кВ до -20 кВ, об'єм накопичуваних даних подій розпаду Cf-252 (стартів) 16 000 – 500 000, ширина каналу детектування 1 або 2 нс/канал, об'єм зразків, що наносили серіями на пробонесучий диск (до 12 шт.) становив 40-80 мкл. Кожен дослід відтворювали щонайменше 3 рази. При пробопідготовці в деяких експериментах використано метод електророзпилення матриці або зразка (електроспрей) на пристрої УНП-2 (ВАТ "SELMІ", Україна). При створенні багатокомпонентних модельних систем in vitro для кожної серії експериментів попередньо знімали мас-спектри окремих інгредієнтів. На рисунках наведені мас-спектри отримані за допомогою спеціальної комп'ютерної програми керування, накопичення та обчислення даних (МСБХ, версія 4.0/m). Ідентифікацію та оцінку стану БАР у сумішах, їх хімічну сумісність, аналіз компонентного складу субстратів різного походження, проводили за характером мас-спектрів, інтенсивністю та співвідношенням комплексу піків КМІ, аддуктів, асоціатів, похідних.

В роботі також використано методи ВЕРХ, ТШХ, колориметрії і УФ-спектроскопії та ін. Для вимірювання рН розчинів використовували іономір лабораторний И-130. Хроматографічні дослідження проводили на рідинному хроматографі "LPP" (виробництва Чехії) з УФ-детектором і скляною колонкою з оберненою фазою С18, рухлива фаза - суміші етанолу (або метанолу) із водою у різних співвідношеннях або спеціально підібрані буферні системи. ТШХ проводили на пластинках "Силуфол" в різних системах розчинників. Колориметричні дослідження виконували на КФК-2, спектрофотометричні - на СФ-46 і "SPECORD M400" (l = 190-700 нм, товщина кювети 1-10 мм).

Об'єкти досліджень: лікувально-профілактичні ветеринарні препарати (антибіотики, сульфаниламіди, нітрофурани, антгельмінтики, вітаміни та ін.), багатокомпонентні субстрати різного походження (СО2-екстракти з лікарських рослин, екстракти з культуральної рідини та міцелію токсинопродукуючих мікроорганізмів та інші), перспективні для використання у ветеринарній медицині БАР та їх композиції. Моніторинг комерційних препаратів та модельних сумішей БАР проводили від декількох діб до трьох років. Клінічні випробування експериментальних препаратів проводили на тваринах великої рогатої худоби та свинях різновікових груп, а також на штамах мікроорганізмів S. aureu 209P, Е. colі, P. aerugіnosa, C. albіcans. Одержані результати обробляли з використанням методів варіаційної статистики.

Результати досліджень та їх обговорення

Значення органічних матриць для процесу іоноутворення. Однією з причин того, що для великої кількості сполук складно отримати на мас-спектрах чіткі піки КМІ, можуть бути сильні міжмолекулярні зв'язки. Це призводить до фрагментації молекул ще при десорбції. Тому доцільно використовувати різні матриці, в яких значно послаблюються міжмолекулярні взаємодії БАР. Унікальні можливості традиційної для ПДМС нітроцелюлозної (НЦ) матриці не виключають необхідності пошуку інших. В процесі роботи з'ясувалося, що можна обійтися і без складного процесу електронапилення. Матрицеформуючу речовину, в кількості до 50% від загального об'єму, можна додавати безпосередньо до зразків перед їх нанесенням на пробонесучий диск.

В якості матриці були випробувані декілька сполук, найкращий результат отримано при використанні двохатомного спирту пропіленгліколю (ПГ). Дослідження антибіотику окситетрацикліну (М=460 а.о.м.) в ПГ-матриці показало, що по-перше в даній матриці значно зростають інтенсивністі піків МІ антибіотику порівняно із контролем, по-друге з'являються гомоасоціати іонів БАР, по-третє характер спектру і вихід іонів практично не погіршуються навіть після 3-х місяців перебування зразку у вакуумній камері приладу. На мас-спектрах чітко фіксуються КМІ: m/z 460 належить МІ [M]+, m/z 443 – іон без однієї гідроксильної групи [M-OH-]+, m/z 427 – без окси і гідрокси груп [M-O-OH-]+, а також гомокластерні іони. На мас-спектрах контрольних зразків, що три місяці перебували в тих же умовах, інтенсивності КМІ зменшилися на 50-70%, відносно зросли характерні фонові пікі. Якщо БАР тривалий час зберігаються без змін в ПГ-матриці, то ця біофізична модель може проясняти ефект пролонгації дії препаратів у організмі. Виходячи з цього, було запропоновано декілька антибактеріальних препаратів для ветеринарної медицини, зокрема Оксимікол (основні складові окситетрациклін і ПГ), Левомікол (із левоміцетином) і Тилозомікол (із тілозином).

Клінічні порівняльні випробування на різновікових групах ВРХ з різними інфекційними патологіями показали, що при двократному введенні з інтервалом в одну добу рівних доз ін'єкційних 10% розчинів окситетрацикліну гідрохлориду і оксиміколу останній має значно більшу лікувальну еффективність, це пояснюється створенням стабільного депо антибіотику і підтриманням тривалий час в організмі тварин його терапевтично оптимальних концентрацій (табл. 1).

Таблиця 1

Пояснення до таблиці: колонка 1 – всього тварин у дослідній групі, 2 - число тварин, що одужало, 3 - відсоток одужавших тварин.

Рис. 1. а – мас-спектр метронідазолу, б – метронідозол в ПГ-матриці (пояснення в тексті).

Застосування ПГ-матриці дає можливість отримати чіткі піки КМІ для багатьох важколетючих БАР. Так, на мас-спектрі метронідазолу без органічної матриці пік його КМІ [M+H]+ m/z 172 малопомітний і дуже слабо відрізняється від фонових (рис. 1.а), а при використанні ПГ-матриці інтенсивність піку його КМІ значно зростає (рис. 1.б). Це дозволяє ідентифікувати БАР у багатокомпонентних препаратах. Також з'ясувалося, що в якості матрицеутворюючої сполуки у деяких випадках доцільно застосовувати лактозу (4-0-[b-D-галактопіранозил]-D-глюкопіраноза).

При перевірці гіпотези про можливий вплив речовин із радіопротекторними або сенсибілізуючими властивостями на процес десорбції/іонізації олігопептидів нами визначено, що перші значно покращують вихід КМІ. В якості сполук із радіопротекторними властивостями нами було випробувано декілька БАР, в тому числі аскорбінова кислота і амінокислоти цистеїн, триптофан. Для порівняння було взято радіосенсибілізатори нітроімідазол, фурацилін і фуразолідон. Визначали їх вплив на вихід КМІ у двох антибіотиків-олігопептидів граміцидину С (ГС) і поліміксину М (ПМ).

При традиційних умовах пробопідготовки на мас-спектрі ПМ його характерні піки КМІ m/z 1167 і 1179 малопомітні. Додавання радіопротекторів призводить до проявлення на мас-спектрі ПМ потужних піків КМІ. Найкращий результат отримано з аскорбіновою кислотою, при цьому стає можливим ідентифікувати компонентний склад препарату. Піки m/z 1143 і 1157 належать КМІ [М+Н]+ двох ізомерів ПМ. Враховуючи те, що різниця між отриманими масами КМІ і масою дезацильованого декапептиду становить 128 і 142, можна визначити склад N-ацильних залишків. Це, відповідно, С8Н16О2 - ізооктанова та С9Н18О2 - метилоктанова кислоти, вони характерні для ізомерів ПМ2, ПМ3 і ПМ1, ПМz, які мають різну антибактеріальну активність (Б.М. Золотарев та ін, 1992). Контрольний аналіз методом ВЕРХ дав аналогічні результати.

Додавання радіопротекторів до ГС, який добре “летить” і без використання будь-яких модифікуючих факторів, призводить до утворення депротонованих позитивно заряджених іонів: [M-H]+, [M-2Н+Na]+, [M-2Н+К]+. Радіопротектори у даному випадку виступають в якості акцепторів електрону і атомарного водню: [H++e-]0, [H++e-+e-]-. Внесення радіосенсибілізаторів дещо змінює характери мас-спектрів олігопептидів, що може бути використано при комплексному аналізі, але загального зростання виходу КМІ нами не помічено.

Поскільки випробувані радіопротектори є переважно органічними кислотами, в т.ч. амінокислотами, логічним було перевірити дію інших сполук цього класу на вихід КМІ. Для деяких МС-методів відомий так званий “кислотний ефект”. Так, при іонізації БША додаванні деяких слабих кислот значно збільшує відносну інтенсивність піків речовин (Fenselau at al., 1987). Аналогічне явище спостерігали і для ПДМС (Р.А.Зубарев та ін., 1991). Для зміни енергетичного стану молекул БАР і поліпшення їх “летючості”, ми спробували додавати до зразків невеликі кількості різних органічних кислот (конц. 1-15 %), зокрема це: аскорбінова, винна, лимонна, мурашина, пікринова, саліцилова, сульфанілова, сульфосаліцилова, трихлороцтова, щавлева і янтарна кислоти, а також амінокислоти гістидин і гліцин.

З усіх випробуваних кислот найкраще на десорбцію важколетючих БАР впливають винна, лимонна та сульфанілова в конц. до 5%. Так, наприклад, кофеїн “летить” досить слабо, а на його мас-спектрі з винною кислотою чітко фіксується пік [M]+ кофеїну m/z 194; m/z 173 належить КМІ [M+Na]+ винної кислоти. Вірогідно, вплив кислот може бути пояснений нейтралізацією катіонів, які в інших умовах спричиняють руйнацію органічних сполук у процесі десорбції/іонізації, можлива конкуренція за високоактивні вільні радикали, що утворюються в процесі іонізації. Тому, зокрема у окситетрацикліну і кофеїну утворюються в "+" іонах не типові КМІ [M+H+]+ або [M+Na+]+, [M+К+]+, а летять МІ типу [M-e-]+ або [M]+.

Гомо- та гетерокластерні асоціати іонів, значення газофазних реакцій. На мас-спектрах окремих БАР та їх сумішей у деяких випадках можна спостерігати гомо- ([nА+Н]+, [nВ+Н]+ , де n=1, 2, ...) або гетерокластерні ([nAmB+H]+, де n,m=1, 2, ...) іони. При аналізі таких спектрів виникає питання: наскільки об'єктивно дані спектри відібражають стану молекул in vitro, чи це не є наслідком реакцій в газовій фазі після десорбції (В.Д.Чиванов та ін., 1996).

Нами зафіксовані подібні асоціати для таких сполук, як: бутадіон, метронідазол, суміш ацетилхолін-хлориду і прозерину та ін. Так, мікотоксин зеараленон (F-2 токсин, М=318 а.о.м.) в "-" іонах утворює гомоасоціати: m/z 317 належить КМІ [M-H]-, m/z 635 - [2M-H]- подвійний однозарядний іон, m/z 953 - [3M-H]- потрійний однозарядний гомокластер (рис.3.а).

Можливо, на стехіометричні параметри гомо- та гетерокластерних іонів в ПДМС певною мірою і впливають реакції в газовій фазі. Але, на наш погляд, отримані мас-спектри переважно свідчать про те, що у водних розчинах міжмолекулярні комплекси БАР, що вивчалися, стабілізовані за рахунок слабих гідрофобних взаємодій. Те, що простежується чітка кореляція інтенсивностей піків асоціатів із ступенем розчинності речовин у воді, свідчить про утворення асоціатів у рідкій фазі. На мас-спектрах гідрофобних бутадіону, метронідазолу, зеараленону і малорозчинного у воді окситетрацикліну дигідрату помітні досить інтенсивні гомокластерні асоціати, для спектрів гідрофільних сполук асоціати не характерні. Так, прозерин та ацетилхолін-хлорид хоча і утворюють в суміші гомо- і гетерокластери, але інтенсивність цих піків, порівняно з КМІ, не значна. Комплекси зберігаються завдякі низькій внутрішній енергії отриманій молекулами БАР і їх асоціатами при десорбції/іонізації. ПДМС-спектри реально відображають стан молекул іn vіtvo, тому стає можливим прогнозування взаємодій молекул БАР в сумішах.

Таким чином, аналіз асоціатів, при біофізичному ПДМС-моделюванні, дозволяє прогнозувати міжмолекулярні взаємодій БАР і визначати хімічну сумісність інгредієнтів при розробці багатокомпонентних препаратів.

Вивчення стану молекул біологічно активних речовин у сумішах різного походження. У лікувальній практиці часто використовують комплексні препарати, що містять одночас кілька біологічно активних складових. Бровасептол (БС) - комплексний препарат широкого спектру бактерицидної і бактеріостатичної дії, до його складу входять: норсульфазол-натрій (8%), триметоприм (3%), фармазин або тілозину тартрат (2,5%), окситетрацикліну гідрохлорид (4,5%), сульгін (7%) і хімічно інертний наповнювач. Через декілька годин після розчинення препарату на мас-спектрі визначаються: m/z 277, що належить [M]+ норсульфазол-натрію, m/z 290 - [M]+ триметоприму, m/z 460 [M]+ окситетрацикліну і m/z 237 - [M+Na]+ сульгіну (рис. 3.а), тілозину тартрат при даних умовах пробопідготовки не проявляє себе. Після тривалого перебування БС в розчині піки БАР зменшуються і поступово зникають. Через п'ять місяців на мас-спектрі ідентифіковано в незмінному стані лише триметоприм (рис. 3.б), інші БАР зазнали хімічних перетворень і втратили свої властивості. Оскільки даний препарат випускається у вигляді порошку, то хімічною несумісністю інгредієнтів можна до певної міри знехтувати. Але коли виникла потреба створити аналогічний за дією ін'єкційний препарат, то враховуючи результати МС-аналізу, його склад за було переглянуто.

Таким чином, підтверджується теза про те, що ПДМС можна використовувати в якості експрес-методу для попереднього визначення компонентного складу комплексних препаратів та хімічної сумісності інгредієнтів. Разом з тим, доцільним є поєднання ПДМС з іншими аналітичними методами. Так, склад БС паралельно було перевірено за допомогою ВЕРХ, результат аналізу аналогічний.

а б

Рис. 2. а - мас-спектр бровасептолу, для покращення десорбції БАР додано 3% щавелевої кислоти; б – мас-спектр препарату знятий після п'яти місяців його перебування у розчині.

Пушновіт - полівітамінний препарат, що згодовується хутровим звірам із кормом. На його мас-спектрі ідентифіковано пікі: m/z 365 належить КМІ [M+Na]+ сахарози, m/z 381 - також КМІ [M+К]+ сахарози, m/z 265 - КМІ [M+Н]+ вітаміну В1, m/z 377 - КМІ [M+Н]+ вітаміну В2, m/z 146 - КМІ [M+Na]+ вітаміну В3, m/z 162 – також КМІ [M+К]+ вітаміну В3, m/z 431 - КМІ [M+Н]+ вітаміну Е (a-токоферолу), m/z 473 - КМІ [M+Н]+ вітаміну Е (токоферолу ацетату), m/z 429 - фолієва кислота. На хроматограмі ВЕРХ наявні піки усіх регламентованих інгредієнтів, крім ціанокобаламіну і вітаміну ВС. Таким чином, результати МС-аналізу і ВЕРХ в значній мірі збігаються. Ці дослідження роблять можливим застосування ПДМС не тільки для визначення якісного складу офіцинальних препаратів, а і дозволяють екстраполювати метод до вивчення складних багатокомпонентних органічних субстратів.

Були досліджені СО2-екстракти з лікарських рослин (піхти сибірської, м'яти перечної, хмелю звичайного). Екстрагування зрідженим вуглекислим газом є одним з перспективних методів вилучення з лікарських рослин біологічно активних складових (Касьянов Г.И. та ін., 1978). До складу СО2-екстрактів входять фенілпропаноїди (до 50 %), кумарини, флавоноїди, терпени, ліпіди тощо. Ці сполуки створюють своєрідну матрицю для молекул БАР, яка може через зміну їх біодоступності зміщувати лікувальний ефект, динаміку засвоєння організмом, виступати стабілізатором БАР тощо.

Фармацевтичний аналіз компонентного складу екстрактів, від якого і залежать їх лікувальні властивості, становить неабияку складність. Ми вперше використали ПДМС для перевірки можливості ідентифікації окремих інгредієнтів у екстрактах. Окремі "маркерні" речовини, що ідентифікуються за допомогою ПДМС, в подальшому можуть стати у нагоді при вивченні багатокомпонентних препаратів, виготовлених на основі цих екстрактів.

Серед БАР, що були ідентифіковані на мас-спектрах СО2-екстрактів з листя м'яти перечної (Mentha pіperіta): бетаїн (в "+" іонах m/z 118 - КМІ [М+Н]+, в "-" іонах m/z 117 - [М]-), вітамін С (m/z 177 - КМІ [М+Н]+), терпен лимонен (m/z 137 - КМІ [М+Н]+), дитерпен (m/z 273 - КМІ [М+Н]+), тритерпен (m/z 409 - КМІ [М+Н]+). В СО2-екстракі з хвої піхти сибірської (Abіes sіbіrіca): холін (m/z 104 - КМІ [М+Н]+), вітамін С (m/z 177 - КМІ [М+Н]+), антоціани (m/z 256 - КМІ [М+Н]+), m/z 397 ергостерин, а m/z 430 - токоферол (вітамін Е); вітамін В1 (m/z 263 [М-Н]- і m/z 299 [М+Cl]-), абієтинова кислота (m/z 301 [М-Н]-), m/z 291 належить молекулі антоціану з аніоном хлору [М+Cl]-. В хмелі звичайному (Humulus lupulus): каріофілен (m/z 219 - КМІ [М+Н]+), вітамін В6 (m/z 166 - КМІ [М+Na]+), церотинова кислота (m/z 420 - КМІ [М+Na]+) і кумарин m/z 147 - KMІ [M+H]+), ізовалеріанова кислота (m/z 125 - [М+Na]-), аденін (m/z 134 - [М-Н]-) і вітамін В1 (m/z 263 [М-Н]-). Крім зазначених вище, на мас-спектрах багато піків в області m/z 140-450, що складні для інтерпретації.

З аналогічною метою були розглянуті і такі відомі препарати, як Іхтіол (Іchtyolum) і дьоготь березовий (Pіx lіquіda betulae, Oleum Ruscі). На мас-спектрах іхтіолу ідентифіковано в "+" іонах лише m/z 225 як КМІ [М+Na]+ похідного тіофену - фенілгідразону, інші піки, як і мас-спектр в "-", не піддаються достовірній інтерпретації. На мас-спектрі дьогтю березового в "+" іонах ідентифіковано m/z 109, що належить КМІ [М+Н]+ крезолу, в "-" іонах МІ крезолу також присутній - m/z 108, крім того є фенол (m/z 93 - КМІ [М-Н]-), бензойна (m/z 121 - КМІ [М-Н]-), арахінова (m/z 311,5 - КМІ [М-Н]-) і бегенова (m/z 340 - КМІ [М-Н]-) кислоти.

Можливість у деяких випадках ідентифікувати окремі БАР у складних субстратах дозволила спробувати напряму визначати мікотоксини в уражених кормах для тваринництва. Як правило, для подібних цілей у токсикології використовуються хроматографічні методи (В.А. Тутельян та ін., 1985). Але ці методи не завжди дають однозначний результат, вимагають трудомісткої пробопідготовки, обов'язковим також є наявність якісних стандартів, які для декількох сотень відомих на сьогодні ксенобіотиків не завжди доступні. Були випробувано різні умови пробопідготовки і знято мас-спектри декількох стандартних зразків найбільш поширених мікотоксинів: афлотоксину В1, зеараленону (рис. 3.а), Т-2 токсину, койової кислоти, патуліну, стеригматоцистину. Після цього в одну серію проб комбікорму було внесено відому кількість зеараленону, в іншу - Т-2 токсину (конц. 0,05-0,2 мг/кг). Екстрагування проводили гексаном і ацетоном, для порівняльного хроматографічного аналізу переекстрагування проводили хлороформом. З'ясувалося, що методом ПДМС у фільтрованих екстрактах з цих проб без концентрування внесені ксенобіотики чітко ідентифікуються. Так, на мас-спектрі екстракту з комбікорму, до якого було привнесено зеараленон, в "+" іонах, незважаючи на велику чисельність інших піків, добре помітні KMІ m/z 319 [M+H]+ зеараленону і m/z 301 [M]+ , що належить a-зеараленолу. Значно потужніший пік зеараленону m/z 317 [M-H]- зареєстровано в "-" іонах (рис. 3.б), де більшість речовин, що також були екстраговані з комбікорму і "засмічували" спектр в позитивних іонах, "летять" слабо.

а б

Рис. 3. а - мас-спектр мікотоксину зеараленону; б – мас-спектр екстракту з комбікорму, m/z 317 належить зеараленону (пояснення в тексті).

Паралельні випробування з використанням ТШХ і ВЕРХ підтвердили результати МС-аналізу. Отже, доведена можливість прямої ідентифікації деяких мікотоксинів в екстрактах з кормів у концентраціях, порівняльних з тими, що визначаються хроматографічно і обумовлюються діючими санітарними нормами (0,05 - 3 мг/кг). У екстрактах з міцелію і культуральної рідини токсинопродукуючих мікроорганізмів різних штамів родів Aspergіllus, Penіcіllіum, Fusarіum, що були надані лабораторією токсикології ІЕКВМ УААН, МС-метод дозволив визначити до двадцяти мікотоксинів.

Визначення хімічної сумісності БАР при розробці нових лікувально-профілактичних препаратів має важливе значення для фармакології. У деяких випадках визначити фармацевтичну несумісність досить складно, особливо коли зміни не явні. В процесі роботи було досліджено декількох десятків сумішей БАР, прослідковано динаміку змін у часі. Порівняльна перевірка результатів ПДМС-аналізу іншими біофізичними методами підтвердила правомірність і ефективність його застосування для вирішення даної задачі.

Одним з ефективних антихолінестеразних препаратів є похідний ціаніміну - аміридину гідрохлорид або АМГХ (9-аміно-2,3,5,6,7,8-гексагідро-1Н-циклопента (в) хіноліну гідрохлориду моногідрат), М=188 а.о.м. Були зняті мас-спектри декількох десятків комбінацій цієї сполуки з іншими БАР, визначена їх хімічна сумісність. Так, для суміші АМГХ з прозерином (М=334 а.о.м.) характерним є підсилення антихолінестеразних властивостей через різні механізми дії. Для мас-спектру прозерину характерні піки m/z 223 катіону молекули [К]+, m/z 209 - цей же іон, але без однієї метильної групи [К–CH3]+, m/z 559 - гомокластер [M+K+H]+. На мас-спектрі еквімолярної суміші прозерину з АМГХ, витриманої певний час у розчині, наявні всі характерні піки прозерину і m/z 189 - КМІ [M+H]+ АМГХ. Це дозволяє зробити висновок про хімічну сумісність даних компонентів і можливість їх використання, у терапевтично виправданих випадках, в одному ін'єкційному препараті.

1,10-Декаметилен-біс-[N-диметил-(карбментоксиметил)-амоній]дихлорид або Декаметоксин (ДК) має бактерицидні і фунгіцидні властивості. Його мас-спектр (рис. 4.а) містить декілька характерних піків, що належать КМІ і визначеним фрагментам молекули (рис. 4.б), М=693,9 а.о.м. З метою підсилення антисептичної дії спробували його поєднати в одному препараті з антибіотиком граміцидином С. Для визначення хімічної сумісності сполук було знято мас-спектри їх еквімолярної суміші у рідкій фазі. Аналіз спектрів окремо взятих речовин і їх суміші показав, що ДК практично повністю зруйнувався: на спектрі залишився лише малопомітний пік одного з його фрагментів (m/z 425); КМІ антибіотику залишилися, але інтенсивності і співвідношення піків m/z 1142 і 1164 помітно змінилися. Таким чином, виявлені зміни вказують на недоцільність поєднання цих БАР у розчинах.

При розробці нового препарату для лікування перитоніту з метою підсилення антисептичного ефекту ДК було зроблено спробу поєднати його в одному препараті з перекисом водню (Н2О2). Мікробіологічні дослідження показали, що антисептична активність суміші значно перевищує дії окремих складових. Випробування проводили на штамах мікроорганізмів Streptomyces aureu 209P, Еscherіchіa colі, Pseudomonas aerugіnosa, Candіde albіcans. Для комплексного препарату, що отримав попередню назву Палісан, необхідно було підібрати оптимальні концентрацій інгредієнтів. Концентрацію ДК брали постійною (0,0066%), а перекису водню змінювали шляхом послідовного подвійного розведення (0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,025%, 0,0125%, 0,00625%).

Моніторинг розчинів сумішей ДК і Н2О2, що зберігалися при кімнатній температурі в захищеному від світла місці, проводився протягом 38 місяців. Аналізували відносні інтенсивності характерних піків 288, 425 і 658.

Характери мас-спектрів сумішей, підготовлених безпосередньо перед проведенням аналізу, незалежно від концентрації перекису водню практично не відрізняються від контролю (0,0066% розчин ДК). Подальші спостереження показали, що при концентраціях Н2О2 в суміші порядку 0,2% і 0,1% основний КМІ ДК - m/z 658 на мас-спектрі через 2-3 місяці вже не визначається, значно зменшуються інтенсивності й інших характерних піків ДК, антимікробна активність препаратів при цьому також зменшувалася. При концентраціях Н2О2 0,05% і менше ДК в суміші зберігається більш тривалий час. Після 21-го місяця зберігання розчинів характерні піки ДК було визначено лише у контрольному зразку чистого ДК та тих зразках, де початкова концентрація Н2О2 була мінімальною (0,0125% і 0,00625%).

Таким чином, аналізуючи співвідношення інтенсивностей піків КМІ та характерних фрагментів молекули ДК за допомогою ПДМС, можна простежити динаміку зміни його стану у часі. Це дозволяє об'єктивно оцінити доцільність тих чи інших комбінацій даних БАР. У випадку суміші ДК з Н2О2 можна рекомендувати цей антисептик ex tempore, оскільки використання у препаратах концентрацій Н2О2 < 0,1% терапевтично себе не виправдовує.

а б

Рис. 4. а - мас-спектр декаметоксину (ДК) крім m/z 658, що належить КМІ [M-Cl]- містить піки декількох характерних фрагментів молекули; б - наявность у водних розчинах сумішей (ДК+Н2О2) незмінних піків ДК (зафарбовані колонки) в залежності від вихідної концентрації Н2О2 (CДК=const) за даними ПДМС, моніторинг сумішей проводився 38 місяців.

При розробці нового препарату для лікування гельмінтозів тварин постало питання хімічної сумісності двох антгельмінтиків - піперазину адипінату (М=86+146 а.о.м.) і фенбендазолу (1-метил-5,6-[феніл-тіо]-2-бензимідазолу карбамат, М=299 а.о.м.). Вони мають різні механізми дії на гельмінтів: фенбендазол гальмує засвоєння паразитами глюкози і таким чином порушує їх енергетичний обмін, а піперазин вибірково паралізує м'язи гельмінтів. Спектр антгельмінтної дії фенбендазолу досить широкий, в той же час, для досягнення високої ефективності при деяких гельмінтозах, через звикання популяцій, необхідно підвищувати його дозу. До піперазину чутливі не всі види нематод. Застосування даних БАР в одному препараті за рахунок явища синергізму підсилює їх дію, при цьому використовуються значно менші дози БАР і зменшується загальне хіміко-токсичне навантаження на тварину.

На мас-спектрі піперазину адипінату (рис. 5.а) наявні потужні піки m/z 87 КМІ [М+Н]+ піперазину, m/z 233 – КМІ [M+H]+ піперазину адипінату, m/z 265 - типовий фоновий пік. На мас-спектрі фенбендазолу (рис. 5.б) піки m/z 99, 142, 241, 268 належать характерним фрагментам молекули, а m/z 300 - КМІ [M+H]+ фенбендазолу. На спектрі їх еквімолярної суміші, що була витримана у розчині сім тижнів присутні всі типові піки обох сполук, асоціатів і дисоціатів (рис. 6).

Отже, можна зробити висновок, що в суміші молекули цих речовин не зазнали скільки-небудь значних змін, продуктів їх взаємодії не виявлено, вони хімічно сумісні. Враховуючи фармакологічну доцільність, було запропоновано використати ці БАР в одному комплексному препараті - Бровадазол плюс. Клінічні випробування нового препарату були проведені на свинях різних вікових груп, ефективність дегельмінтизації при таких інвазіях, як аскаридози, езофагостомози та трихоцефаліози складає 95-100%.

а б

Рис.5. а – мас-спектр піперазину адипінату, б – мас-спектр фенбендазолу.

Рис.6. Мас-спектр еквімолярної суміші двох антгельмінтиків, що були витримані у водно-етаноловому розчині 50 діб, на спектрі наявні всі характерні піки обох інгредієнтів.

ВИСНОВКИ

1. Використання плазмово-десорбційної мас-спектрометрії (ПДМС) при біофізичному аналізі медичних препаратів, полікомпонентних сумішей і субстратів різного походження дозволяє ефективно моделювати стан молекул біологічно активних речовин (БАР) в них. Але, не зважаючи на переваги ПДМС перед іншими методами, інформативність спектрів і адекватність їх інтерпретації залежать від врахування ряду фізико-хімічних факторів, що впливають на механізми десорбції/іонізації зразків.

2. Проведені дослідження свідчать про те, що ідентифікацію та оцінку стану БАР у сумішах, їх хімічну сумісність, аналіз компонентного складу субстратів різного походження необхідно проводити за характером мас-спектрів, інтенсивністю та співвідношенням комплексу піків КМІ, аддуктів, дисоціатів, асоціатів, похідних. На біофізичних моделях in vitro досліджено стан молекул БАР у багатокомпонентних сумішах різного походження, виявлено шляхи визначення причин змін їх біологічної активності при одночасному застосуванні за допомогою ПДМС-аналізу.

3. Встановлено, що для збільшення виходу КМІ і отримання чітких піків БАР на мас-спектрах, доцільно застосовувати органічні кислоти та матриці. Вказані речовини впливають на “летючість” БАР, але не змінюють хімічну структуру їх окремих молекул або асоціатів in vitro. Запропоновано в якості матриць для речовин з молекулярною масою до 2000 а.о.м. використовувати пропіленгліколь або лактозу. В результаті вивчення впливу на десорбцію більше десяти різних органічних кислот з'ясовано, що найкраще на вихід КМІ важколетючих БАР діє додавання до їх розчинів невеликої кількості (до 1-5%) винної, лимонної або сульфанілової кислот.

4. Вперше виявлено, що додавання до зразків олігопептидів речовин із радіопротекторними властивостями (цистеїн, триптофан, аскорбінова кислота) призводить до зменшення фрагментації, через зміни енергетичного стану молекул полегшується десорбція, значно зростає вихід КМІ. Також визначено, що стехіометричні коефіцієнти гомо- та гетерокластерних асоціатів іонів на мас-спектрах пов`язані із ступенем гідрофільності сполук. Малоймовірно, що наявні на мас-спектрах асоціати залежать від реакцій у газовій фазі, швидше за все вони відображають реальні взаємодії молекул БАР in vitro. Це допомогає при визначенні хімічної сумісності інгредієнтів.

5. Правомірність і ефективність застосування ПДМС для експрес-визначення хімічної сумісності БАР в біофізичних моделях in vitro підтверджено іншими фізико-хімічними методами (хроматографія, колориметрія, УФ-спектроскопія), а також методами аналітичної хімії. ПДМС доцільно також застосовувати для оптимізації підбору інгредієнтів, стабілізаторів і пролонгаторів дії при розробці і лабораторному випробовуванні нових багатокомпонентних лікувально-профілактичних препаратів, теоретичному обгрунтуванні та прогнозуванні їх складу, визначенні ступеню зв'язування молекул БАР з субстратом-носієм.

6. Визначення окремих складових в СО2-екстрактах з лікарських рослин, іхтіолі, дьогті березовому, екстрактах, що містять мікотоксини, доводить можливість використання ПДМС для ідентифікації БАР в багатокомпонентних субстратах. Доцільним є використання ПДМС для точного визначення якісного компонентного складу препаратів, це показано на прикладах антибіотика поліміксину М, що складається з декількох ізомерів різної біологічної активності, а також стандартного зразку для хроматографії мікотоксина зеараленону.

7. Створений комп'ютерний банк мас-спектрів БАР, їх сумішей і комерційних препаратів може бути використаний при розробці і випробуванні нових лікувальних засобів. Проведені випробування ефективності ряду комплексних антгельмінтних та антибактеріальних препаратів дозволили рекомендувати їх для впровадження у виробництво і практичного застосування у ветеринарній медицині України.

СПИСОК ОСНОВНИХ РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Лисиця А.В. Ідентифікація біологічно активних речовин в складних сумішах за допомогою плазмово-десорбцiйної мас-спектрометрiї // Наук. вісник Нац. аграр. ун-ту. – К.,1998. - №11. - С. 166-170.

2. Лисиця А.В. Використання мас-спектрометричного методу при конструюваннi препаратiв, необхiдних для лiкування хвороб молодняка // Наук. вiсник нац. аграрного ун-ту. – К.,1998. - №11. - С. 118-121.

3. Лисиця А.В. Дослідження багатокомпонентних сумішей біологічно активних речовин з використанням ПДМС // Вісник Білоцерківського держ. аграр. ун-ту. – Б. Церква,2000. - Вип.11. - С.164-172.

4. Дмитрієв І.М., Лисиця А.В. Визначення мікотоксинів за допомогою ПДМС // Вісник Запорізького держ. ун-ту. – Запоріжжя,2000.- №1.- С.219-224.

5. Мас-спектрометричний аналіз антгельмінтиків / А.В.Лисиця, М.С.Мандигра, І.М.Дмитрієв та ін.// Наук. вісник Львівської держ. акад. вет. медицини ім. С.Гжицького.-Львів,2001.- Т.3, №2.- С.89-91.

6.