НАЦIОНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУK УКРАЇНИ

IНСТИТУТ МIКРОБIОЛОГIЇ І ВIРУСОЛОГIЇ iм. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

ТИМОШОК Наталія Олександрівна

УДК 578.245:616.03:612.112.3+579.24:615:33:636.2.035

АНТИБАКТЕРІАЛЬНА ЕФЕКТИВНІСТЬ ІНДУКТОРІВ ІНТЕРФЕРОНУ РІЗНОГО ПОХОДЖЕННЯ

03.00.07 — мiкробіологiя

А в т о р е ф е р а т

дисертацї на здобуття наукового ступеня

кандидата бiологiчних наук

К И Ї В — 2 0 0 2

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Iнституті мікробіології і вірусології

ім. Д.К.Заболотного НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Спiвак Микола

Якович, Iнститут мiкробiологiї і вірусології

iм.Д.К.Заболотного НАН України, завідувач

відділу проблем інтерферону та імуномодуляторів

Офіцйіні опоненти: доктор біологічних наук, професор Руденко Адель

Вікторівна, Інститут урології та нефрології

АМН України, завідувач лабораторії

мікробіології і вірусології;

доктор медичних наук Шапіро Анатолій

Веніамінович, Інститут епідеміології та

інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського

АМН України, головний науковий співробітник

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса

Шевченка, кафедра мікробіології та загальної

імунології, Міністерство освіти України, м.Київ

Захист вдбудеться “ 25 “ вересня 2002 р. о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного,154)

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, м. Київ, 03143, вул. Заболотного,154

Автореферат розісланий “ 1 ” серпня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останній час лiкарськi препарати інтерферонів (IФН), як природних, так і рекомбiнантних, успiшно використовуються в медичній та ветеринарнiй практицi, де їх застосовують для профiлактики та лiкування iнфекцiйних захворювань та пiдвищення iмунобiологiчної реактивностi організму. Показаннями для призначення імунотропних препаратів в комплексній терапії інфекцій, які викликані вірусно-бактеріальними асоціаціями є неефективність загальноприйнятих методів лікування, а також важкий перебіг захворювань та наявність ускладнень, що пов’язане з формуванням імунологічної недостатності клітинної та гуморальної ланки імунітету. Відомо, що несприятливий перебіг інфекційного захворювання призводить до супресії синтезу інтерферонів, що вказує на доцільність включення до комплексної терапії хворих препаратів ІФН або індукторів ІФН ( Єршов, 1996; Руденко та ін., 2000).

Індуктори ІФН - це препарати які здатні привести в дію власну інтерферон-продукуючу систему організму (Співак та ін., 1998). Можливість використання індукторів ІФН стала очевидною пiсля встановлення факту синтезу IФН практично усіма клітинами організму. Необхідно відзначити і ту обставину, що внаслідок перехрещення шляхів активації генів ІФН і цілого ряду цитокінів, індуктори ІФН стимулюють продукцію інших цитокінів, які відіграють важливу роль у регуляції імунореактивності організму. Тому, цілеспрямований науково обґрунтований пошук препаратів, які індукують ендогенний ІФН та мають виражену антиінфекційну дію і на сьогодні залишається надзвичайно актуальним.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає плану науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, виконувалась у відповідності з тематикою відділу проблем інтерферону та імуномодуляторів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, а також в межах Державної програми “Імунопрофілактика населення” на 1993-2000р.р. та за темами” Держ.N0196Г018119 "Вивчити вплив iнтерферону та його iндукторiв на формування імунозапальних процесів з метою розробки рекомендацій для установ охорони здоров'я".

Мета дослідження: Пошук нових індукторів інтерферону та вивчення їх антибактеріальної ефективності з метою використання в комплексній терапії вірусно-бактеріальних захворювань.

Для досягнення поставленої в роботі мети вирішувались такі задачі:

- вивчити in vitro та in vivo iнтерфероногенну здатнiсть нових iндукторiв IФН рослинного походження.

- визначити вплив стафілококової інфекції на показники неспецифічної резистентності організму. Порівняльно дослідити протективну дію інтерферону та його індукторів при стафілококовій інфекції.

- визначити змiни iнтерферонового статусу телят при шлунково-кишкових та респіраторних захворюваннях, а також в період адаптацiї тварин до нових умов утримання. Вивчити особливості функціонального стану системи ІФН, продукції фактора некрозу пухлин (ФНП) та фагоцитарної системи у телят при шлунково-кишкових захворюваннях.

- дослідити модулюючий вплив гомологічного ІФН і його індукторів на неспецифічну резистентність організму при експериментальній стафілококовій інфекції та шлунково-кишкових і респіраторних захворюваннях телят.

Об’єкт дослідження – неспецифічна резистентність організму при стафілококовій інфекції та вірусно-бактеріальних асоціаціях (шлунково-кишкових та респіраторних інфекціях) у тварин.

Предмет дослідження – роль інтерферону та його індукторів в неспецифічній резистентності при бактеріальних інфекціях.

Методи дослідження – бактеріологічні, вірусологічні, імунологічні та математичні.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше показано, що рослинний Лектин, отриманий з насіння бобiв, сорт Дайва, викликає in vitro та in vivo індукцію інтерферону ІІ типу. Порівняльно досліджена динаміка інтерфероногенної активності нових рослинних препаратів похiдних госиполу (Саврац, Рагосин, Кагоцел), та нового препарата МК (молекулярний комплекс дріжджова РНК та тилорон) in vitro та in vivo.

- вперше показано, що Саврац, Камізол та Лектин кормових бобів активують систему ПКК, фагоцитуючих клітин, стимулюють продукцію ФНП.

- встановлено протективний ефект гомологiчного IФН I типу та iндукторiв IФН Саврац і Камізол при експериментальній стафiлококовій інфекції у мишей. При цьому з’ясовані деякі механізми захисної дії гомологічного ІФН та його індукторів I та II типiв, які пов’язані з модулюючим впливом на ІФН статус, продукцію ФНП, систему фагоцитів та природні клітини кілери (ПКК).

- встановлено, що різниця в ступенi впливу препаратiв екзогенного гомологiчного IФН I типу та iндукторiв IФН I та II типів на поглинальну та кисень-залежну бактерицидну активність фагоцитуючих клiтин призводить до недостатнього впливу iндукторiв на елiмiнацiю персистуючих бактерiй з органiзму експериментальних тварин.

- вперше проведено комплексне вивчення iнтерферонового статусу телят, системи фагоцитів та продукції ФНП при шлунково-кишкових захворюваннях. Встановлені зміни інтерферонового статусу телят при респіраторних захворюваннях, а також в період адаптації тварин до нових умов утримання.

- експериментально підтверджено доцільність використання препарату Бовівiрекс та пробіотичних препаратів Біфідим та Бактерін-SL для підвищення неспецифічної резистентності новонароджених телят при шлунково-кишкових захворюваннях.

- досліджено циркадні коливання індукції ІФН в клітинах периферійної крові великої рогатої худоби.

Практичне значення одержаних результатів.

Отримані експериментальнi данi склали основу для цiлеспрямованного використання препаратiв IФН I типу та його індукторів у ветеринарнiй практицi для підвищення неспецифічної резистентності телят при шлунково-кишкових та респіраторних захворюваннях, а також в період адаптацiї тварин до нових умов утримання. Доведена доцiльнiсть використання IФН I типу та пробіотичних препаратів з метою активації системи імунітету новонароджених тварин. Порівняльне вивчення iндукторiв ІФН / та , а також їх вплив на систему природної резистентності, при пероральному застосуванні, вказує на доцiльнicть їх подальшого вивчення та впровадження в медичну та ветеринарну практику. Використання препаратів IФН та iндукторiв ІФН дозволяє підсилити імунобіологічну резистентність та підвищити продуктивність сільськогосподарських тварин.

Особистий внесок здобувача. Дослідження виконано з ініціативи автора та за її безпосередньою участю. Основний експериментальний матеріал одержано автором особисто. Літературний пошук, аналіз і узагальнення одержаних результатів, а також статистична обробка цифрового матеріалу виконана самостійно. Дослідження виконувалось у відділі проблем інтерферону та імуномодуляторів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. В оцінці iмуномодулюючого впливу препаратiв IФН I типу та iндукторiв I та II типів на неспецифічну резистентність органiзму при шлунково-кишкових та респіраторних захворюваннях телят, а також в період адаптації тварин до нових умов утримання приймав участь канд. вет. наук В.М. Зоценко (Білоцерківський державний аграрний університет). Автор висловлює йому глибоку подяку.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались та публікувались на конференції “Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологи и иммунологии инфекционных болезней”, Харків, 1993; на Мжнародному Конгресі молодих вчених, Івано-Франківськ, 1995; на V Національному з’їзді фармацевтів України “ Досягнення сучасної фармації та перспективи ії розвитку у новому тисячолітті”, Харків, 1999; на I -й міжвузівській науковій конференції молодих вчених і аспірантів “ Iнфекційна патологія молодняка сільсько-господарських тварин і птиці”. Суми 1999; на ІІ (IХ) з’їзді українського мікробіологічного товариства, Чернігів, 2000; на Всеукраїнської науково- практичній конференції молодих вчених: “ Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення”, Київ, 2000; на 22 nd Congress of the Czechoslovak Society for Microbiology with international participation on the topic of HEALTH AND MICROORGANISMS Universiy of Veterinary Medicine, Kosice, Slovakia, на міжнародній конференції “Біоресурси та віруси”, Київ, 2000; на международной научно-практической конференции “Новые технологии получения и применения биологически активных веществ” Алушта, 2002.

Частину результатів дисертації оформлено у вигляді роботи “Інтерфероногенні, антивірусні та імуномодулюючі властивості нових індукторів інтерферону І типу ”, яку відзначено премією для молодих учених НАН України за 1999 рік.

Публікації. Матерiали дисертацiйної роботи вiдображенi у 8 статтях в наукових журналах, 11 тезах, зроблено 6 доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Загальний обсяг роботи становить 164 сторінки машинописного тексту і складається із вступу, двох підрозділів огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, експериментальної частини, яка включає 5 розділів власних досліджень, з використанням 13 рисунків та 18 таблиць, висновків, списку літератури, який охоплює 400 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМIСТ РОБОТИ

Об’єкт та методи дослідження. Проведено скринінг біологічних властивостей нових індукторів ІФН різного походження:

- Саврац, Рогасин та Кагоцел (полiфенольних похiдних госиполу), які люб’язно наданi проф. Єршовим Ф.І. (Iнститут епiдемiологiї та мiкробiологiї ім . Н.Ф. Гамалеї РАМН Москва);

- Молекулярного комплексу (МК) - нового інтерфероногену, сконструйованого на базi вiдомих компонентів - дрiжджової РНК та тилорону (розроблений в ІМВ НАНУ);

- Камізолу - бромід 2,2,3,6-тетрагидро-6-феніл-7-карбамоілметлімідазо-2,1,6- тіазолія, який було синтезовано в Інститутi органiчної химiї НАН України м. Київ та надано д.х.н. Романовим М. М.;

- Лектину кормових бобів, виділеного в ІМВ НАНУ та надано д.б.н. Косенко Л.В., та стандартних індукторів ІФН;

-Ларифану (лікарняна форма препарату дсРНК бактеріофагу f2) виробництва Інституту мікробіології ім. А. Кірхенштейна, Латвія;

-poly(I)-poly(C) (“Calbiochem”, США). Як стандарт використовували:

- інтерферон мишей (лабораторний стандартний препарат) та офіційний препарат інтерферону людини:

- Лейкінферон (виробництва Інституту мікробіології і епідеміології ім. Н.Ф. Гамалеї РАМН).

При шлунково - кишкових захворювання телят використовували препарат:

- Бовівiрекс (IФН I типу великої рогатої худоби “Інтерветмед” ЛТД, Київ);

- Бiфiдим та Бактерін-SL пробіотичні препарати. Бiфiдим, являє собою суху масу антагонiстичних бiфiдобактерiй в сумiшi з аскорбiновою кислотою iмобiлiзованою на ентеросорбентi. Бактерін-SL - ліофілізована маса культур аеробних спороутворюючих бактерій Bacillus subtilis 3 та Bacillus licheniformis 31.

Вивчення інтерфероногенної активності досліджуваних індукторів ІФН проводили на безпородних мишах, та на мишах лiнiї CBA масою 16-18 г, яких одержували з вiварiїв IМВ, IМБiГ НАН України. Препарати вводили мишам перорально в дозах від 1 до 100 мг/кг.

Для ндукції нтерферону в умовах in vitro на моношар клтин чи в суспензю лейкоцитв людини вносили дослджуван нтерфероногени. Для ндукції ФНП в умовах in vitro під дією препаратів в суспензю перитонеальних макрофагів мишей (1х106 кл/мл) вносили дослдн препарати. В культуральному середовищ визначали рвень продукованого нтерферону (Єршов та інш., 1988, Кузнецов та інш., 1989), та ФНП. Для індукції синтезу ФНП використовували ліпополісахарід (ЛПС) Escherichia coli в кінцевій концентрації 2 мкг/мл (Meager et al., 1989).

Культури клітин: перевивні культури фiбробластiв мишей L-929, фiбробластiв людини L-41, клітини перевивної лiнії тестикулiв поросят (ПТП), версенизовані клітини ембріональної нирки свиней (СНЕВ), та первинні культури: лімфоїдні клітини мигдаликів хворих на тонзиліт людей, лейкоцити кров людини (0) і телят. Поживні середовища: 199, Iгла, RPMI-1640, в які вносили 10% прогрітої при 56 С на протязі 30 хв., ембріональної сироватки телят та по 100 од/мл пеніцілину і 100 мкг/мл стрептоміцину.

Віруси: вірус везикулярного стоматиту (ВВС), штам Індіана, отриманий з музею НДІ епідеміології і мікробіології ім. Н.Ф. Гамалеї (Москва), використовували для індикації ІФН. Вiрус хвороби Н’юкасла (ВХН, шт. Н) одержували на курячих ембрiонах та використовували для iндукцiї iнтерферону.

Бактерії: використовували культуру Staphylococcus aureus (музейні штами 209Р, 8325), Escherichia coli штам 08.

Модулювання стафiлококової iнфекцiї здiйснювали на мишах лiнiї CВА. Тварин заражали внутрішньочеревно введенням живої добової культури Staphylococcus aureus шт. 8325 /LD50/. Захисну дiю IФН та iндукторiв при експериментальній стафiлококовій iнфекцiї визначали за показником виживання інфікованих тварин та тривалiстю збереження мiкробiв в органiзмi на фонi попереднього введення дослідних препаратiв.

Активнiсть фагоцитозу (поглинальну здатність фагоцитів) вивчали у мiкроскопiчному тестi (Вихоть, 1981), з використанням тест- культури Staphylococcus aureus шт. 209Р. Визначали показник фагоцитозу (ПФ)- кiлькiсть фагоцитуючих клітин (%) на 100 пiдрахованих, та фагоцитарний iндекс (ФI) - середню кiлькiсть бактерiй, захоплених фагоцитом (ум.Од). Бактерицидну активність фагоцитів (%) вивчали у тесті відновлення тетразолію нітросинього (НСТ-тест) (Грачева, 1984). Активнiсть природних кiлерiв селезiнки мишей визначали у 18-годинному тестi мiкроцитотоксичностi проти клiтин-мiшеней L-929 (Кузовкова, 1991) .

У динаміці лікування було обстежено 50 телят раннього віку від 1 до 14 дiб господарства “Совки” Київської обл., у яких спостерігали шлунково- кишковi iнфекцiї. Для дослідження впливу ІФН на перебіг шлунково- кишкових захворювань телят використовували препарат Бовівiрекс, який вводили тваринам внутрім’язево двічі з інтервалом 3 доби в дозі 1000 МО/кг. Як лікувально-профілактичні засоби для телят використовували пробіотичні препарати Бiфiдим та Бактерін-SL. Профiлактичний курс включав випоювання пробiотиків з другою порцiєю молозива. Бiфiдим застосовували по 1 дозi 3 рази на добу протягом 3-5 дiб. Бактерін-SL випоювали по 1 дозі на добу протягом 3 діб. Контролем були телята, що отримували тiльки молозиво. Лiкувальний курс (друга серія експериментів) включав випоювання препарату Бiфiдим хворим тваринам по 5 доз 2 рази на добу до зникнення клiнiчних ознак дiареї. Бактерін-SL випоювали по 1 дозі на добу протягом 3 діб. Контрольнi тварини отримували тiльки молоко i мали ідентичні клiнiчнi ознаки захворювання. Крім цього, проведено дослідження інтерферонового статусу 89 телят чорно - білої породи віком 20-25 діб, які зазнали стресу (були перевезені в спеціалізоване господарство по дорощуванню молодняку великої рогатої худоби від господарств постачальників) та 40 телят віком 20-25 діб, у яких реєстрували гострі респіраторні захворювання (ГРЗ).

Виявлені порушення у системі ІФН (при стресі та ГРЗ) коригували препаратами Бовівірекс та Камізол. Тваринам внутрім’язево двічі з інтервалом 3 доби, вводили препарат Бовівірекс в дозі 1000 МО/кг маси і 100 МО/кг (перша і друга групи відповідно). Телята третьої групи отримували препарат Камізол, двічі з інтервалом 5 діб, підшкірно у дозі 0,1 мг/кг живої ваги. Телятам четвертої групи вводили фізіологичний розчин, яким розводили препарати.

Iнтерфероновий статус органiзму визначали за трьома основними показниками - а) рiвнем IФН у сироватцi кровi; б) здатнiстю iмуноцитiв в умовах in vitro cинтезувати IФН- у вiдповiдь на iндукцiю ВХН; в) здатнiстю iмуноцитiв в умовах in vitro синтезувати IФН- у вiдповiдь на iндукцiю фiтогемаглютинiном (ФГА). Активнiсть сироваткового i iндукованного IФН- та - визначали за стандартною методикою (Єршов, 1996). Активнiсть фактору некрозу пухлин (ФНП) оцінювали по цитотоксичнiй дiї на перевивний культурi фiбробластiв мишi L-929 (Meager et al., 1989).

Для оцінки достовірності різниць абсолютних значень середніх величин вираховували критерій t Стьюдента - Фішера. Різницю вважали достовірною при значенні Р<0,05 (Гублер, 1978; Стрелков, 1980). Отримані цифрові дані обробляли з використанням програм статистичної обробки для біологічних та медичних досліджень (Костюченко, 1987).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Детально дослiдженi iндукторнi властивостi препаратiв похідних госиполу Саврац, Рогасин, Кагоцел та нового препарату МК (молекулярний комплекс дрiжджова РНК та тилорон). Динаміка iндукцiї /-ІФН пiд впливом досліджуваних препаратiв, що вводились перорально, суттєво відрізнялась ( Рис.1).

Рис.1. Динаміка накопичення ІФН у сироватках крові мишей під впливом нових індукторів І типу.

Дослідження рівня ІФН у сироватці крові тварин, яким вводили поліфеноли рослинного походження показало, що Кагоцел та Рогасин стимулюють синтез “пізнього” ІФН, максимальний рівень якого визначається через 48-72 год. після індукції. При цьому, спостерігались відмінності у динаміці продукції сироваткового ІФН. Так, у відповідь на введення Рагосину у сироватці крові визначали 2 піки накопичення ІФН - через 6 та 48-72 години. При введенні препарату Саврац максимальний рівень ІФН (400 од/мл) у сироватці крові спостерігали через 48 год після індукції.

Препарат МК у порівнянні з Саврац, Кагоцел та Рогасин мав бiльш пролонгований iнтерфероногенний ефект. При цьому пiк продукцiї сироваткового IФН мав місце на першу добу пiсля введення МК. Досягнутий рiвень /-ІФН пiдтримувався ще 3-4 доби, повертаючись до вихiдного тiльки на 7 добу. Таким чином, за даними параметрами препарат МК виявився порівняний з полiрибонуклеїновими iндукторами (максимум продукцiї 1-2 доба, час дiї 3-4 доби).

Внаслідок проведених експериментів на мишах було встановлено, що парентеральне введення препарату Лектин кормових бобiв вело до утворення ендогенного ІФН. Лектин кормових бобів (не залежно від дози) при пероральному введенні продукції ІФН не викликав. В той же час внутрішньочеревне введення препарату в оптимальній дозі 2,5 мг/кг індукувало значну ІФН активність, пік продукції ІФН припадав на 72 год. та підтримувався на значному рівні на протязі 3 діб. В дослідах in vivo Камізол в дозі 0,5 мг/кг стимулював 2 піки накопичення IФН: через 24 та 72 години; досягнутий рiвень IФН (160 од/мл), повертався до вихідного тiльки на 7 добу досліду (Рис. 2).

Рис.2. Динаміка накопичення ІФН у сироватках крові мишей під впливом індукторів інтерфероногенезу ІІ типу.

Проведено порiвняльну оцінку досліджених iндукторiв /-ІФН в умовах in vitro на моделях культур: L-41, L-929, ПТП, СНЕВ, а також первинних культур лейкоцитiв кровi людини та телят, Лiмфоїдних клiтинах мигдаликів хворих на тонзилiт людей та спленоцитiв мишей. Такий вибiр культур був обумовлений тим, що данi культури потенцiйно можуть бути застосовані при промисловому виробництві препаратів ІФН. Показано, що у даних системах найбiльш активними інтерфероногенами, які стимулюють продукцію /-ІФН є препарати Саврац та МК: титри ІФН у культуральному середовищі досягають 40-80 од/мл. Індуктор ІФН- (Камізол) інтерфероногенної активності в культурі клітин не проявляв. Проте Лектин кормових бобів в дослідах in vitro проявляв значну інтерфероногенну активність. Найбільш активними продуцентами ІФН виявились спленоцити свиней при концентрації препарату 10 мкг/мл та інкубації 72 год., рівень ІФН у культуральному середовищі складав 420 од/мл.

Проведення скринінгу можливих індукторів ІФН виявило, що серед досліджуваних препаратів найбільш перспективними індукторами ІФН є Саврац, Камізол та Лектин кормових бобів. Тому в подальшому вивчали біологічні властивості саме цих індукторів порівняно з препаратами ІФН. З метою оптимізації схем використання Саврацу і Камізолу та можливості подолання стану гіпореактивності у відповідь на повторне введення індукторів було проведено серію експериментів, в яких показали, що Саврац можна повторно застосовувати на 7 добу, а Камізол на 5 добу після їх першого введення.

В дослідах in vitro встановлено, що гомологічний ІФН І типу в концентрації 100 МО/мл, а також препарати Саврац і Камізол у дозі 50 мкг/мл та Лектин кормових бобiв у дозі 10 мкг/мл підвищують функціональну активність МФПЕ інтактних мишей лінії СВА Так, ПФ фагоцитуючих клітин, які культивувались з гомологічним ІФН складала 70,11,8%, з Лектином кормових бобiв 80,8 3,5%, з Камізолом 66,21,8%, а з Саврац 62,83,5% в порівнянні з 52,3+2,4% для МФПЕ, не оброблених цими препаратами /Р<0,05/. Крім того, під дією ІФН та індукторів ІФН спостерігали посилення інтенсивності фагоцитуючої функції МФПЕ. Так, ФІ підвищується до 8,2 2,3 ум. од для МФПЕ /Р< 0,05/, оброблених ІФН та до 8,81,4 ум. од для МФПЕ, які обробляли Лектином /Р< 0,05/. Обробка Камізолом дозволяє підвищити ФІ до 7,31,4 ум. од /Р< 0,05/, а препаратом Саврац до 6,61,4 ум. од. /Р>0,05/ проти 5,71,5 ум. од у контролі. Досліджувані препарати підсилювали in vitro здатність МФПЕ інтактних мишей до відновлення нітросинього тетразолію. Так, ІФН І типу, Лектин, Камізол та Саврац підвищували киснево-залежну бактерицидну активність МФПЕ відповідно до 20,61,4%; 18,21,3%; 18,21,3% та 16,31,2% проти 121,3% контролі /P<0,05/.

Гомологічний ІФН І типу в концентрації 100 МО/мл, Саврац та Камізол у дозі 50 мкг/мл та Лектин кормових бобів у дозі 10 мкг/мл in vitro впливали на активність природних клітин-кілерів (ПКК) селезінки мишей лінії СВА. Так, ІФН та Камізол підвищували індекс ПКК до 602,3% /P<0,05/, Саврац – 561,3% /P<0,05/, а Лектин кормових бобів – 531,5% /P<0,05/, в той час як у контролі індекс цитотоксичності склав 401,2%. Крім цього було показано, що дані препарати здатні стимулювати ФНП in vitro. Так, у культуральному середовищі МФПЕ, оброблених Камізолом, Саврац та Лектином у дозi 25 мкг/мл, ФНП визначали відповідно: 3,21,1 нг/мл, 2,00,5 нг/мл та 2,00,5 нг/мл, порівняно з (0,150,02 нг/мл), для МФПЕ, які препаратами не оброблялись /Р<0,05/.

Антибактеріальну ефективність ІФН та його iндукторiв – Саврац, Камiзол визначали при експериментальній стафiлококовiй iнфекцiї. Було встановлено, що при зараженні мишей лiнiї СВА Staphylococcus aureus шт. 8325 (LD50) внутрішньочеревне введення препарату гомологічного ІФН одноразово за 24 год. до iнфiкування або через 24 год. пiсля зараження в дозi 1 х 1000 МО/мишу, або індукторів ІФН: Камiзол в дозi (0,5 мг/кг) та Саврац (10 мг/кг) двiчi - за 24 год. до зараження та через 24 год. пiсля iнфiкування пiдвищувало виживання тварин. Так, ІФН та Камізол забезпечували захист відповідно 100% та 80% дослідних тварин, тоді як Саврац-65%. Протективна активність досліджуваних препаратів супроводжувалась прискоренням елімінації стафілококів з нирок. При цьому, більш ефективно скорочували строки персистенції стафілококів в нирках мишей і зменшували кількість мікробів Камізол та гомологічний ІФН. Відомо, що фагоцитарна активність макрофагів, моноцитів (М) та нейтрофільних гранулоцитів (НГ) є першою лінію захисту організму при бактеріальних інфекціях (Білоцький,1983).

Рис.3. Вплив гомологічного інтерферону та його індукторів на

фагоцитарну (а) та бактерицидну (б) активність МФПЕ при

експериментальній стафілококовій інфекції

Показано що, захисна дія препаратів пов’язана з підвищенням функціональної активності фагоцитів, яка при стафілоковій інфекції пригнічувалась (Рис.3 а, б). Через 24 год. після введення ІФН або його індукторів значно зростала кількість клітин, які беруть участь у фагоцитозі та їх поглинальна здатність. Так, ПФ макрофагів тварин, що отримали Камiзол та Саврац зростав вже на 1 добу до 54,42,1% та 48,22,8 % /Р<0,05/ відповідно, в той час як у контрольно-нфкованих мишей вона складала 35,42,1%, що було практично вдвоє нижче вд показникв активності фагоцитозу нтактних тварин (62,22,2%). На 6 добу інфекційного процесу після введення дослідних препаратів фагоцитарна активність МФПЕ повністю нормалізувалась у всіх групах мишей. Проте індуктори ІФН недостатньо впливали на інтенсивність фагоцитуючої функцiї МФПЕ. Так, введення Камiзолу та Саврацу на 6 добу дозволило підвищити ФІ МФПЕ до 5,61,1 ум. од та 4,41,1 ум. од, в той час як у контрольно-інфікованих ФІ складав 1,51,1 ум. од /Р<0,05/. Але у інтактних тварин ФІ МФПЕ складав 7,81,0 ум. од, що свідчить про недостатній вплив індукторів ІФН на інтенсивність фагоцитозу МФПЕ інфікованих тварин. Бактерицидна активність МФПЕ у мишей, відновлювалась до контрольних показників вже через 3 доби після ін’єкції ІФН та через 6 діб після застосування індукторів ІФН (Рис.3 б).

Перебіг стафілококової інфекції зумовлює специфічну зміну показників ІФН- статусу організму (Таб.1).

Таблиця1

Вплив ІФН та його індукторів на показники IФН-статусу інфікованих мишей лiнiї СВА (LD50)

Групи тварин | Тип ІФН | Титри ІФН од/мл (М+m) в динаміці інфекційного процесу, доба

1 | 3 | 6

інфіковані | сироват | 9612,8* | 54,411,3* | 34,26,8*

-ІФН | 4,62,2* | 6,21,8* | 146,2*

-ІФН | 2,21,1* | 4,42,3* | 9,21,1*

інтактні | сироват | 2 | 2 | 2

-ІФН | 62,112,8 | 62,112,8 | 62,112,8

-ІФН | 34,26,8 | 34,26,8 | 34,26,8

інфіковані

+ ІФН | сироват | 29,38,2 | 6,21,8** | 8,24,2**

-ІФН | 146,2** | 246,2** | 49,411,3**

-ІФН | 4,62,2 | 16,21,1** | 34,26,8**

інфіковані

+Саврац | сироват | 34,26,8** | 29,38,2** | 19,68,2**

-ІФН | 9,21,1 | 16,24,2** | 18,24,2**

-ІФН | 4,62,2 | 9,21,1 | 14,21,1

інфіковані

+Камізол | сироват | 34,26,8** | 34,26,8** | 16,24,2**

-ІФН | 9,21,1 | 16,24,2** | 39,38,2**

-ІФН | 16,24,** | 18,24,** | 34,38,2**

Примітки: ( * ) - вірогідність різниці показників порівняно з інтактними мишами (P<0,05); ( ** )- вірогідність різниці показників в динаміці захворювання (P<0,05). Кількість мишей у групі 10.

Встановлено, що при стафілококовій інфекції змінювались показники ІФН- статусу організму. При цьому різке пригнічення здатності клітин периферичної крові до продукції ІФН - та - у відповідь адекватну індукцію поєднувалось із підвищенням рівня сироваткового ІФН. Введення гомологічного ІФН або індукторів ІФН Саврац та Камізол інфікованим мишам супроводжувалось нормалізацією показників ІФН-статусу на 6 добу досліду. Внаслідок перехрещення шляхів активації генів препарати Камізол та Саврац, крім продукції ІФН, здатні до стимуляції ФНП. Ці цитокіни модулюють функціональну активність фагоцитуючих клітин та опосередковують розвиток реакцій клітинного імунітету. При стафілококовій інфекції спостерігали підвищенні рівні циркулюючого ФНП, але продукція цитокіну у відповідь на стимуляцію ЛПС макрофагами різко знижена на протязі 6 діб. Порушення продукції ФНП при стафілококовій інфекції пов’язане, ймовірно, з пригніченням функціональної активності макрофагів. Внутрішньочеревне введення гомологічного ІФН та індукторів ІФН вже через одну добу сприяло підвищенню продукції ФНП макрофагами у відповідь на ЛПС.

Стафілококова інфекція обумовлює пригнічення активності природних клітин-кілерів. Так, індекс цитотоксичності ПКК на першу добу складав 131,2% в порівнянні з 482,3% ПКК інтактних тварин /Р<0,05/. Введення гомологічного ІФНу І типу, або індукторів ІФНу нормалізувало активність ПКК на 5 добу після введення препаратів.

Таким чином, при стафілококовій інфекції виявлено порушення процесів інтерфероногенезу та продукції ФНП. Можливо, це обумовлює дефіцит функціональної активності фагоцитуючих клітин та ПКК. Гомологічний ІФН І типу, поряд з індукторами ІФН, проявляли протективну дію при експериментальній стафілококовій інфекції та здатен коригувати імунологічні порушення, які виявлені у тварин під час перебігу інфекції. Оскільки, препарати Саврац та Камізол є індукторами ІФН, та здатні стимулювати продукцію ФНП, як встановлено нами in vitro та in vivo, можливо припустити, що їх захисна дія при стафілококовій інфекції опосередковується за рахунок індукції ендогенного ІФН та ФНП.

В наступній серії експериментів було досліджено вплив гомологічного ІФН на неспецифічну резистентність телят при шлунково-кишкових захворюваннях, викликаних кишковою паличкою в асоціації з вірусною інфекцією. Через 2-10 діб після народження у тварин відмічали діарею, дегідратацію організму, токсемію. В сироватці крові хворих встановлена сероконверсія ротавірусу. З фекалій виділяли ентеротоксигенні штами кишкової палочки 015, 026. Якщо захворювання виникало протягом перших 3-5 діб після народження, спостерігали легку форму хвороби (“рання діарея”), а при появі з 5 по14 день - більш тяжку (“пізня діарея”).

Встановлено, що при шлунково-кишкових захворюваннях, незалежно від форми перебігу захворювання, фонові або підвищені титри сироваткового ІФН поєднуються з різким пригніченням здатності лейкоцитів периферійної крові до продукції ІФН-, та особливо ІФН- in vitro, у відповідь на адекватну стимуляцію. При легкiй формi захворювання, тобто “рання дiарея” (І група) на 1 добу вiдмiчали вірогідне пiдвищення рiвня циркулюючого IФН до 24,21,0 од/мл /Р<0,01/ проти 4,41,1 од/мл у контролі. В той же час, спостерігали пригнічення - та - інтерфероногенної активності лейкоцитів. Так, здатність лейкоцитiв до продукцiї -IФН знизилась до 9,62,7 од/мл /P<0,01/ проти 32 од/мл 0,5 од/мл у контролі, а -IФН до 27,81,9 од/мл /P<0,01/ проти 64 од/мл 1,2 од/мл у здорових тварин. У випадку "пiзньої дiареї", яка характеризувалась тяжким перебiгом захворювання, вiдмiчали незначний рiвнь циркулюючого IФН до (4,61,0 од/мл) та пригнiчення здатностi клiтин до продукцiї - та - IФН. Так, рiвень продукції -IФН знизився до 20,21,6 од/мл /P<0,05/ проти 64 од/мл 1,2 од/мл у контролі, а -IФН до 6,02,2 од/мл /P<0,01/ проти 32 од/мл 0,5 од/мл у контролі. При шлунково-кишкових захворюваннях у телят, переважно з тяжким перебігом захворювання, спостерігали підвищення спонтанної продукції ФНП in vitro клітинами периферичної крові. В той же час ЛПС-індукована продукція ФНП in vitro була пригнічена порівняно з аналогічними показниками у здорових тварин. Слід зауважити, що виявлені порушення у системі цитокінів (порушення ІФН- статусу та продукції ФНП) у хворих телят свідчать про їх залучення у патогенез шлунково-кишкових захворювань.

Крім цього, при всіх формах прояву шлунково-кишкових захворювань спостерігали достеменне зниження функціональної активності моноцитів (М) та нейтрофільних гранулоцитів (НГ), в той же час відмічали неповну активацію поглинальної функції М та НГ. Так, поглинальна здатність НГ у телят з синдромом “пізня діарея” на 1 добу захворювання складала до 44,23,2% /Р<0,05/ у порівнянні з 57,22,17% у контролі; а М до 40,41,3% /Р<0,05/ проти 50,31,2% у контролі. У телят з тяжким перебiгом захворювання, тобто "пiзня дiарея", також відмічали пригнічення поглинальної функції клітин фагоцитарного ряду НГ: ПФ - 34,25,0%; контроль 57,22,17% /Р<0,05/; М: ПФ- 30,25,0%; контроль 50,31,2% /Р<0,05/. Наростання важкості перебігу захворювання призводило до зменшення показників ФІ. У телят з синдромом “рання діарея” ФІ М знижувався відповідно до 4,00,9 ум. од. /Р<0,05/, проти 5,21,2 ум. од. у контролі , а НГ до 3,380,9 ум. од. /Р<0,05/, проти 6,11,9 ум. од. у контролі. Синдром “пізня діарея” також характеризувався пригніченням поглинальної функції М та НГ: так ФІ М складав 3,90,5 ум. од. /Р<0,05/ проти 5,20,5 ум. од у контролі, а НГ- 3,70,8 ум. од /Р<0,05/ проти 6,10,3 ум. од у контролі.

У хворих тварин спостерігали підвищення кисенево-залежної бактерицидної активності М та НГ. Найбільш значні порушення встановлені у тварин з синдромом “пiзня діарея”. Так показники сп. НСТ- тесту досягали відповідно 18,54,4% /Р<0,05/ та 382,1% /Р<0,05/ проти 11,53,5% та 291,0% у контролі. Слід відмітити, що супресія системи ІФН та порушення продукції ФНП, поєднані з супресією у системі фагоцитів у телят із шлунково-кишковими захворюваннями, можуть бути однією з причин рецидивуючого перебігу запального процесу, що вказує на доцільність включення до комплексної терапії хворих телят препаратів ІФН або імунобіологічних препаратів (пробіотиків). Хворим тваринам застосовували Бовівірекс у дозі 1000 МО/кг. Препарат вводили двічі з інтервалом між ін’єкціями 72 год. Встановлено, що після проведення інтерферонотерапії (на 6 добу) у телят з синдромом “рання діарея” здатність лейкоцитів до продукції ІФН- та ІФН- в умовах in vitro відновлювалась до показників норми. У телят з синдромом “пізня діарея” після введення препарату Бовівірекс титри ІФН- та ІФН- також зростали, проте залишались нижчими за аналогічні показники у групі контрольних тварин. Так, у телят з синдромом “пізня діарея” після застосування препарату Бовівірекс показники ІФН- зростали до 50,21,0 од/мл /P<0,05/, проти 64,01,2 од/мл у здорових тварин, в той же час показники ІФН- зростали до 18,21,0 од/мл / P>0,05/, проти 32,01,2 од/мл у контролі.

Слід відмітити, що функціональна активність НГ та М крові телят, яким вводили Бовівірекс, підвищувалась. Так, у тварин з синдромом “пізня діарея” показники складали на 6 добу (М: ПФ-46,24,6%, ФІ-4,60,8 ум. од., НСТ-15,54,4%, НГ:ПФ-54,35,0%; ФІ-5,70,8 ум. од., НСТ-30,12,3%), а у телят з синдромом “рання діарея” (М: ПФ-48,44,6%, ФІ-4,80,8 ум. од., НСТ-11,34,4%, НГ:ПФ-56,34,2%; ФІ-6,380,8 ум. од., НСТ-26,02,3%) порівняно з активністю фагоцитів телят, які отримали тільки базисну терапію (М: ПФ-30,22,1%, ФІ-3,90,8 ум. од., НСТ-16,54,4%, НГ:ПФ-34,35,0%; ФІ-4,70,8 ум. од., НСТ-34,14,4%), але не досягала рівня здорових тварин (М: ПФ-50,34,6%, ФІ-5,20,8 ум. од., НСТ-11,53,5%, НГ:ПФ-57,25,0%; ФІ-6,10,8 ум. од., НСТ-29,11,3%). В той же час, незалежно від форми перебігу захворювання, спостерігали нормалізацію показників спонтанної продукції ФНП.

Проведене нами комплексне дослідження показників імунітету у телят із шлунково-кишковими захворюваннями дозволило виділити найбільш інформативні показники котрі дозволяють оцінити ефективність лікування: рівень сироваткового ІФН, спонтанна продукція ФНП, фагоцитарний індекс НГ, показники сп. НСТ-тесту НГ. Включення в комплекс протизапальної терапії імуномодулюючого препарату Бовівірекс сприяє нормалізації показників імунологічної реактивності телят, що веде до підвищення клінічної ефективності терапії.

Проте не сформована імунна система новонароджених телят при шлунково-кишкових захворюваннях не здатна адекватно відповідати на введення низькомолекулярних індукторів ІФН. Тому поряд з препаратами ІФН комплекс заходiв по профiлактицi та лiкуванню шлунково-кишкових захворювань новонароджених телят передбачає використання пробiотикiв - препаратiв живих бактерiй антагонiстiв. Показано, що препарати Біфідим та Бактерін-SL мають профілактичні властивості та підвищують імунний статус новонароджених тварин, стимулюють інтерфероногенез. Механiзм iнтерфероногенної активностi препаратів можна пояснити опосередкованою дiєю бiфiдобактерiй та бацилл на iмунокомпетентнi клiтини, а також їх антагонiстичними та детоксикацiйними властивостями. Все це зменшує iмунодепресивний вплив умовно-патогеної мiкрофлори на органiзм i дозволяє адекватно реагувати продукцією IФН у відповідь на стимуляцію.

Нами було досліджено вплив екзогенного гомологічного ІФН І типу препарату Бовівірекс на ІФН- статус телят в перші дні адаптації до нових умов утримання. Було встановлено, що в цей період спостерігається зниження природної резистентності організму тварин, що супроводжується виникненням гострих респіраторних захворювань (ГРЗ). З першого дня надходження телят в спеціалізоване господарство виявлено порушення ІФН-статусу організму телят (продукції -, - ІФН лейкоцитами периферійної крові та рівня циркулюючого в крові сироваткового ІФН). Критичним періодом в захворюваності тварин на ГРЗ є 3-5 доба, оскільки в цей період спостерігається максимальне зниження інтерферонсинтезуючої активності лейкоцитів. Препарати Бовівірекс та Камізол використовували як засоби, здатні підвищити імунобіологічну реактивність у тварин в перші, критичні дні періоду адаптації. Під час ін’єкції препаратів температура тіла, частота пульсу та дихальних рухів знаходилась в межах норми. Препарати Бовівірекс в дозах (100 МО/кг і 1000 МО/кг) та Камізол в дозі 0,1 мг/кг підвищують біологічну реактивність телят, покращуючи інтерферонсинтезуючу здатність клітин периферійної крові. Застосування вказаних препаратів дозволило скоротити кількість хворих тварин до 11 %, порівняно з 40% в групі тварин, яким вводили фізіологічний розчин.

Паралельно проведено дослідження ІФН - статусу телят при ГРЗ. Показано, що ГРЗ супроводжуються зниженням інтерферонсинтезуючої активності лейкоцитів периферійної крові. Це веде до порушення неспецифічної противірусної резистентності. Встановлено, що перебіг ГРЗ корелює з інтерфероновим статусом організму. Найвища активність процесів інтерфероноутворення спостерігається у телят з легким проявом захворювання. Слід відмітити, що порушення інтерфероногенезу при ГРЗ у телят спостерігали на протязі 60 діб. Для підвищення імунобіологічної реактивності телят застосовували препарати Бовівірекс в дозах (100 МО/кг і 1000 МО/кг) та Камізол в дозі 0,1 мг/кг. Після застосування даних препаратів спостерігали підсилення інтерфероногенезу. Так, на другу добу після введення Бовівірексу в дозі 1000 МО/кг та Камізолу здатність лейкоцитів периферійної крові до продукції -ІФН зросла до 16,21,5 од/мл /Р<0,05/ та 12,41,6 од/мл /Р<0,05/ проти 6,80,5 од/мл у групі тварин, яким препарати не вводили. Але повне відновлення показників ІФН- статусу після введення препаратів спостерігали тільки через 60 діб. Встановлено, що під впливом Бовівірексу та Камізолу спостерігали більш високі темпи росту телят, які можуть бути пояснені більш високою стійкістю організму проти патогенної мікрофлори оточуючого середовища. Більш висока збереженість телят та швидкість їх росту вказують на те, що використання Бовівірексу та Камізолу може ефективно доповнити загальноприйняті методи лікування і профілактики ГРЗ телят.

Для визначення оптимального часу впливу на ту чи iншу ланку імунітету нами проведено вивчення добових коливань системи ІФН у великої рогатої худоби. Показано, що IФН в сироватцi кровi був присутнiй на фоновому рiвнi (2-16 од/мл) у 14-28 % тварин незалежно вiд вiку. Наявнiсть низьких концентрацiй сироваткового IФНу можна пояснити фiзiологiчною функцією IФН, низькі концентрацiї якого продукуються спонтанно i дiють як природний бар'єр для патогених збудникiв. Нами вивчені циркадні коливання індукції ІФН в клітинах периферійної крові різних вікових груп великої рогатої худоби. Найвища інтерферонпродукуюча активність у відповідь на адекватну стимуляцію була зафіксована о 20 і 24 год, а найменша о 8 год. Рiзниця мiж показниками в цi години була достовiрною, незалежно вiд вiку тварин. Тобто здатність до iндукцiї IФН бiльш виражена у вечірні години. Можливо це пов’язано із зменшенням гемодинамічних процесiв i сповільненням мiграцiї iмунокомпетентних клiтин в нiчнi години. Таким чином, можна дiйти висновку, що iнтерфероновий статус у великої рогатої худоби має виражену циркадну організацію. За результатами досліджень показано, що імуномодулюючі препарати доцільно застосовувати