НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

САВЧУК Олексій Миколайович

УДК 577.112.7:612.115

Вплив структури поверхні фібринового згустку на процеси взаємодії з компонентами фібринолітичної системи

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Науковий керівник – доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

ВОЛКОВ Георгій Леонідович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

заступник директора з наукової роботи

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

ВЕРЕМЕЄНКО Кузьма Микитович,

Інститут отоларингології ім. О.С. Коломійченка

МОЗ України,

головний науковий співробітник лабораторії біохімії

доктор біологічних наук, професор

РАДАВСЬКИЙ Юрій Леонідович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України

завідувач відділу структури та функцій білків та пептидів.

Провідна установа – Київський національний університет

імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії

Захист відбудеться „27” січня 2003р. о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (01601, Київ-30, вул.. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий 26 грудня 2002р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Система фібриноген - фібрин, для якої характерно самоскладання упорядкованих волокон фібрину, завдяки її відносній простоті, є цінним об'єктом досліджень механізму складання надмолекулярних структур. Дослідження процесів полімеризації фібрину має не тільки теоретичний, але і практичне значення для медицини, тому що порушення функціонування системи гемостазу приводить до виникнення внутрішньосудинного мікрозсідання крові (ВЗК-синдром). Знання структурних особливостей згустків фібрину, активації компонентів системи фібринолізу в згустках та функціональних властивостей продуктів деградації фібрину може бути корисним для з'ясування механізмів регуляції стану системи гемостазу.

Фібриновий полімер складає основу різноманітних за походженням та умовам утворення згустків в крові, міжклітинній рідині та лімфі. Тривимірна структура згустка утворена сіткою фібринових волокон - фібрил, організацію яких остаточно нез'ясовано. Особливості ранніх етапів формування структури фібринового згустку, дія на згусток фібринолітичної системи крові вивчені недостатньо. Створення модельних систем, в яких процеси формування та руйнування фібринових згустків практично не відрізняються від процесів, що відбуваються в організмі, може бути використано для пояснення нез'ясованих особливостей структури та механізму руйнування фібринових згустків, утворених за різних умов.

В останні роки широко застосовуються в клінічній практиці клеї на основі фібрину або композицій фібриногену, тромбіну та тромбіноподібних ферментів. Також значно зросла кількість композитних матеріалів на основі пластмас та металів, що використовуються при різних хірургічних втручаннях (стенти, пластикові протези, ін.). Поверхня цих речовин може спровокувати процес контактної активації фібриногену на своїй поверхні, і структура утворених фібринових згустків буде відрізнятися від структури згустків, які утворюються в кровотоці. Ці відміни в будові можуть обумовлювати особливості взаємодії цих фібринових згустків з компонентами фібринолітичної системи, що, в свою чергу, може приводити до можливих тромботичних ускладнень. Вивчення умов формування і взаємодії з компонентами фібринолітичної системи поверхневої структури фібринового згустку може мати теоретичне і практичне значення як для біохімії, так і для практичної медицини.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертації затверджена Вченою радою Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України 19.01.1999р. Дисертація безпосередньо зв'язана з плановими дослідженнями відділу структури та функцій білка за бюджетними темами: "Вивчення механізму активації ключових проферментів системи фібринолізу та гемостазу активаторами непрямої дії" (1998-2000 рр.), державна реєстрація № 0198U00345; "Вивчення молекулярних механізмів регуляції активації проферментів систем зсідання крові та фібринолізу в нормі та при патології" (2001-2003 рр.), державна реєстрація № 0101U000103.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було морфологічне дослідження фібринових згустків з різною структурою поверхні та їх взаємодії з компонентами фібринолітичної системи. Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

1) Дослідити за допомогою електронної мікроскопії структуру фібринових згустків у залежності від умов їх формування, а саме в присутності чи відсутності поверхні розділу фаз у місці формування фібринового згустку.

2) Розробити моделі фібринових згустків, на поверхні яких присутній чи відсутній поверхневий шар.

3) За допомогою розроблених моделей дослідити процеси взаємодії фібринових згустків з різною структурою поверхні з компонентами фібринолітичної системи: гідроліз згустків плазміном, активація плазміногена тканинним активатором плазміногена та сорбція молекул даних білків на поверхні полімерного фібрина.

Об'єкт дослідження. Фібринові згустки, які мають різну структуру поверхні.

Предмет дослідження. Структурні особливості формування фібринових згустків та їх взаємодія з компонентами фібринолітичної системи.

Методи дослідження. У роботі застосовували методи отримання та очищення білків (плазміноген, фібриноген), методи скануючої та трансмісійної мікроскопії, електрофоретичного аналізу. Дослідження процесів гідролізу фібринового згустку та активації на його поверхні плазміногену тканинним активатором плазміногену проводилися за допомогою спектрофотометричних методів та специфічних хромогенних субстратів. Процеси зв'язування білків з фібриновими згустками досліджували за допомогою імуноферментного аналізу. Для обчислювання отриманих результатів застосовувались методи статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Дослідження процесу активації системи зсідання крові, ролі фібрину в гемостазі та особливостей структурної організації фібринового гелю має не тільки теоретичний (утворення надмолекулярних структур), але й практичний інтерес в зв'язку з процесом тромбоутворення при різних патологіях. Дослідження показали, що структура згустків залежить від умов їх формування. При формуванні фібринового згустку за допомогою препаратів фібринового клею (в клінічній хірургічній практиці) на поверхні, що контактує з повітрям, утворюється структура особливої архітектури. Методом електронної мікроскопії показано наявність на поверхні фібринового згустку структури, відмінної від структури самого фібринового згустку. Ця структура, що одержала назву “поверхневий шар”, формується в фібриновому згустку за умови наявності гетерогенного розділу фаз. При відсутності поверхні розділу фаз такий шар не формується, а згусток утворюється лише з фібрилярних структур. Електронно-мікроскопічний аналіз показав, що поверхневий шар впливає на структуру фібринового згустку, а саме на товщину фібрил, їх кількість. Значні відміни спостерігаються в згустках з різною структурою поверхні при їх лізисі плазміном.

Досліджено процес гідролізу фібринових згустків, що мають різну структуру поверхні. Аналіз даних показав значні відміни в процесах гідролізу згустків з поверхневим шаром та без нього. Електрофоретичний аналіз продуктів деградації фібринових згустків дозволив встановити різницю якісного складу продуктів гідролізу, що з'являються в інкубаційному середовищі під дією плазміну. Дані, отримані при вивченні процесу активації плазминогена тканинним активатором плазминогена на поверхні фібринових згустків, що мають різну структуру поверхні, також показали значні відміни в цьому процесі.

Порівняння результатів гідролізу плазміном фібринових згустків та даних по активації на їх поверхні плазминогена тканинним активатором дозволили зробити висновок про те, що поверхневий шар перешкоджає як вивільненню продуктів деградації згустка у розчин, так і більш глибокому проникненню молекул плазміну в фібриновий згусток. Таким чином, поверхневий шар відіграє роль бар'єра, що захищає згусток від швидкого руйнування та елімінації з русла крові.

Дослідження процесів зв'язування плазміногену, альфа2-антиплазміну та тканинного активатора плазміногену згустками, що мають різну структуру поверхні, дозволили частково пояснити знайдені відміни процесів гідролізу цих згустків плазміном та активації на їх поверхні плазміногена. Було показано, що в процесі полімеризації на гетерогенній поверхні розділу двох фаз чи при її відсутності, в монофазі, відбуваються зміни структури фібринового згустку, що впливають на його здатність сорбувати на своїй поверхні молекули глу-плазміногену та тканинного активатора плазміногену. Отримані результати щодо процесу зв'язування білків з поверхнею фібринових згустків дозволяють припустити, що зміни структури згустку пов'язані з плазміноген-зв'язуючою ділянкою молекули фібрину — Аa 148-160 в залежності від структури поверхні. Це припущення підтверджується даними по аналізу процеса активації плазминогена тканинним активатором плазминогена на фібринових згустках, що мають різну структуру поверхні.

Знайдені відмінності в структурі, а також у взаємодії фібринових згустків, в залежності від їх поверхні, з компонентами фібринолітичної системи дозволяють дати практичні рекомендації до більш ефективного використання фібринових клеїв у медичній практиці.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати дозволяють глибше зрозуміти вплив умов формування фібринових згустків на механізм взаємодії полімерного фібрину з компонентами фібринолітичної системи, що може мати значення для розуміння особливостей процесу фібриноутворення в кровотоці. Дослідження резистентності полімерного фібрину до дії компонентів фібринолітичної системи може мати значення для розуміння молекулярних основ використання фібринового клею в клінічній практиці.

Особистий внесок здобувача. Експериментальна частина роботи виконана дисертантом особисто. Аналіз отриманих даних та їх обговорення проведено спільно з науковим керівником, д.б.н. Волковим Г.Л. і частково з д.б.н. Макогоненко Є.М. Електронно-мікроскопічна частина роботи зроблена за участю к.б.н. Чернишова В.І. Друковані праці підготовлено за безпосередньої участі автора.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації було продемонстровано на міжнародній конференції – “XVth International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis” (Японія, Хамамацу, 2000), конкурсі молодих вчених (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2001), на VIII Українському біохімічному з'їзді (м.Чернівці, 2002). Результати окремих етапів роботи доповідались і обговорювались на засіданнях відділу стуктури та функцій білка та науковому семінарі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 3 статті в періодичних наукових спеціальних виданнях України, що включені в перелік, затверджений ВАК України, та 3 тез доповідей у збірках наукових конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури (1 розділ, 4 підрозділу), експериментальної частини (4 розділу, 20 підрозділів), висновків та списку літературних джерел (136 найменувань). Робота викладена на 116 сторінках друкованого тексту та містить 33 рисунків і 3 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури детально висвітлені сучасні дані про структуру молекули фібриногена та утворення тривимірної сітки фібринового згустка. Представлені дані про окремі білки системи фібринолізу та використання фібринових клеїв в медичній практиці.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Фібриноген людини) одержували з плазми крові шляхом висолювання 16% розчином сульфату натрію з наступним відділенням кріофібриногена за методом Варецької (1960).

Плазмін одержували з Глу-плазміногена, виділеного за допомогою афінної хроматографії на лізин-сефарозі (Deutch, Mertz, 1970), з наступною активацією урокіназою у співвідношенні Пг:Ук = 1:1250 у 0,05 М трис-НСl буфері, рН 7.4, що містить 25% гліцерин (за об'ємом). В таких умовах 95% плазміногена активується в плазмін, активність якого складає 22 к.е./мг. Фермент зберігали в 0,05 М трис-НСl буфері, рН 7.4, що містить 50% гліцерин (за об'ємом) при 4оС.

Потенційну протеолітичну активність плазміногену та плазміну визначали за їх здатності гідролізувати казеїн за Гамерстеном (Robbins, Summaria, 1979).

Згустки дезААВВ – фібрину, з поверхневим шаром та без нього формували, використовуючи дві модельні системи: блоки з агару, для заливання яких застосовували 1% бакто-агар і пластикові пробірки. Вихідна концентрація фібриногену для полімеризації – 20 мг/мл, тромбіну – 2 од/мл. Для одержання згустків різного ступеня стабілізації підбиралися відповідні умови полімеризації. Згустки без прошивання формувалися протягом 30 хв., що прошиті за g-ланцюгом – 60 хв. при кімнатній температурі і a-, g-ланцюгам – 60 хв. при 370С. Згусток стабілізували домішками фактору XIII, які активували СaCl2 у концентрації 2 мМ (Савчук О.М., 2001).

Біотинілювання білків проводили за Gilting et al., 1987.

Імуноферментний аналіз (ІФА) проводили у мікропланшетах із сорбційною здатністю за стандартною методикою для розчинних білків.

Гідроліз згустків дезААВВ-фібрину плазміном проводили в комірках планшет для ІФА. Реакційну суміш, що складалася з плазміну – 10 мкг/мл та фібринового згустку з певною кількістю фібрину, інкубували при 370С протягом 120 хвилин. Реєстрували появу розчинних продуктів по зміні поглинання при 280 нм протягом усього терміну інкубації.

Активацію плазміногену тканинним активатором плазміногену (ТАП) на згустках дезААВВ-фібрину проводили в комірках планшет для ІФА. Реакційну суміш, що містила Глу-Пг – 100 мкг/мл, ТАП – 10 од/мл, 0,3 мМ субстрату S2251 та фібринового згустку з певною кількістю фібрину, інкубували при 370С протягом 120 хвилин. Реєстрували появу розчинних продуктів по зміні поглинання при 280 нм чи нагромадження n-нітроаніліну (pNA), який звільняється з хромогенного субстрату плазміном, що утвориться (за довжини хвилі 492-405 нм на мікроридері Multiskan MC) протягом усього терміну інкубації.

Електрофорез у поліакриламідному гелі в присутності додецил сульфату натрія (ДСН) проводили за методом Леммлі (1970) на приладі для вертикального гель-електрофорезу (Bio-Rad, США) у пластинах товщиною 0,75 або 1 мм. В якості маркерів використовували суміш білків Low Molecular Weigt Calibration Kit фірми Pharmacia (Швеція) з відомою молекулярною масою, кДа: фосфорилаза Б - 94; альбумін – 67; овальбумін – 43; карбоангідраза – 30; соєвий інгібітор трипсину – 20,1; лактальбумін – 14,4 (“Pharmacia”, Швеція).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Морфологічні дослідження фібринових згустків з різною структурою поверхні.

Широко відомо, що під дією тромбіну та анцистрону фібриноген перетворюється в мономерний фібрин, що потім полімеризується в двунитчаті протофібрили. З часом протофібрили латерально поєднуються й утворюють волокна тривимірної сітки фібринового згустку. Процес зборки протофібрил досить добре вивчений. Однак остаточно не з'ясовано процеси, які відбуваються з поверхнею фібринового згустка під час формування тривимірної сітки полімерного фібрину. У процесі дослідження структури фібринових згустків було вперше показано, що на поверхні згустків присутня структура по своїй будові, відмінна від власної структури фібринового згустку. Ця структура одержала робочу назву “поверхневий шар”. Надалі при викладанні матеріалу вона буде так іменуватися. У таблиці 1 представлені дані про товщину поверхневого шару в плівках з дезАА- та дезААВВ-фібрина в залежності від часу формування згустків.

Утворення поверхневого шару у фібринових плівках (дезАА-, дезААВВ-) ймовірно пов'язано з процесом формування фібринового згустку, а конкретно, із процесами утворення протофібрил та їх подальшої латеральної асоціації.

Факт виявлення на поверхні фібринового згустку структури, що відрізняється від структури самого згустку “поверхневий шар” дав поштовх до досліджень, які показали, що необхідною умовою для формування поверхневого шару у фібриновому згустку є наявність гетерогенної поверхні розділу фаз. У наших експериментах роль такої поверхні виконували повітря, поверхня полімеризованої епоксидної смоли, стінка пробірки і т.п. Доказом такого припущення є експеримент, у якому фібриновий згусток формували всередині агар-агарового чи желатинового блоку, стінки якого були просочені водою. Всередині гель в такому випадку є гомогенною фазовою поверхнею для розчину білка, і тому поверхневий шар не формується.

Можна припустити, що поверхневий шар може сформуватися в результаті впливу на поверхню гелю хімічних препаратів, що входять до складу розчинів, які використовували при підготовці зразків для електронно-мікроскопічних досліджень. Звідси випливає висновок, що структура, подібна до поверхневого шару, не повинна бути присутня всередині гелю. Однак є ряд електронно-мікроскопічних даних, де подібні шари виявляються й всередині гелю при формуванні згустку методом напилювання. При високих концентраціях фібрину (при всіх інших рівних умовах) збільшується швидкість його полімеризації. Тому на поверхні крапель висококонцентрованого фібринового розчину, ще в повітрі, формується поверхневий шар. При поєднанні таких крапель з поверхнею пластинки смоли чи з раніше потрапившим сюди білковим розчином вони можуть залишитися не зруйнованими чи частково зруйнованими. У першому випадку ми будемо спостерігати цілі краплі, а в другому – залишки поверхневих шарів. Збереження поверхневих шарів у цих випадках характеризує їх як механічно міцними і стійкими до дезінтеграції силами, що виникають у фібриновому згустку, який формується.

Для зручності наступної роботи зі згустками, що мають різну структуру поверхні, а саме, присутність чи відсутність на поверхні згустків поверхневого шару, були обрані наступні моделі: згустки полімеризувалися у пластикових пробірках та в блоках з агар-агару. Електронно-мікроскопічними дослідженнями показано, що згустки, сформовані в агарових блоках, позбавлені поверхневого шару, а в згустках, сформованих у пробірках, такий шар присутній.

Аналіз згустків дезААВВ-фібрина з поверхневим шаром і без нього показав, що товщина поверхневого шару складає 28,7 нм. Було виявлено, що фібринові нитки поверхневого шару та нитки самого згустку, що лежать під шаром, структурно пов'язані один з одним. Видно, що поверхневий шар, сформований з більш тонких фібринових ниток (імовірніше всього це протофібрилярні структури), в порівнянні з нитками згустку, що знаходяться під ним.

Пучки цих тонких ниток поверхневого шару, латерально поєднуючись один з одним, переходять у товсті нитки гелю. У згустку з поверхневим шаром переважають тонкі фібрили (можливо, присутня невелика кількість протофібрил, що не встигли сформуватися у фібрили); спостерігаються фібрили, що вбудовані в поверхневий шар чи, як було вже сказане, виходять з нього. Згусток з поверхневим шаром містить менше фібрил, відстань між якими більше, ніж у згустку, сформованому в агаровому блоці. Діаметр фібрил складає для згустків з поверхневим шаром від 30 до 170 нм, а для згустків, які не мають поверхневого шару, – від 230 до 400 нм.

У фібриновому розчині і на його гетерогенній фазовій поверхні спочатку формуються протофібрили, що шляхом латеральної агрегації поєднуються у фібрили. На поверхні згустку процесу латерального об'єднання ниток перешкоджає обмежена рухливість протофібрил. Обмеження рухливості пов'язане чи з прикріпленням ниток до поверхні стінки пробірки або поверхні смоли, чи на границі з повітрям, через сили поверхневого натягу. Обмежено рухливі нитки фібрину, на поверхні згустку, формують хаотично з'єднані тонкі нитки, що структурно переходять у підлягаючі фібрилярні структури, наявність великих ступенів свободи для яких у глибині розчину білка, приводить до формування фібрил. В поверхневому шарі процес формування фібрил дуже повільний за рахунок обмеження рухливості протофібрилярних структур. При відсутності гетерогенної фазової поверхні у фібриновому згустку немає і поверхневого шару, а фібрили рівномірно заповнюють об'єм гелю, тому в згустках, що не мають поверхневого шару, через певний час полімеризації практично відсутні протофібрилярні структури. Одним з можливих механізмів формування поверхневого шару може бути з іншої сторони розпластання протофібрил на границі розділу двох фаз при їх латеральному рості всередину фібринового згустку, що спрямований у бік поверхні згустку. Підтвердженням цього служать електронно-мікроскопічні фотографії, на яких просліджуються фібрили, які вбудовані в поверхневий шар, при цьому помітно розшаровування їх на більш дрібні нитки (протофібрили).

Різниця, що спостерігається між товщиною поверхневого шару і фібрилами всередині згустків в залежності від пептидів, що відщеплюються від молекули фібриногену (дезАА- чи дезААВВ-фібрин), може бути пов'язана з участю центрів полімеризації. Відомо, що D2 – E2 центри полімеризації стабілізують ранні протофібрилярні структури і значно сприяють латеральній асоціації. Це у свою чергу збільшує спорідненість протофібрил одна до одної, що приводить до потовщення фібрил, які утворюються. Відсутність даних центрів у дезАА-фібрині приводить до утворення тонких фібрил за рахунок зменшення спорідненості протофібрил одна до одної, що підтверджується отриманими даними. У згустку спостерігається подовження протофібрил, латеральна асоціація яких затримана, і це приводить до меньшої кількості протофібрилярних структур, що вбудовуються в поверхневий шар. Наслідок цього – стоншення поверхневого шару в дезАА-згустках у порівнянні з дезААВВ-фібриновими згустками.

Отримані результати дозволяють висунути припущення про те, що дана особливість структури фібринового згустку, тобто наявність чи відсутність поверхневого шару, може вносити зміни у взаємодію фібринового згустку з компонентами фібринолітичної системи. Для підтвердження цього припущення були проведені електронно-мікроскопічні дослідження структури фібринових згустків, що мають різну структуру поверхні, підданих дії плазміну.

Аналіз даних з гідролізу плазміном згустків дезААВВ-фібрина, які містять поверхневий шар, показав, що спочатку згусток відповідає опису, що приведений вище. Через 30 хвилин гідролізу поверхневий шар не спостерігається, і структура фібринового згустку зазнає певних змін. Відбувається міграція фібрил у бік поверхні згустку. У центрі згустку відстань між фібрилами максимальна, а на поверхні згустку фібрили практично злипаються та утворюють суцільний “пояс”. У згустку спостерігаються 3 зони:

1 зона - @ 345 нм (зона максимальної щільності фібрил),

2 зона - @ 400 нм (проміжна зона),

3 зона – весь простір згустку, що залишився.

Зменшується кількість тонких фібрил, фібрили стають більш товстими, а відстань між ними збільшується. Після 60 хвилин гідролізу зони залишаються, але їх розмір змінюється. Зона максимальної щільності фібрил дорівнює @ 142 нм, а проміжна зона - @ 310 нм. Тонкі фібрили практично зникають, залишаються більш товсті. Відстань між ними значно збільшується.

Поява зон, що спостерігаються, всередині фібринового згустку, можливо, пов'язана з особливостями процесу полімеризації, при якому на поверхні фібринового згустка формується поверхневий шар. Протофібрили в процесі свого росту та наступної латеральної асоціації можуть випробовувати на собі значний тиск, пов'язаний з обмеженням об'єму згустка. Таким чином, вони знаходяться в конформації, що нагадує пружину, якій перешкоджає поверхневий шар. Після того як шар руйнується під дією плазміну, напруга зникає, і фібрили починають свою міграцію у бік поверхні фібринового згустку. Даний процес може бути спрямований на додаткову перешкоду повному лізису згустку, коли молекули плазміну не здатні глибоко проникати у фібриновий згусток, і процес гідролізу відбувається з поверхні, що служить ще одним захисним механізмом, який дозволяє тривалий час зберігати при ушкодженні кровоносних судин їх цілісність за рахунок згустку, що утворюється в районі ушкодження. Це у свою чергу сприяє запобіганню проникнення чужорідних агентів в кровоносне русло. Висловлене припущення добре погоджується з даними літератури, у яких показане розходження в ступені резистентності згустків до дії компонентів фібринолітичної системи на ушкоджених та інтактних судинах.

Дослідження згустків дезААВВ-фібрина, які не містять поверхневого шару, показало, що при нульовому часі гідроліза згусток відповідає опису, що приведено вище. Фібриновий згусток складається з одних фібрилярних структур. Характер згустку міняється з часом гідролізу. Фібрил стає менше, відстань між ними збільшується. Структурні зони всередині згустку знайти дуже складно. Згодом спостерігається невелике переміщення фібрил до поверхні згустку (30 – 60 хвилин гідролізу), але це імовірніше за все вивільнення фрагментів, які відщеплюються плазміном, зі згустку в навколишній розчин. Не спостерігається помітного стовщення фібрил під час гідролізу, як це спостерігається при гідролізі згустків, що містять поверхневий шар. Відсутність структурних зон у фібриновому згустку пов'язане з тим, що в процесі росту та латеральної асоціації протофібрили не мають перешкоджаючих обмежень для росту та формування фібрилярної структури, як це відбувається зі згустком, що має поверхневий шар. Відсутність напруги, пов'язаної з поверхневим шаром, приводить до більш чи менш рівномірного розподілу фібрилярних структур у згустку і при гідролізі вони не мігрують у бік виникаючого простору, зв'язаного з руйнуванням плазміном поверхні фібринового згустку.

У той же час відсутність стеричної перешкоди (поверхневий шар), можливо, приводить до більш швидкого вивільнення продуктів гідролізу фібринового згустку плазміном в навколишній простір, що у свою чергу приводить до швидкої елімінації фібринових згустків з даною структурою із кровоносного русла. З одного боку, це важливо для запобігання закупорки судин, але, з іншого боку, фібринові згустки, що не містять поверхневий шар, швидше за все, не можуть брати участь у репаративних процесах, які пов'язані з ушкодженням внутрішньої поверхні судини, оскільки вони, завдяки особливостям своєї структури, не здатні тривалий час запобігати проникненню в кровоток чужорідних агентів.

Дослідження взаємодії фібринових згустків, які мають різну структуру поверхні, з компонентами фібринолітичної системи.

Дані електронно-мікроскопічного аналізу дозволяють зробити припущення, що описані вище особливості структури фібринового згустку (присутність чи відсутність поверхневого шару) можуть впливати на процес взаємодії згустку з компонентами фібринолітичної системи. Для з'ясування ролі поверхневого шару в процесах, пов'язаних з ферментативним розщепленням фібринового згустку, були проведені дослідження з вивчення особливостей гідролізу згустків плазміном, активації та сорбції на поверхні полімерного фібрину плазміногену та тканинного активатора плазміногену.

На рисунку 1 (А, Б, В) представлена залежність швидкості гідролізу згустків від вмісту в них фібрину. Як видно з представлених даних, швидкість гідролізу має істотні розходження, пов'язані з умовами полімеризації згустків. Аналіз процесу розщеплення плазміном фібрин-полімеру, не стабілізованого ковалентним прошиванням, показав, що швидкість гідролізу згустків, які містять поверхневий шар, вище, ніж у згустків, позбавлених такого шару (Рис.1, А).

При стабілізації згустків фактором XIII по g- ланцюгам (Рис.1, Б) чи a- і g- ланцюгам (Рис.1, В), ми спостерігаємо протилежну ситуацію – швидкість гідролізу згустків без поверхневого шару виявляється вище швидкості розщеплення згустків, що містять поверхневий шар.

У таблиці 2 представлені дані, що характеризують максимальну швидкість гідролізу плазміном згустків, які мають різну структуру. Показано, що стабілізація згустків з поверхневим шаром робить помітний гальмуючий ефект (приблизно в 2,5 - 4 рази) на швидкість їх розщеплення. У той же час прошивка незначно впливає на швидкість гідролізу згустків без поверхневого шару.

Можна висловити припущення, що у випадку нестабілізованого фібрину поверхневий шар сприяє росту кількості сорбованих молекул плазміну на одиницю поверхні згустку, і це у свою чергу приводить до збільшення швидкості розщеплення його плазміном.

Прошивання зазначених згустків XIII фактором, ймовірно, перешкоджає вільному проникненню плазміну до ділянок взаємодії з молекулами фібрину, що обумовлює зниження швидкості гідролізу.

На рисунках 2 (А, Б), 3 (А, Б) представлена картина електрофорезу в присутності ДСН нестабілізованих згустків та розчинних продуктів плазмінового гідролізу цих згустків протягом 3-х годин.

З приведених даних видно, що в фібриновому згустку, який має поверхневий шар, продукти розщеплення накопичуються переважно у вигляді фрагментів D (100 кДа), E (60 кДа) і невеликої кількості фрагментів з молекулярною масою вище 100 кДа (рис.2.А).

Електрофореграма згустку (рис.2, Б) показала вже на початкових етапах гідролізу, що до складу згустку входять Х фрагменти, кількість яких накопичується з часом гідролізу.

Аналіз продуктів розщеплення згустку, на поверхні якого відсутній шар (рис.3, А), свідчить про наявність переважно фрагмента Х (240 кДа). Фрагменти з молекулярною масою нижче 200 кДа практично відсутні. З картини, представленої на рис.3, Б можна зробити висновок, що після гідролізу згустку протягом 2-х годин у його структурі залишаються неушкоджені фібрин-мономерні одиниці. Наявність Х фрагмента в згустку спостерігається приблизно до 3-ї години гідролізу. Нами виявлені також полімерні структури (які практично відсутні в згустку з поверхневим шаром), які утворилися, швидше за усе, внаслідок спонтанного прошивання згустку фактором XIII.

Виходячи з електрофоретичних даних, можна припустити, що поверхневий шар перешкоджає вільному проникненню плазміну всередину згустку, і процес гідролізу йде лише з поверхні фібринового згустка. У цьому випадку в розчин переходять фрагменти меншою молекулярною масою, ніж у згустку, позбавленому поверхневого шару, коли плазмін вільно проникає по всій його поверхні згустку. Це припущення підтверджують дані ДСН електрофорезу як продуктів гідролізу згустків, так і самих згустків. Поява в складі згустку з поверхневим шаром фрагмента Х на ранніх етапах гідролізу, ймовірно, свідчить про пошарове розщеплення згустку, починаючи з поверхні. У той же час присутність неушкоджених фібрин-мономерних одиниць під час гідролізу фібринового згустку, позбавленого поверхневого шару, говорить про відщеплення великих полімерних структур, що не змінюють його структури.

Електрофоретичний аналіз продуктів деградації згустків, стабілізованих по g- та g- і a-ланцюгам показав, що принципових розходжень у складі продуктів деградації не спостерігається. Переважно накопичується D-D фрагмент, а також виявляється незначна кількість низькомолекулярних (нижче 100 кДа) і високомолекулярних (вище 150 кДа) продуктів гідролізу.

Результати, отримані при визначенні швидкості ферментативного розщеплення фібринових згустків плазміном і при електрофоретичному аналізі розчинних продуктів гідролізу, дозволяють припустити, що утворення поверхневого шару приводить до змін у структурі гелю, що сформувався. Ці зміни відбиваються на взаємодії молекул фібрину з плазміном, що у свою чергу впливає не тільки на швидкість розщеплення плазміном згустку, але і на характер взаємодії плазміну з молекулами полімерного фібрину в згустку.

У фізіологічних умовах ключовим активатором плазминогена в плазмі крові є тканинний активатор плазминогена. Утворення тривимірної сітки фібринового згустку веде до експозиції ділянок, з якими афінно, з високою спорідненістю зв'язуються Пг, ТАП. Знайдена різниця в процесі гідролізу фібринових згустків з різною структурою поверхні ймовірно пов'язана з процесом сорбції на поверхні фібрину компонентів фібринолітичної системи і наступним процесом активації плазминогена ТАП. Процес активації досліджували, використовуючи хромогенний плазміновий субстрат - S2251 (Рис.4). З рис.4 видно, що швидкість активації на згустках з поверхневим шаром вище. Показано, що стабілізація згустків незалежно від їхньої структури сприяє збільшенню швидкості активації Пг. Максимальну швидкість гідролізу ми спостерігаємо при стабілізації згустків по g-ланцюгам фібрину.

Відомо, що головною умовою активації плазміногена ТАП є їх зв'язування з фібрином, що опосередковано афінними ділянками молекул: лізин-зв'язуючими в плазміногені та тканинному активаторі. На фібрині структурами, комплементарними лізин-зв'язуючим ділянкам, є, очевидно, бічні радикали лізину. Локалізація лігандної ділянки на поверхні молекули фібрину для плазміногена і для ТАП визначена. Ними є Аa 148-160 і g 312-324 послідовності. Також показано, що aС-фрагменти фібрину зв'язують тканинний активатор і плазміноген. Був виділений фрагмент плазмінолізу С-кінцевої ділянки a- ланцюга фібриногену, на якому аффино сорбувався ТАП. Однак, хоча роль aС-доменів у процесі полімеризації фібрину показана досить виразно, у процесі ж фібринолізу, зокрема активації плазміногена тканинним активатором, вона до кінця не з'ясована. Можливо, стабілізація згустків створює стеричні перешкоди взаємодії молекул Пг та ТАП зі специфічними ділянками їхнього зв'язування на фібрині, і виявлене збільшення швидкості активації Пг ТАП у даних умовах, при прошиванні полімерного фібрину фактором XIIIа може бути зв'язане з підвищенням локальної концентрації білків на одиницю поверхні згустку.

Присутність поверхневого шару, імовірно, також сприяє збільшенню локальної концентрації молекул Пг і ТАП на поверхні згустку, що приводить до прискорення активації.

Отримані дані щодо процесу гідролізу плазміном фібринових згустків і активації на їх поверхні плазміногена тканинним активатором дозволяють зробити висновок про можливі розходження в процесі зв'язування цих білків з поверхнею фібринових згустків, що мають різну структуру поверхні.

Будь-якому процесу, що відбувається на фібринового згустку, передує процес сорбції та конформаційних перебудов білків з поверхнею згустку. Від цього процесу згодом залежить успішне протікання всіх фізіологічних явищ, які спрямовані на підтримку рідкого стану крові в організмі.

Були проведені дослідження процесів сорбції плазміногена, тканинного активатора плазміногена й альфа2-антиплазміна (a2-AП) з поверхнею фібринових згустків, що мають різну структуру поверхні. Графік залежності зв'язування білків (Глу-Пг і ТАП) на поверхні фібринового згустку від часу інкубації має типову форму кривої, що описує процес зв'язування білків з полімерним фібрином (рис.5).

Ці криві мають дві зони. Перша, практично лінійна, зона характеризує власне процес сорбції білків на поверхні полімерного фібрину, на якій процес зв'язування білків має максимальну швидкість, що обумовлено повною доступністю ділянок специфічної взаємодії цих білків з фібриновим згустком. Друга зона кривої являє собою плато, тобто процес зв'язування і десорбції молекул стає стаціонарним, що обумовлено різким зменшенням кількості специфічних ділянок взаємодії білків (Глу-Пг і ТАП) на полімерному фібрині за рахунок стеричних перешкод молекулами, що зв'язалися, та процесом десорбції зазначених молекул у розчин.

На кількість зв'язаного Глу-Пг із полімерним фібрином впливає ступінь стабілізації фібринового згустку фактором XIII (рис.5). Максимальне зв'язування спостерігається в експериментах з непрошитим згустком, мінімальне – при використанні стабілізованого по a- і g- ланцюгам полімерного фібрину. У той же час ступінь стабілізації фібринового згустку фактором XIII практично не впливає на кількість ТАП, що зв'язується з полімерним фібрином.

Аналіз процесу зв'язування Глу-Пг із фібриновими згустками, що мають різну структуру поверхні, показав (рис.5), що на згустку, який має поверхневий шар, зв'язується більше молекул Глу-Пг, а процес сорбції йде швидше у порівнянні з фібриновими згустками без такого шару. Цю ж ситуацію ми спостерігаємо і при використанні полімерного фібрину, що стабілізован по g-, a- і g- ланцюгам.

Графічно результати, що характеризують процес зв'язування ТАП з фібриновими згустками, які мають різну структуру поверхні, показали, що процес сорбції ТАП при використанні в експериментах нестабілізованого та стабілізованого по g- ланцюгам полімерного фібрину протікає практично однаково на обох типах фібринових згустків. При повному прошиванні полімерного фібрину процес зв'язування ТАП на фібринових згустках, що мають поверхневий шар, значно перевищує такий на згустках без поверхневого шару.

Глу-Пг і ТАП, що циркулюють у крові, не виявляють помітної спорідненості до фібриногену і не утворюють з ним комплексів. З іншого боку фібриноген, симетрична молекула - димер за своєю структурою, містить дві пари Aa 148 – 160 та g 312-324 ділянок, що можуть брати участь у зв'язуванні Глу-Пг і ТАП. Ньювенхаузен (Nieuwenhuizen, 1994) висловив гіпотезу, відповідно до якої ці ділянки відкриваються не тільки при протеолітичній фрагментації фібрин(оген)а, але й у ході перетворення фібриногену в полімерний фібрин. Також він припустив, що g 312-324 послідовність є ділянкою, яка зв'язує тканинний активатор плазміногену, а Aa 148 – 160 – плазміноген-зв'язуючою ділянкою фібрину. Подібну схему локалізації Глу-Пг і ТАП на полімерному фібрині підтвердив на основі електронно-мікроскопічних досліджень руйнування згустку Вейсель (Weisel, 1996).

З огляду на дані літератури ми можемо припустити, що зміни в процесі полімеризації фібринового згустку, які приводять до утворення чи відсутності поверхневого шару, можуть по-різному впливати на експонування ділянок зв'язування як Глу-Пг, так і ТАП. Ці зміни можуть виникати в процесі утворення протофібрил і при їх наступній латеральній асоціації. Як видно з даних, представлених на рисунках, у випадку ТАП ці відміни менш виражені. Швидше за все, ділянки можливого зв'язування ТАП з полімерним фібрином практично не зазнають яких-небудь значних змін при полімеризації фібринового згустку в умовах даного експерименту, у той час як ділянки зв'язування молекул Глу-Пг частково екрануються в процесі формування фібринового згустку, про що свідчать дані рисунка.

Досліди по зв'язуванню плазміногена і ТАП з різними фібриновими згустками показали, що полімеризація фібрину та утворення згустку в плазмі крові зменшує доступність плазміногена і ТАП до ділянок зв'язування на фібрині в порівнянні з теоретично можливою. Так, Раколі і Колін (Racoli and Collin, 1990) показали, що в згустки, утворені в плазмі крові, включається 9% Глу- і 15% Ліз-форми плазміногена, доданого до плазми, тобто 0,15 мкмоль і 0,22 мкмоль на 10 мкмоль полімерного фібрину, у той час як теоретично включення плазміногена склало б 20 мкм, тобто число ділянок зв'язування в полімерному фібрині більш, ніж на порядок, перевершує концентрацію плазміногена в плазмі. Полімеризація фібрину також значно зменшує доступ моноклональних антитіл до епітопів на поверхні полімерного фібрину. Ці факти можна пояснити розходженнями в кінетичних параметрах процесів полімеризації фібрину і зв'язування плазміногена і ТАП з полімерним фібрином. Процес полімеризації супроводжується переходом фібрину у тверду фазу, при цьому фібрин організується у фібрили, що мають циліндричну форму. Якщо прийняти, що в початковій фазі полімеризації утворяться фібрили товщиною близько 60 протофібрил, то відношення молекул фібрину, розташованих у верхньому шарі фібрили, до всієї кількості молекул фібрину складе близько 45 %.

Структура поверхні фібринових згустків, що мають поверхневий шар, може сприяти експонуванню більшої кількості ділянок специфічного зв'язування білків фібринолітичної системи, зокрема плазміногена, на фібриновому згустку. Це пов'язано з можливою протофібрилярною структурою поверхневого шару, що не екранує в такому ступені ділянки зв'язування, як це відбувається у фібрилі. З огляду на дані по зв'язуванню плазміногена і ТАП можна сказати, що в більшій мірі це стосується ділянок зв'язування плазміногена на поверхні полімерного фібрину. Збільшення кількості молекул білків, що зв'язалися на поверхні фібринових згустків з поверхневим шаром, пояснює отримані дані щодо процесу активації плазміногена ТАП.

ВИСНОВКИ

1. Показано утворення особливої структури на поверхні фібриновому згустку - поверхневого шару внаслідок формування фібринового згустку на поверхні розділу двох фаз. В згустку, сформованому в умовах одної фази, ця структурна особливість будови згустку не знайдена.

2. Розроблено моделі фібринових згустків, з поверхневим шаром та без нього для дезАА- та дез ААВВ- фібрину.

3. Встановлено та досліджено за допомогою розроблених моделей методом трансмісійної та скануючої електронної мікроскопії особливості структури фібринових згустків з поверхневим шаром та без нього: будова, розміри, розміщення протофібрилярних та фібрилярних структур.

4. Показано, що структура поверхні фібринового згустку впливає на активацію плазміногена тканинним активатором на поверхні полімерного фібрину та швидкість гідролізу плазміном згустків. Встановлено відміни в якісному складі