ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

ЛИКО ІВАННА ЯРОСЛАВІВНА

УДК 636.32/38.612.79.677.31

ПОРІВНЯЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРИ, ХІМІЧНОГО СКЛАДУ, ФІЗИЧНИХ ПОКАЗНИКІВ НОРМАЛЬНОЇ І ДЕФЕКТНОЇ ВОВНИ

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Львів – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.

Науковий керівник- доктор біологічних наук? професор? член-

кореспондент УААН? Заслужений діяч науки і

техніки України МАКАР Іван Арсентійович

Інститут біології тварин УААН?

головний науковий співробітник лабораторії

фізіолого – біохімічних основ вовноутворення

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук? професор

РОЗГОНІ Іван Іванович, Інститут біології тварин УААН,

головний науковий співробітник лабораторії

клітинної інженерії

кандидат сільськогосподарських наук , доцент

ПЕРІГ Дмитро Петрович, Львівська державна академія

ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького,

доцент кафедри дрібного тваринництва

Провідна установа: Державний науково-дослідний контрольний інститут

ветеринарних препаратів та кормових добавок,

відділ фармакології і імунології

Міністерства аграрної політики України, м. Львів

Захист відбудеться 01.07. 2003 р. о 10 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01. в Інституті біології тварин УААН

за адресою: вул. В. Стуса? 38ё ?. Львів 79034.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН

за адресою: вул. В. Стуса? 38ё ?. Львів 79034.

Автореферат розісланий 30.05. 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Віщур О. І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На всіх етапах розвитку вівчарства вовна завжди вважалася одним з головних продуктів цієї галузі. Маючи унікальні властивості й широкі можливості поєднання з іншими волокнами, вона і в наш час залишається цінною, а часто й незамінною сировиною для текстильної промисловості, хоч не завжди за своєю якістю відповідає вимогам останньої. Значна частина продукованої господарствами АПК вовни ще досить низька за якістю, має явні ознаки патологічного стоншення волокон, так звану “голодну тонину“, пересліди, або уступи, які, звичайно, розглядають як результат сезонної депресії процесів вовноутворення в цілому. Суть її полягає в тому, що в зимово-стійловий період уповільнюється ріст вовни, порушується однорідність вовнинок і, як наслідок, погіршуються їхні технічні властивості, передусім міцність. Така вовна оцінюється набагато нижче за нормальну, отже від її реалізації господарства терплять чималі збитки, а галузь у цілому стає збитковою.

Сезонна депресія вовноутворення посилюється фізіологічним навантаженням на організм, зокрема, під час вагітності та лактації маток, а також хвороб тварин.

Ось чому проблема патологічного стоншення волокон віддавна привертає увагу широкого кола дослідників, хоч і досі залишається не вирішеною, що значною мірою пояснюється відсутністю необхідної наукової інформації, насамперед щодо структури та хімічного складу такої вовни.

По-справжньому ця проблема набула наукового звучання починаючи з 1970-х рр. завдяки працям колективу лабораторії біохімічних основ вовноутворення (Михновский Д.К., 1977; Макар И.А., Михновский Д.К.,1979; Гуменюк В.В., 1994; Макар І.А.,1999). На підставі одержаних даних висунуто робочу гіпотезу, згідно з якою патологічне стоншення волокон пов’язане з порушенням синтезу у вовноутворювальних структурах, тобто волосяних фолікулах, білків які відзначаються високим вмістом сірки, званих ще S-карбоксиметилкератеїнами. Враховуючи те, що останні надзвичайно гетерогенні, свої дослідження ми скерували на вивчення саме цього феномену кератинів, поставивши перед собою мету з’ясувати внесок окремих представників цієї групи у генезис згаданої вади вовни.

Саме в цьому вбачаємо актуальність наших досліджень, аналогів яким на сьогодні фактично немає.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом наукової теми UA N0101U003435, шифр 02.05 ”Вивчити механізми вовноутворення і розробити генетико-біохімічні способи підвищення вовнової продуктивності та поліпшення якості вовни”? яка виконувалася у лабораторії фізіолого-біохімічних основ вовноутворення Інституту біології тварин УААН.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягає у вивченні породних особливостей макроструктури та фізико-хімічних показників дефектної вовни в овець різних генотипів і виявлення зв’язку патологічного стоншення волокон (“голодна тонина“) з кількісним співвідношенням білків, які відзначаються високим вмістом сірки та цистину.

Для реалізації поставленої мети вирішувались наступні питання:

- вивчити породні особливості макроструктури, хімічного складу та фізичних показників нормальної і дефектної вовни;

- з’ясувати взаємозв’язки досліджуваних показників вовни і визначити коефіцієнти їхньої кореляції;

- одержати з вовни білки з високим вмістом сірки ( S-carboxymethylkerateins або SCMKB) і дослідити їх гетерогенність;

- встановити значення цих протеїнів у генезі патологічного стоншення вовни.

Об’єкт дослідження. Зв’язок структурної організації різної за станом вовни асканійських тонкорунних та чорноголових кросбредних овець з її фізико-хімічними параметрами.

Предмет дослідження - кератози та кількісне співвідношення їх, S-карбоксиметилкератеїни (SCMK) та виділені з них протеїни з високим вмістом сірки і цистину (SCMKB), а також сірка, цистин, сульфгідрильні групи, азот, тирозин, триптофан, гексозаміни, розчинність волокна, його товщина та міцність.

Методи досліджень. Для досягнення поставленої мети використовували загально біологічні (показники продуктивності), біохімічні (електрофорез і фракціонування), зоотехнічні (тонина та міцність) та математичні методи(розрахунок білкових фракцій).

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше з’ясовано особливості макроструктури та фізико-хімічних параметрів дефектної вовни асканійських тонкорунних та чорноголових кросбредних овець, що є новим не лише для цих тварин, але й для інших порід, а також не виключено? ще для вирішення низки спеціальних питань, пов’язаних із захворюванням людського волоса.

Новим є також положення про спільну закономірність генези “голодної тонини” вовни овець різних генотипів, принаймні тих, які були об’єктом дослідження в нашому експерименті.

Показано, що вовна з явними ознаками патологічного стоншення волокон характеризується зміненою макроструктурою, зокрема меншим вмістом гамма-кератози, тобто цементуючої речовини або матриксу (SCMKB) і бета-кератози (кутикула, мембрани клітин), та відносно більшим вмістом альфа-кератози (SCMKА). Отже, у вовні з явними ознаками “голодної тонини” очевидне порушення співвідношення між кристалічною й аморфною фазами волокна. Виявлено, що поряд зі зміною структурної композиції дефектна вовна має ще й видозмінений хімічний склад: при майже однакових показниках вміст азоту та сірки в ній міститься менше цистину та набагато більше сульфгідрильних груп. Баланс сірки у такій вовні порушується в основному через зменшення цистину в гамма-кератозі, тобто SCMKB.

На підставі вивчення гетерогенності S-карбоксиметилкератеїнів, яке, до речі, вперше виконано нами, розвинуто концепцію про зв’язок механізмів стоншення вовни з порушенням синтезу у волосяних фолікулах білків, з високим вмістом сірки, особливо тих, що характеризуються відносно більшою молекулярною масою (22-21 тис. кДа) і ультрависоким вмістом цистину ( UHSP).

Виявлено корелятивні зв’язки між біохімічними та фізико-механічними показниками вовни.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані дані насамперед можуть бути використані у селекційно-племінній роботі з асканійською тонкорунною породою та чорноголовими вівцями з кросбредною вовною, а також тваринами інших порід. Окрім того, вони можуть бути корисні під час розробки науково обгрунтованих заходів для виробництва високоякісної вовни, а також викладання курсу вівчарства (основ вовнознавства) для студентів зооінженерних факультетів.

Особистий внесок здобувача. Полягає у підборі та аналізі наукової літератури з теми дисертації, виконанні експериментальної частини, опрацюванні та статистичній обробці результатів, участі в підготовці публіка цій, написанні дисертаційної роботи. Аналіз і обговорення отриманих даних проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів досліджень. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися на: аспірантській конференції Інституту біології тварин УААН, присвяченій 85-річчю від дня народження професора З.П. Скородинського (Львів, 2000); звітних сесіях Інституту біології тварин УААН (Львів, 2000, 2001, 2002); міжнародній науково-практичній конференції “Біологічні основи підвищення продуктивності тварин”, присвяченій 40-річчю створення Інституту біології тварин УААН (Львів, 2001); міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики” (Львів, 2002); конференції молодих вчених ( Львів, 2002).

Публікації результатів досліджень. За результатами досліджень опубліковано 6 наукових статей у фахових журналах.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація містить 112 сторінок машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, аналізу й обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел (261 джерел, з них 163-іноземні). Робота містить 17 таблиць, 14 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Загальна методика та основні методи досліджень. Дослідження з теми дисертаційної роботи виконано на зразках вовни овець двох генотипів: асканійських тонкорунних та асканійських чорноголових з кросбредною вовною, які належать господарствам інституту “Асканія-Нова“ УААН. Отже, наш експеримент виконано на генетичноцінному матеріалі.

Об’єктом досліджень була вовна, зразки якої відбирали під час стрижки тварин. Для досліджень використовували нормальну та дефектну тонку і кросбредну вовну з різним ступенем вираженості самого стоншення.

За контроль правила нормальна за станом вовна цих же самих тварин ( ділянка штапеля без вади).

Для досягнення поставленої мети використовували загальнобіологічні, біохімічні, зоотехнічні і математичні методи.

Кількісне співвідношення кератоз визначали методом Ангніта (Angnith R.S., Parcinson D.C., 1966), який подібно іншим існуючим методам, забезпечив також одержання з окисленої вовни три фракції: альфа-, бета- і гамма-кератози, але з відносно меншими затратами часу та реактивів. Згідно з цим методом окислення вовни здійснюють надмурашиною кислотою (замість надоцтової).

Вміст сірки у вовні визначали за методом Макара та співавторів ( Макар И.А., Гуменюк В.В., 1989). Метод грунтується на нефелометрії сульфату барію, стабілізованого гліцерином.

Вміст цистину визначали методом Фоліна-Марензі в модифікації Цана і Траумана (Zahn H., Traumann K., 1954). Суть методу полягає в тому, що гідролізат вовни з фосфо-9-вольфрамовою кислотою дає синювате забарвлення, інтенсивність якого залежить від вмісту цистину у досліджуваній пробі.

Вміст сульфгідрильних груп визначали методом, який грунтується на реакції цистеїну з іонами тіонітробензойної кислоти реактиву Еллмана. Утворений при цьому аніон із карбокси-4-нітрофенолу переводить безбарвний розчин у жовтий (Калинин В.В., Мглинец А.А., 1977).

Вміст загального азоту визначали за К’єльдалем (Schenke G., 1978), тирозину - за Гольдшмідтом (Goldsmith L.A., Martin G.H.,1957), триптофану - за Грехом (Graham A.R., Statham K.M., 1960), а гексозаміни - за Боас (Boas N.P.,1953).

Гетерогенність білків вовни з високим вмістом сірки (SCMKB) досліджували видозміненим методом електрофорезу в акриламідному гелі з використанням Тріс-гліцин буферної системи, рН 8,3 і за наявності додецилсульфату натрію. Розділення білків проводили в системі Леммлі, що дало змогу нам оцінювати одержані фракції за молекулярною масою (Laemmli U.K.,1970; Read S.M., 1981).

Виділення з вовни білків з високим вмістом сірки, їх очищення та дослідження гетерогенності стало можливим лише після попереднього відновлення вовнових волокон.

У даний час загальновизнано, що лужний розчин тіогліколяту калію або натрію - найефективніше розчиняє кератин вовни. У дослідженнях вовну попередньо відновлювали 0,2М розчином тіогліколяту калію, який містив 8М сечовину, рН 11.

Оскільки білки вовни з високим вмістом сірки характеризуються низькою молекулярною масою (10-25 тис.), як маркери ми використовували інгібітор трипсину з сої (молекулярна маса 20100), апротенін (6500), лізоцим (14300), міоглобін (17000). Овальбумін, молекулярна маса якого 45000, вжито для контролю.

З фізичних показників вовни досліджували товщину та міцність волокон ( Калинин В.В., Калинина В.И.,1969, 1970 ), а ступінь розчинення її визначали в розчинах бісульфіту та сечовини (Nitschke Cerd., 1973).

Статистичну обробку одержаних даних проводили за Ойвіним (1960).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Співвідношення кератоз у вовні. На сьогодні є обмаль відомостей про структурну організацію вовни, особливо в контексті формування її якісних параметрів. Ось чому одержані результати, з цього погляду можна оцінювати як такі, що значною мірою заповнюють дану прогалину, оскільки, характеризуючи пошкоджене волокно, вони тим самим розширюють відомості про вовну в цілому.

Цифрові дані (табл.1) ілюструють загальну картину макроструктури, тобто кількісне співвідношення кератоз нормальної та дефектної тонкої і кросбредної вовни двох генотипів: асканійських тонкорунних та чорноголових кросбредних овець. Аналізуючи ці дані, не трудно побачити, що макроструктура вовнового волокна- досить мінливий показник, зміни якого виражаються в кількісному перерозподілі згаданих фракцій. У нашому випадку ці зміни доволі виразно простежуються з боку усіх трьох фракцій, але особливо – альфа- і гамма-кератоз. Характерно, що виявлена тут закономірність однаково властива як тонкій, так і кросбредній вовні і, що не менш важливо, як нормальним, так і дефектним волокнам.

Якщо подані в табл. 1 цифрові дані виразити відповідними співвідношеннями, то побачимо, що? наприклад, для нормальної вовни асканійських тонкорунних овець цей показник (співвідношення альфа-? бета-? гамма - кератози) становитиме приблизно 54:11:35, а такої ж вовни? але чорноголових кросбредів? відповідно 60:13:27. Отже, явним є факт породних особливостей макроструктури вовни. І хоч вибрані нами генотипи тварин не так уже й віддалені між собою за фенотипічними ознаками, усе ж певні відмінності в макроструктурі їхнього вовнового покриву очевидні.

Таблиця 1

Порівняльна характеристика макроструктури тонкої та кросбредної вовни

(Mm; n=5; %)

Показники | Вовна | Стан волокна | Тонка | Р | Кросбредна | Pальфа-кератоза | К | 54,303,0 | 0,05 | 60,02,60 | 0,05 | Д | 65,902,64 | 68,600,47 | бета-кератоза | К | 11,201,16 | 0,5 | 12,801,77 | 0,5 | Д | 12,761,76 | 11,700,81 | гамма-кератоза | К | 34,453,10 | 0,05 | 26,202,30 | 0,05 | Д | 21,372,52 | 20,01,10 | Примітка. К – нормальна (контроль); Д – дефектна (дослід).

Порівнюючи цифрові дані, не можна не помітити закономірності, яка випливає з цього: у асканійських тонкорунних овець за нормальних фізіологічних умов вовноутворюючий процес яскравіше запрограмований у напрямі синтезу кератинів з високим вмістом сірки, тобто гамма-кератози, або SCMKB, тоді як у чорноголових кросбредів – у напрямі синтезу фібрилярних структур (альфа-кератоза, SCMKA). Є ще одна породна відмінність, яка? зокрема? виявляється в бета-кератозі, тобто нерозчинній частині волокна. Вона полягає в тому, що кількість цієї фракції в кросбредній вовні однозначно більша. У результаті формується вовнове волокно з характерним для нього співвідношенням кератоз.

Як переконуємося з наведених даних? патологічно стоншена вовна на відміну від нормальної відзначається порівняно більшою кількістю альфа-кератози і відповідно меншою – гамма-фракції (65,9 і 21,37 %- у тонкій та 68,6 і 20 % - у кросбредній). Отже, видозміна структурної організації дефектних волокон відбулась, як це, до речі, часто буває, у результаті перерозподілу альфа- і гамма-кератоз. Вміст першої з них у патологічно стоншеному волокні зріс на 22%, а другої відповідно зменшився на 38 %. У дефектній кросбредній вовні ця картина мала дещо інший вигляд. Зокрема, вміст альфа-кератози в ній збільшився на 13 %, а гамма-фракції відповідно зменшився на 23 %.

На підставі одержаних даних можна стверджувати, що реактивнішою в даному випадку виявилася гамма-фракція, яка, як уже знаємо, відзначається високим вмістом сірки. При цьому важливо зауважити, що помітніший спад вмісту гамма-фракції спостерігався у вовні тонкорунних овець (38 % проти 23 % у кросбредній), що може свідчити про можливий зв’язок самого ступеня вираженості депресії вовноутворення з породною належністю тварин.

Вміст сірки та цистину в кератозах Кератози істотно відрізняються між собою за цими показниками. Особливо помітні відмінності існують між альфа- і гамма-кератозами. Так, вміст сірки в гамма-кератозі удвічі більший за вміст її в альфа-кератозі, тобто в білку макро- і мікрофібрил (відповідно 4,46% і 1,59%), а цистину (цистеїнової кислоти) – у півтора раза (17,81% і 9,29%). Бета-кератоза, або нерозчинна частина вовнового волокна, у цьому відношенні має проміжне значення. Зокрема, вона містить в середньому 2,42% загальної сірки і 11,21% цистину. До речі, за вмістом сірки бета-кератоза стоїть ближче до інтактного волокна. Приблизний підрахунок показує, що в загальному балансі сірки вовни найбільша частка припадає на сірку гамма-кератози, хоч її самої у волокні і не найбільше. Це саме можна сказати і стосовно цистину.

Одержані дані ще раз підтвердили положення про те, що існує кореляція між багатими на сірку білками та загальним вмістом цистину, а також між багатими на сірку білками та загальним вмістом сірки у вовні і збігаються з результатами інших дослідників (Гуменюк В.В.?1981; Gillespie J.M., 1991; Powell B.C., Rogers G.E., 1997).

Вміст азоту, тирозину, триптофану, гексозамінів та сульфгідрильних груп у вовні.

Спочатку про вміст загального азоту. Як і слід було очікувати, цей показник і в умовах нашого експерименту виявив неабияку стабільність, що зайвий раз підтверджує відому щодо цього істину. Навіть суттєве зрушення процесів вовноутворення, яке спостерігається в період сезонної депресії, не змінило загального азоту у вовні.

Триптофан та тирозин - амінокислоти, які поряд з цистином мають пряме відношення до генези пожовтіння вовни, тобто ще однієї її серйозної вади. Пожовтіння вовнового волокна - як результат фотохімічної деструкції цистину з подальшим розкладом його лужним потом і утворенням сірководню та аміаку? тирозину з утворенням 3-4-діоксифенілаланіну, аміаку і жовто-коричневого пігменту, а триптофану- з утворенням кінуреніну. У своїй роботі ми керувалися саме цим міркуванням, коли звернулися до названих амінокислот. І хоч аналіз не дав конкретної інформації щодо цього, одержані дані, без сумніву, мають певний інтерес.

Судячи з наших даних, гексозаміни вовни можна вважати породним показником. Вміст їх у вовні тонкорунних овець становить у середньому 228, а в кросбредних 221 мг%. Отже, тонка вовна містить їх більше. Тонка уражена вовна характеризується меншим вмістом гексозамінів (155 мг% проти 228 мг% у нормальній), а така ж за станом кросбредна за цим показником навіть переважає нормальну (відповідно 154,46 і 221,97 мг%).

Сульфгідрильні групи разом з іншими сірковмісними сполуками визначають загальний баланс сірки у вовні. Вміст сульфгідрильних груп у вовні є своєрідним тестом для оцінки її якості. Цей показник у два і більше рази виявився вищим у волокнах з наявною “голодною тониною”ё ?ри чому однаковою мірою як у тонкій, так і в кросбредній вовні. Існують і породні відмінності стосовно цього, які полягають у тому, що кросбредна вовна характеризується порівняно більшим вмістом сульфгідрильних груп. У результаті середній вміст SH-груп у нормальній тонкій вовні становить 26,65, а в дефектній – 58,88 мкмоль/г; для кросбредної - це відповідно 27,20 і 63,16 мкмоль/г при коефіцієнті достовірності в обох випадках Р=0,001. Це, до речі, один з досліджуваних нами показників, у яких найвищий коефіцієнт достовірності. Такий же ступінь достовірності властивий ще для фізичних показників вовни.

Фізичні параметри нормальної та дефектної вовни. Фізичні властивості вовни цілком зумовлені її структурною композицією та хімічним складом (див. табл. 2).

Як бачимо, тонина (товщина) вовни насамперед є породною ознакою. Так, показники поперечного зрізу (діаметр) нормальних волокон асканійських тонкорунних овець? без сумніву? менші? ніж у волокон кросбредних тварин (21,5 і 29,14 мкм). Відповідно меншими у них є і параметри кутикулярного та коркового шару (4,13 і 17,4 мкм -у тонкій та 4,57 і 24,58 мкм – у кросбредних).

Дефектна вовна характеризується різким стоншенням волокон (табл.2.). Так, тонкі волокна з уражених ділянок штапелю (“голодна тонина”) на 7 мкм, а кросбредні на 11 мкм тонші за нормальні в тих же самих тварин, що приблизно становить 40%. Особливо слід наголосити на тому, що загальне стоншення волокон (незалежно від типу вовни) відбулося через одночасне зменшення розмірів їхньої кутикули та кортексу.

Таблиця 2

Фізичні показники вовнових волокон (Mm; n=10-12)

Показники | Вовна | Тонка | Кросбредна | К | Д | Р | К | Д | Р | Діаметр, мкм | 21,50,21 | 13,040,14 | 0,001 | 29,140,223 | 18,680,263 | 0,001 | Розмір кутикули, мкм | 4,130,06 | 1,740,07 | 0,001 | 4,570,038 | 2,060,108 | 0,001 | Розмір кортексу, мкм | 17,40,2 | 11,30,15 | 0,001 | 24,580,213 | 16,620,217 | 0,001

Міцність, км | 6,410,10 | 2,910,11 | 0,001 | 8,210,097 | 4,260,145 | 0,001

Розчинність?

% | 12,80ё23 | 29ё061ё24 | 0ё001 | 9ё20 1ё86 | 24ё8 2ё56 | 0ё001 | Примітка. Р0,001.

Стоншення вовни відразу позначилося на показниках її міцності. У тонкої нормальної вовни у нашому випадку вона становила в середньому 6,41 км, а така ж вовна, але з ознаками “голодної тонини” – тільки 2,91 км, тобто удвічі менша. Подібне спостерігалося й у випадку з кросбредною вовною (відповідно 8,21 і 4,26 км). Аналіз даних міцності вовни виявив ще породні особливості цього показника та його індивідуальні коливання.

Кросбредна вовна, середній діаметр вовнових волокон якої виявився більший, ніж у тонких, мала також і порівняно більші показники розривного зусилля?тобто більшу міцність.

Розчинність вовни в сечовинно-бісульфітному розчині (СБР) свідчить про наявність у ній лантіоніну, а також лізиналаніну, тобто знову ж таки відбувається гідроліз цистину.

Як видно з табл.2, вовна з “голодною тониною” відзначається набагато вищими показниками розчинності у СБР порівняно з нормальною. І? як побачимо далі? вона має також і гіршу якість.

Електрофоретична характеристика виділених з вовни білків з високим вмістом сірки (SCMKB). Як уже згадувалося? гетерогенність білків з високим вмістом сірки (SCMKB) досліджували видозміненим методом електрофорезу в акриламідному гелі з використанням Тріс-гліцин буферної системи рН 8,3 і за наявності додецилсульфату натрію. Для цього вовну попередньо відновлювали 0,2М розчином тіогліколяту калію, який містив 8М розчин сечовини, рН11.

На рис.1 наведено електрофореграму розчинних білків з високим вмістом сірки тонкої? нормальної за станом вовни асканійських тонкорунних овець. Як бачимо, обраний метод, як і сама процедура відновлення вовни, екстракція і очищення білків, виявився вдалим і забезпечив одержання п’яти доволі чітких смуг, які відповідають конкретним фракціям S-карбоксиметилкератеїнів. Підтвердженням того, що дійсно маємо справу саме з цією групою білків, якраз і є білок овальбумін.

Отже, одержано п’ять фракцій протеїнів, умовно позначених літерами А, Б, В, Г, Д. Їхня молекулярна маса (м.м.) становить відповідно 22, 21, 16, 11, 10 тис.

За інтенсивністю забарвлення розташованих на фореграмах смуг переконуємося, що найбільша частка, а це приблизно 80% загальної кількості SCMKB, припадає на фракції з найменшою молекулярною масою, тобто на Г і Д; найменша (усього 15%) - на протеїни А і Б, які мають порівняно найбільшу молекулярну масу. Фракція В у цьому відношенні займає проміжне положення (3-4%).

Рис. 1. Електрофореграма високовміщаючих сірку білків нормальної вовни овець асканійської тонкорунної породи:1- фракції білків вовни; А - м. м. 22000; Б - м. м. 21000; В - м. м. 16000; Г - м. м. 11000; Д - м. м. 10000; 2 - овальбумін (м. м.45000); 3 - інгібітор трипсину з сої (м. м. 20000); 4 - лізоцим з яєчного білка (м. м. 14300).

Цифрові дані табл.3 демонструють кількісне співвідношення білкових фракцій SCMKB, розраховане математичним способом на підставі аналізу електрофоретичних денситограм.

Таблиця 3

Співвідношення фракцій SCMKB нормальної і дефектної вовни асканійських

тонкорунних та кросбредних овець

Фракції,

% | Тонка вовна | Кросбредна вовна | Нормальна | Дефектна | Нормальна | Дефектна | А(22000) | 10,75 | 6,34 | 14,70 | 12,70 | Б(21000) | 4,69 | 5,87 | 5,90 | 11,20 | В(16000) | 3,68 | 7,0 | 9,80 | 13,90 | Г(11000) | 40,50 | 47,76 | 38,40 | 38,50 | Д(10000) | 40,40 | 33,04 | 31,20 | 23,70 | Нормальна кросбредна вовна асканійських чорноголових овець відзначається порівняно вищими показниками фракцій А і Б, особливо першої? і в той же час відповідно меншими Г і Д, особливо останньої (табл.3). У тій же вовні однозначно більше і фракцій В (9,80% проти 3,68% у тонкій).

З даних табл.3 досить яскраво помітно відмінність білкового спектра SCMKB вовни залежно від її стану і?а це особливо важливо наголосити, така відмінність не однакова в різних генотипах овець.

Тонка? але дефектна вовна відрізняється від нормальної порівняно меншим вмістом протеїнів з більшою молекулярною масою (6,34 і 10,75%) і? крім того, ще низькомолекулярних, зокрема, фракцій Д (33,04% проти 40,40%).

І навпаки, кількість білків, зображених на фореграмах смугами Б, В і Г (рис.1.), у такій вовні відносно більша (відповідно 5,87, 7,0 і 47,76%). У результаті денситометричний профіль білків з високим вмістом сірки у волокнах з явно вираженим стоншенням має вигляд, показаний на рис. 2.

Рис. 2. Денситометричні криві SCMKB тонкої нормальної та дефектної вовни.

Кросбредна вовна з “голодною тониною” відрізняється від нормальної, порівняно більшою кількістю протеїнів із молекулярною масою 21000 (фракція Б), фракції В (13,90%) і відповідно меншою А (12,70%) та Д (23,70% - проти 31,20%). Отже, зміна білкового спектра в ураженій вовні зумовлено в основному перерозподілом фракцій (смуг) А, Б, В і Д. Що стосується фракцій Г, то вона практично не зазнала кількісних змін, а тому виявилася однаковою як у нормальній, так і в дефектній вовні.

Наші дослідження без перебільшення можна вважати ще одним кроком на шляху до розшифрування біологічної суті цієї вади вовни. Вони спираються на концепцію про особливо важливе значення в генезі “голодної тонини” білків із високим вмістом сірки, тобто S-карбоксиметилкератеїнів В, або гамма-кератози. Виходячи конкретно з наших даних, можна стверджувати, що тут не просто всій групі SCMKB належить винятково важлива роль, а її окремим представникам, зокрема тим, які мають надзвичайно високий вміст сірки та цистину. Зокрема? це може бути фракція А, яка відповідає білку з молекулярною масою 22000. Це і є той самий протеїн з ультрависоким вмістом сірки (ultra high sulphur proteins). Відомо, що вміст цистину в ньому становить понад 30%. За новішою номенклатурою цей білок зветься КАР 9 (ultra-high sulphur cortex), бо ж відомо ще є один представник цієї групи – КАР 5 (ultra-high sulphur cuticle). Вміст сірки у вовні тісно пов’язаний з наявністю у ній саме цього протеїну. У вовні мериносових овець кількість білка з ультрависоким вмістом сірки може сягати понад 10% маси вовнового волокна.

Отже, ми змогли переконатися, що дефектна вовна незалежно від її типу характеризується відносно меншим вмістом білків молекулярною масою 22000, тобто фракції А (див. табл. 4). Оскільки ця фракція відповідає протеїну з ультрависоким вмістом сірки (UHSP, або КАР 9), то логічно стверджувати, що один з механізмів патологічного стоншення вовнових волокон тісно пов’язаний з порушенням синтезу саме цього білка.

Вовна з “голодною тониною” характеризується також певними змінами й інших фракцій, особливо низькомолекулярних (10-11тис.). Так, білкова фракція Д, на яку припадає 30-40% усіх SCMKB, у дефектній тонкій вовні на 7%, а в кросбредній – на 8% менша. У загальному балансі SCMKB фракція В становить 3-14%. Це білки з молекулярною масою 16000 і, судячи з усього, найвірогідніше вони є однією з субфракцій SCMKB-ІА, а саме SCMKB-ІІІА. Як з’ясувалося, цих протеїнів у дефектній вовні обох генотипів овець значно більше, ніж у нормальній (7,0% проти 3,68%- у тонкій і 9,80% проти 13,90% - у кросбредній).

З усього викладеного випливає, що вовна з “голодною тониною” порівняно з вовною нормального стану характеризується видозміненим кількісним співвідношенням білків із високим вмістом сірки.

Взаємозв’язок між показниками вовни. Досліджено корелятивні зв’язки між настригом вовни і вмістом сірки та цистину, фізичними властивостями волокон та вмістом сірки, цистину, сульфгідрильних груп, а також гексозамінів і товщиною вовни та ступенем її розчинності.

У розрізі досліджуваних нами генотипів тварин зв’язки між показниками можуть бути сильні, як у випадку міцності тонкої вовни з вмістом у ній сульфгідрильних груп (r = 0,792), або ж, скажімо, тониною кросбредної вовни зі ступенем її розчинності (r = 0,752), помірно сильними (товщина тонкої вовни і вміст у ній альфа-кератози (r = 0,792) і слабкими, наприклад, міцності тонкої вовни та вмістом у ній гексозамінів (r = 0,960).

Тонкій вовні асканійських тонкорунних овець притаманні високі коефіцієнти кореляції (r = 0,792) між міцністю волокон та вмістом SH-груп. У кросбредних чорноголових овець, зокрема, зв’язок між цими ознаками набагато нижчий (r = 0,235). Натомість у них високий коефіцієнт кореляції між тониною вовни та ступенем її розчинності (r = 0,549), чого зовсім не спостерігається в тонкої вовни.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що полягає у вивченні макромолекулярної структури, хімічного складу та фізичних показників дефектної вовни двох генотипів овець: асканійських тонкорунних та чорноголових кросбредних. Досліджено співвідношення кератоз, вміст сірки та цистину в нормальних та патологічно стоншених волокнах, виділено S-карбоксиметилкератеїни з високим вмістом сірки (SCMKB) і з’ясовано їхню гетерогенність. Виявлено взаємозв’язки між біохімічними та фізичними показниками вовни.

Одержаний матеріал може бути використаний у практиці розведення овець, та при виробництві високоякісної вовни.

2. Вовна з “голодною тониною” незалежно від типу її приналежності, відрізняється від нормальної зміненою макроструктурою, що виявляється в зміні кількісного співвідношення кератоз головним чином за рахунок альфа- і гамма-фракції, тобто кристалічної та аморфної фаз волокна. У тонкій нормальній вовні співвідношення альфа-? бета-? і гамма-кератоз дорівнює 54,3 : 11,2 : 34,45, а в дефектній 65,9 : 12,76 :21,37; у кросбредній - відповідно 60,0 : 12,8 : 26,2 і 68,6 : 11,7 : 20,0.

3. Патологічне стоншення волокон супроводжується зміною їхнього хімічного складу, особливо цистину, сульфгідрильних груп та гексозамінів.

За майже однакового з нормальною вовною вмісту загальної сірки (3,11 і 3,26%) вміст цистину в дефектних волокнах обох генотипів порівняно менший (10,07 і 9,17% у тонкій та 10,7 і 9,24% у кросбреднй), а вільних сульфгідрильних груп, навпаки, достовірно більший ( 26,65 і 58,88 мкмоль/г у тонкій вовні та 27,20 і 63,16 мкмоль/г у дефектній кросбредній вовні).

4.Розчинність вовни в сечовинно-бісульфітному розчині може бути інтегральним показником оцінки якості її в цілому. Ступінь розчинності дефектних волокон набагато вищий, ніж нормальних (29,06% проти 12,8 - для тонкої і відповідно 24,8% проти 9,2%- для кросбредної вовни).

5. Зміна структури і хімічного складу вовни позначається на її фізико-механічних показниках, зокрема товщині та міцності. Параметри їх у патологічно стоншених волокнах набагато нижчі, ніж у нормальних за станом (2,91 км проти 6,41 км- у тонких і відповідно 4,26 км 8,21 км - у кросбредних).

6. Тотальне стоншення вовнового волокна в результаті одночасного зменшення параметрів його кутикули та коркового шару найбільше проявляється в тонкорунних овець.

7. Виявлено кореляційні зв’язки між біохімічними та фізичними показниками вовни. Виявлено високі від’ємні коефіцієнти кореляції між міцністю тонкої вовни та вмістом у ній SH-груп (r = - 0,792), товщиною кросбредної вовни і ступенем її розчинності (r = - 0,752), товщиною тонких волокон і вмістом альфа-кератози (r = 0,792), розривним зусиллям вовни та ступенем її рочинності (r =- 0, 715, r = -0,549), міцнісю тонкої вовни та вмістом у ній сірки та цистину (r = 0,460, r = 0,549). Відносно помірні коефіцієнти зафіксовано між настригом вовни та вмістом сірки (r = -0,372), тониною вовни та гамма-кератозою (r = 0,320).

8. Білки з високим вмістом сірки (SCMKB) тонкої і кросбредної вовни одержано шляхом її солюбілізації при 40оС 0,2М розчином тіогліколяту калію, який містить 8М сечовину, рН11, і подальшим алкілюванням екстрагованих білків йодацетатом.

9. Методом електрофорезу в поліакриламідному гелі з використанням Тріс-гліцин буферної системи, рН 8,3 і за наявності додецилсульфату натрію досліджено гетерогенність SCMKB. За розміром молекули їх поділено на п’ять фракцій, умовно позначених літерами А, Б, В, Г, Д. Молекулярна маса їх становить відповідно 22, 21, 16, 11, 10 тис. Найбільша частка (приблизно 80%) усієї кількості цих білків припадає на фракції з найменшою молекулярною масою, тобто на Г і Д, найменша (15%) - на А і Б, які характеризуються відносно більшою молекулярною масою (22-21 тис.) і ультрависоким вмістом сірки та цистину (UHSP).

10. Виявлено породні особливості кількісного співвідношення SCMKB. Кросбредна вовна на відміну від тонкої відрізняється порівняно вищими показниками фракцій А і Б, особливо першої ( відповідно 14,70 і 10,75%) і одночасно нижчими показниками Г і Д, особливо останньої (відповідно 40,40 і 31,20%). У ній також порівняно більше білків, які відповідають фракції В (9,80% проти 3,68% у тонкій).

11. Депресія вовноутворення суттєво позначається на макроструктурі білків із високим вмістом сірки. Тонка вовна з явними ознаками “ голодної тонини“ характеризується меншим вмістом протеїнів із відносно більшою молекулярною масою ( фракція А) й низькомолекулярних протеїнів (фракція Д). Білків, зображених на фореграмах смугами Б, В, Г? у тонкій вовні порівняно більше. Подібна модифікація спостерігається і в кросбредній вовні за рахунок фракцій А, Б, В і Д. У неї порівняно більше протеїнів з молекулярною масою 21000 (11,20% проти 5,90% - у нормальній вовні), фракцій В (13,90 % проти 9,80 %) і відповідно менше фракції А (12,70% проти 14,70 %) і Д (23,70% проти 31,20%).

12.Одним із факторів, які зумовлюють “ голодну тонину“ будь-якого типу вовни, є порушення синтезу у вовноутворюючих структурах білків вовни з ультрависоким вмістом сірки?тобто UHSP.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Лико І.Я. Багаті на сірку білки вовни в контексті патологічного стоншення вовняних волокон // Наук.-техн. бюл. Інст. біол. тварин.- 2000.- Вип.2.- С.13-17.

2. Лико І.Я. Порівняльна характеристика морфоструктури та фізико-хімічних показників нормальної і дефектної вовни // Наук.-техн. бюл. Інст. біол. тварин.- 2001.- Вип.1-2.- С. 389-392.

3. Лико І.Я.? Макар І.А. Морфобіохімічні та фізичні показники дефектної вовни овець // Сільський господар.- 2001.- № 5-6. - С. 12-13.

4. Лико І.Я. Дослідження гетерогенності високовміщаючих сірку білків вовни асканійських тонкорунних овець // Наук.-техн. бюл. Інст. біол. тварин.- 2002.- Вип.4, №1.- С.91-95.

5. Лико І.Я.? Макар І.А. Порівняльна характеристика макроструктури та фізичних параметрів нормальної і дефектної вовни овець двох генотипів // Наук. вісн. Львівської держ. акад. вет. медиц. - 2002.- Т.4, №2. – С. 52-55.

6. Лико І.Я.? Макар І.А.? Польська П.І. Вміст азоту?сірки та цистину у вовні асканійських тонкорунних і кросбредних овець // Сільський господар.- 2002.- №9-10.- С.16-17. (Дисертант проводив визначення азоту, сірки, цистину? здійснював статистичну обробку і описання отриманих результатів).

АНОТАЦІЇ

Лико І.Я. Порівняльна характеристика структури? хімічного складу? фізичних показників нормальної і дефектної вовни.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.04. – біохімія.- Інститут біології тварин УААН, Львів, 2003.

Дисертація присвячена вивченню особливостей макроструктури та фізико-хімічних показників патологічно стоншеної вовни (“голодна тонина”) в овець різних генотипів і виявлення зв’язку цього дефекту вовни із їх білковим спектром? особливо білками? які відзначаються високим вмістом сірки та цистину.

Показано? що за умов депресії процесів вовноутворення ріст вовни уповільнюється? наступають зміни в її структурі? хімічному складі? та фізичних показниках волокон.

Методом електрофорезу в поліакриламідному гелі? з використанням Тріс-гліцин буферної системи? рН 8?3 і за наявності додецилсульфату натрію досліджено гетерогенність білків з високим вмістом сірки – S-карбоксиметилкератеїнів. За розміром молекули їх поділено на 5 фракцій? умовно позначених літерами А? Б? В? Г? Д? молекулярною масою відповідно 22? 21ё 16ё 11ё 10 ?ис. Виявлено породні особливості кількісного співвідношення SCMKB і корелятивні зв’язки між біохімічними та фізичними показниками вовни. Показано? що в основі генези патологічного стоншення вовни є порушення синтезу ультрабагатого на цистин білка кортексу? тобто UHSP.

Ключові слова: вівці? вовна? “голодна тонина”? вовноутворення? кератози? кератеїни? гетерогенність.

Лыко И.Я. Сравнительная характеристика структуры? химического состава? физических показателей нормальной и дефектной шерсти.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.04.- биохимия.- Институт биологии животных УААН? Львов? 2003.

Работа посвящена изучению особенностей макроструктуры и физико-химических показателей патологически утонченной шерсти (“голодная тонина”) у овец разных генотипов? обнаружению связей данного дефекта волокон с их белковым спектром? особенно белков? характеризующихся высоким содержанием серы и цистина.

Показано? что в условиях депрессии процессов шерстеобразования? наблюдающейся в период суягности и лактации маток? рост шерсти замедляется? происходят изменения в макроструктуре (соотношение кератоз) и химическом составе. Изменение количественного соотношения кератоз происходит главным образом за счет альфа- и гамма-фракции? т.е. кристаллической и аморфной фаз волокна. Особенно ощутимая разница между альфа- и гамма-кератозами проявляется по содержанию серы и цистина. Содержание серы в гамма-фракции (основное вещество) в 2 раза больше, чем в альфа-кератозе (микрофибриллярные структуры)? а цистина (цистеиновой кислоты) – у 1?5 раза. Бета-кератоза , т.е. нерастворимая часть волокна, в этом отношении занимает промежуточное положение. За содержанием серы эта