НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
НаціональнА академіЯ наук україни
Інститут фізіології імені О.О.богомольця
Козак Лілія Петрівна
УДК: 612.22-06: (612.015.11:547.262)
Вплив інтервального гіпоксичного тренування на етаноліндуковані порушення пероксидних та антиоксидантних процесів
03.00.13 – фізіологія людини і тварин
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2003
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Львівському державному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України.
Наукові керівники: доктор біологічних наук, професор
Тимочко Михайло Федорович,
Львівський державний медичний університет
імені Данила Галицького МОЗ України,
завідувач кафедри біологічної хімії
доктор медичних наук Алексевич Ярослав Ілліч,
Львівський державний медичний університет
імені Данила Галицького МОЗ України,
професор кафедри фармакології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук
Серебровська Тетяна Вікторівна,
Інститут фізіології імені О.О.Богомольця
НАН України, м.Київ, провідний науковий співробітник відділу гіпоксичних станів
кандидат біологічних наук
Стогній Ніна Андріївна,
Інститут біохімії імені О.В.Паладіна
НАН України, м.Київ, старший науковий
співробітник відділу обміну ліпідів
Провідна установа: Національний медичний університет
імені О.О. Богомольця МОЗ України, м.Київ
Захист відбудеться 16.09.2003 р. о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 у Інституті фізіології імені О.О.Богомольця Національної академії наук України за адресою: 01024, м. Київ, вул. О.О.Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитися у Науковій бібліотеці Інституту фізіології імені О.О.Богомольця НАН України (01024, м. Київ, вул. О.О.Богомольця, 4)
Автореферат розісланий 14.08.2003 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. На сьогоднішній день нагромаджено значний обсяг інформації про вплив хронічної алкогольної інтоксикації на різні аспекти метаболізму (Буров Ю.В. и соавт., 1985; Гулий М.Ф. і співавт., 1997; Анохина И.П. и соавт., 2000; Бардина Л.Р. и соавт., 1999; Cелевич М.И. и соавт., 1999; Синицький В.Н., 1999; Lieber C.S., 1997). Згідно з експериментальними та клінічними дослідженнями основними факторами, які визначають токсичні ефекти етилового спирту, є його мембранотропна (Cторожок С.А., 2001; Wood W.G., 1991), прооксидантна дія (Пирожков С.В., 2001; Пронько П.С., 1999; Rouach H. et al., 1997; Schlorf E.C. et al., 1997), накопичення відновлених форм НАД, утворення ацетальдегіду, конкуренція етанолу з іншими джерелами енергії (Лукьянова Л.Д., 2001, Гулий М.В., 1997, Eaton S. et al., 1997). Водночас, залишаються недостатньо вивченими механізми ранніх мобілізаційних реакцій організму на дію етилового спирту.
Сучасні наукові дослідження дають все більше доказів важливої патогенетичної ролі змін оксигеназних реакцій, які призводять до деструкції ліпопротеїнового комплексу клітинних та субклітинних мембран, видозмінюючи їх транспортні функції, а також пригнічуючи процеси генерації енергії (Тимочко М.Ф., 1998, Бурлакова Е. Б., 2001; Лукьянова Л.Д., 2001). При цьому мало уваги звертається на взаємозв’язок оксигеназних реакцій з іншими ланками системи кисеньзалежного обміну та на їх роль у формуванні адаптивно-компенсаторних процесів організму (Тимочко М.Ф., 1998; Серебровська Т.В., 2002). Залишається відкритою проблема щодо можливості направленої корекції виявлених етаноліндукованих порушень кисеньзалежного метаболізму за допомогою одного із неспецифічних засобів підвищення адаптивного потенціалу організму – інтервального гіпоксичного тренування (ІГТ).
Виходячи з вищесказаного, можна вважати, що об’єктивна оцінка інтенсивності перебігу вільнорадикальних пероксидних реакцій та активності антиоксидантного захисту з одночасним урахуванням потужності енергетичного обміну сприятимуть глибшому розумінню механізмів алкогольної залежності та відбору найбільш інформативних критеріїв і методів для оцінки глибини ураження та зворотності етаноліндукованих метаболічних порушень, а також прогнозу та контролю корекції.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького і виконувалась в рамках тематики кафедри нормальної фізіології “Дослідження особливостей функціонально-метаболічних резервів секреторних органів травного тракту та встановлення критеріїв їх оцінки за умов впливу екзо- та ендоекологічних факторів” (№ держреєстрації 01.00.U002258) і Центральної науково-дослідної лабораторії “Оцінка ступеня інтоксикації та адаптаційно-компенсаторного резерву організму за умов впливу різних екстремальних чинників” (№ держреєстрації 0100U006846).
Мета і задачі досліджень. Метою роботи було виявлення особливостей змін пероксидних та антиоксидантних процесів, вмісту метаболітів гліколізу та нітрит-іонів, а також змін ультраструктурних параметрів тканин печінки на початкових стадіях хронічної алкогольної інтоксикації та ефект застосування за цих умов інтервального гіпоксичного тренування.
Для досягнення поставленої мети планувалося вирішити такі завдання:
1. Вивчити особливості пероксидних процесів та антиоксидантного захисту в крові та тканинах печінки і мозку щурів з різною метаболічною резистентністю до етанолу на початкових стадіях хронічної алкогольної інтоксикації.
2. Дослідити вплив хронічного вживання етанолу на вміст метаболітів окисно-відновних реакцій (молочної і піровиноградної кислот) у крові та тканині печінки тварин і детоксикаційну функцію печінки.
3. Провести комплексне дослідження кисеньзалежного метаболізму, включаючи систему монооксиду азоту, за умов хронічного впливу етанолу та застосування інтервальної гіпокситерапії.
4. Порівняти ефект інтервального гіпоксичного тренування, застосованого на початку алкогольної інтоксикації, з впливом ІГТ після 30-ти денного вживання етанолу.
5. Відстежити зміни ультраструктури гепатоцитів та синусоїдних гемокапілярів печінки щурів за умов впливу етанолу та застосування інтервального гіпоксичного тренування.
Об’єкт дослідження: механізми пристосувально-компенсаторних процесів за умов хронічного вживання етанолу в тварин з різною резистентністю до алкоголю та механізм дії ІГТ при алкогольній інтоксикації.
Предмет дослідження: параметри процесів ліпопероксидації, антиоксидантного захисту, інтенсивність гліколізу в тканинах та крові щурів, ультраструктурні зміни в тканинах печінки при алкогольній інтоксикації, а також коригуючому впливі ІГТ.
Методи дослідження. Для досягнення поставленої мети і завдань використовували наступні методи дослідження:–
фізіологічні – поділ тварин за резистентністю до гіпоксії та етанолу (етаноліндукований сон);–
біохімічні – комплекс методик для визначення рівня продуктів пероксидного окиснення ліпідів (дієнові кон’югати та ТБК-активні продукти), стану антиоксидантного захисту (загальна антиоксидантна активність, ферментативна ланка – активність супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази, неферментативна – вміст SH-груп), пероксидна резистентність еритроцитів, вміст нітрит-іонів, антипіриновий тест, вміст метаболітів окисно-відновних реакцій (молочна та піровиноградна кислоти);–
електронно-мікроскопічні – ультраструктура гепатоцитів та синусоїдних гемокапілярів печінки щурів.
Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше досліджено стан кисеньзалежного метаболізму на початкових етапах алкогольної інтоксикації у тварин та вплив на ці показники інтервального гіпоксичного тренування. Виявлено активацію вільнорадикальних пероксидних процесів у тканинах печінки та мозку коротко- та довгосплячих щурів та зниження ТБК-активних продуктів у крові, більш виражене у короткосплячих. Довгосплячі і короткосплячі тварини різняться специфікою та потужністю антиоксидантного захисту у досліджуваних тканинах. У крові короткосплячих щурів відмічено активацію супероксиддисмутази, зростання вмісту небілкових SН-груп, на відміну від різкого зниження активності супероксиддисмутази та глутатіонпероксидази у довгосплячих. Виявлено вищий рівень індексу антиокисної активності у тканинах печінки та мозку короткосплячих щурів, а також зростання активності каталази у тканині печінки цієї групи тварин. Встановлено, що довгосплячі тварини характеризуються низькою резистентністю до гіпоксії. Вперше показано, що інтервальне гіпоксичне тренування довгосплячих тварин достовірно зменшує тривалість етаноліндукованого сну, підвищує резистентність до гіпоксії, збільшує активність антиоксидантних ферментів (каталази, супероксиддисмутази, глутатіонпероксидази) у крові, гомогенатах печінки та мозку. Показано, що інтервальне гіпоксичне тренування компенсує етаноліндуковані пошкодження тканин печінки за рахунок стабілізації мембран і збільшення кількості залучених у кисеньзалежний метаболізм органел – мітохондрій та пероксисом, що забезпечує спряженість оксидазних і оксигеназних процесів та підвищення ефективності утилізації етанолу. Враховуючи вірогідне посилення екскреції амінопохідного метаболіту амідопірину стверджується про спроможність ІГТ у алкоголізованих тварин мобілізувати активність ферментів монооксигеназної системи печінки.
Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані результати суттєво доповнюють сучасні уявлення про структурно-метаболічні зміни за умов алкогольної інтоксикації, а також сприяють поглибленому розумінню механізмів компенсаторно-адаптивних процесів при даній патології та можуть бути основою для розробки адекватних лікувально-профілактичних та реабілітаційних заходів в установах наркологічного профілю. Показано позитивний ефект профілактичного та лікувального застосування ІГТ на ранніх стадіях алкогольної інтоксикації, що обгрунтовує можливість використання інтервальної гіпокситерапії у комплексному лікуванні хворих алкоголізмом.
На підставі результатів досліджень підготовлено інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров’я №150 “Оцінка ступеня інтоксикації на початкових стадіях впливу етанолу”. Окремі результати досліджень впроваджені у навчальний лекційний курс кафедри нормальної фізіології ЛДМУ ім. Данила Галицького, кафедри нормальної фізіології та у науково-дослідну роботу ЦНДЛ Національного медичного університету імені О.О.Богомольця.
Особистий внесок здобувача. Представлена робота виконана автором самостійно. Автором проаналізовано літературні джерела, за участю керівників сплановано науковий напрям роботи і комплекс фізіологічних, біохімічних методик та серії експериментальних досліджень. Дисертант самостійно провела експериментальні дослідження, статистичну обробку отриманих даних та аналіз результатів. Автор описала та узагальнила отримані результати, сформулювала основні положення роботи і висновки. Частина досліджень проведена разом із співробітниками ЦНДЛ Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького, які є співавторами публікацій. Електронно-мікроскопічні дослідження виконано за участю кандидата біологічних наук, старшого наукового співробітника ЦНДЛ ЛДМУ ім. Данила Галицького В.І. Ковалишина.
Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати роботи були представлені та обговорені на міжнародній конференції з фізіології і біохімії тварин, присвяченій 100-річчю від дня народження професора Гжицького С.З. (Львів, 2000), VIII Конгресі Світової Федерації Українських лікарських товариств (Львів, 2000), ІІІ Національному Конгресі патофізіологів України (Одеса, 2000), 43-ій міжнародній конференції з попередження та лікування залежностей (Бахрейн, 2000), міжнародній конференції, присвяченій 75-річчю від дня народження А.М.Уголева “Механизмы функционирования висцеральных систем” (Санкт-Петербург, 2001), міжнародній конференції студентів і молодих вчених “Актуальні проблеми клінічної і теоретичної медицини” (Дніпропетровськ, 2001), 4-й міжнародній конференції “Гіпоксія в медицині” (Женева, 2001), науково-практичній конференції “Актуальні проблеми мікроциркуляції та гемостазу при патології внутрішніх органів” (Чернівці, 2002), ІІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002), міжнародній конференції, присвяченій пам’яті професора Шостаковської І.В. (Львів, 2002).
Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 16 публікаціях, з яких 6 опубліковані у наукових фахових виданнях, 10 – у матеріалах конференцій та з’їздів.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів отриманих даних та їх обговорення, висновків, а також списку використаних джерел із 316 найменувань і додатків. Робота викладена на 162 сторінках, ілюстрована 12 рисунками, 21 таблицею, 16 світлинами.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень
Дослідження проведені на білих статевозрілих щурах-самцях масою 0,18-0,22 кг. Об'єкт дослідження – тканини печінки і мозку, кров щурів. Тварин попередньо тестували за тривалістю етаноліндукованого сну (Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н., 1985). Поділ тварин за резистентністю до гіпоксії проводили за методом Березовського В.Я. (1978) через тиждень після тестування на етаноліндукований сон. Для відтворення в експерименті ранніх стадій алгогольної інтоксикації, нами була обрана модель, при якій щурі-самці як єдине джерело пиття отримували 15 %-ний розчин етанолу впродовж 30 днів. У процесі експерименту контролювали об’єм спожитого алкоголю. Контролем слугували тварини тієї ж вікової групи, які як джерело рідини отримували воду. Окремі групи контрольних та алкоголізованих довгосплячих тварин підлягали впливу інтервального гіпоксичного тренування, яке здійснювали в різні періоди алкоголізації. ІГТ проводили в барокамері в наступному режимі: п’ятиразовий “підйом” на “висоту” 6000 м по 10 хв, перерви між сеансами гіпоксії – 15 хв, тривалість тренувань – 10 днів, швидкість “підйому” – 20 м/с (Dolova F.M. et al., 2000). В одній серії досліджень ІГТ застосовували після 30-ти денного споживання спирту. У наступній – ІГТ було застосоване на початку алкогольної інтоксикації, а саме з 1-ого по 10-ий день вживання етанолу. Крім того, обстежено 53 пацієнти чоловічої статі віком 24-40 років, що перебували на лікуванні у Львівському обласному наркологічному відділенні з приводу алкоголізму ІІ стадії. Контрольна група налічувала 20 практично здорових непитущих чоловіків віком 20-40 років. Для біохімічних досліджень використовували сироватку крові, цільну кров та слину.
Рівень ПОЛ оцінювали за вмістом дієнових кон’югатів (ДК) (Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983) і малонового діальдегіду (МДА) (Тимирбулатов Р.А., Селезнев Е.С., 1986). Загальну антиокисну активність (ІАОА) сироватки крові та досліджуваних тканин визначали за методом Мартинюк В.Б., Ковальчук С.М. і співавт. (1991). Принцип методу полягає у визначенні співвідношення вмісту МДА, перерахованого на одиницю об’єму сироватки або на одиницю маси тканини при активації ПОЛ для двох різних кількостей досліджуваного матеріалу в постійному об’ємі середовища інкубації. В основі методу лежить закономірність, суть якої полягає в тому, що збільшення кількості досліджуваного матеріалу при постійності всіх інших параметрів призводить до зменшення нагромадження перекисних продуктів у перерахунку на одиницю досліджуваного матеріалу. Це пояснюється тим, що кожний ліпідвмісний біологічний матеріал є не лише субстратом окиснення, але й має антиокисну здатність, тому в більш концентрованих пробах ефективність дії ендогенних антиоксидантів є вищою, ніж у розведених. Визначали активність ферментів глутатіонпероксидази (ГПО) (Моин В.М., 1986), каталази (КАТ) (Королюк М.А. та ін., 1988), супероксиддисмутази (СОД) (Костюк В.А. та ін., 1990), гамаглутамілтранспептидази (ГГТП) (Szasz, 1976). Вміст SH-груп визначали за методом В.М.Фаломеєва (1981). Пероксидну резистентність еритроцитів (ПРЕ) оцінювали за методом Покровського А.А., Абрарова А.А. (1964), виведення 4-аміноантипірину (4-ААП) – за методом Т.А.Попова та О.Б.Леоненко (1977), вміст метаболітів монооксиду азоту – нітрит-іонів – за методом Green L.C. et al. (1982). Визначали вміст сечової кислоти (London M., Marymont J.H., 1964), аскорбінової кислоти (Selgrage M.J.K. et al., 1999), молочної кислоти (Hohorst H.J.,1974), піровиноградної кислоти (Bucher І., 1974), ліпопротеїнів низької щільності (?-ЛП) (Бурштейн, 1982). Для оцінки відповідності активності ферментативних систем антиоксидантного захисту (АОЗ) до змін інтенсивності ліпопероксидації нами введені коефіцієнти СОД/МДА і КАТ?СОД/МДА, які відображають загальні адаптаційні можливості досліджуваної системи, незважаючи на варіабельність окремих параметрів, тканинну специфічність та індивідуальні особливості організму (Тимочко М.Ф. та співавт., 1990). Забір і підготовку матеріалу для електронної мікроскопії здійснювали за методом (Stempac J., Ward R., 1964, Reynolds E., 1963). Електронно-мікроскопічне дослідження в трансмісійному режимі проводили на електронному мікроскопі УЕМВ-100К за прискорювальної напруги 75 кВ.
Опрацювання результатів здійснювали з використанням програмного пакету для персональних комп’ютерів Microsoft Excel та калькулятора “Электроника МК-52”. Вірогідність одержаних даних оцінювали за t-критерієм Стьюдента. Визначали середнє значення (М), стандартну похибку (m) і коефіцієнт вірогідності (р) та коефіцієнт кореляції (r).
Результати досліджень та їх обговорення
Cпіввідношення про- і антиоксидантних процесів у тканинах тварин з різною резистентністю до етанолу на ранніх етапах його впливу. Для визначення резистентності щурів до етанолу використали тест на тривалість етаноліндукованого сну. З цією метою щурам вводили 25 %-ний розчин етанолу (4 г/кг маси, доочеревно), реєстрували час перебування тварин у боковому положенні, на основі тривалості якого тварин поділили на короткосплячих (КСп) (тривалість сну – 15±5 хв) і довгосплячих (ДСп) (тривалість сну – 155±15 хв). Виявлено, що 70 % щурів даної популяції є довгосплячими. Через тиждень після етаноліндукованого сну виявляли індивідуальну стійкість тварин до гіпоксії. Встановлено, що ДСп тварини характеризуються зниженою резистентністю до гіпоксичного навантаження. Час перебування ДСп на “висоті” був у межах від 40±5 сек до 180±10 сек, а у короткосплячих – від 420±15 сек до 660±15 cек. Через два дні після поділу щурів на групи КСп і ДСп, вони як єдине джерело пиття отримували 15 % -ний розчин етанолу впродовж 30 днів. У експериментах для вивчення впливу ІГТ використовували ДСп тварин. Десятиденне ІГТ ДСп щурів супроводжувалося зростанням резистентності до гіпоксії. Це виявлялося у збільшенні часу перебування на “висоті” (480±20 сек після ІГТ порівняно із 120±30 сек до сеансів ІГТ). При цьому достовірно зменшувалася тривалість етаноліндукованого сну до 25±5 хв. Нами встановлено зворотню кореляцію між резистентністю до гіпоксії і тривалістю етаноліндукованого сну (r= - 0,609, р<0,05).
Досліджено, що 30-ти денне вживання етанолу короткосплячими щурами призводить до зниження вмісту МДА у сироватці крові на 30,5 %, а концентрація ДК зростає на 37 % відносно контролю, що може бути пов’язане з розбалансуванням у різних ланках системи ліпопероксидації. Спостерігається зменшення вмісту ?-ліпопротеїнів вдвічі, а також зменшення відсотку пероксидного гемолізу еритроцитів (ПГЕ). Наші спостереження співпадають з даними інших авторів, які відмічають зменшення вмісту МДА у крові, зниження ПГЕ у хворих хронічним алкоголізмом, і пояснюють це змінами складу ліпідів у мембранах еритроцитів, збільшенням вмісту холестерину та зменшенням ступеня ненасиченості жирних кислот фосфоліпідів у мембранах клітин (Лапинский А.Г. и соавт., 1989). Такі зміни в складі ліпідів мембран, на думку авторів, зменшують здатність ліпідів до радикалоутворення та компенсують розріджуючу дію етанолу на мембрани клітин (Сторожок С.А. і співавт., 2001). Інші дослідники пов’язують феномен зниження вмісту ТБК-активних продуктів з потенційною роллю етанолу як скавенджера вільних радикалів кисню (Inоmata Т. et al, 1987). За даних умов активність СОД зростає на 42 %. Концентрація загальних SH-груп у крові КСп залишалася незмінною щодо контролю, кількість небілкових SH-груп зростала у 2 рази.
У ДСп щурів дія 15 %-ного розчину етанолу впродовж 30 днів призводить до зниження в крові активності ферментів антиоксидантного захисту – СОД, КАТ, ГПО, відповідно, на 55 %, 18 %, 51 %. При цьому не відмічено істотних змін вмісту МДА та зафіксовано достовірне зниження (на 43 %) рівня ДК, що можна пов’язувати із залученням їх у обмінні процеси ліпідної пероксидації. Зростає вміст ?-ЛП, очевидно, внаслідок мобілізації ліпідвмісних субстратів для енергозабезпечення.
У тканині печінки КСп під впливом етанолу інтенсивність ПОЛ достовірно підвищується, що відбувається на тлі зниження активності СОД (на 32 %), зростання активності КАТ (на 14 %) та ІАОА (на 17,5 %), стосовно контролю. За цих умов зафіксоване зниження концентрації небілкових SH-груп та незначне збільшення білкових –– з 20,88±0,15 у контролі до 22,16±0,17 (мкмоль/мл) у досліді (р<0,05). Це може свідчити, по-перше, про активне використання для інактивації вільнорадикальних процесів низькомолекулярних SH-вмісних компонентів цитоплазми (в першу чергу, глутатіону), а, по друге, про їх залучення до ресинтезу білкових молекул. У тканині печінки ДСп, після 30-ти денної алкоголізації, відмічено зростання концентрації як початкових (ДК), так і проміжних продуктів ПОЛ (МДА) на 80 % та 42 %, відповідно, щодо контролю. При цьому зафіксовано зменшення активності КАТ та ГПО на 15 % та 37 %, відповідно, активності СОД – на 19 %, ІАОА – на 27 %, відносно контрольних значень. Посилення процесів ліпопероксидації за умов дії етанолу в печінці – органі, в якому відбувається окиснення основної маси алкоголю, що надходить в організм, – може бути опосередковане зростанням кількості відновлених еквівалентів, які утворюються під час метаболізму етанолу або ж продукту його окиснення – оцтового альдегіду, в результаті метаболізму якого утворюється гідроксильний радикал – основний індуктор ПОЛ (Пронько П.С. та ін., 1999).
У тканині мозку КСп тварин спостерігається збільшення рівня МДА на 29% (менш виражене, ніж у тканині печінки). Відмічено зменшення активності СОД на 24 %. На відміну від печінки, в гомогенатах мозку зафіксоване достовірне зниження каталазної активності, яка становить 63 % від контролю. Концентрація небілкових SH-груп вірогідно зросла з 2,9±0,15 до 4,5±0,63 (мкмоль/г) (р<0,05). Підвищення концентрації небілкових сульфгідрильних груп у крові та гомогенатах мозку КСп тварин, 95 % яких, судячи з даних літератури, представлено SH-групами глутатіону, є, на наш погляд, опосередкованим свідченням мобілізації антиоксидантної системи за рахунок активації системи глутатіону. У тканині мозку ДСп тварин, які зазнали впливу етанолу, дані майже аналогічні до результатів, отриманих нами для гомогенатів печінки щурів цієї групи. Зокрема, спостерігається збільшення вмісту МДА та ДК (на 50 % та 55 %, відповідно), ІАОА зменшений на 34 %. Проте, на відміну від печінки, в гомогенатах мозку фіксується суттєве зниження активності КАТ (на 48 %) та незначне зменшення активності СОД і ГПО. Значна чутливість мозку до пероксидних процесів може бути зумовлена високим споживанням кисню, великою кількістю субстратів, які легко підлягають окисненню (поліненасичені жирні кислоти, біогенні аміни), низькою активністю деяких антиоксидантних ферментів, особливо, каталази. Тридцятиденне вживання довгосплячими щурами етилового спирту супроводжується достовірним зменшенням у крові щурів величини коефіцієнтів СОД/МДА і КАТ?СОД/МДА на 54 % і 62 % відповідно. У короткосплячих тварин відношення СОД/МДА у крові зростає у 2 рази відносно контролю. Також спостерігається збільшення коефіцієнта КАТСОД/МДА на 83 %.
Отже, хронічна алкоголізація тварин з різною резистентністю до етанолу зумовлює активацію вільнорадикальних пероксидних процесів у тканинах печінки та мозку щурів обох груп та зниження ТБК-активних продуктів у крові, більш виражене у короткосплячих. Тварини різних груп відрізняються потужністю та специфікою антиоксидантного захисту в досліджуваних тканинах, яка виявляється в крові КСп у переважному функціонуванні СОД і неферментативної антиоксидантної системи (ІАОА, небілкові SН-групи) і вищому рівні КАТ та ІАОА у тканині печінки КСп щурів. Виходячи з перебігу метаболічних перетворень при формуванні пристосувальних реакцій до впливу алкоголю і враховуючи адаптаційний резерв досліджуваних систем, більш сприятливою у відношенні розвитку компенсаторних процесів є група короткосплячих тварин.
Стан кисеньзалежного метаболізму у хворих з алкогольною інтоксикацією. Нами було проведене комплексне дослідження крові та слини хворих алкоголізмом. Обстежених розділили на дві групи залежно від рівня малонового діальдегіду при алкогольній інтоксикації. Першій групі хворих властивий підвищений рівень МДА (на 44 % щодо норми) на тлі вірогідно вираженого зростання активності СОД (на 75 %) та ГПО (на 46 %). Активація ферментів антиоксидантного захисту в крові є, очевидно, компенсаторною реакцією, спрямованою на підтримання гомеостазу організму. З цими змінами корелюють показники молочної та сечової кислот, незначне зниження вмісту яких щодо норми є, в комплексі з попередньо описаними змінами, свідченням активного залучення оксидазних реакцій до адаптаційно-компенсаторних процесів організму. У хворих цієї групи спостерігали зниження вмісту одного з основних компонентів неферментативного антиокиснювального захисту – аскорбінової кислоти в слині, що може бути наслідком активного залучення її у відновні процеси або порушення її обміну. Останнє корелює з даними Шугалей Ю.С. та ін. (1986), згідно з якими хронічна алкогольна інтоксикація, підвищуючи вміст аскорбінової кислоти в тканинах (нирки, головний мозок), різко знижує його концентрацію в плазмі крові.
У другій групі хворих зафіксоване істотне зниження вмісту МДА у крові порівняно з нормою, причому на тлі виснаження ферментативних антиокиснювальних систем – зниження СОД в 2,7 разу, а ГПО – в 1,6 разу (рис. 1). Пригнічення активності антиоксидантних ферметів у ІІ групі хворих свідчить про можливий зрив адаптивно-компенсаторних процесів на метаболічному рівні. Водночас вміст аскорбінової кислоти в слині хворих достовірно знижений. Підвищення вмісту молочної та сечової кислот (у 1,5 разу і на 58 %, відповідно) може бути свідченням пригнічення аеробних реакцій енергетичного забезпечення за цих умов. Отримані нами дані підтверджують виявлені раніше низкою авторів значні порушення метаболізму молочної та сечової кислот у крові при алкогольному ураженні печінки (Lieber C.S., 1997; Mitchell D.J. et al. , 1989). На наш погляд, більш прогностично несприятливою є друга група хворих, оскільки тривале пригнічення оксидазних реакцій енергетичного обміну не створює умов для утилізації різних недоокиснених метаболітів і продуктів їх реакцій і цим самим виснажує енергокомпенсаторні процеси, які забезпечують стабілізацію клітинних мембран та індукцію ферментів антиокиснювального захисту. Така метаболічна ситуація схожа з виявленими нами змінами обмінних процесів у групі довгосплячих тварин після 30-ти денного споживання алкоголю (рис 1, 2). Отримані результати обгрунтовують доцільність включення у комплексну корекцію етаноліндукованих змін, окрім специфічних засобів, методів, спрямованих на нормалізацію кисеньзалежного метаболізму.
Рис. 1. Зміни метаболічних показників у крові хворих з другою стадією алкоголізму (у %) | Рис. 2. Зміни біохімічних показників
у крові довгосплячих щурів після 30-ти денного вживання 15 % розчину етанолу (у %)
Роль окисного метаболізму в формуванні адаптаційного ефекту за умов впливу етанолу та коригуючої дії інтервального гіпоксичного тренування. Встановлено, що адаптація до десятиденного курсу ІГТ у контрольних щурів призвела до збільшення в крові активності СОД на 18,5 %, ГПО – на 57,8 %, КАТ – на 37 %, зростання загальної АОА на 14,9 % відносно контролю при зменшеному вмісті продуктів ПОЛ (табл.). Підвищення потужності антиоксидантного потенціалу виявляється також у істотному збільшенні в крові коефіцієнтів СОД/МДА, КАТЧСОД/МДА, які відображають динамічну рівновагу в системі про- та антиоксидантних процесів. Таку спрямованість метаболічних процесів ми розглядаємо як прояв мобілізаційного ефекту всіх ланок ферментативного компоненту антиоксидантного захисту на короткотривалі гіпоксичні впливи.
Використання ІГТ у алкоголізованих тварин призводить до зменшення в крові МДА як щодо контролю, так і по відношенню до тварин, які споживали етанол. При цьому зафіксовано збільшення активності СОД майже у 2 рази та зростання каталазної активності на 42 % відносно алкоголізованих тварин. Зниження вмісту ТБК-активних продуктів, ймовірно, обумовлене як зростанням активності, так й індукцією систезу ферментів АОЗ. Застосування гіпокситерапії в групі тварин з хронічною алкоголізацією супроводжується зростанням величини коефіцієнтів СОД/МДА, КАТЧСОД/МДА у 2,8 разу та 3,8 разу, відповідно. При цьому активність ГПО знаходиться на рівні показників алкоголізованих щурів, хоча ІГТ контрольних щурів призводило до зростання активності цього ферменту. Враховуючи корпоративні зв’язки між активністю основних ферментів АОЗ, можна припустити, що малий ступінь відновлення активності ГПО компенсується зростанням активності каталази і СОД.
Нами виявлено зниження вмісту -ліпопротеїнів у контрольній та дослідній групах за умов впливу ІГТ. Оскільки -ЛП є основною транспортною формою жирів ендогенного походження та містять у своєму складі важливі енергетичні (поліненасичені жирні кислоти) та пластичні речовини (холестерин, фосфоліпіди), можна зробити висновок, що вищеописана метаболічна перебудова свідчить про збільшення внеску ліпідів у енергетику організму і спрямована на збереження гомеостазу за умов гіпоксії (Стрелков Р.Д., Чижов А.Я., 2002).
Таблиця
Зміни біохімічних показників у крові довгосплячих щурів за умов дії інтервального гіпоксичного тренування (10 сеансів) після 30-денного вживання етанолу
(M±m, n=10)
Показники | Контроль | Етанол | ІГТ | Етанол+ІГТ
МДА, мкмоль/мл | 112,36±5,91 | 109,93±5,42 | 105,50±4,32 | 78,12±3,10*
ДК, од.Е/мл | 1,32±0,08 | 0,75±0,12* | 1,13±0,09 | 0,89±0,05*
ІАОА, відн.од. | 1,34±0,04 | 1,32±0,05 | 1,54±0,08* | 1,29±0,07
КАТ, мкмольН2О2/
мл· год | 0,097±0,006 | 0,080±0,007 | 0,133±0,008* | 0,113±0,015
СОД, од. акт/мл· хв | 545,57±35,98 | 243,73±68,17* | 646,57±26,76 | 477,15±45,06
ГПО, мкмольмл· хв | 1,16±0,08 | 0,57±0,08* | 1,83±0,04* | 0,63±0,09*
-ЛП, ум.од. | 7,83±0,23 | 8,63±0,40* | 6,06±0,35* | 6,28±0,17*
ПГЕ, % гемолізу | 10,21±0,14 | 7,020,17* | 10,140,19 | 8,120,18*°
ГГТП, мкмоль
п-нітроаніліну/
мл·год | 0,950,03 | 2,250,05* | 0,750,07* | 1,550,04*°
Примітка: * – вірогідність (р<0,05) стосовно контролю;
– вірогідність (р<0,05) стосовно групи тварин за умов впливу етанолу; –
вірогідність (р<0,05) стосовно групи тварин за умов дії ІГТ
При застосуванні ІГТ у печінці алкоголізованих тварин відстежені достовірні зміни активності ферментів – збільшення активності КАТ на 27 % порівняно з контролем та на 50 % порівняно з алкоголізованими тваринами, підвищення активності ГПО на 24 % відносно контролю і майже у 2 рази відносно щурів з 30-тиденним впливом етанолу. Значна інтенсифікація активності ГПО за даних умов пов’язана з тим, що у тканині печінки ГПО функціонує не лише як фактор антиоксидантного і антиперекисного захисту, але і як компонент системи детоксикації.
У алкоголізованих тварин після сеансів ІГТ значною мірою посилюється виведення з сечею 4-аміноантипірину в порівнянні з контрольною групою та групою з тривалою дією етанолу (у 1,9 разу та 1,2 разу, відповідно). Посилення екскреції амінопохідного метаболіту амідопірину вказує на мобілізуючий ефект ІГТ по відношенню до ферментів монооксигеназної системи печінки. Активність специфічного ферменту печінки – гамаглутамілтранспептидази (ГГТП) за умов хронічної алкогольної інтоксикації зростала у 2,4 разу в порівнянні з контролем, що ми пов’язуємо як із звільненням мембранозв’язаної ГГТП, так і з індукцією синтезу ферменту алкоголем. Застосування у контрольних щурів ІГТ супроводжується зниженням активності ГГТП стосовно контролю, а ІГТ після 30-тиденного вживання алкоголю призводить до зниження активності ГГТП відносно групи алкоголізованих тварин.
Встановлено, що ІГТ контрольних щурів у гомогенатах мозку призводить до зменшення вмісту ДК удвічі порівняно з контролем. Поряд з цим спостерігається тенденція до зниження МДА. Зафіксовано достовірне підвищення ІАОА – на 24 % відносно контрольних значень. Застосування ІГТ у алкоголізованих тварин супроводжувалося зменшенням вмісту МДА у гомогенатах мозку на 25 %, ДК – на 46,5 % порівняно з тваринами з хронічним впливом етанолу. Встановлено підвищення ІАОА як відносно контролю, так і стосовно алкоголізованих тварин, а також збільшення активності СОД, ГПО та КАТ на 27 %, 66 %, 52 %, відповідно, відносно щурів за умов впливу етанолу. Підвищення активності КАТ у гомогенаті печінки та мозку алкоголізованих тварин з використанням ІГТ на фоні відсутності збільшення концентрації продуктів ПОЛ може мати захисний ефект. Відомо, що впродовж кожного сеансу гіпоксії спостерігається збільшення ступеня відновленості носіїв мітохондріального дихального ланцюга, а поява достатньо високих концентрацій кисню в оточуючому середовищі при наступній реоксигенації (в період “спуску” в барокамері) створює сприятливі умови для утворення вільних радикалів. Найбільше значення в цьому процесі має пероксид водню, тому каталаза, яка стимулює його розклад, володіє антигіпоксичним ефектом (Лукьянова Л.Д., 1982). Кооперативно з нею функціонують супероксиддисмутаза та глутатіонпероксидаза, тому збільшення активності цих ферментів має компенсаторний характер.
Про участь у перебігу вільнорадикальних реакцій метаболітів NO свідчить зростання концентрації нітрит-іонів у гомогенатах мозку щурів з алкогольною інтоксикацією, оскільки цим сполукам властива здатність у відповідних концентраціях впливати на функцію мембранозалежних ферментних систем (Реутов В.П., 1997). З літератури відомо, що адаптація до ІГТ супроводжується посиленням синтезу NO та вивільненням додаткового NO з депо (Манухина Е.Б. и соавт., 2000). В наших дослідженнях спостерігається збільшення концентрації нітритів на 32 % відносно контролю. Застосування ІГТ у алкоголізованих тварин супроводжується зростанням вмісту метаболітів оксиду азоту як по відношенню до контролю (на 25так і по відношенню до тварин з хронічною алкогольною інтоксикацією (на 20
Відомо, що структурні зміни в організмі залежать від стану енергетичного і пластичного обміну, а адекватна регуляція енергетичного обміну визначає стійкість організму до екстремальних умов (Тимочко М.Ф. 1998; Березовський В.Я., 2000; Лебкова Н.П., 2000). Однією з важливих характеристик інтенсивності окисного метаболізму є концентрація лактату та пірувату в крові та тканинах. Це і спонукало нас до визначення вмісту метаболітів окисно-відновних реакцій за умов впливу етанолу та при застосуванні ІГТ. Нами виявлено достовірне збільшення концентрації лактату та пірувату в крові та тканинах печінки алкоголізованих тварин, що може вказувати на пригнічення окисних процесів у циклі Кребса та активацію гліколітичних реакцій. ІГТ нормалізує вміст молочної та піровиноградної кислот як у крові, так і в тканинах печінки. Отже, головним ефектом коригуючого впливу ІГТ у алкоголізованих тварин, виходячи з результатів наших досліджень, є активація антиокиснювальних ферментів і залучення в метаболічні перетворення недоокиснених продуктів вуглеводної та ліпідної природи, що сприяє нормалізації ПОЛ та вмісту продуктів гліколізу.
Зміни ультраструктури гепатоцитів та синусоїдних гемокапілярів печінки щурів за умов хронічного впливу етанолу та застосування інтервальної гіпоксії. Досліджено, що споживання 15 % розчину етанолу впродовж 30 днів призводить до пошкоджень ультраструктур синусоїдних гемокапілярів, жовчних капілярів та гепатоцитів тканин печінки довгосплячих щурів. Цитоплазма біліарного полюса гепатоцитів вміщує гіпертрофований комплекс Гольджі, дрібні мітохондрії, що мають дезорганізовані кристи, матрикс та частково розпушену зовнішню та внутрішню мембрани, що згідно з даними літератури може свідчити про деенергізацію мітохондрій (Кондрашова М.Н., 2000). Ендоплазматичний ретикулум, що прилягає до таких мітохондрій, представлений видовженими каналами, що в більшості випадків мають розпушені мембрани. Глікоген, який оточує комплекс Гольджі та прилеглі до нього мітохондрії, не має чітко вираженої гранулярної будови. Описані ультраструктурні зміни можуть характеризувати певні стадії апоптозу, які розвиваються за умов дії екстремальних факторів з метою запобігання неконтрольованого поширення деструктивних змін і можуть бути структурно-метаболічною основою для підтримання компенсаторних процесів у сусідніх ділянках цілісної тканини (Скулачев В.П., 2000).
У тканинах печінки щурів, тренованих методом інтервальної гіпоксії, збережені печінкові балки та синусоїдні гемокапіляри. Поміж мітохондрій в безпосередній близькості до розширених каналів агранулярного ендоплазматичного ретикулуму знаходиться велика кількість пероксисом та скупчень глікогену. Мітохондрії, зазвичай, мають дрібнозернистий матрикс та чітко виражені кристи, внутрішню та зовнішню мембрани. При цьому просвіти синусоїдних гемокапілярів майже не відрізнялись від інтактних, хіба що більшою кількістю еритроцитів. Ультраструктура тканин печінки контрольних тварин за умов ІГТ вказує на компенсаторно-функціональне забезпечення органел клітин, індуковане короткотривалими змінами режимів кисневого постачання. У першу чергу, це стосується кисеньутилізуючих та продукуючих органел – мітохондрій та пероксисом, які знаходяться у тісному функціональному взаємозв’язку зі синтезуючими системами ендоплазматичного ретикулуму. Судячи з представлених результатів, обраний режим тренування не має уражуючого впливу, свідченням чого є підтримання структурно-функціональної цілісності клітинних та субклітинних компонентів печінки.
За умов впливу інтервальної гіпоксії у тварин з хронічною дією етанолу печінкові балки та синусоїди збережені. Просвіти синусоїдів є розширеними, а їх стінка утворена ендотеліальними клітинами з дещо зниженою електронною щільністю цитоплазми. Цитоплазма наповнена значною кількістю структурованих мітохондрій, гранулярним ендоплазматичним ретикулумом, пероксисомами, розширеними цистернами комплексу Гольджі, що вказує на їх посилене функціонування. Все вище сказане може бути свідченням активного перебігу компенсаторних процесів, спрямованих на забезпечення енергетичного та пластичного гомеостазу клітин печінки.
Біохімічні особливості етанольної інтоксикації щурів при застосуванні інтервального гіпоксичного тренування на початку алкоголізації.
Детальний аналіз результатів досліджень не виявив істотної різниці між показниками ТБК-активних продуктів у крові, гомогенатах печінки і мозку тварин у групі з дією ІГТ на початку алкоголізації стосовно тварин з впливом гіпокситерапії після 30-ти денного споживання етилового спирту. Відмінності виявлені щодо активності ферментів антиоксидантного захисту. Проведення ІГТ на початку алкоголізації супроводжується збільшенням активності СОД на 72 %, активності ГПО вдвічі відносно щурів, що споживали етанол впродовж 30-ти днів. Міра активаціії ГПО у крові за умов впливу ІГТ на початку алкоголізації є у 2 рази більшою, ніж у групі з впливом ІГТ після алкоголізації. Відносно активності ферментів антиоксидантного захисту в гомогенатах печінки, то і активність каталази, і СОД зростала відносно контролю у двох групах, з переважанням активації КАТ у групі за умов впливу ІГТ на початку 30-ти денної алкоголізації відносно групи тварин з ІГТ після алкоголізації. Активність ГПО була більшою на 25 % у групі щурів з впливом ІГТ після 30-ти денної алкоголізації відносно групи порівняння. Аналіз стану антиоксидантної системи тканин мозку показав, що активність ферментів КАТ, СОД, ГПО у щурів з гіпокситерапією після алкогольної інтоксикації була більшою на 55 %, на 33 %, на 45 %, відповідно, порівняно з щурами з впливом ІГТ на початку алкоголізації. Вміст нітрит-іонів у мозку тварин за умов дії ІГТ на початку алкоголізації не відрізнявся від тварин з ІГТ після хронічного впливу етанолу.
При співставленні результатів досліджень вмісту молочної та піровиноградної кислот у крові виявлено деякі особливості в залежності від досліджуваної групи. За умов впливу ІГТ після 30-ти денної алкоголізації спостерігається збільшення концентрації молочної та піровиноградної кислот на 10 % та у 2 рази, відповідно, відносно групи з впливом ІГТ на початку алкоголізації. Отримані результати свідчать про компенсаторне енергозабезпечення за рахунок активації гліколітичних реакцій у групі з дією ІГТ вкінці алкоголізації. Аналіз перебігу компенсаторно-пристосувальних змін у досліджуваних тканинах щурів груп порівняння виявив позитивний ефект ІГТ, застосованого у різні періоди споживання етилового спирту тваринами. Встановлено нормалізацію порушених, внаслідок впливу етанолу, процесів ліпопероксидації, яке забезпечується активацією різних ланок антиоксидантного захисту досліджуваних тканин обох груп щурів.
Як видно з рисунку 4, динаміка споживання тваринами 15 %-ного розчину етанолу як єдиного джерела пиття мала двофазний характер. Перший максимум споживання етанолу спостерігається на 5-тий день, другий, більш виражений – на 15-ий день експерименту.
Рис. 4. Динаміка споживання 15 %-ного розчину етанолу щурами, які підлягали впливу інтервального гіпоксичного тренування на початку алкоголізації.
Очевидно, до 5 днів проходить процес звикання до етилового спирту, а після 10 днів алкоголізації, ближче до 15-го дня, формується виражений потяг до алкоголю, що супроводжується збільшенням дози етанолу, який тварини споживають. Не дивлячись на плавне зниження кривої споживання етанолу після 15-того дня, кількість випитого спирту в цей
