академія медичних наук україни

Інститут фармакології та токсикології

КОШЕЛЄВ Олег Станіславович

УДК 612.821.2:611.813.14] – 02:615.31

експериментальне обгрунтування використання похідних вазопресину для регуляції просторової пам`яті і функціонального стану гіпокампа

14.03.05. - фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Центральній науково-дослідній лабораторії Дніпропетровської державної медичної академії МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, Дроздов Олексій Леонідович, Центральна науково-дослідна лабораторія Дніпропетровської державної медичної академії МОЗ України, завідуючий

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор, Вікторов Олексій Павлович, Інститут кардіології ім. М.Д.Стражеско АМН України, завідуючий відділом клінічної фармакології

доктор медичних наук, професор, Кульчицький Олег Костянтинович, Інститут геронтології АМН України, завідуючий лабораторії регуляції метаболізму

Провідна установа: Одеський державний медичний університет МОЗ України, кафедра загальної та клінічної фармакології

Захист відбудеться “_18_” ____лютого____2004 р. о ___15_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.550.01 в Інституті фармакології та токсикології АМН України ( 03057, м. Київ, вул. Е. Потьє, 14)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України ( 03057, м. Київ, вул. Е. Потьє, 14)

Автореферат розісланий “__16_” _____січня___2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.26.550.01

кандидат біологічних наук І.В.Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. В останній час вивчення нейрофізіологічних та нейрохімічних механізмів такої інтегративної функції головного мозку, як пам`ять ( Н.П.Бехтерева, 1971; Г.А.Вартанян и др. 1984; Р.Ю.Ильюченок, 1979), а також розробка способів її фармакологічного поліпшення, пошук нових груп лікарських засобів для лікування розладів мнестичних процесів, є однією з актуальних проблем фармакології ( І.П.Ашмарін, 1996; Т.О.Вороніна, 2001; Л.О.Громов, 1996; та ін.).

Вивчення різних нейрофізіологічних показників (збудження, викликані потенціали, нейрональна активність та інш. ), використання методик моно - та білатерального фармакологічного або хірургічного руйнування структур центральної нервової системи дозволило встановити мозкові утворення, які приймають участь в процесах навчання та пам`яті (Н.П.Бехтєрєва, 1985; В.О.Крауз, 1976 та ін.). Вивчення цих аспектів проблеми говорить про те, що провідну роль в мнестичних процесах належить гіпокампу (Гп). Вказана структура ЦНС у взаємодії з іншими утвореннями мозку виконує роль детектора новини та компаратора зовнішніх сигналів ( G.J.De Vries et al.,1998; R.E.Clark et al.,1998), бере участь в процесах збереження інформації ( L.E. Iarrard, 1993; J.E.Gabrieli et al., 1997) та відтворенні пам`ятного сліду ( I.Izquierdo, 1998). В останній час особливу увагу дослідники приділяють вивченню ролі Гп в конкретних видах пам`яті : декларативній (K.Petersson et al.,1997), семантичній ( L.R.Squire, S.M.Zola, 1998) та, особливо, розлоговій ( R. Worden, 1992). В процесі розробки цієї проблеми сформувалося уявлення про те, що в морському конику відбувається кодування зовнішнього простору за алоцентричним принципом (N.Spear, J.Miller, 1990). Крім того, визначена (E.R.Wood et al.,1999) необхідність участі даного мозкового утворення в процесах відновлення закодованої раніше інформаціїї по неповному або дефектному зразку (R.C.O`Keilly, I.L.McClelland, 1991).

Вивчення фармакологічних властивостей ноотропних препаратів (Г.В.Ковальов, 1990; М.Д. Машковський, 1993; О.В. Стефанов, 2000), в першу чергу сполук, які селективно стимулюють цю інтегративну функцію мозку, активують пізнавальну діяльність та мнестичні процеси, привело до суттєвого розширення даного класу лікарських засобів. На сьогодняшній день в цю групу включають похідні пірролідіну, антифеіну, пірідоксину, оротової та феноксіоцтової кислот, ГАМК та її аналоги, алколоіди ріжка, стимулятори мозкового кровообігу та засоби, які мають серед своїх ефектів ноотропний компонент (наприклад, синаптотропні фармакопрепарати). Однією з перспективних груп ксенобіотиків, які вивчаються в якості потенційних ноотропних засобів, являються пептиди (В.Е.Клуша 1984; Л.О.Громов, 1992) і, в особливості, похідні аргінін-вазопресину (АВП). Вивчення нейротропних ефектів антидіуретичного гормону, започатковане в 60 - х роках XX століття D. de Wied`ом (1967), закінчилося експериментальним та клінічним доказом наявності у нього стимулюючого впливу на процеси навчання та пам`яті, а також когнітивні здібності (D.De Wied, 1993; M. Kubota, 1997). Цей вплив обумовлен здатністю АВП поліпшувати як консолідацію ( Y.Shen, R.Li, 1995), так і відтворення ( О.Л.Дроздов 1992,1993;B.Alescio-Lautier, B.Soumireu-Mourat, 1998) енграм пам`яті. В останній час активно вивчаються метаболіти, фрагменти та аналоги антидіуретичного гормону (АДГ) з переважно нейротропним ефектом (M.J.Neal et al., 2002) в плані пошуку сполук, переважаючих по силі ефект родоначальника, а також з метою розшифровки механізму їх дії. В цьому аспекті найбільшу увагу привертає N-кінцевий фрагмент АВП послідовності 4-9, тому що у цієї сполуки практично відсутні гормональні властивості (Г.В.Дзяк та ін., 2002 ). Подальше порівняльне вивчення ноотропних ефектів пептидів вазопресинового ряду показало наявність серед них сполук переважаючих, як антидіуретичний гормон, так і тетрапептидний частково захищений фрагмент АВП послідовності 4-9 по ефекту, наприклад, на відтворення пам`ятного сліду (О.Л.Дроздов, 1992; S.Tanabe et al., 1997).Разом з тим, ще не встановленим залишається вплив аналогів та N - і С - кінцевих фрагментів вазопресину (ВП), виявляючих переважно нейротропну дію, на розлогову пам`ять у тварин.В ряді наукових праць була встановлена істотна роль ВП та його присутність в гіпокампі (I.J.Urban, 1998) в процесах збереження та відтворення інформації. Використання методики інтрагіпокампальних ін`єкцій АВП та його аналогів (C. Barberis, E.Tribollet, 1996) підтвердило значення даного мозкового утворення в перебігу мнестичних реакцій. В цих умовах спостережень було встановлено, що ефекти зазначених речовин реалізуються через вазопресинові рецептори I типа (R.S.Yamazaki et al.,1996). Але, ще недостатньо вивченими являються зміни показників функціонального стану гіпокампу на фоні попереднього застосування вазопресину, його аналогів, С - і N - кінцевих фрагментів з переважно нейротропною дією в дозах, що стимулюють відтворення енграм пам`яті.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в Центральній науково-дослідній лабораторії Дніпропетровської державної медичної академії (ДДМА) згідно плану держбюджетної науково-дослідної роботи МОЗ України за темою : “Розробка та впровадження в практику охорони здоров'я технології лікування розладів пам'яті із застосуванням пептидних аналогів вазопресину”( № державної реєстрації 0199 U 002121 ) та плану науково-дослідних робот ДДМА на 2001-2003 рік.

Мета та задачі роботи. На основі експериментальних досліджень встановити характер впливу вазопресину та його аналогів на просторову пам`ять та функціональну активність гіпокампу.

У відповідності до мети було визначено такі основні задачі дослідження:

1.

2.

3.

4.

Об`єкт дослідження – функціональний стан гіпокампу та структури порівняння фронтальної зони неокортексу у білих щурів лініі Вістар.

Предмет дослідження - аргінін-вазопресин, його аналоги, С- і N- кінцеві фрагменти гормону, пірацетам.

Методи дослідження: фармакологічні, поведінкові, нейрофізіологічні, нейрохімічні, статистичні методи.

Наукова новизна роботи. Проведеними дослідженнями вперше експериментально було визначено, що пірацетам, аргінін-вазопресин, його аналоги, N - і С-кінцеві фрагменти з переважною нейротропною активністю в дозах, що стимулюють відтворення енграм пам`яті у тварин, по - різному впливають на просторову пам`ять. Показано, що АВП скорочує пошук схованої платформи на всьому перебігу досліду, пентапетидний аналог НРФ - зменшує в першій спробі та подовжує латентний період просторової пам`яті в заключній (четвертій), а N - (АВП-4-9) та С - (АВП-2-5) кінцеві фрагменти істотно не впливають на час пошуку зануреної платформи у водному лабіринті при тестуванні стану просторової пам`яті. Вперше встановлена закономірність змін показників біоелектричної активності гіпокампу в порівнянні з фронтальною зоною неокортексу (ФК), у щурів на фоні застосування пірацетаму та пептидів цієї родини. АВП-4-9 через 20 хв після використання приводив до одночасного ( у Гп та фронтальній корі ) підвищення частоти домінуючої складової, пептиди НРФ та АВП-2-5 викликали аналогічні зміни у ФК через 5 хв, а у гіпокампі на пізніших етапах дослідів. На підставі отриманих даних встановлені зміни концентрації продуктів біологічного окислення, підвищення вмісту лактата на фоні дії пірацетаму, АВП та АВП-2-5, накопичення ТБК активного продукту під впливом АВП та 2Г-ДГА-АВП та зростання рівня 2,3-діфосфогліцерату (показник кисневого забезпечення), після застосування НРФ та АВП-4-9 у Гп. Встановлено, що АВП, його аналоги та N- і С- кінцеві фрагменти неоднаково впливають на рівень насичених і ненасичених вільних жирних кислот (ВЖК). Використання пептидів в дозах, що поліпшують відтворення енграм пам`яті, підвищують концентрацію насичених порівняно низькомолекулярних та зменшують рівень ненасичених ( включаючи арахідонову ) вільних жирних кислот у Гп.

Практичне значення отриманих результатів. Робота є фундаментальним дослідженням, що поглиблює сучасні уявлення про зрушення показників пам`яті, нейрофізіологічні та нейрохімічні зміни функціонального стану гіпокампу, які виникають на фоні дії пірацетаму, аргінін-вазопресину, його аналогів та С- і N- кінцевих фрагментів антидіуретичного гормону. Встановлено нові закономірності впливу вивчаємих сполук на процеси просторової пам`яті, нейрофізіологічну активність гіпокампа в порівнянні з фронтальною зоною неокортекса, визначено вплив цієї групи ксенобіотиків на вміст продуктів гліколізу та перекісного окислення ліпідів, а також 2,3 – діфосфогліцерата, концентрацію вільних жирних кислот, включаючи такий вторинний мессенджер, як арахідонова кислота.

Отримані експериментальні дані можуть бути підґрунтям для розробки принципів адекватного фармакологічного управління перебігом мнестичних процесів з урахуванням змін функціональної активності гіпокампа.

Результати дослідження впроваджені в учбовий процес кафедр нормальної фізіології, патологічної фізіології Дніпропетровської державної медичної академії та кафедри загальної та клінічної фармакології Запорізького державного медичного університету, відображені в монографії “Ренальні ефекти похідних вазопресину”. За результатами дослідів було отримано патент України № 44397 А.

Особистий внесок здобувача. Представлені в роботі матеріали є особистими дослідженнями автора. Визначені напрямки досліджень, сформульована мета та завдання роботи. Здобувач самостійно провів експериментальні дослідження, аналіз даних літератури, статистичну обробку та аналіз результатів, розробив основні положення та сформулював висновки роботи.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідались і обговорювались на наукових конференціях: “Школа академіка О.І.Черкеса: ідеї, розвиток, перспективи” (м. Київ, 1994), “Актуальні питання морфології та клінічної медицини” ( м. Дніпропетровськ, 1996), V міжнародній науково-практичній конференції “Франція та Україна, науково-практичний досвід у контексті діалогу національних культур” (м. Дніпропетровськ, 1998). Міжнародному симпозіумі “International Behavioral Neuroscience Society. 8th Annual Meeting”. (м.Нансі, Франція, 1999). Міжнародній конференції “Наука і освіта” (м.Дніпропетровськ, 2001 ), II-му національному з`ізді фармакологів України (м.Дніпропетровськ, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових праць, з них 3 статті у фахових виданнях рекомендованих ВАК України, отримано 1 патент, 8 – у збірках наукових праць.

Обсяг і структура роботи. Дисертаційна робота викладена на 126 сторінках машинописного тексту. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, двох спеціальних розділів, обговорення результатів досліджень та висновків. Робота проілюстрована 16 таблицями, 12 рисунками. Список використаної літератури має 256 найменувань, з яких 65 вітчизняних та 191 зарубіжних джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Дослідження проведені на 992 білих статевозрілих щурах лінії Вістар масою 160,0-210,0 г.

Процеси відтворення енграм просторової (розлогової) пам`яті вивчали у водному лабіринті Морріса (P. Prior, 1998).

Платформа являла собою чорну пластину з радіусом 5,5 см, яка була розташована на 1 см нижче поверхні води, що заповнювала чорний басейн (діаметром 1,5 м, з температурою води 22 градусів С) На стіни басейну під кутом 90 градусів, відповідно сторонам світу, були нанесені геометричні фігури, що давали щурам змогу орієнтуватися у просторі лабіринту. Навчання щурів проводилося протягом 2 днів та включало 4 сесії по 4 спроби досягнення платформи, в цих умовах тварина стартувала щоразу із різних квадратів басейну в послідовності, яку обирали довільно. Щурам, які знайшли платформу, дозволяли залишатися на ній в перебігу 30 с. Після чого починалася наступна процедура навчання.

Якщо в перебігу першого блоку навчання тварині не вдавалося знайти платформу в на протязі 60 с, вона виключалася з експерименту.

Час за який тварина знаходила занурену у воду платформу реєстрували як латентний період умовної реакції. Даний показник визначався в кожній пробі тварин і являв собою результуючий показник для кожного блоку навчання.Для перевірки вироблення плавального тесту на 3 день платформу вилучали з басейну. Кожного щура поміщали в басейн напроти квадрата, де платформа була на протязі перших днів навчання. Після плавання на протязі 60 с, щур повертався до своєї клітки і час, який щур знаходився в кожному з чотирьох квадратів розцінювався як придбана просторова пам'ять.

Для дослідження біоелектричної активності вивчаємих структур щурам, у гострих експериментах, під тіопенталовим наркозом (50 мг/кг) за допомогою стереотаксичної техніки вводили сталеві електроди. Для дослідження змін біопотенціалів гіпокампа електроди вводилися білатерально по слідуючим координатам : АР – 3,6 мм від лінії Брегма, на + 2,5 мм від середньої лінії, DV- 3,0 мм нижче поверхні черепа, на глибину 2,4 мм. Два коаксіальних електроди накладали на фронтальну зону кори головного мозку (G.Paxinos et al., 1986; E.Fifkova, Marsall J. et al., 1967.).

Оцінка функціонального стану гіпокампа у порівнянні з фронтальною зоною неокортексу включала вимір їх біоелектричної активності по частоті та амплітуді реєструємих потенціалів. Одночасно визначали сумарну біоелектричну активність гіпокампу і фронтальної зони неокортекса шляхом її цифрової фільтрації, біопотенціали розділялися на 4 основних частотних піддіапазона ( бета -, альфа -, тета - і дельта -), в межах кожного з яких визначали спектри потужності, частотну та амплітудну характеристики біопотенціалів. Перевага цифрової фільтрації полягає в тому, що її використання сприяє поділу широкополосної сумарної біоелектричної активності на більш вузькі ідентифікаційні фрагменти, що дозволяє усунути “інформаційний шум” і додати досліджуємим параметрам більшу вірогідність (О.Л.Дроздов та інш., 2002).

Потенціали, що відводились від проекційних зон вивчаємих мозкових утворень, подавалися на вхід многоканального підсилювача, далі на аналоговий фільтр аналізатора, де вони поділялись на частотні піддіапазони. Вихідні сигнали аналогового фільтра, а також сумарна біоелектрична активність перетворювалися в цифрову форму та надходили в комп`ютер (клас IBM - 486) із вбудованим програмним модулем (тип МВ - 5202), що розподіляв та аналізував отриману інформацію по рядах Фур'є, обчислювалися спектри потужності, визначалися амплітудні і частотні характеристики. Зміни реєструємих показників визначали через 5, 10, 15, 20, 30 , 45 і 60 хв після внутрішньочревної ін`єкції ксенобіотиків.

Про перебіг біохімічних процесів в гіпокампі на фоні дії досліджуємих речовин свідчили вміст вільних жирних кислот (ВЖК), концентрація проміжних продуктів різних шляхів біологічного окислення субстратів - ТБК активного продукту, молочної кислоти (МК), а також 2,3 – діфосфогліцеринової кислоти (2,3 – ДФГ).

Для визначення складу вільних жирних кислот із тканини гіпокампа щурів екстрагували загальні ліпіди за методом Фолча ( К.Кейтс, 1975). Після метилювання жирних кислот газовохроматографічний аналіз проводився на хроматографі “Schimadzu – 9 A” з полум'яно-іонізаційною детекцією при температурі стовпчика 180 градусів С, в якості твердофазного носія використовували “Хроматон NAW” (Англія), насичений 15% розчином полиетиленгліколя сукцинату, а газа-носія – гелій. Для ідентифікації піків використовувалися, як стандарти, метилові ефіри відповідних жирних кислот.

Концентрацію молочної кислоти визначали після фіксації тканини мозку рідким азотом за методом Хохорста. Методика заснована на вимірі при довжині хвилі 340 нм вмісту відновленої форми НАД, у зразку, яка утворюється при окисленні молочної кислоти лактатдегідрогеназою. Продукт даної реакції – піровиноградна кислота зв'язується гліцингідразиновим буфером, що сприяє повному окислюванню лактата ( И.И.Иванов и др., 1975) Концентрацію МК обчислювали в міллімолях на грам тканини.

Зміст ТБК активного продукту встановлювали по реакції з тіобарбітуратовою кислотою ( В.Н.Орехович, 1977). В основі методу лежить здатність ТБК активного продукту при високій температурі в кислому середовищі утворювати з 2-тіобарбітуратовою кислотою пофарбований триметиновий комплекс з максимумом поглинання світла при довжині хвилі 532 нм. Рівень проміжного продукту вимірювали в наномолях на грам тканини.

2,3-діфосфогліцерат визначали по різниці у вмісті загального і неорганічного фосфору після абсорбції нуклеотидів активованим вугіллям. Концентрацію фосфору встановлювали по методу Лоурі і Лопеса в модифікації Скулачьова (Г.А.Кочетов, 1980).

Для вивчення фармакологічної активності нами були використані наступні пептиди вазопресинового ряду:

8-аргінін-вазопресин (АВП) в дозі 1 мкг/ кг, дігліциновий аналог гормону - дігліцил – дез-9-гліцинамід - (8-аргінін)- вазопресин (2Г-ДГА-АВП) - 20 мкг/кг, аналог фрагмента нейроростового фактора послідовності 52-57, позбавлений в 54 положенні фенілаланіну (НРФ), тетрапептидний С-кінцевий фрагмент вазопресину послідовності 2-5 (АВП-2-5) обидва по 5 мкг/кг, тетрапептидний частково захищений N- кінцевий фрагмент вазопресину послідовності 4-9 (АВП-4-9) в дозі 40 мкг/кг. Для дослідження ефектів пептидів були взяті дози, що виявляють антиамнестичну та ноотропну дію (В.А.Крауз, О.Л.Дроздов, 1990;) тобто надають стимулюючий ефект на відтворення енграм пам`яті.

В якості еталонного ноотропного препарату використовували пірацетам в дозі 500 мг/кг. Досліджуємі нейропептиди і пірацетам вводили внутрішньоочеревинно за 30 хв до визначення змін вивчаємих показників. Щурам контрольної групи в еквіоб`ємній кількості вводили ізотонічний розчин хлористого натрію.

Нейропептиди були синтезовані в Інституті органічного синтезу АН Латвії (м.Рига) і представлені для дослідження доктором хімічних наук О.С.Папсуєвічем, за що автор йому щиро вдячний. Статистичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Ст`юдента (Н.А.Плохинский, 1970).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ оБГОВОРЕННЯ

Вплив пірацетама, аргінін-вазопресина, його аналогів і N - та С - кінцевих фрагментів на просторову пам'ять у щурів. Спостереження показали, що у інтактних тварин найбільший час вимагав пошук платформи в першій спробі, де латентний період виконання тесту коливався від 9,25 + 1,00 до 13,99 + 1,65 с в різних групах. В наступних спробах даний параметр поступово знижувався, досягаючи зменшення в 2-3 рази в заключній, четвертій спробі в блоці. Середній час досягнення платформи із змінним розташуванням в водному лабіринті складав 7,22 + 0,26 с. Результати спостережень показали, що пірацетам в 1,5-2 рази подовжує час виконання плавального тесту у водному лабіринті, аргінін-вазопресин його скорочує на 27,4% ( р<0,05), аналог АВП – НРФ істотно на 33,3% зменшує пошук платформи в першій спробі та подовжує латентний період в четвертій на 31,5%. Пептид 2Г-ДГА-АВП вірогідно скорочує період реакції при першому “запливі” та збільшує його тривалість в 3 і 4 спробах відповідно на 53,0% і 62,9%. Фрагменти АВП-2-5 і АВП-4-9 істотного впливу, на реєструємі показники просторової пам'яті, не оказують.

Зміни біопотенціалів гіпокампа та фронтальної зон неокортекса на фоні дії пірацетама, вазопресину, його аналогів і фрагментів. Вихідні значення домінуючої частоти біоелектричної активності гіпокампу в наших дослідженнях в середньому складали 5,58 ± 0,28 Гц (, що відповідає тета-піддіапазону коливань), амплітуда – 60, 65 ± 2,48 мкВ. В умовах попереднього введення пірацетама в перші 10 хв спостережень відзначалося істотне зменшення частоти біоелектричних коливань в гіпокампу з переходом домінуючої компоненти з тета - до дельта – піддіапазона. Попереднє застосування АВП в дозі 1мкг/кг приводило до істотного зменшення частоти превалюючої компоненти біоелектричної активності Гп через 5-45 хв дослідів. Використання близького аналога гормону – 2Г-ДГА-АВП не мало на реєструємі параметри істотного впливу. Застосування НРФ викликало протилежні зміни, на разі, істотно підвищувалася частота домінуючої складової біоелектричних коливань, яка на 15 хв дослідів переходила до альфа-піддіапазону біоелектричної активності гіпокампу. С-кінцевий фрагмент АВП послідовності 2-5 справляв аналогічний вплив на 5 і 60 хв спостережень, а N- кінцевий тетрапептид послідовності 4-9 - на 20-й хв.

Аналогічним чином вивчаємі сполуки впливали на показники біоелектричної активності у фронтальній зоні неокортексу. В цьому мозковому утворенні, що було обране як структура для співставлення ефектів і тісно пов`язана з гіпокампом в перебігу мнестичних реакцій, у вихідному стані показники домінуючої частоти складали: частота – 2,20±0,10 Гц ( що відповідало дельта-піддіапазону), амплітуда – 90,68±4,37 мкВ. Використання пірацетаму в перші 10 хв спостережень приводило до суттєвого зниження амплітуди домінуючої компоненти біоелектричних коливань у фронтальному неокортексі. При цьому, локалізація компоненти залишалася в межах дельта-піддіапазону, де розташовувалася домінуюча хвиля у вихідному стані. Аргінін-вазопресин викликав розвиток тенденції до зменшення амплітуди переважної частоти. НРФ приводив до статистично значущого збільшення домінуючої частоти біоелектричної активності до верхніх границь дельта-піддіапазону через 5-10 і 30-45 хв після введення. С-кінцевий тетрапептид послідовності 2-5 збільшував частоту переважної складової через 5 хв від початку експерименту, а АВП-4-9 після перебігу 20-45 хв наглядів. У фронтальній зоні неокортексу пірацетам приводив, у відмінності від гіпокампу, до збільшення частоти домінуючої компоненти біопотенціалів, а аргінін-вазопресин здебільшого до зниження її амплітуди. Аналоги АВП із переважно нейротропною дією як у Гп, так і у фронтальній зоні неокортексу збільшували, насамперед, частотну складову біоелектричної активності. Імовірно, що подібні зміни є проявом десинхронізуючої активності вивчаємих сполук. Вивчення змін частоти та амплітуди домінуючих компонентів основних піддіапазонів біоелектричних коливань як гіпокампу, так і фронтального неокортексу показало, що їх епізодичний і різнонаправлений характер обумовили нестабільні зміни загальної домінуючої частоти біопотенціалів, що відводяться від досліджуємих мозкових утворень. Порівнюючи, отримані на фоні дії досліджуємих речовин з ноотропним ефектом, зміни показників біоелектричної активності в гіпокампі і фронтальній зоні неокортексу можна прийти до висновку про їх неоднаковий характер. Референтний ноотропний препарат пірацетам викликав появу тенденції до зменшення частоти і збільшення амплітуди домінуючої компоненти в гіпокампі, а також підвищення частотних характеристик цього показника у ФК. Аргінін-вазопресин істотно зменшував частоту переважно в Гп і знижував, переважно, її амплітуду у фронтальній зоні неокортекса. При цьому, звертає на себе увагу збільшення амплітуди коливань бета - піддіапазона у фронтальній зоні неокортексу на протязі перших 30 хв спостережень, тоді як аналогічні зміни мали істотний характер для Гп в перші 5 хв після введення АВП. Пептиди НРФ, АВП-2-5 і АВП-4-9 аналогічним чином впливали на показники біоелектричної активності гіпокампу і фронтальної зони неокортексу. Встановлені зрушення характеризувалися підвищенням, переважно, частоти домінуючої компоненти, що на окремих етапах спостережень, переміщалася до більш високочастотного піддіапазону. Зазначені зміни на фоні дії НРФ і АВП-2-5 відбувалися у ФК, починаючи з 5 хв, а в гіпокампі на більш віддалених етапах спостережень. Попереднє введення АВП-4-9 приводило до підвищення частоти в обох вивчаємих структурах ЦНС, що були статистично вірогідними з 20-ї хв спостережень. Ще однією особливістю, встановленою в умовах проведених дослідів, є підвищення амплітуди біоелектричних коливань, що відводяться від гіпокампа, на фоні дії АВП-2-5, починаючи з перших стадій експерименту, у всіх частотних піддіапазонах. На фоні дії інших вивчаємих похідних АВП чітких особливостей змін амплітудних характеристик біопотенціалів досліджуємих мозкових утворень не відзначалося.

Зміни нейрохімічних процесів в гіпокампі на фоні введення аналогів вазопресину. Порівняння змін показників, що характеризують різні процеси біологічного окислення може привести до висновку про те, що досліджуємі сполуки по різному впливають на співвідношення даних видів метаболізму в гіпокампі. Зокрема, НРФ і фрагмент АВП послідовності 4-9, які підвищують рівень 2,3-діфосфогліцерату, сполуки, що регулює тропізм хромопротеідів до кисню, в 2-2,5 рази не викликають накопичення продуктів гліколізу і перекісного окислення ліпідів. Пірацетам і С-кінцевий фрагмент АВП послідовності 2-5 в Гп стимулювали накопичення переважно лактату. Аналог АВП – 2Г-ДГА-АВП приводив до вірогідного підвищення рівня ТБК активного продукту на 34,8%. Застосування АВП викликало в гіпокампі істотне зростання концентрації як лактату, так і ТБК активного продукту.

В наших умовах спостережень пірацетам викликає статистично значуще накопичування пальмітинової і стеаринової кислот в гіпокампі на 31,9% і 36,1% ( р<0,05) відповідно. АВП, 2Г-ДГА-АВП і АВП-2-5, зменшуючи рівень С8:0 – С12:0, в різному ступені збільшують концентрацію С13:0 – С15:0 вільних жирних кислот. Відмінність впливу на реєструємі показники аналогів від родоначальника групи полягала в тому, що на фоні їх дії істотно ( відповідно на 73,9% і 79,0%) ( р<0,05) зменшувався рівень пальмітинової вільної жирної кислоти. Аналог АВП – НРФ, на відмінність від попередніх пептидів, різко підвищує рівень капрінової і ундецилової кислот. N- кінцевий фрагмент АВП послідовності 4-9 серед досліджуємих пептидів в найменшому ступені впливає на реєструємі в цій частині роботи показники.

Попереднє введення пірацетама приводило до накопичення олеінової на 37,2% і арахідонової на 39,2% кислот, тоді як АВП та його аналоги різко зменшували вміст даного класу жирних кислот у досліджуємій структурі ЦНС.

Обговорення результатів.Отриманні результати спостережень, які були присвячені вивченню впливу вазопресину, його аналогів, N- і С- кінцевих фрагментів гормону з переважним нейротропним ефектом та пірацетаму на просторову пам`ять, показники функціонування гіпокампу свідчать про їх істотний та неоднаковий характер.

Для визначення впливу на просторову пам`ять фармакологічні агенти були використані в дозах, які поліпшують відтворення енграм пасивно - та активно - захисних умовних навичок, а пірацетам, АВП і НРФ в цих умовах покращують також показники робочої пам`яті, які тестувались на емоційно-позитивному фоні у 8-проміневому радіальному лабіринті (О.С.Папсуевич и др.,1990; А.Л.Дроздов, 1993; Y.Oomura et al., 1992) Вивчення змін відтворення енграм просторової пам`яті, які доволі тісно пов`язана безпосередньо з функціонуванням гіпокампу (W.Beatty et al., 1985; E.Greene, 1986; J.Aggleton, 1989; D.Amaral, 1990; C.V.Buhusi, 1996;), показало, що в цих умовах фармакологічні речовини виявляють іншу біологічну активність. Пірацетам (в дозі 500 мг/кг) подовжує ( в 1,5-2 рази) час пошуку платформи у водяному лабіринті, аргінін-вазопресин його скорочує на 27,4%, аналог АВП – НРФ істотно зменшує цей показник ( на 33,3%) в першій спробі. Близький аналог гормону – 2Г-ДГА-АВП, скорочуючи період виконання тесту при першому “запливі”, подовжує його в 3 і 4 спробах. Цікавим, на наш погляд, являє той факт, що N- кінцевий фрагмент гормону послідовності 4-9, а також С-кінцевий – АВП-2-5 істотно на показники просторової пам`яті не впливали. Це може означати необхідність наявності суцільної молекули родоначальника сімейства для істотного впливу на просторову пам`ять.

Подовження часу пошуку платформи щурами, яким попередньо було введено пірацетам, добре узгоджується з даними літератури про зменшення спонтанної рухливості тварин і наявність у цього лікарського засобу транквілізуючого ефекту (V.Petkov, 1984; V.Petkov et al., 1984; J.L.Martnez, 1986;).

Доволі складними, в цих умовах експериментів, були зміни нейрофізіологічних та нейрохімічних показників функціонального стану гіпокампу.

Пірацетам (порівняльний ноотропний препарат) викликав тенденцію до зменшення частоти і збільшення амплітуди домінуючої компоненти біоелектричної активності, що відводиться від Гп. Таким змінам відповідали накопичення молочної кислоти, пальмітинової, стеаринової, олеінової та арахідонової вільних жирних кислот.

Аргінін-вазопресин зменшував частоту переважної складової біоелектричної активності Гп та в перші 5 хв спостережень збільшував амплітуду коливань у -піддіапазоні. В цих умовах експерименту АВП підвищував рівень лактату і ТБК активного продукту, а також вільних жирних кислот С13:0, С14:0, С15:0, і С22:0 в гіпокампі. Одночасно, в тканині даної структури ЦНС істотно зменшується рівень олеінової та арахідонової ВЖК.

Аналог антидіуретичного гормону 2Г-ДГА-АВП в дозі, що виявляє антиамнестичну дію, порівняно слабко впливав на нейрофізіологічні показники біоелектричної активності. Через 30 хв після введення цей пептид приводив до збільшення вмісту ( на 34,8% ) в тканині гіпокампу ТБК активного продукту. Вплив на концентрацію ВЖК, для цього пептида, що за структурою досить близький до родоначальника групи, відрізнявся від нього різким зменшенням рівня пальмітинової кислоти.

Пентапептидний аналог АВП – НРФ виявляв здатність збільшувати частоту домінуючої складової біопотенціалів гіпокампу, зміщуючи її, на 15 хв експерименту, з тета- в альфа-піддіапазон. В цих умовах відзначалося збільшення в 99,6% рази вмісту в Гп 2,3-діфосфогліцерата, який регулює тропізм хромопротеідів до кисню, що, імовірно, запобігало накопичуванню продуктів як гліколізу, так і перекісного окислення ліпідів. Одночасно, підвищувалася концентрація насичених, порівняно низькомолекулярних, ВЖК і істотне зменшення рівня арахідонової і олеінової вільних жирних кислот 78,9% і 80,6% відповідно.

Тетрапептидний С-кінцевий фрагмент гормону послідовності 2-5 збільшував частоту переважної компоненти біоелектричної активності гіпокампа в меншому ступені, ніж НРФ. Істотною особливістю біологічних ефектів даного пептидного фрагменту АДГ було різке підвищення амплітуди біопотенціалів в Гп у всіх частотних піддіапазонах, починаючи з перших стадій спостережень, що втрачало вірогідний характер, за винятком -піддіапазона, через 30-45 хв. Через 30 хв після використання АВП-2-5 спостерігалося накопичення молочної кислоти (на 22,6%) та насичених жирних кислот С13:0, С14:0, С15:0 і С22:0. Одночасно, тканина гіпокампа істотно збіднювалася пальмітиновою кислотою та практично не визначалися досліджуємі ненасичені ВЖК.

N - кінцевий фрагмент АДГ послідовності 4-9 викликав, через 20 хв після застосування, одночасний перехід домінуючої складової біоелектричних коливань у Гп та ФК до більш високочастотних піддіапазонів. Цьому з`єднанню, як і пептиду НРФ, була притаманна здатність різко (у 1,5 рази) підвищувати в гіпокампі рівень 2,3-діфосфогліцерата, який прямо пропорційно регулює тропізм хромопротеідів до кисню. На склад і вміст вільних жирних кислот у досліджуємому мозковому утворенні пептид АВП-4-9 впливу практично не оказував.

Біоелектрична активність відділів ЦНС із застосуванням різних комп`ютерних засобів аналізу результатів, в наш час, розглядається (Ю.М.Пратусевич и др., 1982; E.Daniel, 1989; A.Wijers et al., 1989;) як валідний показник інтенсивності інтелектуальних функцій головного мозку та їх порушень. Отримані нами зміни параметрів біоелектричних коливань, що відводились від Гп та ФК щурів при використанні ксенобіотиків в дозах, що поліпшують відтворення енграм пам`яті знаходять підтвердження в існуючій літературі. Центрофеноксін або 2-етіл-6-метіл-3-оксіпірідін в дозах, які попереджували розвиток амнезії УРПУ підсилювали фазічний компонент тета-ритму електрогіпокаптограми щурів (Л.Н.Неробкова, Т.А.Воронина, 1989). У людей, що значно успішніше виконували тести на короткострокову пам`ять з батареї Векслера ( N.Klimesch et al.,1990) або при навчанні поняттям було виявлено підвищення частоти ЕЕГ в альфа-піддіапазоні. Аналіз змін амплітудних характеристик біоелектричних коливань, включаючи хвилю Р300, привів до формування уявлень (И.Е.Кануников, В.И.Ветошева, 1988) про те, що вони відбивають стан функціональної перебудови, перебігаючої в тій або іншій структурі головного мозку. Таким чином, виявлений в наших дослідах десінхронізуючий вплив на електрогіппокапмограму щурів АВП, його аналогів та N- і С-кінцевих фрагментів в дозах, стимулюючих відтворення енграм захистних навичок, добре узгоджується із змінами показників електрокортікограми ( А.Л.Дроздов, 1992), які викликають ці сполуки у собак і відбивають стан перебудови функціонування Гп.

Одночасні зміни нейрофізіологічних показників функціональної активності в гіпокампі та фронтальній зони неокортексу в умовах застосування АВП-4-9, з нашого погляду, можуть свідчити про меншу швидкість проникненя цього пептида в досліджені мозкові структури.

Істотний вплив вазопресину на різні показники ліпідного обміну, який було показано іншими дослідниками (В.Д.Слепушкин и др., 1989; A.Дишкелов и др., 1990; J.Siegel, B.Agranoff et al.,1999) був також встановлений в наших експериментах. Різке зменшення рівня ненасичених вільних жирних кислот в Гп на фоні дії АВП, його аналогів та N- і С-кінцевих фрагментів може бути пояснено із залученням літературних даних ( Y.Natochin, R.Parnova, 1981) про значне збільшення звільнення арахідонової кислоти при введенні АДГ в культуральне середовище. Ще однією із робочих гіпотез (Н.В.Гуляева и др., 1989) відносно механізмів впливу гормону та його похідних на обмін ліпідів можна вважати вплив на співвідношення в- та перекісного окислення. Таке припущення підтверджується встановленим накопиченням ТБК активного продукту і “мінорних” ВЖК при одночасному істотному зменшенні концентрації арахідонової кислоти на фоні використання АВП та його близького аналога 2Г-ДГА-АВП. Тоді як, в умовах застосування НРФ і N-кінцевого фрагмента АВП послідовності 4-9 зростання рівня порівняно низькомолекулярних жирних кислот і збіднення Гп С20:4 не супроводжується накопиченням ТБК активного продукту, що дозволяє припустити більшу роль, в цих умовах, в- окислення ліпідів.

Загальною рисою, притаманною нейрохімічним ефектам АВП, його аналогам та N- і С-кінцевим фрагментам в дозах, стимулюючих відтворення енграм пам`яті, є здатність зменшувати рівень ненасичених ВЖК в Гп і, в першу чергу, арахідонової кислоти, яка відіграє суттєву роль ( J.M.Bourre, 1988) в пошкодженні мембран та загибелі нейронів.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1.