МНСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРА±НИ
ІНСТИТУТ ГІГІЄНИ ТА МЕДИЧНОЇ ЕКОЛОГІЇ
імені О.М. МАРЗЕЄВА АМН УКРАЇНИ
ОБУХАН КАТЕРИНА ІВАНІВНА
УДК 613.-076.5+615.849.11+612.1
ОБГРУНТУВАННЯ ЦИТОЛОГІЧНИХ КРИТЕРІЇВ ДЛЯ ГІГІЄНІЧНОЇ
ОЦІНКИ УЛЬТРАВИСОКОЧАСТОТНИХ ЕЛЕКТРОМАГНІТНИХ
ВИПРОМІНЮВАНЬ
14.02.01 – Гігієна
Автореферат
Дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Київ - 2002
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті гігієни та медичної екології імені О.М. Марзеєва
АМН України
Наукові консультанти:
доктор медичних наук, професор Думанський Юрій Данилович,
Інститут гігієни та медичної екології імені О.М.Марзеєва АМН України,
завідувач лабораторії;
доктор медичних наук, професор Руднєв Михайло Іванович,
директор Інституту експериментальної радіології Наукового центру радіаційної
медицини АМН України, директор.
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор Войціцький Володимир Михайлович,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор
кафедри біохімії;
доктор біологічних наук, професор Горова Алла Іванівна,
Інститут проблем природокористування і екології НАН України,
завідувач відділу цитоекології;
доктор медичних наук, старший науковий співробітник
Гвозденко Людмила Андріївна, Інститут медицини праці АМН України,
завідувач відділу епідеміологічних досліджень.
Провідна установа:
Київська медична академія післядипломної освіти імені П.Л.Шупика,
кафедра гігієни і екології людини, МОЗ України, м.Київ.
Захист дисертації відбудеться “_26_” _лютого___ 2002 року о __10__ годині
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.604.01 в Інституті гігієни та медичної
екології імені О.М.Марзеєва АМН України (02660, м. Київ-94, вул. Попудренка, 50).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гігієни та медичної
екології імені О.М.Марзеєва АМН України (м. Київ, вул. Попудренка, 50).
Автореферат розісланий “_25_” лютого_____2002 року
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Селезньов Б.Ю.
1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Електромагнітні поля радіочастотного спектру (ЕМП РЧ), поширеність і різномаїття яких у сфері життєдіяльності людини без-перервно нарощуються, є екологічно значущим чинником, потенційно шкідливим для здоров?я. Небезпечна електромагнітна обстановка виникає за рахунок обєк-тів радіолокації, телебачення, радіозвязку (Ю.Д.Думанський і ін., 1974, 2001; А.М.Сердюк, 1977; ВООЗ, 1984,1999; М.Г.Шандала та ін., 1990; Н.Dolk a.al.,1997; Ю.Г.Григор'єв, 2000; М.Л.Рудаков, 2001; T.Hiraku a.al., 2001). В районах їх розміщення рівні ЕМП РЧ на 2-4 порядки перевищують природний фон (Ю.Д. Думанський і ін.,1984; І.І.Карачов,1993; Н.Г.Нікітіна,1995; В.В.Медведев, 2001).
Виражена біологічна активність притаманна ультрависокочастотним (УВЧ) випромінюванням в діапазоні 300-3000 МГц (довжина хвилі 1 м-10 см), тобто де-циметровим хвилям (ДМХ), які мають високу проникну здатність (А.С.Прес-ман,1968; В.А. Мінін,1974, С.І.Геращенко,1997). В імпульсному режимі (зокрема УВЧ 3000 МГц) працюють радіотехнічні засоби Держкомгідромету, цивільної авіації, флоту, радіозвязку, телевізійні передавачі (Ю.Д.Думанський та ін.,1984, Н.Г.Нікітіна і ін., 1984). ЕМП частотою 2375 МГц та 2450 МГц використовуються у мікрохвильових печах, фізіотерапевтичній апаратурі, електроніці тощо. У наш час дециметрові хвилі повсюдно стали активно діючим супутником людини.
Разом з тим механізм біологічної дії радіохвиль, у тому числі ДМХ, ще не визначено, і питання методології їх біолого-гігієнічної оцінки є суперечливими, що зумовлюється у значній мірі принципово різними точками зору фахівців на критерії електромагнітної безпеки. Так, гігієнічна регламентація ЕМП РЧ в Ук-раїні здійснюється з урахуванням максимально недіючих рівнів для населених регіонів (Ю.Д.Думанський і ін., 1984). Для виробничих умов застосовують (Росія) концепцію порогів шкідливої дії випромінювань (Б.М.Савін, 1986; Ю.П.Пальцев, 1999), і критерієм безпеки прийнято функціональні (не патологічні) зміни в організмі під впливом ЕМП низької інтенсивності. У США та окремих країнах Західної Європи гігієнічні стандарти радіохвиль враховують пороги порушень найчутливіших органів за теплових рівнів дії. Відтак, санітарні норми ДМХ від-різняються в межах від 0,01 до 10 мВт/см2 (Ю.І.Кольчугін,1996, J.C.Lin, 2000).
Пріоритетним напрямом оптимізації гігієнічної оцінки ЕМП РЧ є експери-ментальне визначення механізму їх біологічної дії й установлення закономірно-стей формування адаптивних реакцій та пошкодження в різних функціональних системах (М.І.Руднєв та ін., 1974,1999; А.М.Сердюк, 1977; М.Г.Шандала і ін. 1983; Б.М.Савін, 1986; І.Г.Акоєв, 1987, Ю.П.Пальцев,1999; Л.Ф.Зюбанова, 2000). Ці складні питання потребують, перш за все, вирішення на клітинному і субклі-тинному рівнях інтеграції, оскільки вплив електромагнітного поля пов'язаний із функціональним статусом клітин (Н.Д.Девятков і ін., 1991, О.В.Бецкий, Н.Д.Де-вятков, 1996), й існує думка, що на рівні органів і тканин ефекти ЕМП "можуть губитися у природних шумах організму" (Б.І.Давидов та ін., 1984).
Враховуючи, що клітини є елементарними фізіологічними одиницями жит-тя, будови, функціонування та відновлення організму, а також метаболічною, енергетичною і генетичною основою живих організмів (Ю.С.Ченцов, 1995; В.М. Благодаров і ін., 1997), остаточне визначення критеріїв небезпечності УВЧ-випромінювань в умовах модельного експерименту вимагає поглиблення і більш широкого застосування комплексу цитохімічних, цитогенетичних, цитоімуноло-гічних, фізико-хімічних, та інших методик клітинної й молекулярної біології.
Клітинні популяції системи крові мають вирішальне значення для оцінки дії радіохвиль на цілісний організм, оскільки неспецифічні реакції імунокомпетен-тних і гемопоетичних клітин перебувають під безпосереднім контролем нейро-ендокринної регуляції (Р. Шмідт, Г. Тевс, 1996) й сигналізують про порушення гомеостазу при відповідних параметрах опромінення. Дію чинника на гемопоез вивчають, починаючи з 30-х років. Однак здебільшого виявлена лабільність і фаз-ність реакцій крові під впливом опромінення високої інтенсивності, а закономір-ності структурно-функціональних змін кровотворної та лімфатичної тканин залишаються не вивченими. Гігієнічна оцінка дії УВЧ-випромінювань на систему крові раніше не проводилася. Фактично не зясований вплив ДМХ на генетичний апарат недиференційованих клітин та їх репродукцію, а також на процеси імуно-генезу. Цитологічні реакції кісткового мозку, тимусу та селезінки не використані в якості критеріїв шкідливості ЕМП РЧ .
Оскільки єдність взаємовідносин біологічних об’єктів з довкіллям здійснюється за допомогою генетично детермінованих процесів проліферації та диференціації клітин і координації оновлення їх переважної більшості (Д.С.Сар-кісов, 1998), виявлення цих процесів у гемопоетичній тканині є життєво важли-вим показником ранньої діагностики порушень. Згідно з даними S.Baranski, P.Czerski (1976), Е.М.Михайловської (1994, 1998) і наших досліджень висунуто припущення, що гемопоетичні, імунокомпетентні, стромальні та інші клітини, які мають вирішальне значення у формуванні захисних реакцій організму (П.В.Сі-монов, 1962, Г.Сельє, 1972, Л.Х.Гаркаві і ін.,1979, П.Д.Горизонтов і ін.,1983, П.В.Литвицький,1997), слід вважати адекватними тест-системами для оцінки сту-пеня небезпечності УВЧ-випромінювань у комплексі з іншими методиками, прий-нятими в гігієнічних дослідженнях. Актуальність, соціальне значення і недос-татня розробленість проблеми критеріїв гігієнічної оцінки ДМХ є підставою для виконання теми. Доцільність поглибленого вивчення закономірностей і механізму дії радіохвиль на клітини системи крові в галузі профілактичної медицини зумовлена також широким обговоренням проблеми ризику захворювань на лейкемію в умовах тривалого опромінення (Г.Б.Гурвіч і ін.1995, 1998; Dolk H. a al., 1997; Goldsmith J., 1997, Ю.Г.Григор’єв, 2000). Епідеміологічні й клінічні дослідження, проведені в Англії, Данії, Польщі, Росії, Фінляндії, Швеції та інших країнах, не виключають можливість розвитку віддалених наслідків у кровотворній тканині під впливом низькочастотних та надвисокочастотних випромінювань особливо в молодому віці.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота вико-нана в межах державних і галузевих програм Українського наукового гігієнічного центру МОЗ України, нині Інститут гігієни та медичної екології АМН України. Дисертант була виконавцем цитологічних і гематологічних досліджень в межах 7 наукових тем. Окремі фрагменти роботи виконані факультативно. Базовими тема-ми для підготовки дисертації є: 1. "Характер и пределы адаптационных и ком-пенсаторных реакций здорового и больного организма при воздействии малоин-тенсивного СВЧ-поля" (№ ГР 75031776); 2. "Изучить особенности биологическо-го действия микроволновой радиации для выяснения механизмов и разработки рекомендаций по предупреждению ее неблагоприятного действия на организм" (№ГР 81048886); 3. "Выявить характер, степень и основные закономерности био-логического действия новых факторов окружающей среды" (№ ГР 01.86.0012677); 4. "Определить информативность и значимость в адаптационных реакциях показа-телей высшей нервной деятельности (оборонительного характера), используемых при гигиенической оценке и нормировании факторов окружающей среды" (№ ГР 01.90001.6122).
Мета роботи: обгрунтування й удосконалення критеріїв біолого-гігієнічної оцінки ультрависокочастотних електромагнітних випромінювань на клітинному рівні з позицій концепції фізіологічної адаптації (на прикладі клітин системи крові).
Для досягнення поставленої мети вирішували ряд завдань:
- установити цитологічні показники шкідливості ЕМП УВЧ-діапазону для системи крові залежно від віку опромінених тварин і часу дії;
- виявити закономірності та залежність від рівня опромінення адаптаційних реакцій і пошкодження клітин в умовах тривалої дії ЕМП (2450, 3000 МГц);
- визначити особливості впливу УВЧ-випромінювань в агравованих умовах (на моделі щурів з нирковою гіпертонією та при наявності дії інших чинників);
- установити показники небезпечного впливу ДМХ на генетичний апарат, процеси репродукції клітин, синтез ДНК і протеїнів;
- визначити генез пошкоджень клітин при дії УВЧ-випромінювань за даними електронної мікроскопії;
- обгрунтувати цитологічні критерії адаптаційних реакцій та пошкодження в умовах дії ДМХ та науково-методичний підхід до гігієнічної оцінки чинника.
Об'єкт досліджень: реакції клітин периферичної крові, кісткового мозку, се-лезінки, тимусу, печінки, яєчка на ЕМП УВЧ-діапазону. У модельних експе-риментах використані білі нелінійні та лінійні щури різного віку.
Предмет досліджень: цитологічні критерії (згідно з енциклопедичним виз-наченням - "засіб судження, мірило визначення") для біолого-гігієнічної оцінки УВЧ-випромінювань, якими є радіочутливі показники по розмежуванню реакцій фізіологічної адаптації від патологічних процесів на клітинному рівні.
Методи досліджень: 1) метод лабораторного гігієнічного експерименту з оцінкою характеру, ступеня і механізму дії УВЧ-випромінювань на клітинні сис-теми. Виконані морфологічні, гематологічні, цитоімунологічні, цитохімічні, цито-генетичні, фізіко-хімічні дослідження на щурах. Вибірково проведені: цитоавто-радіографічні дослідження активності синтезу ДНК і протеїнів, цитофотометрія ДНК, електронномікроскопічні і вітальні (in vitro) спостереження; 2) математичні: методи варіаційної статистики (по Стьюденту), кореляційний та дисперсійний аналізи, визначення порогових рівнів дії чинника на систему крові.
Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що вперше:
- обгрунтований комплекс цитологічних критеріїв гігієнічної оцінки ЕМП (2375, 2450, 3000 МГц) із позицій концепції адаптації, зокрема визначені показни-ки для розмежування реакцій фізіологічної норми від адаптаційних і компенса-торних процесів та пошкодження. Установлено, що критерієм шкідливості випро-мінювань є замасковані компенсаторні процеси у кістковому мозку, які вияв-ляються в ослабленому організмі (на моделі щурів з нирковою гіпертонією), при дії ДМХ і гіпоксії, а також у молодих тварин при інтенсивності цих ЕМП 0,05 мВт/см2. Критерієм небезпеки чинника для випадків тривалої дії та екстрема-льних ситуацій визнані порушення репродукції бластних клітин і диференціації різних типів клітин;
- визначені закономірності формування адаптаційних реакцій і пошкод-ження клітин системи гемостазу, імунної системи, еритрону залежно від рівня та часу дії ЕМП УВЧ, а також порушень репродукції клітин, повязаних із їх впли-вом на генетичний апарат, синтез ДНК і протеїнів, мітотичний цикл;
- з'ясовано, що фізіологічний механізм формування неспецифічних реакцій системи крові при дії УВЧ-випромінювань зумовлюється перерозподілом лейко-цитів та активізацією компенсаторних процесів, а в генезі пошкодження клітин основне значення мають порушення диференціації й дозрівання клітин і струк-турні зміни мітохондрій, лізосом, ендоплазматичної сітки, ядра. Під впливом ЕМП УВЧ-діапазону низького рівня виявлено стимуляцію утворення дво- і бага-тоядерних клітин, патологічних форм мітозу бластних клітин, появу фігур міто-зу.в крові;
- встановлена залежність цитологічних реакцій від рівня й часу опромінення дозволила визначити вірогідні мінімальні та середні ефективні інтенсивності чин-ника й ранжувати різні показники за ступенем радіочутливості, що в сукупності з фактичними цитоморфологічними змінами у системі крові є основою для біоло-го-гігієнічної оцінки чинника на клітинному рівні.
Практичне значення одержаних результатів полягає в обгрунтуванні кри-теріїв та адекватних модельних тест-систем для гігієнічної оцінки радіохвиль. Здобуті результати застосовані при визначенні безпечних рівнів ЕМП УВЧ-діапазону. Встановлені цитологічні критерії, закономірності й механізми можуть бути застосовані для розмежування адаптивних реакцій і пошкодження під впливом радіовипромінювань, діагностики донозологічних змін у системі крові, прогнозування можливих захворювань людини у різних умовах опромінення. Матеріали роботи використані при розробці методичних документів та Держав-них санітарних норм і правил, які вже діють на території України:
1. Методические рекомендации по оценке биологического действия малоин-тенсивной микроволновой радиации для гигиенической регламентации в усло-виях окружающей среды. - К., 1981; Утв. МЗ УССР от 26.05.81. – 26 с.
2. Методические рекомендации: Оценка биологического действия микро-волн в целях их гигиенической регламентации.- К., 1990; Утв. 21.11.90. – 27 с.
3. Державні санітарні норми і правила захисту населення від впливу елек-тромагнітних випромінювань. Затв. наказом МОЗ України від 01.08.96. - N 239. – К., 1996. – 22 с.
Наукові положення роботи є підгрунтям для удосконалення методології гігієнічної оцінки радіохвиль, зокрема для реалізації принципу пороговості при розмежуванні адаптаційних, компенсаторних процесів і пошкодження на клітин-ному рівні, а також для оцінки дії чинника на систему крові по скороченій схемі.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведені: аналіз літера-тури, цитологічні, гематологічні, авторадіографічні, цитофотометричні, цитохімі-чні, електронномікроскопічні дослідження, спостереження in vitro, науковий ана-ліз результатів, їх представлення у вигляді дисертації. Дозиметричний контроль і опромінення щурів виконані за участю к.ф.-м. н. В.В.Варецького, к.б.н. М.О.Нава-катікяна, В.М.Дяченко; інженерно-технічні роботи по цитофотометрії – Л.П.Са-ленко. Препарати для електронної мікроскопії підготовлені О.І.Сватко. В обчис-ленні мінімальних ефективних рівнів ДМХ (за участю д.б.н. М.Ю.Антомонова) та середніх ефективних рівнів доля досліджень автора складає 50-75 %.
Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи оприлюднені на: Все-союзній нараді з питань біологічних ефектів НВЧ-енергії (Обнінськ, 1980),Україн- ському гігієнічному з`їзді (Київ, 1981), Українській республіканській конференції (Київ, 1982), Всесоюзній робочій нараді "Комбинированное действие ионизирую-щих излучений и других физических факторов среды" (Обнінськ, 1983), Всесою-зній конференції по анатомії, гістології і ембріології "Актуальные проблемы раз-вития человека и животных" (Сімферополь, 1983), Всесоюзній науковій кон-ференції "Реактивность и резистентность" (Київ, 1987), науковій конференції "Проблемы донозологической гигиенической диагностики" (Ленинград, 1989), конференції, присвяченій 95-й річниці кафедри гігієни (Тарту, 1990), науково-пра-ктичній конференції "Новые приложения морфометрии и математическое модели-рование в медико-биологических исследованиях" (Харьков, 1990), 2 конгресі Європейської біоелектромагнітної асоціації (Словенія, 1993), 1-му Міжнародному симпозиумі "Гигиена физических факторов окружающей и производственной сре-ды" (Київ, 1993), засіданні кафедри біохімії, науково-дослідної лабораторії біофі-зики збудливих систем Київського ун-ту ім. Т.Шевченка (1998), засіданні вченої ради Українського наукового гігієнічного центру (1998;1999;2001), науково-прак-тичній конференції "Гігієна фізичних факторів навколишнього та виробничого середовища" (2000), науково-практичній конференції "Сучасні проблеми гігієни та медичної екології України" (2001).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 43 наукові праці, із них: одна монографія, 21 стаття у фахових журналах і збірниках праць, авторське свідоцт-во; 2 рукописи, депоновані ВІНІТІ, 4 статті – у нефахових виданнях, 14 тез до-повідей.
Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 306 сторінках машино-писного тексту (основна частина – 246 с.) і складається із вступу, огляду літера-тури, розділу "Методи і матеріали досліджень", 6 розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів, висновків, списку літератури (261 джерел – країн СНД, 72 – іноземних), двох додатків. Дисертація містить 48 рисунків і 42 таблиці (16 таблиць і 13 сюжетів рисунків – на окремих аркушах).
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Обсяг, обєкти та методи досліджень. Оскільки безпека екзогенних чин-ників для людини гарантована недопустимістю перевищення адаптаційної спро-можності організму (Г.І.Гончарук, 1995, 2000), вибір методичних прийомів робо-ти обгрунтований відповідно до положень концепції фізіологічної адаптації, сфо-рмульованих у 50-90-ті роки в багатьох наукових працях І.Г.Акоєва, П.К.Ано-хіна, Р.М.Баєвського, В.М.Благодарова, Т.І.Бонашевської, Л.Х.Гаркаві, П.Д.Гори-зонтова, В.П.Казначеєва, Ф.З.Меєрсона, М.А.Пальцева, М.І.Руднєва, Д.С.Саркі-сова, Г.Сельє, А.М. Сердюка, В.В. Сєрова, А.І.Струкова, І.М.Трахтенберга, Ф.І. Фурдуя, П.Хочачки, М.Г.Шандали, І.І. Шмальгаузена й інших вчених.
Основні напрямки експериментальних досліджень включають: встановлення закономірностей та механізму формування адаптивних процесів і пошкодження на клітинному рівні при дії УВЧ-випромінювань; визначення порогових рівнів чинника для розвитку цих процесів з урахуванням залежності ефектів від умов опромінення; обгрунтування цитологічних критеріїв для гігієнічної оцінки випро-мінювань. Програмою дисертації передбачено 7 етапів роботи:
- оцінка вікових змін кісткового мозку щурів під впливом УВЧ-опромінення;
- встановлення залежності реакцій гемопоетичних клітин від рівня і часу одноразового опромінення;
- оцінка закономірностей процесів диференціації і репродукції клітин при УВЧ-опроміненні 1-2 місяці у безперервному та імпульсно-переривчастому ре-жимах;
- оцінка впливу УВЧ-випромінювань на здоровий та ослаблений організм (на моделі кісткового мозку щурів з експериментальною нирковою гіпертонією);
- виявлення реакцій гемопоетичних клітин в умовах дії ЕМП УВЧ-діапазо-ну та гіпоксії (як функціонального навантаження) і УВЧ-випромінювань та рент-генівського опромінення;
- оцінка механізму цитологічних ефектів чинника з урахуванням впливу на мітотичний цикл, синтез ДНК і протеїнів, ультраструктуру клітин тощо;
- визначення порогів адаптивних реакцій і пошкодження клітин та обгрун-тування цитологічних критеріїв для гігієнічної оцінки УВЧ-випромінювань.
Медико-біологічні дослідження виконані в модельному лабораторному екс-перименті на 676 щурах, опромінених у безлунній камері за допомогою гене-раторів "Луч-2" та "Луч-58" (у безперервному режимі) та магнетрону "Hitachi" (в імпульсно-переривчастому режимі). Умови опромінення (частота, режим, інтен-сивність, поляризація та ін.) відповідали реальним параметрам ЕМП УВЧ-діапа-зону, які мають місце поблизу джерел випромінювань. Контроль за моделюван-ням ЕМП здебільшого здійснено групою кваліфікованих фахівців в умовах радянсько-американського співробітництва за допомогою сучасної апаратури. Умовно опромінених тварин (контроль) утримували в аналогічній безлунній ка-мері (без опромінення). Кількість щурів у виборках становила при індивідуальній експозиції кожної тварини 6-9, при груповій – 7-10. Проведено 7 серій дослід-жень. Щурів (здебільшого статевозрілих самців масою 180-300 г) лінії Вістар або Фішер та нелінійних опромінено 7 год/день упродовж 1-2 місяців за частот 2450, 2375 МГц у безперервному режимі (БР) при густині потоку енергії (ГПЕ) 0,01; 0,05; 0,5; 1; 10 мВт/см2 та 12 год/день протягом 2 місяців на частоті 3000 МГц (400 імп./сек, тривалість імпульсу - 2 мксек, 4 імп/кожні 3,75 сек) в імпульсно-переривчастому режимі (ІПР) при ГПЕ 0,1; 0,5; 2,5 мВт/см2. В умовах одноразових експозицій (вибірково 30 хв, 1, 2, 7 год) досліджено вплив ДМХ високої інтенсивності (35;40;50 мВт/см2). Вікові особливості реакцій на ЕМП (2375 МГц; 50 і 0,05 мВт/см2) визначали на щурах лінії Вістар.
Цитологічний аналіз виконано на мазках крові, кісткового мозку стегнових кісток метафізарної зони (де міститься найбільша кількість недиференційованих клітин), тимусу, селезінки, забарвлених по Папенгейму. Вибірково досліджували відбитки печінки та яєчка для підтвердження окремих закономірностей клітинних реакцій на опромінення. Проаналізовано понад 3000 препаратів. Застосовані 24 методики і прийоми для оцінки цитологічних та гематологічних реакцій на ЕМП УВЧ-діапазону (всього 15656 визначень), виконано 3770 основних аналізів, із них - 530 аналізів мієлограм. За один аналіз приймали комплекс досліджень кожної тканини з урахуванням клітинного складу, морфології, загальної кількості клітин, індексів дозрівання, деструкції, мітотичного індексу, співвідношень клітин, статистики. Цитохімічні дослідження включали визначення неспецифічної ес-терази і кислої фосфатази, визначення гемосидерину на гістологічних зрізах селезінки та кісткового мозку по Перлсу, спонтанний NCT-тест (спосіб Ю.І. Бажори). Вибірково виявлена кислотна стійкість еритроцитів (по Терскову, Гітельзону), застосована методика екзогенного клонування кісткового мозку Till a. Мс Culloch та підрахована кількість мієлокаріоцитів по Mantz. Реакції імунної системи оцінені згідно з даними кількісних змін імунокомпетентних клітин у крові, кістковому мозку, тимусі, селезінці, а також з урахуванням результатів цитохімічних досліджень.
Оскільки в онтогенезі можуть існувати періоди підвищеної чутливості орга-нізму до ЕМП, вивчали вікові особливості реагування клітин системи крові на щурах, які перебували у фазах прогресивного (3-4 тижні), стабільного (7-8 міс) та регресивного (17-20 міс) росту (термінологія В.І.Махінько і В.М.Нікітіна, 1975).
Вплив УВЧ-випромінювань на кістковий мозок ослаблених тварин вивчали на моделі експериментальної ниркової гіпертонії, яка впливає на еритрон. Гіпер-тонію створювали шляхом ішемії нирок після накладання гумових кілець (досліди виконані під керівництвом проф.М.І.Руднєва).
Фрагменти цитофотометричних, цитоавторадіографічних, електронномік-роскопічних, цитохімічних, прижиттєвих (на культурах кісткового мозку in vitro) спостережень використані для оцінки механізму дії ДМХ на клітинні структури.
У щурів, опромінених 1-2 місяці, визначали порушення репродукції бласт-них клітин та цитогенетичні зміни (по І.А.Алову, 1984). Загальну проліферативну активність (із розрахунку на 1000 каріоцитів, здатних до поділу) оцінено за величиною мітотичного (Мі) та статмокінетичного (Сі) індексів. Для визначення Сі (кількість метафаз) частині щурів на 1,5 год вводили колхіцин у дозі 0,004 мг/г маси тіла. Паралельно визначали число амітозів. Мі встановлений також із роз-рахунку на 200 бластних клітин кісткового мозку.
Вплив УВЧ-випромінювань (0,5 мВт/см2) після експозиції 7 годин на міто-тичний цикл оцінювали за допомогою методу двохвильової цитофотометрії (ци-тоспектрофотометр МУФ-5) маси ДНК клітин кісткового мозку, забарвленого по Фелгену, що має високу прогностичну здатність для визначення функці-онального стану генетичного апарату. Дослідження виконані на базі відділу цито-логії та гістогенезу Інституту зоології НАН України.
Для виявлення дії ЕМП (2450 МГц) ГПЕ 1 мВт/см2 на синтез ДНК та про-теїнів щурам лінії Фішер вводили радіоактивну позначку відповідно 3Н-тиміди-ном або 35S-метионіном. Цитоавторадіографічні дослідження виконані на мазках або відбитках тканин. Препарати підготовлені з урахуванням відомих методичних прийомів (А.Ф.Кисельова та співавт., 1983).
Основними ознаками розвитку адаптивних процесів під впливом ДМХ вважали зниження поліморфності клітин та інтенсивності лейкоцитарних реакцій після 7-10 експозицій, а також фазність морфофункціональних змін кісткового мозку і крові у динаміці тривалого опромінення. Ознакою компенсаторних і регенераційних зрушень у мієлоїдній і лімфатичній тканинах використано по-силення процесів гіперплазії, гіпертрофії і проліферації клітин, показником пош-коджень – підвищення індексу деструкції та цитопенічні реакції. Особливого зна-чення надавали структурним змінам мегакаріоцитів, нейтрофільних гранулоцитів і лімфоцитів та розвитку неспецифічних цитоімуноморфологічних зрушень.
Індекс деструкції клітин визначали з урахуванням явищ вакуолізації, азуро-фільної зернистості, каріорексису, пікнозу, лізису, клазматозу. Наявність цитопе-нічних реакцій визначена за допомогою даних про абсолютний вміст мієлока-ріоцитів і лейкоцитів (в Г/л).
Для з'ясування впливу ЕМП високої (40 мВт/см2, 2 год) і малої (1 мВт/см2, 7 год) інтенсивностей на клітини кісткового мозку in vitro через 2 год після оп-ромінення щурів шматочки тканини клали у гусячу плазму з ембріональним екс-трактом теляти і живильним середовищем 199 (2:1:1). Експлантацію проводили модифікованим нами способом в спеціальних скляних камерах. Культури виро-щували в термостаті мікроскопу МБІ-13, де провадили візуальні та мікрокінема-тографічні спостереження у фазовому контрасті (почергово - досліду і контролю). Дослідження проведені в Інституті гематології та трансфузіології АМН України.
Для субмікроскопічних досліджень щурів опромінено при ГПЕ 10 мВт/см2 (7 год; 1, 6 сеансів). Шматочки тканин фіксували в 2,5%-му розчині глютараль-дегіду на фосфатному буфері (40оС) з дофіксацією в 1%-му розчині OsO4 на буфе-рі Міллоніга. Для зневоднення використано етанол, для заключення в капсули - аралдит. Зрізи готували на ультрамікротомі УМТП-3. Контрастування проведено в 2,5 %-му розчині уранілацетату. Виготовлення препаратів та їх мікроскопічний аналіз (мікроскоп Tesla BC-500) здійснено у лабораторії цитології і гістогенезу Інституту зоології НАН України. Порушення ультраструктури підраховані на 200-400 клітинах.
Реакції бластних клітин при дії ДМХ оцінені в експерименті з екзогенним клонуванням кісткового мозку експонованих тварин (2450 МГц) щу-рам-ре-ципієнтам після їх рентгенівського опромінення у летальній дозі. Щурів лінії Фішер опромінювали при ГПЕ 10 мВт/см2 (10 днів, 7 год/день). "Умовно опро-міненим" тваринам вводили 1 мл суспензії кісткового мозку із стегнових кісток щурів, експонованих в ЕМП УВЧ-діапазону. Концентрацію клітин доводили до 1,1-1,57 106/мл; 1 мл суспензії вводили у хвостову вену. Наступного дня щурів 14 хв опромінено у дерев'яних ящиках апаратом РУМ-17. Умови опромінення: РІП 40 см, напруга 180 кВ, сила струму 15 мА, фільтр 0,5 мм Cu +1 мм Al, потужність дози 1,08 р/сек, експозиційна доза 891,8 бер. Поєднану дію обох чинників оцінено за показниками часу виживання щурів і морфологічних змін клітин.
Отримані цифрові дані оброблені на електронно-обчислювальній техніці стандартними статистичними методами. Вплив опромінення на різні показники оцінювали за допомогою дисперсійного однофакторного аналізу й визначення коефіцієнту кореляційного відношення ( -"ета"), яке дає уяву про силу взає-мозв'язку між фактором та виявленими змінами. Крім того, здійснено попарне порівняння даних кожної експериментальної групи, отриманих у градуйованій формі, з її контролем за допомогою критерію Стьюдента, що дозволило виявити мінімальні рівні УВЧ-випромінювань, з яких починаються зрушення кожного показника відносно контролю. Обчислення величини мінімальної ефективної інтенсивності ЕМП для різних показників проведено графічно з урахуванням залежності ефекту, вираженої в критерії Стьюдента, від рівня опромінення. Для більшості досліджуваних показників аналогічні підрахунки проведені за допомогою спеціальної програми, оскільки виявлені ефекти мали нелінійну залежність від інтенсивності чинника. Завершували аналіз оцінкою всіх даних в альтернативній формі з підрахунком середнього ефективного рівня опромінення (ЕР50) методом найменших квадратів, запозиченим із монографії Д. Сепетлієва (1968). Ці результати використані для визначення порогових рівнів УВЧ-випромінювань, що викликають зміни кожного показника у 50% тварин.
Порівняльну радіочутливість різних елементів системи крові визначали шля-хом комплексного ранжування всіх статистичних параметрів (критерію Стью-дента, ЕР50, коефіцієнту кореляції), які кількісно характеризують біологічну ефективність ДМХ на клітинному рівні. При цьому найменшому рангові відпо-відають найменші значення критерію Стьюдента і ЕР50, а в випадках, коли вели-чина ЕР50 була однаковою, для більш точного ранжування відповідних показників застосовували і значення коефіцієнту кореляційного відношення.
Результати досліджень та їх обговорення. Існуючі гігієнічні нормативи ЕМП УВЧ-діапазону розроблені без урахування вікової чутливості організму. Ра-зом з тим окремі клініко-гігієнічні та експериментальні дослідження свідчать, що радіочастотні випромінення низького рівня можуть прискорювати темпи старіння, знижувати пристосувальні можливості організму, імунологічну реактивність, порушувати гормональну функцію та інші показники (В.Н.Нікітіна,1999).
Результати кількісних змін співвідношення клітин кісткового мозку та крові опромінених щурів у порівнянні з групами "умовно опромінених" тварин віддзеркалюють особливості адаптаційних реакцій системи крові на УВЧ-опромінення залежно від віку. На рис. 1 наведено відмінність клітинності кіст-кового мозку щурів різного віку від контролю (по Стьюденту) після однора-зової експозиції (50 мВт/см2, 30 хв). За ознаками цитоімуноморфологічних змін (збільшення числа лімфоцитів, базофілів, плазмоцитів, нейтропенія тощо) та проліферативної активності мієлокаріоцитів найчутливішими фазами онтогенезу в умовах одноразової дії ЕМП УВЧ теплової інтенсивності є прогресивна й рег-ресивна. При цьому мітотичний індекс у молодих щурів підвищується, у старих – зменшується. Значущі зрушення чисельності імунокомпетентних клітин у кістковому мозку виявлені у старих щурів, у статевозрілих – реактивність клітинних популяцій порівняно з іншими групами є невисокою, оскільки абсолю-тний вміст лейкоцитів у крові та зміни гемограм і мієлограм менш виражені. Отримані дані свідчать про високу радіочутливість на пізній стадії онтогенезу імунної системи. У молодому віці високочутливими виявляються малодифе-ренційовані клітини.
Під впливом ЕМП низького рівня (0,05 мВт/см2, 10 сеансів, 1 і 4 доби після дії) у кістковому мозку молодих щурів збільшується порівняно із статевозрілими відносна кількість бластних, молодих еритроїдних клітин та лімфоцитів, що, оче-видно, є наслідком стимуляції компенсаторних процесів у кровотворній тканині.
Здобуті результати дозволили виявити характер впливу ДМХ на систему крові
Рис. 1 Вікові зміни кісткового мозку при дії ЕМП теплового рівня (50 мВт/см2).
1) бластні клітини; 2) еозинофіли; 3) нейтрофіли; 4) лімфоцити; 5) Мі; 6) міє-лоїдно-еритроїдне співвідношення; 7) вміст мієлокаріоцитів в 1 мкл; 8) базофіли; 9) плазмоцити (порівняння даних досліду й контролю за критерієм Стьюдента).
та оцінити найчутливіші клітинні показники для діагностики ранніх порушень гомеостазу. Крім того, виявлення порівняно низької чутливості до опромінення статевозрілих щурів у віці 7-12 місяців, який відповідає працездатному вікові людини, стало приводом для більш поглибленого пошуку критеріїв безпеки чинника та виконання основної частини роботи саме на цих групах тварин.
Гігієнічна оцінка УВЧ-випромінювань на систему крові з урахуванням аб-солютного та відносного вмісту різних типів клітин у кістковому мозку та крові статевозрілих щурів, опромінених одноразово (0,1; 1; 10; 50 мВт/см2, 2 години та 0,1; 1; 10; 35 мВт/см2, 7 годин), свідчить про залежність кінетики неспецифічних лейкоцитарних реакцій від рівня й часу опромінення. Практично безпечним є ЕМП інтенсивністю 0,1 мВт/см2. Найвища чутливість до одноразової експозиції ДМХ притаманна нейтрофільним гранулоцитам кісткового мозку. Абсолютна кі-лькість лімфоцитів не має лінійної залежності від рівня та часу дії після опро-мінення, але через кілька годин їх вміст у кістковому мозку значно підвищується.
У гострих дослідах диференційовано 3 типи морфофункціональних зрушень в клітинних популяціях, за участю яких відбувається мобілізація захисних ме-ханізмів, і які можна розглядати як прояв термінових адаптаційних реакцій або їх напруження та зриву: 1) незначна активізація порівняно з контролем перерозпо-ділу лейкоцитів (0,1 мВт/см2); 2) стимуляція адаптивних та компенсаторних процесів з неспецифічними явищами гіперплазії та гіпертрофії нейтрофільних і еозинофільних гранулоцитів на різних стадіях диференціації (0,5-10 мВт/см2); 3) стресові реакції з гіпоплазією кісткового мозку, посиленням процесів деструкції клітин, гальмуванням мітотичного поділу (35 мВт/см2), міграцією із кісткового мозку в кров молодих клітин, одиночних мегакаріоцитів, десквамацією окремих ендотеліальних клітин, яка опосередковано свідчить про наявність пошкодження ендотелію судин (50 мВт/см2).
Найважливіше значення для гігієнічної оцінки УВЧ-випромінювань та ви-значення закономірностей і критеріїв їх небезпечної дії мають результати цитоло-гічних досліджень кісткового мозку, крові, селезінки, тимусу у динаміці опромі-нення 1-2 місяці. Вплив чинника на мегакаріоцити, лімфоїдні, еритроїдні, грану-лоцитарні, стромальні клітини характеризується широким спектром структурно-функціональних змін. Закономірною ознакою реактивності клітин на дію ДМХ є підвищення поліморфності різних типів клітин, пов’язаної зі змінами форми, ве-личини та структури ядра й цитоплазми. Найчутливішими до УВЧ-випроміню-вань виявилися поліплоїдні клітини - мегакаріоцити, яких вважали критичними, сигнальними структурами, оскільки процеси їх диференціювання та дозрівання порушуються вже після 1-7 експозицій (0,05;0,1;0,5 мВт/см2) на тлі стимуляції ут-ворення тромбоцитів. Закономірністю електромагнітного впливу на мегака-ріоцити (після перших експозицій) є гальмування процесів диференціації, почи-наючи зі стадії промегакаріоцита, і прискорення тромбоцитоутворення. При ГПЕ 0,5 мВт/см2 виникають зрушення процесів морфогенезу і дозрівання клітин, посилення інволюції ядерного апарату і клазматозу цитоплазми, поява фігур амітозу. Підвищується також здатність лейкоцитів і еритроцитів занурюватися в цитоплазму мегакаріоцитів (емперіополезис), очевидно, внаслідок порушень про-никливості їх цитоплазменої мембрани. При рівнях ЕМП понад 10 мВт/см2 у крові з'являються одиночні мегакаріоцити, відсутні в контролі, виникає тром-боцитопенія. Вплив ДМХ на мегакаріоцити в значній мірі є подібним до ефектів іонізуючої радіації (І.О. Рудаков і ін., 1973). П.А.Власов і Ю.Г.Квачова (1997, 1998) вважають, що взаємодія мегакаріоцита і нейтрофільного гранулоцита внаслідок емперіополезису може призвести до загибелі мегакаріоцита. В умовах комбінованої дії неіонізуючої та іонізуючої радіації Е.М.Михайловська (1994, 1997,1998) виявила кілерну активність нейтрофілів і звільнення тромбоцитів. Згідно з нашими даними можливі також процеси мегакаріоцитофагоцитозу, які призводять до реутилізації захвачених часток і клітин. Поглинання інших клітин може відбуватись і в момент мітотичного поділу мегакаріоцита. Реакції мегака-ріоцитів опосередковано свідчать про напруженість функціональної активності системи гемостазу, що залежить від інтенсивності та часу дії чинника. Кількісна вираженість і фазність виявлених зрушень дозволяють заключити. що морфо-функціональні зміни мегакаріоцитів при ГПЕ 0,01 та 0,05 мВт/см2 мають ада-птаційний характер, оскільки у динаміці тривалої дії ДМХ їх найвища реак-тивність проявляється після 1-2 експозицій. Упродовж 7-10 днів опромінення мо-рфологічні зміни зрілих мегакаріоцитів відносно контролю мало виражені, однак посилюються компенсаторні процеси в популяціях їх молодих попередників, чисельність яких збільшується (0,5 мВт/см2).
Встановлено, що ключове значення для гігієнічної оцінки УВЧ-випроміню-вань мають показники імунобіологічної реактивності клітин кісткового мозку, тимусу, селезінки, крові, кількісні зміни яких є індикатором ранніх структурно-функціональних зрушень в імунній системі при опроміненні 1-2 місяці. Зако-номірності цитоімунологічних змін у мієлоїдній і лімфатичній тканинах відо-бражують розвиток неспецифічних реакцій клітинного імунітету у відповідь на можливу антигенну стимуляцію в умовах опромінення низького рівня, про що свідчать гіперплазія лімфоцитів та клітин ретикулярної строми, активізація мак-рофагальної й плазмоцитарної трансформації, зміни кількості допоміжних імуно-компетентних клітин - макрофагів, вільних ретикулярних клітин, гранулоцитів.
Загальною закономірністю реакцій імунної системи є залежність від інтен-сивності та часу опромінення. Так, ЕМП густиною потоку енергії 0,01 мВт/см2 призводить до незначної варіабельності у кістковому мозку окремих щурів вмісту лімфоцитів. Продовження експозиції (1 місяць) не викликає суттєвих змін. Після 1-10 днів опромінення (0,05 мВт/см2) спершу посилюються, а далі знижуються поліморфність клітин, міграція лімфоцитів у кістковий мозок, гіперплазія нейтро-фільних мієлоцитів. Внаслідок дії УВЧ-хвиль 1 місяць у селезінці збільшується кількість антитілоутворюючих клітин – плазмоцитів (р<0,05). Оцінка отриманих результатів у певній мірі узгоджується з даними Г.І.Виноградова (1982), які ха-рактеризують порушення Т-системи імунітету під впливом ДМХ інтенсивністю 0,05 мВт/см2. Більш високі рівні чинника, згідно з нашими спостереженнями, під-вищують кооперацію лімфоцитів і макрофагів, посилюють перерозподіл нейтро-філів і лімфоцитів між кров'ю та кістковим мозком, активізують процеси регене-рації їх попередників у кістковому мозку, селезінці, тимусі. Тривале опромі-нення при ГПЕ 0,5 мВт/см2 порушує метаболізм ферментів лейкоцитів і процеси диференціації лімфоцитів, плазмоцитів, нейтрофільних гранулоцитів, клітин строми, а також суттєво змінює співвідношення Т-лімфоцитів і В-лімфоцитів у крові. Кількість В-лімфоцитів збільшується і зростає вміст великих лімфоцитів з азурофільною зернистістю в цитоплазмі (очевидно, клітин-кілерів). ДМХ більш високого рівня (різні режими генерації) підвищують індекс деструкції клітин за рахунок явищ пікнозу, каріорексису, лізису, фрагментації, вакуолізації, тобто призводять до формування явно патологічних змін у процесах імуногенезу. Деструктуровані клітини, особливо нейтрофіли, найчастіше з'являються в крові.
При інтенсивності УВЧ-опромінення 0,5 мВт/см2 визначено динаміку й зако-номірності імуноцитоморфологічних порушень: зниження вмісту в кістковому мозку нейтрофільних гранулоцитів, посилення міграції лімфоцитів у кістковий мозок з виникненням "лімфоїдного піку, гіперплазія й гіпертрофія мієлоцитів, нейтропенія крові та кісткового мозку, активізація макрофагальної реакції клітин строми, стимуляція гуморальних чинників імунітету, ознаками чого є збільшення вмісту антитілоутворюючих клітин у кістковому мозку і селезінці та В-лімфо-цитів у крові. Отримані результати дозволяють заключити, що критеріальне значення для оцінки впливу УВЧ-випромінювань на імунну систему мають кіль-кісні зміни різних типів імунокомпетентних клітин в кістковому мозку, а не в крові, морфологічний склад якої в значній мірі залежить від реакцій пере-розподілу клітинних елементів в тканинах організму. Тривале опромінення (1-2 міс, понад 0,5 мВт/см2) призводить до виникнення в кістковому мозку так званих лейкемоїдних реакцій мієлоїдного типу, які характеризуються гіперплазією та анізоцитозом нейтрофільних мієлоцитів і значним збільшенням у цитоплазмі гранулоцитів вмісту токсикогенної зернистості. Можливість лейкемоїдних реак-цій в умовах дії 10-сантиметрових хвиль на морських свинок і кроликів встано-влена S.Baranski та P.Czerski (1976) за інтенсивності 3,5 мВт/см2. Подібні патоло-гічні зміни виникають також під впливом іонізуючої радіації, шоку, інфекції і мають тенденцію до зворотнього розвитку після припинення дії первинного чинника (А.Ф.Романова та ін., 2000).
Зниження мієлоїдно-еритроїдного співвідношення й індексу дозрівання еритробластів відображують наявність реактивності і стимуляції регенерації ерит-роїдних клітин кісткового мозку при інтенсивностях поля 0,05 і 0,5 мВт/см2. Опромінення 1-2 місяці (0,5 мВт/см2; БР, ІПР) активізує також процеси ерит-ропоезу в селезінці. У відновний період після експозиції ДМХ підвищується міто-тична активність нормоцитів. Разом з тим еритроїдні клітини виявилися стійкі-шими до опромінення, ніж інші, оскільки порушення їх диференціювання та під-вищення деструкції виявлено лише за інтенсивностей 1 і 10 мВт/см2.
Аналіз еритроцитограм крові свідчить, що при дії ЕМП (1 мВт/см2) збіль-шується кількість кислотостійких фракцій еритроцитів, очевидно, внаслідок ін-тенсивного розпаду старих і активного виходу їз кровотворної тканини молодих еритроцитів та ретикулоцитів. Але вміст еритроцитів у крові суттєво не змінює-ться, оскільки водночас посилюється їх регенерація й активізуються процеси ери-тропоезу і в кістковому мозку, і в селезінці. Гістохімічні дослідження показали, що продукт розпаду червоних тілець (гемосидерин) захвачується інтенсивніше, ніж у контролі, макрофагами ретикулярної строми селезінки й кісткового мозку.
Морфофункціональні зміни різних типів клітин в умовах тривалого опро-мінення інтенсивністю 0,05 мВт/см2 (БР) та 0,1 мВт/см2 (ІПР) мають адаптивний характер на відміну від виражених компенсаторних реакцій (0,5 мВт/см2) з яви-щами гіперплазії та гіпертрофії гранулоцитів і клітин строми, стійким змен-шенням глікогену та лужної фосфатази в нейтрофілах, пригніченням їх погли-нальної й травної функції (Н.М. Гончар, 1985). Однак, окремі цитологічні зміни кісткового мозку та селезінки при дії ЕМП інтенсивністю 0,05 мВт/см2 свідчать про формування прихованих компенсаторних процесів в імунній системі. З підвищенням рівня та часу опромінення активізуються регенераційні процеси в кровотворній та лімфатичній тканинах на тлі збільшення індексу деструкції клітин (1-10 мВт/см2, БР і 2,5 мВт/см2, ІПР). Експозиція щурів 1-2 місяці (10 мВт/см2) призводить до патологічних змін у кровотворній тканині, тимусі, крові: значне посилення деструкції клітин, цитопенії, проліферативної активності, лей-кемоїдних реакцій, порушення диференціації клітин та, за даними А.М.Шеметун (1985) – підвищення цитогенетичних ефектів.
Реакції кісткового мозку мають хвилястий характер: вже після першої екс-позиції ЕМП (0,5-10 мВт/см2) крім лейкоцитарних зрушень виявлено зміни біо-ритму мітотичної активності. Після 2-10 сеансів опромінення посилюються ком-пенсаторні процеси (з явищами клітинної гіперплазії та гіпертрофії й приско-реним дозріванням гранулоцитів, тромбоцитів, еритроцитів). За рівнів понад 1 мВт/см2 ефекти стимуляції регенерації після 1-2 місяців опромінення супровод-жуються задержкою диференціації базофільних нормоцитів, мієлоцитів, проме-гакаріоцитів. Проліферація клітин посилюється, індекс деструкції зростає.
При дії ЕМП УВЧ-діапазону 1 місяць (0,015; 0,03;0,05 мВт/см2 по 10 днів, безперервний режим) адаптаційні реакції системи крові у здорових щурів реалі-зуються, перш за
