Академія медичних наук України

Інститут фармакології та токсикології

Бухтіярова Ніна Вікторівна

УДК 615.272.4.014.425:544.792+547.856

Пошук речовин з антирадикальною і

антиперекисною активністю серед похідних

хіназолону-4 та 4-амінохіназоліну

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі фармакології Запорізького державного медичного університету МОЗ України

Науковий керівник: Заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Дунаєв Віктор Володимирович, Запорізький державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фармакології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Мохорт Микола Антонович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач відділу фармакології серцево-судинних засобів

доктор медичних наук, професор Степанюк Георгій Іванович, Вінницький національний медичний університет ім. М.І. Пирогова МОЗ України, завідувач кафедри фармакології

Провідна установа: Одеський державний медичний університет МОЗ України, кафедра фармакології

Захист відбудеться “ 19_” _листопада_ _ 2003 року о _13-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 в Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Пот'є, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Пот'є, 14.

Автореферат розісланий “_16_” ___листопада______2003 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

Д 26.550.01

кандидат біологічних наук І.В.Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. В останні роки все більше привертають увагу фармакологів такі поняття, як антиоксиданти, антиоксидантна дія ліків, ліки-антиоксиданти (Ю.І. Губський та ін., 1998; М.В. Биленко, 1989). І це не випадково, як показали дослідження останніх років: більшість розповсюджених захворювань людини, зокрема патології серцево-судинної системи, дихальних шляхів, злоякісні новоутворення та ін. у своєму патогенезі мають достатньо чітко виражену вільнорадикальну фазу (А.Л. Базилевич, 1996; Є.Л. Левицький та ін., 1993; В.А. Малахов та ін., 2001; Cao W. Et al., 1998).

Утворення надлишкової кількості високореакційних радикалів (супероксиданіон-, гідроксилрадикал тощо) викликає окисну модифікацію ліпідів, білків, нуклеїнових кислот і, як наслідок, приводить до деструкції мембран і загибелі клітин [Ю.І. Губський та ін., 2000; В.Л. Козловський, 1990; J.D. Adams et al, 1991).

Здатність антиоксидантів інгібувати вільнорадикальне окиснення (ВРО), стабілізувати структуру і функції клітинних мембран, і завдяки цьому створювати оптимальні умови для гомеостазу клітин і тканин, дає патогенетичне обґрунтування до застосування їх в кардіологічній, неврологічній, офтальмологічній, геронтологічній практиці для профілактики та лікування атеросклерозу, гепатиту, інфаркту міокарда, мозкових інсультів тощо (А.А. Болдырев, 2000; Веселинський І.Ш. та ін., 1997; Ю.И. Губский и др., 1993).

На сьогоднішній день у клінічній практиці знайшли застосування такі антиоксиданти як емоксипін, мексидол, дибунол, похідні -токоферолу, тіотриазолін, ліпін та ін. (В.В. Дунаєв та ін., 2002; Г.Г. Коновалова и др., 2000; И.А. Мазур и др., 2002). Однак, незважаючи на застосування у клінічній практиці як класичних антиоксидантів, так і препаратів, що проявляють антиоксидантну дію, вибір засобів антиоксидантної терапії обмежений внаслідок їх недостатньої ефективності та наявності побічних дій (Д. Кригер, 1998). Тому пошук нових високоефективних антиоксидантних засобів, що діють на ініціальних етапах ВРО, а також засобів, що реактивують антиоксидантну систему та гальмують основні шляхи утворення вільних форм кисню, є актуальною задачею сучасної фармакології.

Достатньо перспективними у цьому плані є похідні хіназоліну, що мають широкий спектр біологічної активності, зокрема антиоксидантну (Р.С. Синяк и др., 1986; И.А. Мазур и др., 1988; В.В. Дунаєв та ін., 2002). Дослідженнями співробітників Запорізького державного медичного університету і Національного фармацевтичного університету (м. Харків) виявлена антиоксидантна активність серед похідних 4-амінохіназоліну.

Насьогодні антиоксидантна активність у ряду N-(4-хіназоліл)-аміноалкіл(арил)карбонових і 2-R2-6-R3-8-R4-(3H)-хіназолон-4-іл-3-()-алкілкарбонових кислот та їх водорозчинних солей не вивчена.

Вищенаведене обумовлює перспективність пошуку речовин з антиоксидантною дією серед похідних хіназоліну.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлена дисертаційна робота виконана як фрагмент планових науково-дослідних робіт кафедр фармацевтичної хімії та фармакології Запорізького державного медичного університету “Синтез нових функціональних заміщених п'яти-, шестичлених моно- і анельованих азагетероциклічних систем та їх біологічна активність” (№ державної реєстрації 0196 U 13916, шифр ІН 15.00.05.96) та " Цілеспрямований пошук біологічно активних речовин у ряду п'яти- і шестичлених азагетероциклів та створення на їх основі лікарських препаратів" (№ державної реєстрації 0102 U 002863, шифр ІН 15.00.02.01).

Мета і задачі дослідження. На основі скринінгових досліджень встановити наявність антиоксидантної дії похідних хіназоліну та виявити найбільш активні сполуки.

Згідно з метою дослідження вирішувалися наступні задачі:

1.

2.

3.

4.

Обєкт дослідження. Білі щури та собаки з ішемією головного мозку, тканини головного мозку, кров щурів та собак.

Предмет дослідження. Антиоксидантні і нейропротективні властивості у ряду N-(4-хіназоліл)аміноалкілкарбонових кислот, N-(4-хіназоліл)аміно-арилкарбонових кислот, 2-R2-6-R3-8-R4-(3H)-хіназолон-4-іл-3-()-алкілкар-бонових кислот та їх солей.

Методи дослідження. Фармакологічні, біохімічні, токсикологічні та статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше отримані дані про антиоксидантну активність похідних N-(4-хіназоліл)аміноалкіл(арил)-карбонових кислот, 2-R2-6-R3-8-R4-(3H)-хіназолон-4-іл-3-()-алкілкарбоно-вих кислот. В дослідах in vitro встановлено, що із 42 сполук 5 речовин виявляють антиоксидантну активність і по ступені зниження МДА та супероксидрадикалу перевищують еталонні антиоксиданти (дибунол, -токоферол, метіонін та сечовину), а моноетаноламонієва сіль 6-нітро-(3Н)-хінолон-4-іл-3-оцтової кислоти ("Нітрокол") проявляє найбільш високу антиоксидантну дію.

В дослідах in vivo на моделі ішемії головного мозку підтверджена наявність антиоксидантної дії моноетаноламонієвої солі 6-нітро-(3Н)-хінолон-4-іл-3-оцтової кислоти. Вперше показано що механізм цієї сполуки пов'язаний із здатністю інігбувати активні форми кисню та реактивувати антиоксидантні ферменти. Виявлено що за високу антиоксиданту дію цієї сполуки відповідає наявність нітро- та карбоксиметильної групи в структурі її молекули.

Практичне значення отриманих результатів. Моноетаноламонієва сіль 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти проявляє виражену антиоксидантну та нейропротективну активність яка по силі дії перевищує відомі фармакологічні аналоги (пірацетам, дибунол).

Одержані результати свідчять про перспективність створення на основі вказаної сполуки нового нейропротективного препарату з антиоксидантним механізмом дії.

Результати дисертаційної роботи використовуються в наукових дослідженнях і навчальному процесі кафедр фармакології Дніпропетровської державної медичної академії, Запорізького державного медичного університету, Національного Львівського національного державного медичного університету ім. Данила Галицького, Кримського державного медичного університету ім. Георгієвського.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведений патентно-інформаційний пошук, аналіз наукової літератури за даною темою, визначені мета і задачі дослідження, освоєні і відтворені моделі гострого порушення мозкового кровообігу на тваринах.

Самостійно проведено пошук речовин з антиоксидантною активністю серед 42 сполук похідних хіназолона-4 і 4-амінохіназоліна in vitro на трьох моделях ініціювання ВРО.

Виконано статистичну обробку отриманих результатів, проведено аналіз результатів, сформульовані висновки роботи, опубліковані основні положення дисертації, оформлення дисертаційної роботи та автореферату виконано дисертантом самостійно.

Апробація роботи. Основні фрагменти результатів дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на XIV з'їзді фізіологів України (м. Київ, 1994), I конгресі Всесвітньої федерації Українських фармацевтичних товариств (м. Львів, 1994), V Національному з'їзді фармацевтів України (м. Харків, 1995), Всеукраїнській науково-практичній конференції "Вчені України – вітчизняній фармації" (м. Харків, 2000), III Національному конгресі геронтологів і геріатрів України (м. Київ, 2000), II Національному з'їзді фармакологів України (м. Дніпропетровськ, 2001), IV з'їзді гематологів і трансфузіологів України (м. Київ, 2001), XVI з'їзді фізіологів України (м. Вінниця, 2002), III Міжнародній науково-практичній конференції "Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія" (Харків, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 робіт, що повною мірою відображають її зміст, з них 8 статей (1 – самостійно) у наукових фахових виданнях, 4 тез у матеріалах з'їздів, конгресів, науково-практичних конференцій різних рівнів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 137 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, двох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та списку літератури, який містить 232 літературних джерела, з них вітчизняних – 121, іноземних – 112. Роботу ілюструють 25 таблиць, 5 рисунків.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень. Досліди виконані на 800 білих щурах лінії Вістар масою 220-260 г та на 10 безпорідних собаках вагою 10-20 кг.

Оцінку антиоксидантної активності нових синтезованих сполук проводили у два етапи: в дослідах in vitro (метод ферментативного ініціювання ВРО, метод неферментативного ініціювання ВРО, метод оцінки по інгібуванню активної форми кисню – супероксидрадикалу) та на моделях експериментальної патології.

Ферментативне ініціювання проводили шляхом додавання надлишку НАДФ.Н2 до гомогенних тканин мозку білих щурів. АОА оцінювали по рівню зниження кінцевого продукту ВРО – МДА в гомогенатах (Л.И. Андреева и др., 1998; Ю.І. Губський та ін., 2001). Неферментативне ініціювання моделювали шляхом додавання солей двовалентного заліза до суспензії ліпопротеїдів курячого яйця (Г.И. Клебанов Г.И. и др., 1999; Ю.І. Губський та ін., 2001). Антиоксидантну активність сполук по інгібуванню супероксидрадикалу виявили в реакції аутоокислення адреналіну в адренохром у лужному середовищі (Ю.І. Губський та ін., 2001).

Експериментальну патологію відтворювали на моделях загальноприйнятих гострих порушень мозкового кровообігу (ГПМК) – одно і двобічної перев’язки загальної сонної артерії та введення аутокрові, взятої із хвостової вени щурів та стегнової вени собак в область внутрішньої капсули головного мозку (Б.Б. Иринханов и др., 1989; А.Н. Макаренко и др., 1998). Гостру ішемію та реперфузію головного мозку моделювали шляхом тимчасового виключення кровообігу по брахіоцефальним артеріям після накладання (30 хвилин) та зняття лігатури (С.А. Шалимов и др., 1989).

Тварини виводились з експерименту в ранковий час під нембуталовим наркозом (40,0 мг/кг для щурів, 30,0 мг/кг для собак). Після досягнення глибокого наркозу розтиналась передня стінка живота і черевна порожнина, і після введення голки в район біфуркації аорти проводився забір крові. У тварин з експериментальною ішемію головного мозку швидко розкривалась черепна коробка, після чого видаляли ішемізовану півкулю і заморожували в рідкому азоті.

Для біохімічних досліджень тканини гомогенізувалися в сольовому ізотонічному розчині (0,15 М KCl) при охолодженні (до +4С) за допомогою скляного гомогенізатора в співвідношенні 1:40. Після виділення ядер i незруйнованих клітин (1000g), методом диференційного центрофугування (15000g) виділялася цитозольна фракція (М.И. Прохорова, 1982).

Екстракцію ліпідів проводили за методом Кейтса (Р. Кейтс, 1974). Безбілковий екстракт одержували додаванням точної наважки гомогенату тканини в хлорну кислоту (0,6 М), з наступною нейтралізацією 5,0 М К2СО3 (М.И. Прохорова, 1982).

Для оцінки інтенсивності вільнорадикального окислення в плазмі крові та тканинах головного мозку визначали початкові та кінцеві продукти ВРО – дієнові кон’югати (ДК), триєнкетони (ТК), малоновий діальдегід (МДА) відповідно до загальноприйнятих методів (М.В. Биленко, 1989; Л.И. Андреева и др., 1988; Р. Кейтс 1974; В.С. Коган и др., 1986). Стан антиоксидантної системи оцінювали по активності супероксиддисмутази (СОД), каталази, глутатіонпероксидази (ГПР) та рівню ?-токоферолу в тканинах головного мозку (А.Р. Гаврилова, 1986; М.А. Королюк и др., 1988; С. Чевари, 1988; І.М. Rapola, 1998). Стан вуглеводно-енергетичного обміну визначали по рівню найбільш важливих інтермедіатів – АТФ, АДФ, АМФ, лактату, пірувату, малату (В.В. Зінчук, 1999; В.В. Меншиков и др., 1987; М.И. Прохорова, 1982). Для оцінки ішемічного пошкодження тканин головного мозку визначали рівень гіперферментемії церебрального ізоензиму креатинфосфокінази (ВВ-КФК) (Г.А. Яровая и др., 1982).

Досліджувались такі препарати: пірацетам в дозі 250 мг/кг, дибунол – 50 мг/кг, ?-токоферол – 50 мг/кг, моноетаноламонієва сіль 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти (“Нітрокол”) – 50 мг/кг, 42 нові сполуки – похідні хіназоліну різних хімічних структур, синтезовані на кафедрі фармацевтичної хімії Запорізького державного медичного університету.

Препарати вводили щурам внутрішньоочеревинно (пірацетам, “Нітро-кол”) та per os (?-токоферол, дибунол), собакам внутрішньовенно (пірацетам, “Нітрокол”) та підшкірно (дибунол) в лікувальному режимі протягом 4 діб протягом експерименту. Синтезовані сполуки в дослідах in vitro вводили в систему в кількості, кратній їх молекулярним масам.

Отримані данні піддавались статистичній обробці згідно з методом варіаційної статистики із використанням t-критерію Ст’юдента.

Результати дослідження та їх обговорення

Пошук антиоксидантної активності проводили серед 42 сполук, які мають наступну хімічну структуру: N-(4-хіназоліл)аміноалкілкарбонові кислоти (1.1-1.4), N-(4-хіназоліл)аміноарилкарбонові кислоти (2.1-2.5), 2-R2-6-R3-8-R4-3(Н)-хіназолон-4іл-3-?(в)-?арбонові кислоти (3.1-3.9), солі N-(4-хіназоліл)аміноарилкарбонових кислот (4.1-4.18), солі 2-R2-6-R3-8-R4-3(Н)-хіназолон-4-іл-3-?(в)-?арбонових кислот (5.1-5.6, схема 1).

Скринінгові дослідження in vitro показали, що при ферментативному ініціюванні ВРО більшість вивчених сполук виявляють АОА. Так, N-(4-хіназоліл)аміноалкілкарбонові кислоти (1.1, 1.2, 1.3, 1.4) проявляють прооксиданту активність (1.1,1.2, 1.4) і лише деякі з них АОА (1.3).

Заміна в положенні 4 хіназолінового циклу аміноалкільного радикалу на аміноарильний і одержання відповідних N-(4-хіназоліл)аміноарилкарбоно-вих кислот приводить до збільшення АОА при ферментативному ініціюванні ВРО in vitro. Так, проведені дослідження in vitro серед N-(4-хіназоліл)аміноарилкарбонових кислот показали, що всі сполуки (2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5) проявляють АОА. Cила антиоксидантної дії в цьому ряді сполук залежить від розташування замісника в фенільному залишку. Так, наявність карбоксилу в мета- та пара-положенні фенільного залишку приводить до посилення АОА в умовах ферментативного ініціювання ВРО у сполук (2.2, 2.3). Введення метиленової групи між пара-карбоксифенільним радикалом і 4-амінохіназоліном приводить до зниження АОА (2.4), а заміна атому водню в орто-положенні пара-карбоксильного радикалу на гідроксигруппу (2.5) приводить до посилення АОА.

Пошук речовин з АОА серед 2-R2-6-R3-8-R4-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-?(в)-?арбонових кислот при ферментативному ініціюванні ПОЛ показав, що всі 9 сполук проявляють АОА, яка по силі дії дорівнює або перевищує еталонну. АОА залежить від характеру карбоксилу в положенні 3 хіназолінового циклу. Найбільшу активність мають сполуки, які містять залишки оцтової та пропіонової кислоти. Так, введення залишку оцтової кислоти і одержання відповідної (3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти (3.1) приводить до появи АОА, яка порівняна по силі з активністю унітіолу.

Модифікація досліджених сполук введенням радикалів в положення 2, 6 і 8 хіназоліну також впливає на значення АОА. Так, введення, метильної групи в положення 2 хіназолону-4 і одержання 2-метил-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти посилює АОА, а введення в положення 6 нитрогрупи приводить до появи найбільш високої АОА в цьому ряді сполук (3.6). Бромування (3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти приводить до деякого підвищення АОА у відповідної 6,8-дибром-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти (3.9).

Схема 1

В результаті дослідження нами були відібрані N-(4-хіназоліл)-аміноарилкарбонові кислоти (2.2, 2.3, 2.5) і дві 2-R2-6-R3-8-R4-(3Н)-хіназо-лон-4-іл-3-карбонові кислоти (3.1, 3.6), які мають найбільш високу АОА при ферментативному ініціюванні ВРО і достовірно (р0,05) перевищує дію унітіолу та метіонину. З метою підвищення АОА нами були одержані водорозчинні солі цих кислот (4.1-4.18; 5.1-5.6). Дослідженями серед солей цих кислот показано, що всі одержані сполуки проявляють АОА, яка по силі дії перевищує активність як еталонів порівняння (унітіол), так і АОА відповідних кислот. Так, найбільшу АОА проявляють натрієва, моноетаноламонієва, морфолінієва солі цих кислот.

Дослідженнями in vitro при неферментативному ініціюванні ВРО було виявлено, що N-(4-хіназоліл)аміноалкілкарбонові кислоти проявляють низьку АОА або прооксидантну дію. Введення в положення 4 хіназолінового циклу аміноарилкарбоксильної групи приводить до помітного підвищення АОА, причому у всіх сполук АОА перевищує ?-токоферол. Сила АОА залежить від розташування карбоксильної групи у фенильній субституенті і максимальна при її розташуванні в мета- і пара-положенні.

Дослідження в ряді 2-R2-6-R3-8-R4-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-карбонових кислот показали, що всі сполуки (3.1-3.9) проявляють АОА і по силі дії перевищують активність дибунолу і ?-токоферолу. Сила АОА в цьому ряді залежить від характеру карбоксиалкільної групи у положенні 4 хіназоліну. Найбільша АОА виявлена у речовин, які мають залишок оцтової кислоти. Модифікація сполук введенням замісників в хіназолінове кільце також приводить до зміни АОА, яка найбільша при введення нітро-групи в положення 6.

Для подальшого пошуку речовин, які б проявляли більш високу АОА нами були досліджені водорозчинні солі найбільш активних кислот (2.1, 2.2, 2.3, 3.5, 3.1, 3.6). Солі 2-[N-(хіназоліл-4’)]-амінобензойної кислоти проявляють більш високу АОА ніж сама кислота і еталони порівняння (дибунол, ?-токоферол). Найбільшу активність виявляє натрієва і метиламонієва солі.

Скриніг АОА серед солей N-(4-хіназоліл)аминосаліцилової кислоти показав перспективність подальших досліджень АОА в цьому ряді. Всі досліджені сполуки (4.14-4.18) проявляють високу АОА, яка по силі дії перевищує або порівняна з активністю дибунола і ?-токоферола. Серед солей 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти виявлено також декілька сполук, активність яка перевищує таку еталонів порівняння. Це натрієва (5.1) та моноетаноламонієва (5.2) солі (3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти.

Дослідження in vitro по інгібуванню супероксидрадикалу серед N-(4-хіназоліл)аміноалкілкарбонових кислот показали, що у цих сполук зникає прооксидантний ефект. Серед 4-хіназоліламіноарилкарбонових кислот найбільшу АОА проявляють сполуки, в яких є залишки амінобензойної і аміносаліцилових кислот. 2-R2-6-R3-8-R4-(3Н)-хіназолон-4іл-3-?(в)-?арбонові кислоти також виявляють значну АОА на цій моделі.

В умовах моделі ініціювання супероксидного радикалу нами був проведений також пошук речовин з антиоксидантною активністю серед водорозчинних солей найбільш активних кислот (2.2, 2.3, 2.5, 3.1, 3.6). В результаті дослідження було виявлено, що всі солі 2-[N-(хіназоліл-4’)]амінобензойної кислоти проявляють АОА. Так, активність натрієвої (4.1) та метиламонієвої (4.3) солей цієї кислоти можна порівняти з АОА сечовини. По здатності інгібувати утворення супероксидрадикалу в дослідах in vitro найбільш активними виявились моноетаноламонієва і натрієва солі 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти.

Порівнюючи результати фармакологічного скринінгу у досліджених рядах сполук на трьох моделях ініціювання вільнорадикальних процесів in vitro, а також фізико-хімічні властивості даних сполук, нами було відібрано 5 сполук для подальшого вивчення їх активності в умовах модельної патології. Це натрієва сіль 2-[N-(хіназоліл-4’)]амінобензойної кислоти (4.1), моноетиламонієва сіль (4.10), монопропіламонієва сіль 4-[N-(хіназоліл-4’)]аміно-саліцилової кислоти (4.17), моноетаноламонієва сіль (3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти (5.2) і моноетаноламонієва (5.5) сіль 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти.

При вивченні гострої токсичності було встановлено, що сполуки 4.1, 4.10, 4.17, 5.2, 5.5 відносяться до класу малотоксичних і практично нетоксичних речовин при внутрішньоочеревинному введенні щурам (ЛД50 280-2800 мг/кг).

Дані сполуки були досліджені в умовах моделювання експериментального ГПМК, яке відтворювали однобічною перев’язкою загальної сонної артерії. Дана модель ГПМК характеризується типовими біохімічними змінами – активацією процесу гліколізу, гальмуванням активності реакцій в циклі Кребса, зміною фонду макроергічних фосфатів, пригніченням активності антиоксидантних ферментів і зниженням рівня ендогенних антиоксидантів, підвищенням активності реакцій ВРПО, вираженою гіперферментемією, що відповідає клініко-біохімічним змінам, що спостерігаються в хворих з ішемічними інсультами (В.В. Дунаєв та ін., 2001, Б.Б. Іринханов, 1989).

Експериментальні дослідження показали, що похідні хіназоліну (4.1, 4.10, 4.17, 5.2, 5.5) виявляють високу АОА в умовах експериментальної ішемії головного мозку, при цьому всі сполуки по силі антиоксидантної дії перевищують ефективність як ?-токоферолу, так і дибунолу. Курсове призначення тваринам з експериментальним ГПМК в гострий період досліджуваних сполук приводило до значної реактивації ферментів антиоксидантного захисту і гальмуванню активності ВРО в ішемізованій тканині головного мозку. АО ефект даних сполук реалізувався на ініціальних етапах ВРО за рахунок реактивації антиоксидантних ферментів (СОД, каталази, глутатіонпероксидази) і захисту ендогенного фонду ?-токоферолу, що вигідно відрізняє їх від стандартних антиоксидантів – дибунолу, вітаміну Е. Найбільшу активність мають сполуки 5.5, 5.2 і 4.17. В основі механізму антиоксидантної дії даних сполук лежить їх здатність інгібіювати активні форми кисню, а саме супероксидрадикалу, за рахунок відновлювальних властивостей нітрогрупи, а також за рахунок гальмування основних шляхів утворення активних форм кисню і ліпідних радикалів, завдяки нормалізації порушення окремих ланок метаболізму при ішемії. Так, сполуки 5.5, 5.2, 4.17 сприяли нормалізації деяких показників вуглеводно-енергетичного обміну. Так, сполуки 5.5 і 5.2, що є моноетиламонієвою і натрієвою солями 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти збільшують енергетичний потенціал клітин мозку за рахунок інтенсифікації аеробних і компенсаторно-анаеробних шляхів окислення. При цьому сполуки 5.5 і 5.2 збільшують вміст АТФ на фоні збільшення його попередника АДФ і зниження АМФ, який виявляє прооксидантну дію. Сполука 4.17 (моноетаноламонієва сіль 4-N-(хіназоліл)аміносаліцилової кислоти збільшує утворення АТФ тільки за рахунок активації аеробного окислення. Всі досліджувані сполуки мають значний церебропротективний ефект, про що свідчить зниження гіперферментемії ВВ-КФК. Причому всі сполуки по силі дії перевищували пірацетам (р0,05).

Порівнявнюючи антиоксидантну і протиішемічну дію в умовах експериментального порушення мозкового кровообігу досліджуваних сполук і референс-препаратів (пірацетам, дибунол, ?-токоферолу ацетат) нами було відібрано моноетаноламонієву сіль 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти (5.5) для подальших поглибленних досліджень.

Дослідження показали, що найбільш ефективною дозою для сполуки 5.5 (робоча назва "Нітрокол") при внутрішньоочеревинному введенні щурам з однобічною перев'язкою загальних сонних артерій і внутрішньомозковим крововиливом є доза 50 мг/кг.

Курсове призначення нітроколу в дозі 50 мг/кг щурам з одно- і двобічною перев'язкою загальних сонних артерій і внутрішньомозковим крововиливом приводило до нормалізації неврологічного статусу (тремор кінцівок, гіпертонус м'язів, рухова активність) і підвищувало виживаність у всіх експериментальних групах. Так, у групі тварин з одно- і двобічною перев'язкою загальних сонних артерій виживаність підвищилася на 40% і 50% відповідно до контролю (р0,05), а в групах тварин, що одержували пірацетам виживаність підвищилася на 20% відносно контролю. При призначенні нітроколу тваринам з внутрішньомозковим крововиливом виживаність підвищувалася на 40% (р0,05), а при призначенні пірацетама – на 20% відносно контролю.

Курсове призначення нітроколу протягом 4 діб тваринам з одно- і двобічною перев'язкою загальних сонних артерій і внутрішньомозковим крововиливом приводило до гальмування реакцій ВРО, реактивації антиоксидантної системи захисту, нормалізації систем біоенергетики в тканинах мозку і зниженню гіперферментемії ВВ-КФК. Так, при введенні нітроколу тваринам з одно- і двобічною перев'язкою загальних сонних артерій рівень АТФ підвищувався на 60,2% і 47,6% відповідно у головному мозку, а в мозку тварин з внутрішньомозковим крововиливом на 55,2% відносно контролю.

Нітрокол приводив до інтенсифікації аеробних процесів синтезу АТФ (зниження лактату, збільшення малату). У групах тварин, що одержували пірацетам, показники біоенергетики (АТФ, лактат, малат) статистично не відрізнялися від таких у групах, що одержували нітрокол.

Рис. Вплив нітроколу на біохімічно-функціональні показники головного мозку щурів на 4 добу експерименту

Важливим моментом у механізмі нейропротективної дії нітроколу є його антиоксидантний ефект. Так, у головному мозку тварин з одно- і двобічною перев'язкою загальних сонних артерій і внутрішньомозковим крововиливом, що отримували нітрокол на протязі 4-х діб, спостерігалося зниження продуктів ВРО в головному мозку, ДК на 43,5-57,7%, ТК – 42,1-53,6% і МДА – 43,7-52,0% відносно контролю (р0,05).

Одним з механізмів антиоксидантної дії нітроколу є його здатність реактивувати антиоксидантні ферменти в умовах ішемії головного мозку. Так, введення нітроколу тваринам з перев'язкою загальних сонних артерій і внутрішньомозковим крововиливом підвищувало активність у головному мозку СОД на 153,5-308,0%, ГПР – 71,4-97,5% і каталази – 140-185% відносно контролю (р0,05).

Введення тваринам з ГПМК і внутрішньомозковим крововиливом дибунола протягом 4-х діб у дозі 50,0 мг/кг було менш ефективним, ніж введення нітроколу. Так, за впливом на такі показники антиоксидантної системи мозку, як активність СОД, ГПР, каталази нітрокол достовірно (р0,05) перевищував дію дибунолу на 150-300%, а по зниженню продуктів ВРО ДК і МДА – на 25-30%.

Підтвердженням нейропротективної дії нітроколу було зменшення гіперферментемії ВВ-КФК у крові тварин із ГПМК і внутрішньомозковим крововиливом. Нітрокол по цьому показнику у 2-2,5 рази достовірно (р0,05) перевищував активність пірацетаму.

Курсове призначення нітроколу в дозі 25,0 мг/кг на протязі 4-х діб собакам з однобічною перев'язкою загальних сонних артерій приводило до зниження в корі головного мозку ДК на 41,0%, ТК – 39,4%, МДА – 45,1%, підвищенню активності СОД на 198,4%, ГПР – 90,0%, каталази – 183,8% відносно контролю (р0,05). Призначення нітроколу приводило до збільшення продукції АТФ на 46,1% на фоні збільшення рівня малату (20,0%) і пірувату (20,0%) у лобній корі мозку експериментальних собак. Введення нітроколу собакам із ГПМК знижувало гіперферментемію ВВ-КФК на 42,7%, а застосування пірацетаму знижувало цей показник на 19,1%.

Призначення нітроколу собакам у дозі 25,0 мг/кг перед окклюзією сонних артерій і перед реперфузією приводило до гальмування реакцій ВРО у крові та головному мозку.

Так, введення нітроколу перед оклюзією сонних артерій призводило, на 30 хвилині перев’язки, до зниження ДК в артеріальній крові на 42,0%, в венозній – на 45,0%, ТК – на 64,5% і 16,6%, МДА – на 43,2% і 25,0% відповідно. При цьому спостерігалось підвищення, в порівнянні з контрольними значеннями, рівня ?-токоферолу в артеріальній крові на 37,4%, а в венозній – на 21,9%. На 30 хвилині реперфузії нітрокол знижував вміст ДК на 70,8% і 51,0% ТК – 75,0 і 60,8%; МДА – на 44,2% і 20,2%, рівень -токоферолу підвищувався на 30,4% і 25,0% відповідно в артеріальній і венозній крові. У тварин, які отримували безпосередньо перед окклюзією і реперфузією пірацетам, ці зміни були менші.

Таблиця

Вплив нітроколу на показники антиоксидантно-оксидантного гомеостазу головного мозку собак з ГПМК (однобічна перев'язка загальной сонної артерії) на 4 добу експерименту

Група тварин | СОД, у.о./мг білка/хв. | Каталаза, мкат/мг білка/хв | ГПР, мкм/мг білка/хв | ДК, мкм/г тканини | МДА, мкм/г тканини

Інтактні | 280,510,2 | 14,50,32 | 78,46,1 | 1,480,13 | 0,350,02

ГПМК (контроль) | 105,89,3 | 3,70,11 | 35,23,7 | 5,120,31 | 0,910,05

ГПМК + нітрокол | 315,712,7о* | 10,50,21о* | 66,72,1о* | 3,020,11о* | 0,500,04о*

ГПМК + дибунол | 110,69,1 | 4,20,24 | 38,26,0 | 4,000,12 | 0,680,3*

Примітка: о – р0,05 по відношенню до дибунолу;

* – р0,05 по відношенню до контролю.

Підтвердженням вираженої захисної дії нітроколу в період гострої ішемії та реперфузії є нормалізація показників енергетичного обміну і стану антиоксидантної системи в тканинах головного мозку тварин на 3 добу після оперативного втручання. В тканинах головного мозку тварин, які отримували нітрокол, спостерігалась нормалізація основних показників вуглеводно-енергетичного обміну, підвищення активності антиоксидантної системи, зниження продуктів ВРО. Так, підвищувався рівень АТФ на 15,5% на фоні зниження рівня лактату на 16,6% і підвищення малату на 16,0%, що свідчить про виражений вплив нітроколу на аеробні процеси окислення.

Призначення в період операції нітроколу викликало і підвищення активності антиоксидантних ферментів в тканинах мозку на 3 добу після операції. Так, активність СОД була вище контрольних значень на 30,5%, каталази на 51,0%, ГПР – на 32,0% (р0,05), рівень ?-токоферолу був вище контрольного значення на 15,5%. При призначенні пірацетаму активність антиоксидантної системи змінювалась менше.

Таким чином, нітрокол (моноетаноламонієва сіль 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти) виявляє значний нейропротективний ефект на різних моделях експериментальної ішемії і ішемії-реперфузії головного мозку, який перевищує дію референс-препаратів (пірацетам, дибунол).

Захисна дія нітроколу, можливо, реалізується за рахунок вираженого впливу на антиоксидантну систему організму (СОД, ГПР, каталаза), нормалізації деяких ланок біоенергетики при ішемії і власного антирадикального ефекту. Подібне ствердження про можливу дію нітроколу є експериметальним обґрунтуванням для подальших поглиблених доклінічних досліджень з метою створення нового ефективного нейропротективного засобу з антиоксидантною дією.

Висновки

Вперше в результаті досліджень in vitro та in vivo у ряду похідних N-(4-хіназоліл)аміноалкіл(арил)карбонових кислот і 2-R2-6-R3-8-R4-(3Н)-хіназо–лон-4-іл-3-карбонових кислот виявлена речовина моноетаноламонієва сіль 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти яка проявляє виражену антиоксидантну і нейропротективну дію.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

Перелік робіт опублікованих за темою дисертації

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

Анотації

Бухтіярова Н.В. Пошук речовин з анти радикальною і антиперекисною активністю серед похідних хіназолону-4 та 4-амінохіназоліну. –Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05- фармакологія. - Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2003.

Дисертація присвячена проведенню первинного скринінгу антиоксидантної активності 42 нових похідних хіназоліну та вивчення їх нейропротекторної дії в умовах експериментальної ішемії головного мозку. Скриніногові дослідження цих сполук дозволили вивчити взаємозв’язок “структура-дія” та показали, що рівень антиоксидантної активності залежить від розташування і характеру функціональних замісників у хіназоліновому циклі.

В дослідах in vitro найбільшу АОА виявили солі N-(4-хіназоліл)-амінобензойних, (3Н)-хіназолон-4-іл-3- та 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтових кислот. Подальші їх дослідження на моделях експериментального ГПМК показали, що ці сполуки інгібують процеси ВРО, мають позитивний вплив на антиоксидантну систему та процеси обміну в тканинах головного мозку при ішемії. В результаті порівняльного аналізу антиоксидантної та протиішемічної активності досліджених сполук з референс-речовинами (пірацетам, дибунол) біла відібрана та досліджена моноетаноламонієва сіль 6-нітро-3(Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти (“Нітрокол”).

Було встановлено, що курсове призначення нітроколу тваринам з експериментальними моделями ішемічного та геморагічного пошкодження головного мозку, а також на моделі ішемії-реперфузії призводить до зниження реакцій ВРО, нормалізації більшості показників вуглеводно-енергетичного обміну, зменшення гіперферментемії, підвищення активності ферментів АО-захисту, причому, ефективність його перевершує ефективність препаратів порівняння - дибунолу та пірацетаму.

Нейропротективна дія нітроколу, вірогідно, реалізується за рахунок активного впливу на антиоксидантну систему та нормалізації біоенергетичних процесів (гліколіз, окислення в циклі Кребса, енергетичний фонд).

Ключові слова: вільнорадикальне окислення, ішемія, головний мозок, антиоксидантна дія, хіназолін.

Бухтиярова Н.В. Поиск веществ с антирадикальной и антиперекисной активностью среди производных хиназолона-4 и 4-аминохиназолина. –Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 – фармакология. - Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена проведению первичного скрининга антиоксидантной активности среди 42 новых производных хиназолина с последующим изучением их нейропротективного действия в условиях экспериментальной ишемии. Исследованы соединения следующих химических структур :N-(4-хиназолил)аминоалкилкарбоновые кислоты, N-(4-хиназолил)аминоарилкар-боновые кислоты и их соли, 2-R2-6-R3-8-R4-(3H)-хиназолон-4-ил-3?(в)-?арбоновые кислоты и их водорастворимые соли. Скрининговые исследования этих соединений in vitro на трех моделях инициировании СРО (ферментативное, неферментативное инициирование и по ингибированию супероксидрадикала) показали, что большинство из них обладает АОА, сила которой зависит от расположения и характера функционального заместителя в фенильном остатке. Так, перемещение его из орто- в мета- или пара- положение приводит к усилению АОА, а введение гидроксила – повышает.

Экспериментальные исследования наиболее активных соединений (соли N-(4-хиназолил)аминобензойных, (3Н)-хиназолон-4-ил-3- и 6-нитро-(3Н)-хиназолон-4-ил-3-уксусных кислот) на моделях острого нарушения мозгового кровообращения показали, что все они проявляют высокую АОА в условиях ишемии, причем по силе антиоксидантного действия превосходят эффективность ?-токоферола и дибунола. Антиоксидантный эффект данных соединений реализовывался на инициальных этапах СРО за счет реактивации антиоксидантных ферментов (СОД, каталазы, глутатионпероксидазы) и защиты эндогенного фонда ?-токоферола, что выгодно отличает их от стандартных антиоксидантов – дибунола, и витамина Е.

Проведено доклиническое изучение наиболее перспективного соединения – моноэтаноламмониевой соли 6-нитро-(3Н)-хиназолон-4-ил-3-уксусной кислоты в качестве антиоксидантного и нейропротективного средства (рабочее название “Нитрокол”). Определена эффективная доза (50мг/кг), изучена острая токсичность и эффективность на моделях ишемического и геморрагического инсульта и ишемии-реперфузии. Исследования показали, что курсовое назначение нитрокола приводило к увеличению содержания АТФ (на 60,2%), АДФ (на 50,5%) и снижению АМФ (на 31,5%) в тканях мозга по сравнению с группой нелеченых животных. В группах животных, получавших пирацетам,