НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

КОВАЛЕНКО Оксана Петрівна

УДК 577.217.335

577.217.337.2

ПОРІВНЯЛЬНЕ ВИВЧЕННЯ ПРОСТОРОВОЇ СТРУКТУРИ тРНКSER і тРНКLEU ІЗ THERMUS THERMOPHILUS І ДІЛЯНОК ЇХНЬОГО КОНТАКТУ З ГОМОЛОГІЧНИМИ АМІНОАЦИЛ - тРНК СИНТЕТАЗАМИ

03.00.03 - молекулярна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі ензимології білкового синтезу Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Тукало Михайло Арсентійович,

Інститут молекулярної біології і генетики

НАН України,

завідувач відділу ензимології білкового синтезу.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Негруцький Борис Сергійович,

Інститут молекулярної біології і генетики

НАН України,

провідний науковий співробітник відділу

механізмів трансляції генетичної інформації;

доктор біологічних наук, професор

Виноградова Руфіна Петрівна,

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна

НАН України,

провідний науковий співробітник

відділу біохімії ліпідів.

Провідна установа: Інститут біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України,

м. Київ.

Захист дисертації відбудеться "_28_"____жовтня_________ 2003 року о _1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано ___26___вересня_____________ 2003 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Транспортні РНК відіграють надзвичайно важливу роль у процесі трансляції генетичної інформації. Розуміння механізмів впізнавання тРНК, наслідком якого є специфічне аміноацилування тРНК аміноацил-тРНК синтетазою, досі залишається однією з невирішених проблем молекулярної біології, незважаючи на велику кількість робіт, присвячених цій темі. Результати рентгеноструктурного аналізу і біохімічних досліджень виявили значну подібність просторової будови молекул тРНК, які мають різну амінокислотну специфічність, що додатково ускладнює процес вибору аміноацил-тРНК синтетазою гомологічної тРНК серед інших молекул тРНК. За останні два десятиріччя за допомогою генетичних, біохімічних і біофізичних методів було показано, що для тРНК будь-якої амінокислотної специфічності характерний набір певних секвенс-специфічних елементів впізнавання. Але разом з тим було виявлено, що просторова структура тРНК не лише відіграє роль каркасу для належної репрезентації нуклеотидів - елементів впізнаваня. Встановлено, що для цілого ряду тРНК локальні особливості просторової структури важливі для їхнього ефективного специфічного аміноацилування (Gieg, 1993, 1998).

На особливу увагу заслуговують тРНК ІІ класу, варіабельна гілка яких складається більше ніж з десяти нуклеотидних залишків і утворює додатковий структурний домен, який відсутній в тРНК І класу. У клітинах прокаріотів три види тРНК містять довгу варіабельну гілку: тРНКSer, тРНКLeu і тРНКTyr. За допомогою мутагенезу було визначено елементи впізнавання тРНК ІІ класу із E.coli (Asahara, 1993, 1994; Himeno, 1990; Tocchini-Valentini, 2000). Встановлено, що нуклеотиди антикодону не беруть участі у специфічному впізнаванні тРНКSer і тРНКLeu, тоді як для тРНК І класу (за винятком тРНКAla) антикодон є основним елементом впізнавання (McClain, 1993; Giegй, 1998). Разом з тим критичну роль відіграють елементи просторової структури. Для впізнавання тРНКSer і тРНКTyr важливе значення мають довжина і правильна орієнтація варіабельної гілки, для тРНКLeu - особливості будови корової частини (tertiary core) макромолекули, тоді як роль довгої варіабельної гілки не з'ясовано. З іншого боку, довга варіабельна гілка була запропонована як важливий елемент у процесах дискримінації між тРНК ІІ класу (Brennan, 1976; Himeno, 1990).

Істотним етапом у вирішенні проблеми специфічного аміноацилування тРНК з довгою варіабельною гілкою є визначення особливостей їхньої просторової організації, а також топографії комплексів з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами. Прямим методом для вирішення цих завдань є рентгеноструктурний аналіз, але його застосування обмежене труднощами, які виникають при кристалізації біологічних макромолекул, та невисокою якістю багатьох з одержаних кристалів. На сьогодні отримано кристали та вивчено будову лише двох комплексів тРНК ІІ класу з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами, а саме тРНКSer - серил-тРНК синтетаза і тРНКTyr - тирозил-тРНК синтетаза із Thermus thermophilus (Biou, 1994; Yaremchuk, 2002). Результати досліджень свідчать про наявність у структурах тРНКSer і тРНКTyr просторових взаємодій (tertiary interaction), які не знайдені в тРНК І класу. Але необхідно зауважити, що з одного боку умови кристалізації, а з іншого - взаємодія з ферментом можуть призводити до змін у просторовій організації тРНК (Giegй, 1983; Nureki, 1993; Goldgur, 1997). Тому виникає проблема відповідності структур тРНК у вільному стані та у складі комплексів з білками, а також станів комплексів у кристалі та у розчині. Отже, важливого значення набувають дослідження тРНКSer і тРНКTyr із T.thermophilus як у вільному стані, так і в комплексах з білками в умовах, наближених до фізіологічних, тобто у розчині.

У 70-х роках були отримані кристали тРНКLeu із Escherichia coli (Spencer, 1979), але їхня якість не дозволила вивчити будову тРНК рентгеноструктурним аналізом. Незважаючи на накопичену детальну інформацію про функціональну роль елементів просторової структури прокаріотичних тРНКLeu у процесах специфічного аміноацилування, конкретні особливості цієї будови залишаються нез'ясованими.

Зв'язок роботи з науковими планами, програмами, темами. Дисертаційна робота відповідє основному плану науково-дослідних робіт відділу ензимології білкового синтезу Інституту молекулярної біології і генетики НАН України. Її виконано в рамках бюджетної теми “Вивчення молекулярних механiзмiв специфiчного впiзнавання i амiноацилювання тРНК амiноацил-тРНК синтетазами другого класу”, (номер державної реєстрації - 0100U000793), а також за підтримки гранта № 75195-4801 “Структурні основи специфічного впізнавання аміноацил-тРНК синтетазами гомологічних амінокислот і тРНК” Медичного інституту ім. Говарда Хьюза (м. Чеві Чейз, США).

Мета та завдання дослідження. Метою наших досліджень було встановити спільні та відмінні риси у просторовій організації тРНКSer і тРНКLeu із T.thermophilus, а також визначити ділянки контакту цих тРНК з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі завдання:

1.

2.

3.

4.

Об'єкт дослідження - серинова і лейцинова тРНК прокаріотичного типу.

Предмет дослідження - просторові структури тРНКSer і тРНКLeu із T.thermophilus; ділянки контакту тРНКSer із серил-тРНК синтетазою і тРНКLeu - з лейцил-тРНК синтетазою із T.thermophilus.

Методи дослідження - нуклеотидні послідовності тРНК визначали методом швидкого гель-секвенування (Peattie, 1979), участь залишків фосфорної кислоти і азотистих основ у підтриманні просторової структури тРНК, а також ділянки контакту тРНК з аміноацил-тРНК синтетазами - методами хімічної модифікації (Peattie, 1980; Vlassov, 1981).

Наукова новизна одержаних результатів. Одержало подальший розвиток вивчення просторової структури тРНКSer, а також структури комплексу тРНКSer - серил-тРНК синтетаза із T.thermophilus, яке було проведене в умовах, наближених до фізіологічних, тобто у розчині. Визначено фосфатні залишки і азотисті основи тРНКSer, які беруть участь у формуванні її просторової структури. Виявлено ділянки контакту тРНКSer із серил-тРНК синтетазою. Зроблено висновок про загальну відповідність просторової структури тРНКSer і ділянок її контакту із серил-тРНК синтетазою в розчині та у кристалі.

Визначено фосфатні залишки і азотисті основи, які беруть участь у підтриманні просторової структури прокаріотичної тРНКLeu. Вперше одержано дані, що вказують на різну орієнтацію довгої варіабельної гілки в прокаріотичних тРНКSer і тРНКLeu, а також показано відмінності в організації корових частин цих тРНК.

Виявлено ділянки контакту прокаріотичної тРНКLeu із T.thermophilus з гомологічною лейцил-тРНК синтетазою. Вперше показано, що лейцил-тРНК синтетаза утворює контакти з фосфатами нуклеотидів - учасників корових триплетних взаємодій. Конфігурація останніх, за нашими даними, різна в тРНКSer і тРНКLeu, що дозволило висунути припущення про важливу роль знайдених відмінностей для впізнавання лейцил-тРНК синтетазою гомологічної тРНК.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані дані про реакційну здатність азотистих основ і фосфатних залишків тРНКLeu T.thermophilus дають необхідну інформацію для створення комп'ютерної моделі тривимірної структури цієї тРНК, що має важливе значення для виявлення особливостей просторової організації прокаріотичних тРНКLeu.

Надалі створена модель разом з одержаними нами даними про ділянки контакту тРНКLeu з гомологічною аміноацил-тРНК синтетазою, а також з даними рентгеноструктурного аналізу будови лейцил-тРНК синтетази із T.thermophilus (Сusack, 2000) нададуть можливість створити модель комплексу тРНКLeu - лейцил-тРНК синтетаза із прокаріотів, що має важливе значення для подальшого вивчення структурних основ впізнавання тРНК ІІ класу гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами.

Одержана в роботі інформація про існування контактів між довгою варіабельною гілкою тРНКLeu і лейцил-тРНК синтетазою є вкладом у вирішенняя участі довгої варіабельної гілки в процесах дискримінації серед тРНК ІІ класу.

Результати роботи можуть бути корисними при вивченні еволюційних аспектів функціонування молекул тРНК.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу виконано під керівництвом д.б.н., ст. н. с., зав. відділу ензимологігії білкового синтезу ІМБіГ НАН України М.А.Тукала. Основний обсяг експериментальної роботи виконаний за безпосередньої участі здобувача. Обробку і аналіз отриманих результатів виконано безпосередньо пошукачем. Експерименти із визначення нуклеотидних послідовностей обох тРНКSer, рівней реакційної здатності залишків фосфорної кислоти обох тРНКSer у вільному стані та у присутності серил-тРНК синтетази виконані у співробітництві з к.б.н. З.М. Петрушенко та Н. М. Мальченко. Здобувач висловлює подяку І. А. Крикливому за люб'язно надані препарати індивідуальних тРНКSer і тРНКLeu із T.thermophilus, к.б.н. Г.Д. Яремчук - за визначення нуклеотидних послідовностей генів тРНКLeu із T.thermophilus і люб'язно надані препарати індивідуальних серил- і лейцил-тРНК синтетаз із T.thermophilus. Автор висловлює подяку д. б. н., ст. н. с. М. А. Тукалу за керівництво, корисні поради і обговорення результатів. Одержані результати обговорено та опубліковано в спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на конференціях Медичного інституту ім. Говарда Хьюза для міжнародних наукових співробітників із країн Балтії, центральної Європи і колишнього Радянського Союзу (Прага, Чехія, 1996; Москва, Росія, 1999), XVIII Міжнародній робочій нараді по тРНК (Кембридж, Велика Британія, 2000), VIII-му Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей та тези чотирьох доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 169 сторінках. Вона складається зі вступу, огляду літератури (1 розділ), експериментальної частини (4 розділи), узагальнення одержаних результатів, висновків, списку цитованої літератури, який охоплює 155 найменуваннь, і додатків. Дисертацію проілюстровано 53 рисунками і 2 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослідження. Індивідуальні тРНКSer(GCU), тРНКSer(GGA) та тРНКLeu(CAG) із T.thermophilus виділені та люб'язно надані І.А. Крикливим (ІМБіГ НАН України). Серил-тРНК синтетаза (90% чистоти) і лейцил-тРНК синтетаза (~90% чистоти) із T.thermophilus виділені і люб'язно надані к.б.н. Г.Д. Яремчук (ІМБіГ НАН України).

Для мічення молекул тРНК використовували [32P]- ATP, [32P] ATP з питомою активністю 2000-3000 Кі/ммоль і [ 32 P]pCp з питомою активністю 300 Кі/ммоль ( "Amеrsham", Велика Британія ).

Хімічну модифікацію молекул тРНК проводили із використанням диметилсульфату ("Fluka", Швейцарія), діетилпірокарбонату ("Calbiochem", США) і етилнітрозосечовини (синтезована к.х.н. А. Г. Терент'євим, ІМБіГ НАН України).

Мічення 3'- і 5'-кінців молекул тРНК проводили відповідно з роботами (Bruce, 1978; Vlassоv, 1981; Silberklang, 1977). Визначення нуклеотидної послідовності тРНКSer і тРНКLeu проводили відповідно з роботою (Peattie, 1980).

Алкілування фосфатів тРНКSer і тРНКLeu етилнітрозосечовиною здійснювали згідно з (Vlassоv, 1981), але з невеликими змінами. Інкубацію проводили в умовах, що стабілізують просторову структуру тРНК (300 мМ какодилат натрію рН 8,0, який містив 100 мМ NaCl; 20 мМ MgCl2; 2 мМ EДTA; при 65?С протягом 5 хв), і в умовах денатурації (300 мМ какодилат натрію рН 8,0; 2 мМ EДTA 2 хв при 80?С).

Алкілування азотистих основ тРНКSer і тРНКLeu. Хімічну модифікацію залишків гуанозину і цитидину диметилсульфатом, аденозину - діетилпірокарбонатом і наступний гідроліз тРНК за модифікованими основами здійснювали як в роботі (Peattie, 1980), але з невеликими змінами. Інкубацію проводили в 50мМ какодалаті натрію рН 7,0; 10 мМ MgCl2 при 65С (контрольні інкубації і нативні умови) і в присутності 1 мМ ЕДТА, але за відсутності MgCl2; при 65С (умови напівденатурації) або 90С (умови денатурації).

Визначення ділянок контакту тРНКSer і тРНКLeu з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами здійснювали методом захисту фосфатів тРНК аміноацил-тРНК синтетазами від модифікації етилнітрозосечовиною відповідно до (Vlassоv, 1981). Алкілування тРНК у присутності гомологічної аміноацил-тРНК синтетази проводили в умовах, що сприяють комплексоутворенню, а саме - в 50 мМ трис-HCl рН 7,9; який містив 5 мМ MgCl2; 2,5 мМ ?-меркаптоетанол; при 37?С протягом 2 год. Суміш містила 1мкМ тРНКSer або тРНКLeu і 4 мкМ відповідну аміноацил-тРНК синтетазу. Такий надлишок дозволяє не зважати на зниження активності ферменту під час інкубації.

Фрагменти міченої тРНК, отримані в результаті гідролізу модифікованих молекул, розділяли електрофорезом у поліакриламідному гелі різної концентрації (10%, 12,5%, 15% і 20%) у присутності 8М сечовини. Для радіоавтографії гелів використовували рентгенівську плівку Kodak. Інтенсивність електрофоретичних смуг, яка відображає ступінь модифікації фосфатів, визначали, використовуючи сканувальний денситометр "UltraScan XL" фірми LKB (Швеція).

Результати досліджень та обговорення. Визначення нуклеотидних послідовностей тРНКLeu і тРНКSer із T.thermophilus. Було досліджено дві ізоакцепторні тРНКSer і одну тРНКLeu із T.thermophilus. Нуклеотидні послідовності тРНКSer(GCU), тРНКSer(GGA) і тРНКLeu(CAG) із T.thermophilus визначали методом швидкого гель-секвенування (Peattie, 1979), в основі якого лежить специфічна хімічна деградація полінуклеотидного ланцюга тРНК. Мінорні нуклеотидні залишки визначені к.б.н З.М. Петрушенко та Н.М. Мальченко (ІМБіГ НАН України) (Петрушенко, 1997).

Встановлено, що тРНКSer(GCU) складається із 93, тРНКSer(GGA) - із 94 нуклеотидних залишків, з яких 62 гомологічні залишкам у структурі тРНКSer(GCU) (рис.1). Послідовності акцепторних стебел, Т- і D -гілок майже ідентичні (за винятком пари 10-25), в антикодоновій і варіабельних гілках гомології практично відсутні. Довжина варіабельної петлі тРНКSer(GGA) збільшена порівняно з тРНКSer(GCU) на 1 нуклеотидний залишок. тРНКLeu T.thermophilus складається із 87 нуклеотидних залишків, з яких 37 - гомологічні залишками в "узагальненій" послідовності двох ізоакцепторних тРНКSer із T.thermophilus. Аналіз послідовностей D- петель і варіабельних гілок тРНКSer і тРНКLeu виявив , що D - петля тРНКSer має структуру ? =1, в=3, ?іж варіабельним стеблом і нуклеотидом у положенні 48 немає неспарених нуклеотидних залишків;

Рис. 1. Структури тРНКSer(GCU) (А), тРНКSer(GGA) (Б) і тРНКLeu(CAG) (В) із T.thermophilus у вигляді листка конюшини. Виділено нуклеотиди, які гомологічні для обох тРНКSer (Б), а також для тРНКLeu, тРНКSer(GCU) і тРНКSer(GGA) із T.thermophilus (В). Зірочками позначено мінорні нуклеотидні залишки в тРНКLeu. Нумерація нуклеотидів загальноприйнята (Sprinzl, 1980)

у тРНКLeu D-петля має структуру ? =2, в=2 ? присутній один неспарений залишок між варіабельним стеблом і нуклеотидом 48, що є характерними особливостями послідовностей тРНКSer і тРНКLeu із клітин прокаріотів. За цими ознаками, що запропоновані як важливі для формування просторової структури тРНК ІІ класу (Himeno, 1990), тРНКSer і тРНКLeu є типовими прокаріотичними сериновими і лейциновими тРНК відповідно.

Дослідження просторової структури тРНКSer і тРНКLeu із T.thermophilus. Для дослідження тРНКSer і тРНКLeu із T.thermophilus використовували методи хімічної модифікації, які дозволяють вивчити елементи просторової структури РНК на рівні окремих нуклеотидів. Реакційну здатність залишків фосфорної кислоти тРНКSer визначали за допомогою етилнітрозосечовини, яка реагує з кисневими атомами фосфатних груп нуклеїнових кислот. Низька реакційна здатність фосфатних залишків свідчить про їхню участь в утворенні водневих зв'язків з іншими елементами структури тРНК або у зв'язуванні іонів металу. Доступність фосфатів для модифікації вивчали в умовах, що стабілізують просторову структуру тРНК, і в умовах денатурації. В обох тРНКSer неможливо дослідити рівень модифікації 5'-фосфату нуклеотиду G19 через присутність у положенні 18 залишку з 2'-О-метилрибозою (Петрушенко, 1997), що значно ускладнює розрив фосфодіефірного зв'язку між нуклеотидами 18 і 19. Відносні реакційні здатності залишків фосфорної кислоти визначали на основі розрахунків денситограм відповідних електрофоретичних доріжок.

З кривих розрахунку денситограм ( рис.2 ) видно, що фосфати з низьким рівнем модифікації розташовані переважно на гомологічних ділянках в тРНКSer(GCU) і тРНКSer(GGA): у куті між акцепторним і D-стеблами (Р7-P11), у D-петлі (Р20 - Р22), у варіабельній (Р47h-P47j) і Т-петлях (Р57-Р60), а також на ділянці з'єднання варіабельного і Т-стебел (Р47q - Р49). У тРНКSer(GGA) додатково низький рівень модифікації мають 5'-фосфати нуклеотидів антикодонової петлі (Р36, Р37).

Реакційну здатність азотистих основ тРНКSer визначали в умовах стабілізації, напівденатурації і денатурації просторової структури тРНК. Для модифікації використовували диметилсульфат, який алкілує атом N7 гуаніну і атом N3 цитозину, а також діетилпірокарбонат, який етилює атом N7 аденіну. Оскільки атом N3 цитозину бере участь в утворенні Вотсон-Криківських пар нуклеотидів, а реакції модифікації залишків гуанозину і аденозину чутливі до стекінг-взаємодій, що виникають на двоспіральних ділянках тРНК, визначити участь у просторових взаємодіях можливо лише для тих залишків, які розташовані на одноланцюгових ділянках. Винятком є залишки G51-G53, низька реакційна здатність яких пов'язана, найімовірніше, із взаємодією основ з іоном Mg2+, що стабілізує просторову структуру тРНК. Таку взаємодію спостерігали в кристалі тРНКPhe дріжджів (Teeter, 1980; Shi, 2000), а також запропоновано для тРНКSer дріжджів при комп'ютерному моделюванні її просторової структури (Dock-Bregeon, 1989).

В умовах збереження просторової структури в обох тРНКSer нереакційноздатні основи залишків G9, G13, A14, A22, С48, C56, G57, A59, а також пуриновий залишок у положенні 26. Додатково в тРНКSer(GGA) низький рівень модифікацій мають основи С32, ms2i6A37, A38 і A47j.

Результати модифікації фосфатних груп і азотистих основ тРНКSer наведено на рис.3. Порівняння одержаних результатів свідчить, що розбіжності в реакційній здатності гомологічних фосфатів і азотистих основ характерні переважно для нуклеотидів антикодонової петлі. У тРНКSer(GGA) в положеннях 35 і 36 знаходяться залишки пуринів на відміну від тРНКSer(GCU), де вони представлені піримідинами. Таким чином, 3'-ділянка антикодонової петлі тРНКSer(GGA) складається виключно із залишків пуринів, що створює інші порівняно з тРНКSer(GCU), умови для стекінг-взаємодій основ і може призводити до виникнення такої локальної конформації петлі, для стабілізації якої необхідне зв'язування катіону. Отже, знижена реакційна здатність нуклеотидних залишків антикодонової петлі тРНКSer(GGA), найімовірніше, пов'язана з існуванням центру зв'язування іона Mg2+, як це спостерігали, наприклад, у тРНКPhe дріжджів (Shi, 2000). Знайдені відмінності, очевидно, не мають принципового значення для формування особливої просторової структури тРНКSer. Аналіз одержаних результатів вказує на те, що незважаючи на значні відмінності у нуклеотидних послідовностях, тРНКSer(GCU) і тРНКSer(GGA) iз T.thermophilus мають однакову загальну просторову конфігурацію.

Формування просторової структури тРНКSer, ймовірно, відбувається з виникненням пар нуклеотидів G19-C56, U8-A14, Pu26-U44 (де Pu - залишок пурину) і G15-C48. Основа А59, найімовірніше, розташована над нуклеотидами пари 15-48 і знаходиться з ними у стекінг-взаємодії. В корі тРНКSer виникає незвичайна триплетна взаємодія G9-A22-G13, додатково стабілізована водневим зв'язком між основою G9 і фосфатною групою нуклеотиду А22. У Т-петлі виникають водневі зв'язки між фосфатами нуклеотиду U60, атомом N4 основи С61 і рибозою нуклеотиду m1A58, між Ш55 і фосфатом нуклеотиду m1A58, що вказує на канонічну просторову структуру Т-петлі, обумовлену наявністю консервативних нуклеотидних залишків

Рис. 3. Структури тРНКSer(GCU) (А) і тРНКSer(GGA) (Б) у вигляді листка конюшини. Трикутниками позначені залишки фосфорної кислоти, стрілками – залишки гуанозину, цитидину і аденозину, реакційна здатність яких знижена в умовах, що зберігають просторову структуру тРНК (за винятком залишків, які розташовані на двоспіральних ділянках

у положеннях 54, 58 і 61 (Romby, 1987). Просторова структура тРНКSer стабілізована взаємодією нуклеотидів, які розташовані на стику акцепторного та D-стебел (Р7-Р10), у варіабельній петлі (Р47h-P47j в тРНКSer(GCU) ; Р47і i А47j в тРНКSer(GGA)) і Т-стеблі (G51-G53) з іонами Mg2.

Одержана нами інформація про реакційні здатності фосфатів і азотистих основ в тРНКSer T.thermophilus, узгоджується з даними, які очікували, виходячи з будови тРНКSer у кристалі (Biou, 1994). Це дозволило нам зробити висновок про загальну відповідність просторової структури тРНКSer в розчині та у кристалі в межах застосованих методів дослідження.

При вивченні просторової структури тРНКLeu із T.thermophilus застосовували ті ж методичні підходи, що й для тРНКSer. Через неспецифічну деградацію полінуклеотидного ланцюга не вдалося визначити реакційну здатність фосфатів нуклеотидів 20а, 28 і 47d. З кривої розрахунку денситограм (рис. 4) видно, що в умовах, які стабілізують просторову структуру, в тРНКLeu T.thermophilus низький рівень модифікації мають фосфати D-гілки (Р11, Р12, Р21, Р22), фосфати, які розташовані у кутах між антикодоновим і варіабельним стеблами (Р45) та між варіабельним і Т-стеблами (Р48), а також у Т-петлі (Р58-60). Нереакційноздатними виявились основи залишків G9, A14, A15, A20a, G21, A22, A26, C56, A57 і G59, що свідчить про їхню участь у підтриманні просторової структури тРНКLeu (рис. 5).

Рис. 5. Структура тРНКLeu T.thermophilus у вигляді листка конюшини. Трикутниками позначено залишки фосфорної кислоти, стрілками - залишки гуанозину, цитидину і аденозину, які мають низький рівень модифікації специфічними хімічними реагентами в умовах, що стабілізують просторову структуру тРНК

Аналіз одержаних результатів свідчить про те, що молекули тРНКLeu T.thermophilus мають канонічну просторову L-форму, при утворенні якої відбувається взаємодія D- і Т-петель з виникненням пар G19-C56 і G26-U44. Т-петля, найімовірніше, має канонічну просторову конфігурацію. Довга варіабельна гілка експонована у розчин. У коровій частині тРНКLeu виникає триплетна взаємодія нуклеотидів (8-14)-21, характерна для тРНК як І, так і ІІ класу (Jack, 1976; Moras, 80; Biou, 1994; Yaremchuk, 2002). Одержані нами результати вказують на існування в корі тРНКLeu ще двох триплетних взаємодій (15 - 48) - 20а і 9 - (13 - 22), які не знайдені в тРНК І класу (триплет 9 - (13 - 22), можливо, існує лише в тРНКCys E.coli (Nissen, 1999; Christian, 2000), але присутні у двох інших

тРНК ІІ класу із T.thermophilus, тРНКSer (Biou, 1994) і тРНКTyr (Yaremchuk, 2002), і,

мабуть, є характерною особливістю тРНК з довгою варіабельною гілкою. Структура тРНКLeu T.thermophilus стабілізована взаємодіями з іонами Mg2+, які відбуваються за участю фосфатних залишів нуклеотидів С11, G12, G18 і азотистих основ залишків G51, G52, G53.

Умови експериментів були аналогічними для тРНКSer і тРНКLeu із T.thermophilus, що дозволило порівняти одержані результати. Очевидно, що встановлені нами взаємодії, які виникають при утворенні просторової структури

тРНКLeu, аналогічні взаємодіям у тРНКSer. Разом з тим знайдено і суттєві відмінності. Порівняння рівней модифікації фосфатів варіабельних гілок виявило, що в тРНКSer нереакційноздатні фосфати, розташовані у куті між варіабельним і Т-стеблами (Р47q - Р49), у тРНКLeu нереакційноздатний лише Р48, але низьку реакційну здатність має також фосфат Р45, розташований у куті між варіабельним і антикодоновим стеблами. Різні картини модифікації фосфатних груп нуклеотидів, розташованих в основі варіабельного стебла, вказують на різні способи взаємодії варіабельної гілки з "тілом" молекули і, як наслідок, на різну орієнтацію варіабельних гілок у тРНКSer і тРНКLeu. У тРНКSer перша пара нуклеотидів варіабельного стебла знаходиться у стекінг-взаємодії з основою G20b (D-петля), яка і визначає напрямок варіабельної гілки (Biou, 1994). У тРНКLeu залишок 20b відсутній, але встановлено, що певна роль у взаємодії варіабельної гілки з коровою частиною тРНК належить залишку 47j, реакційна здатність якого знижена. Наявність неспареного нуклеотидного залишку перед залишком U48 є характерною особливістю прокаріотичних тРНКLeu (Himeno, 1990), тому можливо, що G47j у тРНКLeu T.thermophilus є функціональним аналогом залишку G20b в тРНКSer.

Другу важливу відмінність було знайдено у реакційній здатності основ залишків 15 і 21, які входять до складу корових триплетних взаємодій (8 -14) - 21 і (15 - 48) - 20а. У тРНКSer залишок 21 повністю реакційноздатний, а реакційна здатність залишку 15 лише дещо знижена. У тРНКLeu обидва залишки нереакційноздатні, що на нашу думку, свідчить про різні умови для стекінг-взаємодій основ у корових частинах досліджуваних тРНК, а отже, про різну конфігурацію триплетних взаємодій в тРНКSer і тРНКLeu із T.thermophilus. Одним із можливих пояснень виникнення сильних стекінг-взаємодій в корі тРНКLeu є збереження планарності триплетів (8 - 14) - 21 і 9 - (13 - 22), яка порушена в тРНКSer (Biou, 1994). Очевидно, що причиною виникнення відмінностей в структурах корових частин тРНКSer і тРНКLeu є відсутність на в-ділянці D-петлі тРНКLeu додаткового нуклеотидного залишку в положенні 20b, який відіграє важливу роль у формуванні "внутрішньомолекулярного простору" двох інших тРНК ІІ класу із T.thermophilus, тРНКSer (Biou, 1994) і тРНКTyr (Yaremchuk, 2002). Наші висновки добре узгоджуються з припущенням, що участь D-петлі в корових взаємодіях відіграє важливу роль у створенні локальних відмінностей у просторовій будові молекул тРНК, що може мати суттєве значення для специфічного впізнавання гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами (Himeno, 1990; Perret, 1992).

Визначення ділянок контакту тРНКSer і тРНКLeu із T.thermophilus з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами проводили методом захисту фосфатних залишків тРНК від модифікації етилнітрозосечовиною в присутності аміноацил-тРНК синтетаз. Як було показано (Vlassov, 1981), у зоні контакту з ферментом доступність фосфатів для дії реагенту зменшена. Стратегія експериментів аналогічна до таких для вільної тРНК. Через ефект "стиснення" електрофоретичних смуг не вдалося визначити рівень модифікації фосфатів, які розташовані у куті між варіабельною гілкою і Т-стеблом, а також фосфатів з 5'-боку Т-стебла (Р47і-Р53) в тРНКLeu.

З кривих розрахунку денситограм (рис.6) видно, що серил-тРНК синтетаза із T.thermophilus захищає від модифікації етилнітрозосечовиною 5'-фосфати нуклеотидів, які в обох тРНКSer розташовані на трьох ділянках: у варіабельному стеблі (фосфати 46- 47c, 47o, 47p), Т-гілці (Р 53, Р54, Р57) і акцепторному стеблі (Р67-Р69). Реакційну здатність фосфатної групи залишку G57 у тРНКSer(GCU) встановити не вдалося через неспецифічний гідроліз полінуклеотидного ланцюга на відповідній ділянці. Фосфати антикодонової і D-гілок мають високий рівень модифікації, тобто не беруть участі в утворенні зв'язків з ферментом. Ділянки контакту з білком в обох ізоакцепторних тРНКSer збігаються, незважаючи на відмінності у нуклеотидних послідовностях варіабельних гілок.

Порівняння ділянок взаємодії тРНКSer із серил-тРНК синтетазою в розчині та у кристалі (рис.7), виявило відповідність одержаних нами результатів даним рентгеноструктурного аналізу. Таким чином, наші результати дозволяють зробити висновок про те, що взаємодія тРНКSer із серил-тРНК синтетазою із T.thermophilus у розчині та у кристалі відбувається аналогічно, при визначальній ролі рибозофосфатного остова молекули тРНК. Відомо, що правильна

Рис. 7. Узагальнена послідовність тРНКSer(GCU) і тРНКSer(GGA) із T.thermophilus у вигляді листка конюшини. Вказано залишки фосфорної кислоти, які захищені від алкілування етилнітрозосечовиною у присутності серил-тРНК синтетази у розчині ( ), і фосфатні групи, з якими фермент взаємодіє у кристалі ( ) (Biou, 1994). Крапками позначено положення, за якими нуклеотидні послідовності двох ізоакцепторних тРНКSer T.thermophilus відрізняються одна від одної

орієнтація варіабельної гілки є найважливішою умовою специфічного аміноацилування тРНКSer E.coli (Аsahara, 1994), тому очевидно, що безпосередній контакт серил-тРНК синтетази з довгим варіабельним стеблом не лише відіграє важливу роль у впізнаванні тРНКSer із T.thermophilus, але й дозволяє уникнути помилкового аміноацилування серином тРНКLeu, в якій орієнтація варіабельної гілки, як ми встановили, відрізняється від такої в тРНКSer.

У тРНКLeu із Thermus thermophilus у присутності лейцил-тРНК синтетази захисту від модифікації етилнітрозосечовиною зазнають фосфати, які локалізовані в чотирьох зонах: у D-петлі (Р14, Р15), з 3'-боку D-стебла (Р24, Р25), в антикодоновому (Р38-Р40) і варіабельному (Р47і) стеблах (рис. 8 і рис.9). Фосфатні групи антикодонової петлі не захищені ферментом від модифікації, більше того, у присутності лейцил-тРНК синтетази відбувається деградація полінуклеотидного ланцюга на ділянці антикодону (Р34 - Р36), якій не запобігає додавання у реакційну суміш інгібітора нуклеаз. Можливо, при взаємодії з тРНК фермент спричиняє конформаційні зміни в антикодоновій петлі, внаслідок чого її структура на окремих ділянках стає менш стабільною (Deitrich, 1989; Петрушенко, 1989).

Рис. 9. Структура тРНКLeu T.thermophilus у вигляді листка конюшини. Вказано залишки фосфорної кислоти, які захищені від модифікації етилнітрозосечовиною у присутності лейцил-тРНК синтетази

Розташування ділянок контакту вказує на те, що лейцил-тРНК синтетаза із T.thermophilus взаємодіє з гомологічною тРНК з боку D-гілки. На відміну від серил-тРНК синтетази контакт лейцил-тРНК синтетази з варіабельним стеблом тРНКLeu, ймовірно, відіграє лише допоміжну роль у процесах дискримінації серед тРНК ІІ класу. Основними детермінантами специфічного впізнавання тРНКLeu E.coli є структура ?- і ?-ділянок D-петлі, а також залишки А14, А15 і А20а, які важливі саме як елементи просторової структури (можливо, за винятком А14) (Asahara, 1993, 1998). Отже, важливого значення набувають знайдені нами контакти лейцил-тРНК синтетази з фосфатами нуклеотидів 14 і 15 тРНКLeu T.thermophilus. За результатами наших досліджень структура корової частини тРНКLeu, побудована за участю саме цих нуклеотидів, відрізняється від структури кору тРНКSer, що дозволило висунути припущення про важливу роль знайдених відмінностей для впізнавання лейцил-тРНК синтетазою гомологічної тРНК. Можливо, на ділянці залишків 14 і 15 відбувається формування унікальної конфігурації цукрово-фосфатного остова.

Результати наших досліджень є основою для подальшого вивчення особливостей функціонування прокаріотичних тРНКLeu і вказують на необхідність ретельного дослідження можливості секвенс-специфічного впізнавання залишку А14 в корі тРНКLeu, а також ролі довгої варіабельної гілки тРНКLeu у процесах дискримінації серед тРНК ІІ класу.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі досліджено просторову структуру прокаріотичних тРНКSer і тРНКLeu у розчині, а також ділянки контакту цих тРНК з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами, що важливо для вивчення структурних основ функціонування тРНК ІІ класу.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ

ДИСЕРТАЦІЇ

1.

Особистий внесок дисертанта - визначення нуклеотидних послідовностей тРНКSer(GCU) і тРНКSer(GGA) із T.thermophilus методом швидкого гель-секвенування.

2.

Особистий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності фосфатних груп тРНКSer(GGA) в присутності серил-тРНК синтетази із T.thermophilus.

3.

Особистий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності фосфатних груп в тРНКSer(GCU) і тРНКLeu(CAG) із T.thermophilus.

4.

Особстий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності фосфатних груп і азотистих основ, що входять до складу тРНКSer(GCU).

5.

Особистий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності азотистих основ, що входять до складу тРНКLeu(CAG) із T.thermophilus.

6.

Особистий внесок дисертанта - визначення нуклеотидної послідовності двох ізоакцепторних тРНКSer із T.thermophilus методом швидкого гель-секвенування; визначення ділянок контакту тРНКSer з серил-тРНК синтетазою із T.thermophilus.

7.

Особистий внесок дисертанта - визначення нуклеотидної послідовності тРНКLeu із T.thermophilus; визначення реакційної здатності фосфатних залишків в тРНКLeu і тРНКSer із T.thermophilus; визначення ділянок контакту тРНКLeu і тРНКSer з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами.

8.

Особистий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності фосфатних залишків і азотистих основ в тРНКLeu і тРНКSer із T.thermophilus; визначення ділянок контакту тРНКLeu і тРНКSer з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами.

9.

Особистий внесок здобувача - визначення реакційної здатності фосфатних залишків і азотистих основ в тРНКLeu і тРНКSer із T.thermophilus; визначення ділянок контакту тРНКLeu і тРНКSer з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами.

АНОТАЦІЯ

Коваленко О. П. Порівняльне вивчення просторової структури тРНКSer і тРНКLeu із Thermus thermophilus і ділянок їхнього контакту з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2003.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню просторової структури прокаріотичних тРНКSer і тРНКLeu у розчині, а також ділянок контакту цих тРНК з гомологічними аміноацил-тРНК синтетазами, що важливо для вивчення структурних основ функціонування тРНК ІІ класу. В результаті проведеної роботи визначено нуклеотидні послідовності тРНКSer(GCU), тРНКSer(GGA) і тРНКLeu(CAG) із T.thermophilus. Методами хімічної модифікації