МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

СКІТЯК СВІТЛАНА АНАТОЛІЇВНА

УДК:616.831–006.484:616.155.32:612.124.017.1

ФЕНОТИПІЧНІ ТА ЦИТОКІНОВІ ХАРАКТЕРИСТИКИ

ЛІМФОЦИТІВ У ХВОРИХ НА ГЛІОМИ ГОЛОВНОГО МОЗКУ

14.03.08 – імунологія та алергологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті нейрохірургії ім. акад. А.П.Ромоданова АМН України

Науковий керівник : доктор медичних наук, професор Лісяний

Микола Іванович, Інститут нейрохірургії ім.

акад. А.П.Ромоданова АМН України,

завідувач відділом нейроімунології

Офіційні опоненти : доктор медичних наук, професор Мельников

Олег Феодосійович, Інститут отоларингології

ім. О.С.Коломійченка АМН України, завідувач

лабораторією патофізіології та імунології;

доктор медичних наук, професор Гриневич

Юрій Акимович, Інститут онкології АМН

України, завідувач лабораторією імунології

Провідна установа : Інститут фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г.Яновського АМН України

(м. Київ)

Захист відбудеться “30” січня 2003 р. о 13.30 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02. при Національному медичному університеті ім. О.О.Богомольця МОЗ України за адресою: 01023, м.Київ-23, вул. Шовковична, 39/1, корпус 2, Центральна міська клінічна лікарня

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця МОЗ України (01017, м. Київ -17, вул. Зоологічна,1)

Автореферат розіслано “ 25 ”грудня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор Свирид С.Г.

Загальна характеристика дисертаційної роботи

Актуальність теми. На сьогоднішній день пухлини головного мозку займають 9–10 місце в структурі загальної онкологічної захворюваності в розвинутих країнах світу. В Україні з 1989 по 1995 рр. поширеність злоякісних пухлин головного мозку серед чоловіків підвищилася з 4,7 до 5,1 на 100 тис., а серед жінок – з 3,4 до 3,8 на 100 тис., що узгоджується з загальною тенденцією росту числа онкозахворювань Ю.А. Зозуля, В.Д. Розуменко, Н.И. Лисяный, 1999.

Особливості морфологічної будови ЦНС, високе функціональне диференціювання різних її елементів обумовлюють велику різноманітність гістобіологічних видів пухлин, що відомі в нейроонкології. Проте, переважну більшість серед первинних пухлин головного мозку займають гліобластоми – злоякісні гліоми IV ступеня анаплазії H.A. Fine et al., 1993. Тривалість життя у хворих на злоякісні гліоми залишається дуже короткою – менше 1 року, а п’ятирічний рівень виживаємості не перевищує 10% S.H. Kawaguchi et al., 2000.

Досягнення в нейрохірургічній техніці, хіміо- та променевій терапії лише в деякій мірі збільшили ефективність лікування. Новим перспективним шляхом покращення лікування гліом є застосування імунотерапії S.H. Kawaguchi et al.,2000; I.F. Parney et al., 2000 . Її проведення не можливе без попереднього вивчення стану імунної системи при гліомах головного мозку вцілому та встановлення основних патогенетичних ланок взаємодії імунокомпетентних клітин з пухлинним процесом.

В загальній онкоімунології порушення в імунній системі досліджені більш детально, ніж при пухлинах головного мозку, проте вони не мають однозначного трактування Ю.А.Гриневич, 2001; Н.М.Бережная, В.Ф.Чехун, 2000; О.Ф.Мельников и соавт., 2001.

Існуючі в літературі багаточисельні дані про зміни в імунній системі при гліомах головного мозку також досить різноманітні. Так, одні автори I.F. Parney et al., 2000; J.P. Zou et al., 1999 вказують на наявність імуносупресії, викликаної розвитком пухлини, а інші L.A. Morford et al., 1999 - лише на ураження Т-ланки імунітету тільки у хворих на злоякісні гліоми. Також показано, що у хворих на гліобластоми, порівняно з хворими на гліоми I-II ступеня анаплазії, має місце збільшення проліферативної активності лімфоцитів у тесті РБТЛ з ФГА Ю.П.Зозуля, М.І.Лісяний, 1998, а також спонтанної цитотоксичності мононуклеарів периферичної крові М.І.Лісяний та співавт.,1999. Механізми та причини таких різноспрямованих змін в імунній системі досконально ще не вивчені. Враховуючи той факт, що пухлини, в тому числі і гліоми, здатні виробляти цілий спектр цитокінів та інтерлейкінів Н.М.Бережная, В.Ф. Чехун, 2000, актуальним є питання вивчення впливу цих медіаторів на основні ланки імунітету. Залишаються практично не вивченими питання перебігу активаційних та апоптичних процесів у лімфоцитах крові хворих на гліоми головного мозку різного ступеня анаплазії. Не вивчено залежність між ступенем злоякісності гліоми та синтезом імунокомпетентними клітинами крові основних протипухлинних цитокінів – ІФН- та ФНП-.

В той же час вивчення даних питань дозволить визначити направленість та доцільність імунокорекції у хворих на гліальні пухлини головного мозку, що, в свою чергу, призведе до подовження термінів ремісії та покращення ефективності лікування хворих.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана згідно з науковими темами Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова АМН України: № держреєстрації 0198U001337 “Дослідити молекулярно-генетичні зміни в гліомах різного ступеня злоякісності і провести співставлення з клінічними та імунологічними проявами захворювання”; № держреєстрації 0199U004590 “Комбіноване лікування гліом головного мозку з регіонарною хіміо- та імунотерапією” та науковою темою відділу нейроімунології “Вивчення порушень імунного та цитокінового статусу у хворих з пухлинами головного мозку різного ступеня злоякісності”(№держреєстрації 0101U004579).

Мета: Встановити характерні порушення в імунній системі у хворих на гліоми головного мозку на основі вивчення фенотипічної характеристики лімфоцитів периферичної крові та продукції прозапальних цитокінів.

Для вирішення цієї мети були поставлені наступні завдання:

1. Вивчити зміни складу основних субпопуляцій лімфоцитів крові у хворих на гліальні пухлини головного мозку різного ступеня анаплазії.

2. Дослідити за допомогою моноклональних антитіл активаційні та апоптичні процеси в лімфоцитах крові хворих на гліоми різного ступеня анаплазії в динаміці хірургічного лікування.

3. Визначити рівень продукції імунокомпетентними клітинами та вміст у сироватці крові ФНП- та ІФН- залежно від ступеня злоякісності гліальної пухлини.

4. Провести аналіз змін в субпопуляційному складі лімфоцитів крові в залежності від ступеня анаплазії гліоми, її розміру та величини перифокального набряку.

Об'єкт дослідження – лімфоцити крові хворих на гліальні пухлини головного мозку.

Предмет дослідження – особливості фенотипічного складу лімфоцитів та продукції ними цитотоксичних цитокінів - ФНП- та ІФН- у хворих на гліоми з урахуванням ступеня анаплазії пухлини та динаміки лікування.

Методи дослідження: Клінічні - для оцінки перебігу захворювання та визначення ефективності лікувальних засобів; імунологічні : фенотипування лімфоцитів для визначеня їх субпопуляційного складу, імуноферментний аналіз - для визначення вмісту цитокінів, біологічні методи тестування активності цитокінів. Достовірність отриманих результатів досліджувалася статистичними методами.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено грунтовне комплексне дослідження фенотипічних ознак лімфоцитів крові та продукції прозапальних цитокінів в залежності від ступеня анаплазії гліальної пухлини. Вперше встановлено, що при злоякісних гліальних пухлинах відбуваються різноспрямовані - супресивні, стимулюючі та проапоптичні зміни в клітинах імунної системи. Імуносупресивні проявляються зменшенням загальної кількості лімфоцитів, вмісту NK-клітин прямопропорційно розміру пухлини та ступеню її злоякісності, імуностимулюючі полягають в збільшенні відносної кількості В-клітин та CD8+ лімфоцитів, а проапоптичні - в збільшенні кількості лімфоцитів з фенотипом CD95 незалежно від ступеня анаплазії гліоми. Вперше доведено, що найбільш значимі імуносупресивні зміни при гліальних пухлинах спостерігаються в процесах активації лімфоцитів, що проявляється як зменшенням кількості CD25+ клітин, так і пригніченням продукції ІФН- активованими клітинами in vitro. Вперше виявлена невідповідність між рівнем прозапальних цитокінів в сироватці крові та здатністю імунокомпетентних клітин індукувати їх синтез - в сироватці крові виявляється підвищений рівень ІФН- та ФНП-, в той час, як in vitro спостерігається гальмування їх продукції. Вперше встановлено, що при “швидкому” перебігу гліобластоми з коротким періодом клінічних проявів зміни в імунній системі виявляються лише в зменшенні кількості NK-клітин та активованих лімфоцитів, що дозволяє віднести їх до ранніх ознак наявності в організмі гліального пухлинного процесу.

Теоретична і практична значимість одержаних результатів. Поглиблено і розширено уявлення про зміни в клітинній ланці імунітету при гліальних пухлинах головного мозку, виявлено точки первинного впливу гліоми на імунну систему. Встановлення залежності між ступенем анаплазії гліоми та характером і спрямованістю реакцій імунної системи є основою для розкриття патогенезу порушень в імунній системі при даному виді новоутворень та створення нових підходів до їх корекції. Виявлено особливості продукції основних протипухлинних цитокінів –ІФН- та ФНП-, які необхідно враховувати при призначенні імунокоригуючої терапії хворим на гліальні пухлини. Встановлено ранні ознаки порушень в імунній системі у хворих на злоякісні гліобластоми, які можуть бути використані як допоміжні діагностичні критерії гліальних пухлин головного мозку. Запропоновано комплекс імунологічних досліджень із визначенням як основних фенотипічних характеристик лімфоцитів, так і їх цитокінсинтезуючої функції, який дає змогу в повній мірі оцінити ступінь імуносупресивного, імуностимулюючого та проапоптичного впливу гліальних пухлин на імунну систему.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок автора полягає в аналізі актуальності і глибини вивчення теми роботи, здійсненні патентно-інформаційного пошуку та оцінці літературних даних, виборі і опрацюванні методик дослідження, проведенні аналізу фенотипу лімфоцитів непрямим імунофлюоресцентним методом, постановці імуноферментного аналізу продукції ІФН- та ФНП- імунокомпетентними клітинами крові та в сироватці крові, проведенні досліджень по вмісту імуноглобулінів у сироватці крові, наборі клінічного матеріалу для досліджень, його обробці та аналізу. Визначення фенотипу лімфоїдних клітин непрямим імунофлюоресцентним методом на етапі урахування реакції виконано разом із співробітниками лабораторії імуноцитології НЦРМ АМН України (керівник – д.мед.н. Д.А.Базика). Біологічний метод тестування активності ІФН- та ФНП- проведено разом із співробітниками групи мікробіології та вірусології Інституту отоларингології ім. О.С.Коломійченка АМН України. Автор висловлює щиру подяку співробітникам відділення внутрішньомозкових пухлин Інституту нейрохірургії (зав. відділенням - д.мед.н. В.Д.Розуменко) за допомогу в клінічному підборі хворих. Автором проведено статистичну обробку отриманих результатів, зроблено відповідні до теми висновки, написаний текст дисертації.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до дисертації, викладено в доповідях на II з'їзді онкологів країн СНД (Україна, Київ 23–26 травня 2000 р.), науково-практичній конференції з нагоди 15-річчя створення відділу клінічної імунології Наукового центру радіаційної медицини АМН України (23–24 травня 2002 р., м.Київ), на розширеному засідання Вченої ради Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П.Ромоданова АМН України сумісно з кафедрами нейрохірургії НМУ та КМАПО (20 вересня 2002 р.), на III з’їзді нейрохірургів Росії (4-8 червня 2002 р., м.Санкт-Петербург).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 17 робіт, в тому числі 6 наукових статей у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України.

Структура та об’єм дисертації. Дисертація побудована за загальноприйнятим планом і складається зі вступу, огляду літератури, розділу матеріал і методи дослідження, 4 розділів власних досліджень, заключення, висновків, списку використаних джерел наукової літератури, який включає – 85 українсько- і російськомовних та 95 іноземних джерел. Основний текст дисертації викладено на 171 сторінці машинописного тексту (з них основного тексту - 135 сторінок) та ілюстровано 32 таблицями, 4 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДОСЛІДЖЕННЯ

Для вирішення поставленої мети та завдань дослідження було обстежено 212 хворих, з них - 165 хворих на гліоми головного мозку (77,83%), 32 хворих на менінгіоми (15,09%) та 15 пацієнтів з метастатичними пухлинами (7,08%). Контрольну групу склали 22 здорових особи, співставлюваних за віком та статтю. Усі хворі на пухлини головного мозку були обстежені в динаміці: до оперативного втручання – на 1-2 добу від моменту вступу до стаціонару та на 8-10 добу після операції. Серед усіх хворих на різні пухлини головного мозку чоловіків було – 108 (50,95 %), а жінок – 104 особи (49,05%). Розподіл хворих за віком був таким: до 20 років – 12 осіб (5,67%); 21-30 років – 43 особи (20,28%); 31-40 років – 59 осіб (27,83%); 41-50 років – 50 осіб (23,58%); 51-60 років – 43 хворих (20,28%); старше 60 років – 5 осіб (2,36%) .

Діагноз пухлини головного мозку верифікувався гістологічно у відповідності з гістологічною класифікацією пухлин нервової системи Ю.А.Зозуля и соавт., 2001.

Гліоми I-II ступеня анаплазії виявлені у 47 осіб (28,48%), III ступеня – у 65 осіб (39,39%), IV ступеня анаплазії – у 53 осіб (32,12%). Усі хворі на пухлини головного мозку в доопераційному періоді отримували протинабрякову терапію дексаметазоном в дозі 4 -8 мг 2 рази на день для зменшення явищ набряку та симптомів компресії головного мозку. Проте, у хворих на гліоми I-II ступеня анаплазії у 11 осіб (23,4% від групи хворих на даний вид гліом) перше імунологічне обстеження було проведене до призначення дексаметазону у зв’язку із більш задовільним станом хворих.

У групі хворих на гліоми IV ступеня анаплазії теж була виділена окрема підгрупа пацієнтів з надзвичайно швидким перебігом захворювання, у яких анамнез хвороби складав 1,5-2 тижні, на відміну від групи вцілому, де тривалість захворювання становила 1-1,5 місяці. Таких хворих було 9 осіб, що складало 16,98% від загальної групи хворих на гліобластоми.

Три групи хворих на гліальні пухлини (в залежності від ступеня анаплазії) були, в свою чергу, розподілені на підгрупи: А – з пухлинами великого розміру та В – з пухлинами малого розміру. Враховуючи відсутність в літературі класифікацій за цією ознакою, ми об’єднали в підгрупу великих ті пухлин, які за даними комп’ютерної томографії мали розміри більші за 4,0 см (кожен з трьох розмірів); малими ми вважали пухлини, кожен з трьох розмірів якої був менше 4,0 см.

Кожна з груп хворих на гліоми в залежності від ступеня анаплазії пухлини була розподілена, в свою чергу, також на підгрупи С та Д. Підгрупу С склали ті хворі, у яких величина перифокального набряку становила 2,0 см і вище, а підгрупу Д – ті особи, у яких даний показник був невираженим або не перевищував 2 см.

Для вирішення поставлених завдань використовувалося комплексне обстеження хворих на пухлини головного мозку, яке включало клініко-анамнестичне дослідження, комп’ютерну томографію головного мозку, загально-лабораторні дослідження (підрахунок кількості лейкоцитів та лейкоцитарної формули крові), імунологічні методи.

Імунологічне обстеження включало в себе кількісну оцінку різних субпопуляцій лімфоцитів непрямим імунофлюоресцентним методом за допомогою моноклональних антитіл виробництва ЗАТ “Сорбент-сервіс” (Москва). За допомогою даного методу визначалися наступні субпопуляції лімфоцитів – CD3+лімфоцити (Т-клітини); CD4+лімфоцити (Т-хелпери); CD8+лімфоцити (Т-цитотоксичні лімфоцити/супресори); CD16+лімфоцити (NK-клітини), CD56+лімфоцити (NK-клітини та лімфоцити, що експресують молекулу адгезії NCAM); CD19+ лімфоцити (В-клітини); CD25+лімфоцити (активовані клітини, що експресують -ланцюг рецептора ІЛ-2); HLA-DR+лімфоцити (активовані клітини); CD54+лімфоцити (активовані лімфоцити, що експресують молекулу адгезії ІСАМ-1); CD95+лімфоцити (клітини, які експресують FASR). Також проводилося вивчення цитокінпродукуючої функції імунокомпетентних клітин крові за допомогою визначення продукції ІФН- та ФНП- як імуноферментним методом, з використанням наборів для ІФА виробництва ТОВ “Протеиновый контур” (Санкт-Петербург), так і біологічним методом [А.Л.Рахмилевич и соавт., 1989]. Рівень основних класів сироваткових імуноглобулінів визначали методом простої радіальної імунодифузії в гелі за G. Mancini et al., 1965. Для постановки реакції використовували кролячі моноспецифічні антисироватки та стандарти імуноглобулінів із комерційного набору фірми “ИмБио”, м. Нижній Новгород, Росія.

Статистичну обробку отриманих результатів досліджень проводили за домогою стандартного комп’ютерного пакета “Аналіз даних”Microsoft Excel для Windows 1995, версія 7.0а, 1996 р. Обчислено значення середнього арифметичного (М), середнього квадратичного відхилення (), похибку визначення середнього квадратичного (m), рівень вірогідності розбіжностей (р), коефіцієнт кореляції (r).

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для хворих на гліоми вцілому без урахування ступеня анаплазії характерною ознакою була лімфопенія (відносний вміст лімфоцитів складав - 20,48+2,3%, а абсолютна кількість - 1,58+0,171х109/л), зменшення вмісту NK-клітин (11,88+1,14% та 0,19+0,022х109/л) та відсутність грубих порушень в системі Т-лімфоцитів та їх основних імунорегуляторних субпопуляцій:відносний вміст CD3+клітин становив 60,09+6,12%, СD4+ лімфоцитів - 34,65+3,83%, а CD8+ - 24,17+2,95%. В той же час була виявлена дисоціація між показниками відносного та абсолютного вмісту даних субпопуляцій клітин, оскільки зменшення кількості лімфоцитів в даній групі хворих було найбільш вираженим і призводило до зменшення абсолютної кількості CD3+, CD4+ та CD8+ лімфоцитів. У хворих на гліальні пухлини головного мозку виявлено зниження процесів активації лімфоцитів, особливо тих, що відбуваються за участю -ланцюга рецептора ІЛ-2 (CD25+): вміст CD25+лімфоцитів становив 6,20+0,71% та 0,10+0,011х109/л, що значно менше (p<0,01) від величин здорових осіб (15,3+1,71% та 0,37+0,041х109/л). В той же час при гліомах страждають і процеси активації лімфоцитів, що відбуваються за участю HLA-DR антигена та молекули адгезії ІСАМ-1,- кількість HLA-DR+ лімфоцитів була зменшена на 40–45%, а CD54+ лімфоцитів – на 25–30%, тобто було виявлено нерівномірний характер змін в системі активації лімфоцитів у хворих на гліоми. Для хворих на гліоми був притаманний найвищий вміст CD95+лімфоцитів - 9,13+0,98%, що втричі перевищує значення здорових осіб (p<0,01).

У хворих на менінгіоми, пухлини з оболонок головного мозку, не було виявлено порушень в системі генерації лімфоцитів та їх диференціювання в основні популяції та субпопуляції. Їм також було притаманно зменшення вмісту NK-клітин як характерна риса онкологічного процесу (13,90+1,52% та 0,26+0,020х109/л), проте супресивний вплив на дану ланку імунітету був менш виражений, ніж у хворих на гліоми. Для хворих на пухлини з оболонок головного мозку характерні також порушення експресії -ланцюга рецептора ІЛ-2 (вміст CD25+лімфоцитів становив 6,22+0,81% та 0,12+0,011х109/л), пригнічення активаційних процесів за участю HLA-DR-рецептора (вміст лімфоцитів даного фенотипу складав 12,02+1,01%; 0,22+0,026х109/л) та вірогідне зменшення вмісту CD54+ лімфоцитів (8,03+0,93%; 0,12+0,013х109/л). Проапоптичні впливи менінгіальної пухлини на лімфоцити були виражені мало, і підвищення вмісту CD95+ лімфоцитів до 7,60+0,94% при значенні у здорових осіб - 3,20+0,43% спостерігається, можливо, більше за рахунок проапоптогенної дії глюкокортикоїдних гормонів.

У хворих на метастатичні пухлини, представлені в переважній більшості меланомами, існує порушення утворення лімфоцитів, при цьому, однак, збережені процеси їх диференціювання в CD3+, CD4+, CD8+лімфоцити та в NK-клітини. Апоптоз лімфоцитів порівняно з хворими на інші пухлини головного мозку був виражений найменше - вміст CD95+лімфоцитів не відрізнявся (р>0,05) від здорових осіб і становив 4,55+0,62% і 0,08+0,001х109/л). Виявлено порушення в системі активації лімфоцитів - виражене зменшення вмісту CD25+лімфоцитів до 9,70+1,02% та 0,17+0,019х109/л, хоча ці величини були вірогідно більші (р<0,01) за аналогічні показники у хворих на гліоми. Встановлено вірогідне збільшення (p<0,01) вмісту В-клітин (16,70+1,93%; 0,30+0,041х109/л).

Додатково в усіх групах хворих було вивчено вміст імуноглобулінів у сироватці крові як показник функціонального стану В-клітин. У хворих на гліоми головного мозку спостерігається вірогідне збільшення вмісту в сироватці крові IgA (3,78+0,41 г/л). Дане явище може бути обумовлене тим, що гліома продукує TGF, а даний цитокін викликає вибіркову активацію продукції IgA та сприяє переключенню синтезу імуноглобулінів на цей тип И.С.Фрейдлин, 2002. В сироватці крові хворих на метастатичні пухлини було виявлено вірогідне збільшення вмісту Ig G до 19,20+2,13 г/л та IgA до 3,60+0,45 г/л.

В зв’язку з різноманітністю гістоморфологічних варіантів гліальних пухлин головного мозку було вивчено порушення в субпопуляційному складі лімфоцитів залежно від ступеня анаплазії гліоми (табл.1).

Таблиця 1.

Показники вмісту основних субпопуляцій лімфоцитів у хворих на гліоми головного мозку різного ступеня анаплазії в доопераційному періоді (M±m)

Показник |

Хворі на гліоми I-II cт.

(n=47) | Хворі на гліоми III ст.

(n=65) | Хворі на гліоми IV ст.

(n=53) | Контрольна група

(n=22)

Лейкоцити, | х109/л | 7,20±0,73 | 6,81±0,41 | 7,72±0,52 | 7,76±0,82

Лімфоцити, | % | 24,40±2,29 | 23,71±1,64 | 19,42±2,01 | 31,64±3,90

х109/л | 1,76±0,191 | 1,62±0,18 | 1,48±0,17 | 2,41±0,239

CD3+ лімфоцити | % | 66,21±3,31 | 65,67+3,75 | 52,73±3,26* | 65,85±7,20

х109/л | 1,18±0,13 | 1,02±0,110 | 0,78±0,081* | 1,59±0,172

CD4+ лімфоцити | % | 35,54±3,23 | 32,55±2,01 | 27,79±2,9* | 33,23±3,90

х109/л | 0,63±0,071 | 0,53±0,061 | 0,41±0,053* | 0,80±0,093

CD8+ лімфоцити | % | 26,63±3,39 | 31,09±1,83 | 20,70±1,85 | 21,50±2,01

х109/л | 0,47±0,052 | 0,51±0,059 | 0,32±0,039* | 0,52±0,059

CD4/CD8 | 1,35±0,15 | 1,07±0,13 | 1,41±0,15 | 1,81±0,19

CD19+ лімфоцити | % | 9,20±1,10 | 13,18±1,85х | 12,46±1,51* | 7,8±1,04

х109/л | 0,16±0,018 | 0,21±0,029 | 0,18±0,02 | 0,19±0,021

CD16+ лімфоцити | % | 13,74+1,47 | 15,38+1,89 | 12,05+1,39 | 18,90+2,30

х109/л | 0,24+0,029 | 0,25+0,029 | 0,18+0,021* | 0,46+0,051

CD56+ лімфоцити | % | 14,03+1,52 | 14,8+1,51 | 12,15+1,15 | 17,3+1,86

х109/л | 0,25+0,026 | 0,24+0,027 | 0,18+0,019* | 0,42+0,051

Примітки: 1. *- вірогідність різниці показника при гліомах IV ступеня анаплазії з аналогічним при гліомах I-II ступеня ( p<0,01)

2.

При розгляді змін в субпопуляційному складі лімфоцитів залежно від ступеня анаплазії пухлини встановлено, що із зростанням ступеня злоякісності гліоми збільшується лімфопенія. Виявлена дисоціація між показниками відносного та абсолютного вмісту CD3+ та CD4+ лімфоцитів: якщо відносні величини цих показників були збережені у хворих з гліомами I-II та III ступенів анаплазії, то абсолютна кількість CD3+ лімфоцитів зменшена на 30% у пацієнтів з гліомами I-II ступеня злоякісності та на 45% - хворих з гліомами III ступеня (p<0,01). При гліомах IV ступеня анаплазії відмічено вірогідне зменшення відносного і абсолютного вмісту CD3+ та CD4+ лімфоцитів порівняно з пацієнтами з I-II ступенем злоякісності пухлини. У хворих на гліоми III ступеня анаплазії встановлено збільшення відносного вмісту CD8+ лімфоцитів до 31,09±1,83% (p<0,01) порівняно з контрольною групою та хворими на гліобластоми.

Для хворих на гліоми головного мозку також притаманно вірогідне збільшення відносного вмісту CD19+ лімфоцитів, особливо виражене при пухлинах III та IV ступенів злоякісності -13,18±1,85% та 12,46±1,51% відповідно. В той же час абсолютна кількість клітин даного фенотипу внаслідок лімфопенії знаходилася в межах контрольної групи.

Вивчення вмісту NK-клітин, які відіграють велике значення у протипухлинній відповіді, показало, що спостерігається вірогідне зменшення не тільки вмісту CD16+ лімфоцитів, найбільш виражене при гліомах IV ступеня злоякісності ( 12,05+1,39%; 0,18+0,021х109/л), але й відносного та абсолютного вмісту CD56+ лімфоцитів, які експресують NCAM, прямопропорційно ступеню анаплазії гліоми (14,03+1,52%; 0,25+0,026 х109/л - у хворих на гліоми I-II ступеня анаплазії та 12,15+1,15%; 0,18+0,019 х109/л - у хворих на гліобластоми).

Вміст активованих лімфоцитів з фенотипом HLA-DR+ (табл. 2) виявився прямопропорційно залежним від ступеня анаплазії гліоми: дефіцит цих клітин за відносними величинами складав від 25% при гліомах I-II ступеня анаплазії до 50% при гліомах IV ступеня анаплазії, за абсолютною кількістю дефіцит даної субпопуляції відповідно становив 50% та 70%. Вміст активованих лімфоцитів з фенотипом CD25+ та CD54+ був вірогідно зниженим незалежно від ступеня злоякісності пухлини, а наявна лімфопенія призводила до значного зменшення абсолютної кількості даних субпопуляцій клітин в периферичній крові.

Дослідження вмісту лімфоцитів крові, які несуть рецептор апоптозу, показало, що вірогідних відмінностей у кількості CD95+ лімфоцитів (табл.2) між групами хворих немає, однак їх рівень перевищував значення здорових осіб втричі (p<0,01) за відносними величинами та вдвічі за абсолютною кількістю.

Таблиця 2.

Вміст лімфоцитів з різними маркерами активації та апоптозу у хворих на гліоми головного мозку різного ступеня анаплазії (M+m)

Показник |

Хворі на гліоми I-II ст.

(n=47) | Хворі на гліоми III ст.

(n=65) | Хворі на гліоми IV ст.

(n=53) | Контрольна група

(n=22)

CD25+ | % | 5,00±0,57 | 7,17±0,60 | 6,90±0,71 | 15,3±1,71

лімфоцити | х109/л | 0,10±0,011 | 0,12±0,011 | 0,10±0,012 | 0,37±0,041

HLA-DR+ | % | 15,33±1,63 | 14,29±1,56 | 10,39±1,12* | 22,50±2,40

лімфоцити | х109/л | 0,27±0,031 | 0,23±0,027 | 0,15±0,018* | 0,52±0,063

CD54+ | % | 9,45±1,01 | 8,02±0,71 | 9,90±1,08 | 11,07±1,65

лімфоцити | х109/л | 0,17±0,019 | 0,13±0,013х | 0,15±0,017 | 0,27±0,032

CD95+ | % | 9,15±0,99 | 8,39±0,97 | 9,83±1,01 | 3,20±0,41

лімфоцити | х109/л | 0,16±0,018 | 0,14±0,016 | 0,15±0,017 | 0,08±0,001

Примітки: 1. *- вірогідність різниці показника при гліомах IV ступеня анаплазії з аналогічним при гліомах I-II ступеня ( p<0,01)

2.

Таким чином, при гліальних пухлинах головного мозку із зростанням ступеня анаплазії спостерігаються вірогідне зменшення відносного та абсолютного вмісту CD3+ та CD4+ лімфоцитів, пригнічення активаційних процесів, що проявляється зменшенням вмісту HLA-DR позитивних лімфоцитів, збільшення процентного вмісту В-клітин.

Видалення пухлини та стабілізація задовільного клінічного стану не призводили до відновлення імунологічних показників. Навпаки, в усіх групах хворих на 8-10 добу після операції зростала лімфопенія - до 1,51+0,173 х109/л у хворих на гліоми I-II ступеня злоякісності та 1,25+0,13 х109/л - у хворих на гліоми IV ступеня анаплазії (p<0,01). В групі хворих на пухлини I-II ступеня анаплазії достовірно зменшувалася відносна та абсолютна кількість CD4+лімфоцитів. У групі хворих на гліоми III ступеня анаплазії після операції також відбувалося вірогідне зменшення відносного та абсолютного вмісту CD3+ та CD8+ лімфоцитів. В той же час, у хворих на гліоми IV ступеня злоякісності відносний вміст CD3+ та CD4+ лімфоцитів лишався стабільно низьким, проте виражена лімфопенія в післяопераційному періоді у цих хворих призводила до зменшення абсолютної кількості клітин даного фенотипу. У хворих на гліоми IV ступеня злоякісності зростала відносна кількість CD8+ лімфоцитів до 27,53+2,43% (p<0,01). Відносний вміст CD16+ клітин в післяопераційному періоді вірогідно зменшувався у хворих на гліоми I-II та III ступеня анаплазії, в той час як у хворих на гліобластоми він лишався стабільно низьким. Найнижча абсолютна кількість клітин даного фенотипу була виявлена саме в післяопераційному періоді у хворих на гліоми IV ступеня анаплазії - 0,13+0,017 х109/л. Вміст CD56+ лімфоцитів достовірно зменшувався за відносними та абсолютними величинами у хворих на гліоми III та IV ступеня анаплазії; найнижча кількість лімфоцитів даного фенотипу виявлена теж у хворих на гліобластоми в післяоперційному періоді - 6,0+0,60%; 0,075+0,001 х109/л. Проведеними дослідженнями не встановлено вірогідних відмінностей у кількості активованих та апоптичних лімфоцитів в динаміці оперативного лікування. Таким чином, в ранньому післяопераційному періоді на 8-10 добу у хворих на гліоми головного мозку відновлення імунологічних показників не відбувається.

Обстеження підгрупи хворих на гліоми I-II ступеня анаплазії, які до проведення імунограми не приймали дексаметазон, виявило, що кількісний вміст основних субпопуляцій CD3+, CD4+, CD8+, CD16+ , HLA-DR+ лімфоцитів вірогідно не відрізнявся від значень цих показників по групі хворих вцілому. Однак, вміст CD25+ лімфоцитів у групі хворих, які до проведення імунологічного обстеження не отримували глюкокортикоїдну терапію, був вищим – 7,30±0,82% проти 5,00±0,57%, проте все ж вдвічі меншим від значень контрольної групи – 15,30±1,71% (p<0,01). Найбільший вплив призначення глюкокортикоїдів мало на субпопуляцію CD54+ лімфоцитів. Якщо в групі хворих, обстежених до призначення дексаметазону, вміст цих клітин становив 12,15±1,49% та 0,18±0,023х109/л, то в загальній групі хворих – 9,45±1,01% та 0,17±0,019х109/л. Отримані нами дані підтверджуються існуючими в літературі про те, що глюкокортикоїдні гормони зменшують експресію ICAM-1 (CD54) на моноцитах та ендотеліальних клітинах [Г.Н.Дранник, 1999]. Помітний вплив виявляють глюкокортикоїди і на вміст CD95+ лімфоцитів. Кількісний склад цієї субпопуляції у хворих, які обстежені до призначення дексаметазону, складав 6,13±0,47% та 0,11±0,001х109/л, що становило величину, яка вірогідно перевищувала показники контрольної групи – 3,20±0,41% та 0,08±0,001х109/л, проте була вірогідно меншою (р<0,01) від значень CD95+ лімфоцитів в загальній групі хворих на гліоми I–II ступеня анаплазії – 9,15±0,99% та 0,16±0,018х109/л. Отже, підвищений вміст в периферичній крові хворих на гліоми лімфоцитів з фенотипом CD95+ зумовлений як виділенням гліомою проапоптичних чинників, так і призначенням глюкокортикоїдів, які теж здійснюють проапоптичну дію на лімфоцити.

Обстеження підгрупи хворих на гліобластоми з “швидким перебігом” (анамнез захворювання становив 1,5-2 тижні) теж виявило особливості в їх субпопуляційному складі лімфоцитів. Відносна кількість лімфоцитів у цій підгрупі була значно вищою за показники в загальній групі – 26,33±2,93% і вірогідно не відрізнялася від значень у здорових осіб. Абсолютна кількість лімфоцитів теж вірогідно перевищувала показник по загальній групі – 1,91±0,201х109/л , проте була нижчою за аналогічну в контрольній групі (p<0,01). Крім того, у цих хворих відмічалися рівні CD3+, CD4+ та CD8+ клітин, які значно перевищували дані по загальній групі хворих на гліобластоми та не відрізнялися від значень контрольної групи, а вміст CD4+ лімфоцитів навіть перевищував величину здорових осіб. Тобто, в цій підгрупі хворих був відсутній пригнічуючий вплив пухлини на Т-ланку імунітету. Вміст В-лімфоцитів не відрізнявся від даних по загальній групі. Відносний вміст CD16+ та CD56+ лімфоцитів у цих хворих був нижчий за показники здорових осіб (р<0,01) і не відрізнявся від даних по загальній групі пацієнтів з гліобластомами.Привертає увагу той факт, що навіть такий нетривалий клінічний розвиток пухлинного процесу уже мав вплив на процеси активації лімфоцитів даних хворих. Вміст активованих лімфоцитів, як CD25+, так і HLA-DR+, був знижений в даній підгрупі і статистично не відрізнявся від значень по загальній групі хворих. Вірогідну відмінність мали лише абсолютні кількості зазначених субпопуляцій, оскільки в даній підгрупі з надзвичайно швидким розвитком хвороби не спостерігалося лімфопенії. Проте навіть ці величини були вдвічі менші за значення контрольної групи (p<0,01). Крім того,у даних хворих було менше лімфоцитів з фенотипом CD95+ (7,01±0,69%), ніж взагалі по групі (9,83±1,01%) при значенні у здорових осіб – 3,20±0,41%. Це свідчить, на наш погляд, про те, що пухлинний процес ще не спричинив значну проапоптогенну дію на лімфоцити периферичної крові, як це спостерігається при більш тривалому існуванні злоякісної пухлини.

Аналізуючи залежність між розміром пухлини та змінами у фенотипічному складі лімфоцитів, нами встановлено, що чим більшою за розмірами є гліома головного мозку, тим більше її супресивний вплив на процеси лімфопоезу, при цьому також слід враховувати і ступінь її злоякісності — чим він вищий, тим більшим є вплив на лімфопоез ( найнижчий абсолютний вміст лімфоцитів виявлено у хворих на гліобластоми великого розміру - 1,41+0,15х109/л), що призводило до виникнення дисоціації між відносними та абсолютними показниками субпопуляційного складу лімфоцитів. Проведеними дослідженнями не виявлено суттєвих відмінностей у відносному складі Т-лімфоцитів у хворих в залежності від розміру пухлини. В той же час, абсолютний вміст Т-лімфоцитів у хворих з великими пухлинами був вірогідно нижчим (р<0,01) за показники підгрупи пацієнтів з малими пухлинами (1,38±0,17х109/л – при малих розмірах гліоми I–II ступеня злоякісності проти 0,90±0,10х109/л – при великій пухлині; 1,19±0,13х109/л – при малих анапластичних астроцитомах та 0,93±0,091х109/л – при великих). Подібна динаміка спостерігалася і в кількісному складі CD4+ лімфоцитів в групах хворих на гліоми III та IV ступеня злоякісності. В той же час процентний вміст даної субпопуляції у хворих на гліоми I–II ступеня анаплазії вірогідно не залежав (р>0,1) від розміру пухлини. Відносний вміст CD8+ лімфоцитів, навпаки, був нижчим (р<0,01) в групі хворих з малими гліомами I–II та III ступеня злоякісності і вірогідно вищим в підгрупі хворих з малими гліобластомами (26,19±2,91% проти 21,63±2,13%). Імунорегуляторний індекс в групі хворих на гліоми I–II та IV ступеня злоякісності не залежав від розміру пухлини, а в групі анапластичних гліом був більшим (р<0,01) у хворих на пухлини малого розміру. Суттєвий вплив мала величина гліоми на кількість В-лімфоцитів. В усіх групах хворих незалежно від ступеня злоякісності пухлини при великих розмірах гліоми кількість CD19+ лімфоцитів була значно вище, ніж при малих. Вміст CD16+ лімфоцитів вірогідно не відрізнявся в залежності від розміру гліоми, хоча більший абсолютний вміст лімфоцитів в підгрупі хворих на малі гліоми I–II ступеня злоякісності призводив до збільшення абсолютної кількості CD16+ клітин в цій підгрупі. Вміст CD56+ лімфоцитів при злоякісних гліомах відрізнявся в залежності від розміру пухлини. Так, в підгрупі А (“великі пухлини”) у хворих на анапластичні гліоми він складав 12,86±1,14%, а в підгрупі В (“малі пухлини”) – 15,01±1,17% (р<0,01), при великих гліобластомах він становив – 9,43±0,99%, а при малих – 12,03±1,13% (р<0,01). В той же час, в підгрупах хворих на гліоми I–II ступеня злоякісності для відносного значення CD56+ лімфоцитів такої тенденції не було виявлено, а лише для абсолютної їх кількості. У всіх групах хворих при великих розмірах гліоми вміст CD25+ та HLA-DR+ лімфоцитів був значно зниженим порівняно з аналогічними показниками при менших пухлинах, за винятком анапластичних гліом, де відносний вміст даної субпопуляції не відрізнявся (р>0,1) – 14,21±1,57% – в підгрупі А та 14,01±1,51% в підгрупі В. Відносна кількість лімфоцитів, що експресують молекулу адгезії ІСАМ-1, при великих гліомах III та IV ступеня анаплазії була вдвічі меншою, ніж при малих. Лише у хворих на гліоми I–II ступеня злоякісності не було виявлено суттєвих відмінностей ні в абсолютному, ні у відносному вмісті даної субпопуляції. В той же час для хворих з гліомами малого розміру була характерна більша активація процесів апоптозу лімфоцитів. Процентний вміст CD95+ лімфоцитів при малих гліомах I–II ступеня злоякісності перевищував аналогічний при великих в 2 рази (10,21±1,13% проти 5,70±0,62%), а за абсолютною кількістю – втричі (0,23±0,027х109/л проти 0,08±0,001х109/л). Аналогічна закономірність зберігалася і при гліомах III та IV ступеня злоякісності (p<0,01). Таким чином, у хворих з “великими” гліальними пухлинами на відміну від “малих” більш виражені лімфопенія, дефіцит активованих лімфоцитів, наявність порушень процесів адгезії та кооперації лімфоцитів та збільшення вмісту CD19 позитивних клітин.

Проведеними дослідженнями виявлені також характерні ознаки порушень в клітинній ланці імунітету залежно від вираженості перифокального набряку головного мозку, який може бути досить великих розмірів, займати в деяких випадках до однієї долі мозку та мати велике значення при визначенні лікувальної тактики Ю.А.Зозуля, В.Д.Розуменко, Н.И.Лисяный, 1999; С.А.Усатов, 2002 В першу чергу, це стосується порушень на етапі дозрівання лімфоцитів: пухлини III та IV ступеня анаплазії з великим перифокальним набряком характеризуються більш вираженою лімфопенією, що призводить до дисоціації між відносними та абсолютними величинами субпопуляцій лімфоцитів. Кількість CD3+, CD4+ , CD16+ лімфоцитів не залежала від величини перифокального набряку, лише більший дефіцит лімфоцитів у хворих в підгрупах С (“великий перифокальний набряк”) призводив до вірогідного зменшення абсолютної кількості цих клітин. І, навпаки, кількість CD8+лімфоцитів в периферичній крові по мірі зростання перифокального набряку вірогідно зростала. Так, в групі хворих на гліоми I–II ступеня злоякісності при великому перифокальному набряку вміст цих клітин складав 31,75±3,46%, а при малому – 22,65±2,51%(р<0,01). Таке ж співвідношення було притаманне і хворим на анапластичні гліоми. У хворих на гліобластоми спостерігалася зворотня залежність – чим більше за розміром перифокальний набряк головного мозку, тим меншою була кількість CD8+ лімфоцитів у периферичній крові – 21,79±2,28% та 0,27±0,035х109/л – при великих розмірах набряку та 26,95±3,03% і 0,45±0,051х109/л – при малих. Звертає також увагу вірогідне збільшення (в 2 і більше разів) кількості В-лімфоцитів у хворих з великими розмірами перифокальної зони. Процеси адгезії лімфоцитів за участю молекул NCAМ та ІСАМ-1 не мали суттєвих розбіжностей і лише при анапластичних гліомах з великим перифокальним набряком було встановлено вірогідне збільшення (в 2 рази) кількості лімфоцитів, що експресують ІСАМ-1. Порушення в системі активації мали вибірковий характер: якщо кількість HLA-DR+ лімфоцитів не залежала від величини перифокальної зони, то при її великих розмірах вміст CD25+ лімфоцитів був знижений на 40–50%. Експресія лімфоцитами FASR не відрізнялася при великих і малих розмірах перифокальної зони, хоча в останньому випадку була вірогідно збільшена абсолютна кількість апоптичних лімфоцитів внаслідок більшої загальної кількості лімфоцитів крові.

При дослідженні вмісту ФНП- в сироватці крові виявлено, що у хворих на гліоми I-II ступеня анаплазії до оперативного втручання рівень даного цитокіна вдвічі перевищував значення здорових осіб до операції (p<0,01) та не відрізнявся від них (p>0,1) після неї (табл.3). Процент лізису клітин L-929 в даній групі хворих при визначенні біологічним методом мав аналогічні тенденції. В групі хворих на гліоми III ступеня злоякісності вміст ФНП- в сироватці крові перевищував значення здорових осіб в 4 рази, а аналогічну величину в групі хворих на гліоми I-II ступеня анаплазії - вдвічі (p<0,01). Вірогідних змін його в динаміці оперативного лікування не виявлено. Процент лізису клітин L-929 в даній групі хворих на гліоми III ступеня злоякісності теж був стабільно високим та складав відповідно в динаміці лікування 16,67±1,98% та 14,59±1,55%. У хворих на злоякісні гліоми IV