УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

НІКІТСЬКИЙ БОТАНІЧНИЙ САД — НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

ЛІТОВКІН Кирило Валентинович

УДК 581.143.6:575:633.16

ГЕНОТИПОВІ ОСОБЛИВОСТІ МОРФОГЕНЕТИЧНИХ

РЕАКЦІЙ В КУЛЬТУРІ ТКАНИН ЯЧМЕНЮ

03.00.20 — біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Ялта — 2003

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Селекційно-генетичному інституті — Національному центрі насіннєзнавства та сортовивчення Української академії аграрних наук та Південному біотехнологічному центрі у рослинництві Української академії аграрних наук і Міністерства освіти і науки України, м. Одеса

Науковий керівник: кандидат біологічних наук

ІГНАТОВА Світлана Олександрівна,

Південний біотехнологічний центр у рослинництві УААН та

МОН, завідувач лабораторії культури тканин

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

МИТРОФАНОВА Ольга Володимирівна,

Нікітський ботанічний сад — Національний науковий центр УААН,

Завідувач відділу біотехнології і вірусології рослин

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

ЄГОРОВА Наталія Олексіївна, Інститут ефіроолійних і

лікарських рослин УААН, завідувач сектора культури тканин

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, відділ

генетики клітинних популяцій, м. Київ

Захист відбудеться “ 10 ” квітня 2003 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 53.369.01 при Нікітському ботанічному саді — Національному науковому центрі за адресою: 98648, Україна, Крим, м. Ялта, Нікітський ботанічний сад — Національний науковий центр.

Факс: (0654) 33-53-86

E-mail: nbs1812@ukr.net

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Нікітського ботанічного саду — Національного наукового центру за адресою: 98648, Україна, Крим, м. Ялта, Нікітський ботанічний сад — Національний науковий центр.

Автореферат розісланий “ 24 ” лютого 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Садогурський С.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Створення технології масової відтворюваної регенерації будь-якого генотипу є гарантією ефективного використання тканинних культур ячменю в селекційному процесі. Вирішення даної проблеми в чималій мірі лімітується відсутністю чіткіх знань про взаємодію різноманітних чинників та механізмів, від яких залежить індукція проліферативних процесів у експлантах, частота і швидкість регенераційних процессів в клітинних популяціях та новоутвореннях в умовах in vitro.

У перебігу розроблення нетрадиційних методів підвищення ефективності та прискорення селекційної роботи з використанням культури in vitro стало очевидним, що, незважаючи на притаманну клітинам вищих рослин тотипотентність, клітинні культури різних генотипів або різних експлантів одного і того ж генотипу характерізуються неоднаковим морфогенетичним потенціалом. Реалізація потенцій до регенерації в таких культурах багато в чому залежить від умов культивування та епігенетичних особливостей експлантів. В той же час одноіменні, одновікові, однаково локалізовані тканини й органи у різних форм одного виду досить часто мають неоднакову регенераційну здатність, тому можливість створення стандартних умов культивування для різних генотипів є проблематичною. У зв’язку з цим поряд з оптимізацією умов культивування експлантів виникає необхідність дослідження генетичної природи регенераційних процессів.

Оскільки реалізація складних ознак, до яких відносять і здатність до регенерації, знаходиться в сполученій взаємозалежності з експресією інших кількісних ознак організму, то при їх вивченні надто важливим є з’ясування структурної системи кореляції, зумовленої генотиповими особливостями. При цьому певний інтерес становить вивчення впливу на регенераційну здатність конкретних генів, що контролюють морфологічні та фізіологічні ознаки.

Зв’язок работи з науковими програмами, темами, планами. Робота виконувалася в період з 1996 р. по 2001 р. в лабораторії біотехнології відділу генетики Селекційно-генетичного інституту — Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення УААН, та в лабораторії культури тканин Південного біотехнологічного центру у рослинництві УААН та МОН у рамках Державної науково-технічної програми 03.04-МВ/322-97 “Теоретичні основи селекції та насінництва сільськогосподарських культур”, затвердженої Міністерством України в справах науки і технологій, науково-технічної програми УААН “Біотехнологія культурних рослин. Розробка і впровадження ДНК-технологій, культури тканин та органів in vitro для розвитку теорії і практики селекції рослин”, затвердженої Постановою Президії УААН (протокол №17 від 21 грудня 2000 р.), а також згідно з планом аспірантської підготовки.

Мета та завдання дослідження. Мета роботи — пошук експериментальних шляхів підвищення ефективності технологій масового одержання регенерантів ячменю, детермінація впливу генотипу на процеси калюсоутворення і регенерації. Для досягнення даної мети ставились такі завдання:

1. Оптимізація умов культивування недостиглих зародків і пиляків ячменю, порівняння сортів та ліній ярого ячменю за здатністю до калюсоутворення і регенерації в запропонованих умовах культивування експлантів.

2. Вивчення шляхів морфогенезу в культурі недостиглих зародків і пиляків.

3. Вивчення впливу умов вирощування рослин-донорів, стадії розвитку недостиглих зародків і строків холодової обробки пиляків на ефективність регенераційних процесів.

4. Визначення характеру генетичного контролю ознаки “регенерація рослин” у культурі недостиглих зародків.

5. Вивчення кореляції між здатністю до регенерації та морфобіологічними ознаками рослин ячменю.

Об’єкт дослідження. Культура недостиглих зародків і пиляків ячменю.

Предмет дослідження. Морфогенетичні реакції і показники регенераційної здатності in vitro різних генотипів ячменю при різноманітних умовах культивування тканин та вирощування рослин-донорів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено вивчення впливу ряду маркерних генів ячменю на здатність до морфогенезу в культурі недостиглих зародків і пиляків. На основі порівняльного вивчення морфогенетичних реакцій в культурі недостиглих зародків ізогенних ліній сорту Одеський 100 вперше показано вплив мутації в гомеобокс-гені ячменю на здатність до регенерації в умовах in vitro. Встановлено, що в запропонованих нами умовах культивування недостиглих зародків ячменю джерелом регенерації є меристеми експлантів. Генотип визначає кількісні відмінності за здатністю до регенерації, тоді коли спрямованість регенераційних процесів залежить від стадії розвитку експлантів та умов вирощування рослин-донорів.

Вперше виявлено зв’язок регенераційної здатності в культурі недостиглих зародків ячменю з ознаками вегетативної потужності рослин. Виявлено достовірну позитивну кореляцію між числом пиляків з новоутвореннями та кількістю рослин-регенерантів.

Встановлено, що ознака “регенерація рослин” контролюється адитивно-домінантною генетичною системою з переважанням ефектів наддомінування. Вивчення генетичного контролю даної ознаки в запропонованих умовах культивування недостиглих зародків проводилося вперше.

Практичне значення одержаних результатів. В процесі досліджень оптимізовані умови одержання морфогенного калюсу і регенерації рослин ярого ячменю в культурі недостиглих зародків. Визначено оптимальні розміри експлантів (1-1,7 мм) та середовище для їхнього культивування (MS з доданням 16 мг/л 2,4-Д і 1 г/л гідролізату казеїну для індукції калюсу та MS з доданням 6 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л ХФО і 1 г/л гідролізату казеїну для проліферації калюсу). Запропоновано умови одержання морфогенного калюсу та регенерації рослин при культивуванні ізольованої щиткової тканини (середовище Гамборга В5 з доданням 1 мг/л 2,4-Д і 30 г/л мальтози, освітлення 2 клк). Підібрано оптимальні умови попередньої обробки пиляків (2 тижні при +4 С). Встановлено, що сорт Одеський 100 має високу здатність до морфогенезу в культурі пиляків, що дає змогу рекомендувати цей генотип до використування в селекційно-генетичних програмах з використанням методів in vitro. Проведені дослідження генетичного контролю регенераційної здатності є внеском до вивчення генетичної різноманітності ячменю з метою одержання необхідних комбінацій генів. Наявність кореляції між здатністю до морфогенезу в культурі тканин та морфобіологічними ознаками рослин дає змогу прогнозувати регенераційну здатність in vitro різних генотипів ячменю. Наведені в дисертації результати досліджень включено до курсу лекцій з сільськогосподарської біотехнології для студентів другого курсу факультету плодоовочівництва Одеського державного аграрного університету (довідка про впровадження від 22 квітня 2002 р.).

Особистий внесок здобувача. Безпосередньо здобувачем здійснено планування та проведення лабораторних і польових експериментів, аналіз одержаних результатів, огляд літератури і написання тексту дисертації. В дисертаційну роботу включено ту частину опублікованих матеріалів, що містить результати, отримані автором особисто.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи було представлено на міжнародному науково-практичному семінарі “Introducing microspore culture to improve breeding methods in Ukraine” (м. Одеса, 1999), на 2 міжнародній конференції “Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии” (м. Москва, 2000), на конференції молодих вчених “Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні” (м. Київ, 2002), на міжнародній конференції “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources” (м. Ялта, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті у фахових наукових виданнях та 2 тезові повідомлення у збірниках конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація містить вступ, огляд літератури за останні 20 років, опис матеріалів і методів дослідження, викладення результатів та їх обговорення (4 розділи), висновки, практичні рекомендації, список використаної літератури (247 джерел, з них 198 публікацій іноземними мовами) і 1 додаток, включає 20 рисунків і 24 таблиці. Роботу викладено на 137 сторінках машинописного тексту.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Як вихідний матеріал використовували 9 сортів ярого ячменю (Hordeum vulgare L.), люб’язно наданих відділом селекції та насінництва ячменю Селекційно-генетичного інституту — Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення УААН (далі СГІ), а також ізогенні лінії сорту Одеський 100, створені співробітником відділу генетики СГІ к.б.н. Г.П. Бондарем. Перелік ізогенних ліній наведено в таблиці 1. Донорні рослини вирощували в умовах фітотрона та в полі (1996-2000 рр.). Відбір недостиглих зародків проводили на 10-15 добу після запилення, коли їхній розмір сягав 1-2 мм. Матеріал стерилізували за методикою, розробленою у відділі біотехнології СГІ (С.Ф. Лукьянюк, С.А. Игнатова, 1980). Експланти розміщували в асептичних умовах на агаризованому середовищі MS (T.Murashige та F. Skoog, 1962) з доданням 30 г/л сахарози, 16 мг/л 2,4-Д, 1 г/л гідролізату казеїну, і культивували в темряві при +25 С. Через 28 діб експланти, які утворили калюс, переносили на середовище MS з доданням 6 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л ХФО, 30 г/л сахарози і культивували впродовж 3-4 тижнів під розсіяним світлом інтенсивністю 2-3 тис. люкс при 16-годинному фотоперіоді і температурі +25 С. Після цього калюси розміщували для регенерації на середовищі MS з доданням 0,5 мг/л зеатин-рібозиду, по 200 мг/л проліну та глутаміну. Перед пересадкою на середовище для регенерації здійснювали облік калюсів з ділянками росту, з яких формувались пагони або щільний світлий вторинний калюс (морфогенні калюсні культури).

Таблиця 1 Ізогені лініі сорту Одеський 100

Фенотип | Гени-маркери та їхня локалізація

Шестирядність, безлігульність | v (хромосома 2), li (2)

Шестирядність, глянсове стебло та колос | v (2), gs3 (1)

Шестиряднsсть, широка квіткова луска | v (2), log1 (2)

Жовта строкатість листя | yst2 (3)

Шестирядність, гладкі ості | v (2), r (7)

Фуркатність | K (4)

Короткі ості | ari-a12 (4)

Некротична плямистість листя | nec1a (5)

Темний перикарп, оранжева лема | B (5), o (6)

Для генетичного аналізу ознаки “регенерація рослин” у культурі недостиглих зародків провели схрещування за діалельною схемою сортів Одеський 115, Геліос, Golden promise та фуркатної лінії сорту Одеський 100. Визначення типів ефектів генів за ознаками “довжина проростка” і “регенерація рослин” на підставі середніх значень генерацій F1, F2, B1та B2, одержаних від схрещування сорту Геліос та фуркатної лінії сорту Одеський 100, здійснювали методом зважених найменших квадратів. Статистичну обробку даних та генетичний аналіз здійснювали за допомогою програми Excel 7.0 з пакета програм Microsoft Office для IBM PC.

Для ізоляції пиляків використовували колосся з мікроспорами на середній та пізній одноядерній стадії розвитку. Колосся без попереднього вилучення з листової піхви стерилізували 70 % етанолом. Далі вилучені в асептичних умовах колосся з мікроспорами в належній стадії розвитку розміщали в кількості 5-6 штук у чашках Петрі діаметром 95 мм з краплею стерильної дистильованої води для підтримання вологості. Чашки Петрі запечатували парафільмом і тримали у побутовому холодильнику при +4 С на протязі 2 тижнів для холодової обробки мікроспор. Вилучення та висадження пиляків на агаризоване (агар 8 г/л) живильне середовище, склад якого запропонували A. Jahne-Grtner та H. Lorz (1995), проводили в асептичних умовах. Культуральними посудинами слугували чашки Петрі діаметром 40 мм, запечатані парафільмом. Інкубацію пиляків проводили в термостаті в темряві при температурі +32 С перші дві доби з подальшим зниженням температури до +25 С. Новоутворення (ембріоїди та калюс) переносили на живильне середовище такого ж складу без додання БАП (6-бензиламінопурин) і з концентрацією мальтози 30 г/л, культивували під розсіяним світлом (2-3 тис. люкс) при температурі +25 С і 16-годинному світловому дні. Ефективність андрогенезу in vitro оцінювали за кількістю пиляків з новоутвореннями (у відсотках від числа пиляків, висаджених на середовище) і кількістю рослин-регенерантів.

Морфометричну оцінку рослин здійснювали за загальносприйнятою методикою. Вивчали такі ознаки: число пагонів, довжина головного пагона, продуктивна кущистітсь, довжина головного колоса, довжина бокового колоса, довжина колосоносного міжвузля, щільність головного колоса, щільність бокового колоса, маса тисячи зерен, час виходу флагового листа. Вивчення зв’язку між показниками регенерації in vitro та морфобіологічними ознаками рослин здійснювали методом кореляційного аналізу, обробку даних виконували за допомогою пакета статистичних програм SPSS для IBM PC.

Для приготування постійних цитологічних препаратів об’єкти фіксували в оцтовому алкоголі протягом доби, після цього двічі промивали 96 % етанолом протягом години. Просочування матеріалу глікольметилакрилатом та приготування гістогумових блоків проводили згідно з інструкцією, що додається до LKB 2218-500 HISTORESINE Embedding Kit. Зрізи товщиною 10-15 мкм одержували за допомогою мікротома 2218 HistoRange (LKB). Фарбування зрізів проводили гематоксиліном за Делафільдом за стандартною методикою (З.П. Паушева, 1974).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

ВИВЧЕННЯ ОСОБЛИВОСТЕЙ МОРФОГЕНЕЗУ ПРИ КУЛЬТИВУВАННІ

НЕДОСТИГЛИХ ЗАРОДКІВ ЯРОГО ЯЧМЕНЮ

Для оптимізації умов культивування недостиглих зародків ячменю провели вивчення впливу гормонального та сольового складу живильного середовища на морфогенетичні реакції експлантів. При висадженні зародків розміром 1-2 мм на середовище MS з доданням 1-5 мг/л 2,4-Д, а також ІМК, ІОК та ХФО в різних концентраціях, експланти активно проростали без формування калюсу. При доданні до живильного середовища для індукції калюсу 16 мг/л 2,4-Д пригнітити проростання цілком не вдалося, але практично у всіх експлантів (поза залежності від генотипу) ріст пагона супровождувався формуванням пухкого первинного калюсу, утвореного подовженими вакуолізованими клітинами. На середовищі MS первинний калюс формувався в основі зародкової осі та з колеоризи, щиток при цьому некротизувався. В той же час на середовищі Гамборга В5 клітини щитка брали активну участь в утворенні первинного калюсу, який не проявляв в подальшому здатність до морфогенезу. В окремих випадках на поверхні або на краях щитка експлантів, розміщених на середовищі Гамборга В5, формувався щільний компактний калюс кремового забарвлення, здатний до регенерації шляхом соматичного ембріогенезу. Вивчення впливу сольового складу живильного середовища на індукцію калюсогенезу та регенерації показало, що на середовищі Гамборга В5 маса неморфогенного щиткового калюсу перевершувала аналогічний показник на середовищі MS. Оскільки на середовищі MS експланти проростали не так інтенсивно, як на середовищі Гамборга В5, а показники регенерації були вищими, для подальших експериментів ми використовували сольову основу MS.

Як показали гістологічні дослідження, проростання експлантів на середовищі для індукції калюсу призводило до формування у основі проростка вузла кущіння, і в подальшому меристеми кущіння були джерелом регенерації. При цьому спостерігався як прямий органогенез, так і формування внаслідок клонування клітин меристематичного типу морфогенного калюсу. В подальшому такий калюс проявляв здатність до стеблового морфогенезу, а також до регенерації шляхом соматичного ембріогенезу. Загальну схему морфогенетичних процесів, що спостерігалися в умовах наших експериментів, зображено на рис. 1.

Зрушення морфогенетичних реакцій в тому чи іншому напрямку залежало від розміру експланта і умов вирощування рослин-донорів. Так, в умовах 1997 року утворення морфогенного калюсу та регенерація з нього найчастіше відбувалися в культурі зародків розміром 1-1,7 мм (рис. 2). При культивуванні експлантів довжиною понад 2 мм спостерігався переважно прямий органогенез. Незначне проростання експлантів на середовищі для індукції калюсу стимулювало утворення морфогенного калюсу, тоді коли при більш інтенсивному проростанні також спостері-

Експлант

неморфогенний щиток меристеми неморфогенний

калюс калюс

ембріогенний прямий морфогенний

калюс органогенез калюс

соматичний непрямий

ембріогенез органогенез

Рис. 1. Морфогенетичні процеси в культурі недостиглих зародків ячменю

Рис. 2. Залежність частоти регенерації від розміру недостиглих зародків

гався переважно прямий органогенез. Слід зазначити, що розміри експлантів корелювали з інтенсивністю їхнього проростання. Проте відмічено чітку залежність частоти індукції регенераційних процесів від генотипу експланта. Серед ізогенних ліній сорту Одеський 100 найбільшою здатністю до морфогенезу in vitro відзначалася фуркатна (К) лінія: цей генотип достовірно перевершував контрольну лінію як за частотою утворення морфогенних культур, так і за показником регенерації рослин (табл. 2). Рослини фуркатної лінії значно перевищували чисту лінію сорту також за числом погонів, довжиною головного пагона та довжиною колосоносного міжвузля (табл. 3). Як відомо, домінантний маркерний ген К є тотожний гомеобокс-гену Hvknox3 (K.J. Mьller et al., 1995). Гомеобокс-гени кодують серію регуляторних білків, що виконують роль чинників транскрипції (L. Reiser et al., 2000).

Таблиця 2

Морфогенез в культурі недостиглих зародків ізогенних ліній сорту Одеський 100

Генотип | Число калюсів, шт. | Частота утворення морфогенних калюсних культур, % | Частота регенерації від загального числа калюсів, %

Одеський 100 | 50 | 40,006,87 | 16,005,21

K | 100 | 56,004,11** | 46,004,52**

yst2 | 119 | 34,484,37 | 12,583,03

nec1a | 154 | 47,414,00 | 28,643,61

v gs3 | 144 | 43,114,15 | 29,883,79

v log1 | 28 | 35,729,13 | 21,377,80

v r | 88 | 43,225,28 | 28,414,77

B o | 75 | 37,265,59 | 14,744,13

v li | 196 | 36,153,41 | 18,922,76

ari-a12 | 66 | 34,885,86 | 18,194,75

Примітка. Розбіжності з сортом Одеський 100 достовірні при **Р 0,01

Таблиця 3

Порівняння рослин фуркатної

та контрольної ліній сорту Одеський 100 за морфометричними показниками |

Ознака

Генотип | Число пагонів, шт. | Продуктивна кущистість, шт. | Довжина головного пагона, см | Довжина головного колоса, см

К | 7,460,44** | 5,040,38 | 81,461,00** | 10,610,24*

Одеський 100 | 5,710,36 | 4,960,36 | 68,681,15 | 9,980,17

| Признак

Генотип | Щільність зерен у колосі, зерен/см | Довжинана колосоносного міжвузля, см | Довжина 2-го нижнього міжвузля, см | Число зерен у колосі, шт.

К | 1,470,02 | 25,280,67** | 9,940,22 | 27,540,43

Одеський 100 | 1,450,02 | 19,950,67 | 9,110,35 | 28,000,31

Примітка. Розбіжності з сортом Одеський 100 достовірні при *Р 0,05 та **Р 0,01

Експресія гомологічного гену Hvknox3 гена кукурузи kn1 є маркером формування стеблової меристеми у перебігу зиготичного ембріогенезу (N. Sentoku et al., 1999). В нашому досліді фуркатна лінія сорту Одеський 100 в порівнянні з контролем відрізнялася підвищеною здатністю до формування стеблових меристем, що знайшло відображення в підвищених показниках кущіння в польових умовах та регенерації при культивуванні недостиглих зародків in vitro. Як відомо, фенотиповим проявом мутації фуркатності є невластиве дикому типу формування меристематичного вузла внаслідок поділу клітин субепідермального шару зачатка ості (K.J. Muller et al., 1995). Подібне явище пов’язане зі збільшенням в 2,5 рази акумуляції продукту гена Hvknox3 в ділянці формування меристематичного вузла в порівнянні з диким типом, що викликано дуплікацією в четвертому інтроні даного гена. Ми вважаємо, що підвищена регенераційна здатність, яка спостерігається в культурі недостиглих зародків фуркатної лінії сорту Одеський 100, як і підвищена в порівнянні з контрольним генотипом здатність до кущіння в польових умовах, є результатом підвищеної експресії гена Hvknox3 внаслідок дуплікації в інтроні даного гена, яка звичайно асоціюється з мутацією фуркатності.

Умови вирощування рослин-донорів визначали сезонні коливання показників калюсоутворення та регенерації у одних і тих же генотипів. В нашому експерименті відмічено вплив умов вирощування рослин донорів не тільки на частоту регенерації, але й на спрямованість регенераційних процесів. У 1996 році посівний період був жарким і посушливим, у 1997 – дощовим і прохолодним. При використанні недостиглих зародків розміром 1-2 мм погодні умови 1997 року в більшій мірі сприяли індукції морфогенного калюсу: в культурі зародків контрольної та короткоостої ліній сорту Одеський 100 прямий органогенез того року не спостерігався взагалі. Причиною цьому, на наш погляд, є дещо уповільнений розвиток зародків за таких погодних умов, що розширює часові межі оптимальної для індукції морфогенного калюсу і соматичного ембріогенезу стадії розвитку експлантів. Такі зародки, очевидно, чутливіші до токсичного ефекту 2,4-Д у порівнянні з експлантами такого ж розміру, отриманими в жарких та сухих умовах, про що свідчить зниження в 1997 році загальних показників регенерації.

У зв’язку з тим, що проростання недостиглих зародків на середовищі для індукції калюсу перешкоджає утворенню морфогенного калюсу з щиткової тканини, ми провели вивчення можливості культивування ізольованої щиткової тканини з попереднім вилученням зародкової осі. В експерименті використовувались зародки сорту Геліос і середовище Гамборга В5 з різними концентраціями 2,4-Д. Встановлено, що найоптимальнішим варіантом є культивування експлантів при освітленні 2 клк на середовищі Гамборга В5 з доданням 1 мг/л 2,4-Д. Таку методику можна рекомендувати для генотипів, у яких ускладнена регенерація з меристематичних ділянок експлантів.

Отже, у перебігу роботи виявлено різноманітність морфогенетичних реакцій у рамках регенераційних процесів при культивуванні недостиглих зародків. Спрямованість регенераційних процесів залежала від фізіологічного стану експлантів, тоді коли генотип визначав переважно кількісні відмінності за здатністю до регенерації. Підвищити частоту утворення морфогенного калюсу можна шляхом відбору для висадки на середовище для індукції калюсу недостиглих зародків довжиною 1-1,7 мм з подальшим вилученням з культури інтенсивно прорастаючих експлантів (довжина проростка понад 1,5 см). Запропонована методика культивування ізольованої щиткової тканин може бути рекомендована для генотипів, у яких ускладнена регенерація з меристематичних зон експлантів. Фуркатна лінія сорту Одеський 100 характеризується найбільшою частотою індукції морфогенного калюсу і регенерації рослин. Встановлено, що рослини фуркатної лінії перевершують контроль за здатністю до кущіння в польових умовах, довжиною головного пагона, колосоносного міжвузля та головного колоса.

ГЕНЕТИЧНИЙ КОНТРОЛЬ МОРФОГЕНЕЗУ В КУЛЬТУРІ

НЕДОСТИГЛИХ ЗАРОДКІВ

Для оцінки генетичного контролю ознаки “регенерація рослин” проведені схрещування за повною діалельною схемою з використанням як батьківські форми сортів Геліос, Golden promise, Одеський 115 та фуркатної лінії сорту Одеський 100. Дисперсійний аналіз показав достовірність відмінностей між генотипами за рівнем розвитку ознаки, що дало змогу провести розкладання дисперсії варіантів на її компоненти, зумовлені адитивною та неадитивною дією алельних генів. Значення компонентів генетичної варіації наведено в таблиці 4. Оцінки успадковуваності в широкому та вузькому сенсі склали 0,86 та 0,43 відповідно, що свідчить про зумовленість генотипової мінливості головним чином домінантними ефектами. Оцінка Н1, яка вимірює домінантні ефекти, значно більша оцінки D, що вимірює адитивні ефекти. Це свідчить про переважання ефектів наддомінування при успадкуванні регенераційної здатності у групи сортів, що вивчалися. Величина середнього ступеня домінування дорівнює 1,59 і вказує на наддомінування в кожному локусі. З нерівності оцінок Н1 та Н2 випливає, що в даному наборі сортів позитивні та негативні алелі розподілені нерівномірно. Асиметрічність розподілупідтверджується відхиленням величини балансу негативних та позитивних алелей від 0,25. Позитивний знак величини F, як і оцінка частки домінантних алелей, свідчить про переважання домінантних алелей над рецесивними. Близьке до нуля (r=-0,252) значення коефіцієнта кореляції між середньою батьків та відповідними значеннями (Wr+Vr) свідчить про неспрямований характер домінування. Асиметрія між домінантними та рецесивними алелями при неспрямованому домінуванні призводить до викривлення параметрів, що характеризують тип успадкування.

Таблиця 4

Оцінки компонентів генетичної дисперсії

Генетичні параметри | Значення

D | 124,95

F | 51,97

H1 | 314,26

H2 | 232,70

E | 31,26

Середній ступінь домінування | 1,59

Частка домінантних алелей | 1,30

Баланс домінантних та рецесивних алелей | 0,19

Успадковуваність в широкому сенсі | 0,86

Успадковуваність в вузькому сенсі | 0,43

Крім діалельного аналізу було здійснено визначення типів ефектів генів за ознаками “довжина проростка” (дана ознака характерізує інтенсивність проростання експлантів на середовищі для індукції калюсу) та “регенерація рослин” на основі середніх значень генерацій F1, F2 та перших беккросів, одержаних від реципрокних схрещувань фуркатної лінії сорту Одеський 100 і сорту Геліос. Оцінки параметрів генетичних моделей, адекватних одержаним даним для ознак, що досліджувались, наведено в таблиці 5.

Для ознаки “регенерація рослин” була адекватна проста модель, що враховує лише адитивні [d] та домінантні [h] ефекти. Включення до генетичної моделі параметрів, які характеризують неалельні взаємодії ([i], [j] та [l]), а також параметрів материнського ефекту ([dm], [dh]) та/або цитоплазматичних параметрів ([c], [cd] та [ch]) призвело лише до втрати адекватності. Хоча за даною ознакою і спостерігається деякий незначний рівень реципрокних відмінностей, здійснений аналіз не дає змогу зробити висновок про причину їхнього виникнення.

За ознакою “довжина проростка” значущими виявилися оцінки всіх ядерних параметрів, за винятком параметра [l], що характеризує домінантно-домінантну взаємодію між гетерозиготними локусами. Крім того, достовірність параметра [c] свідчить про суттєвий вплив цитоплазми на експресію даної ознаки. Таким чином, ознаки, які вивчаються, контролюються різними генетичнимим системами і тому інтенсивність проростання недостиглих зародків на середовищі для індукції калюсу фактично не може розглядатися як індикатор їхньої регенераційної здатності.

Таблиця 5

Достовірні (Р 0,05) значення параметрів, які характеризують

генетичні ефекти за ознаками, що вивчаються |

Ознаки

Параметри | Довжина проростка | Частота регенерації

M | 2,400,07 | 0,690,06

[d] | 0,170,04 | 0,140,06

[h] | 0,600,08 | 0,600,10

[i] | 0,530,10 |

[j] | -0,880,15 |

[l] | |

[c] | 0,070,01 |

[cd] | 0,150,06 |

[ch] | |

[dm] | |

[dh] | |

2[3] 0,5 | 2[7] 5,8

В нашому експерименті гібридні зародки значно перевершували експланти батьківських форм за здатністю до регенерації, про що свідчить значне переважання величини домінантних [h] ефектів над адитивними [d]. Спостережуване явище цілком імовірно є не специфічним феноменом in vitro, а проявом загальної гібридної потужності. Таке припущення підтвердилося при вививченні кореляції між здатністю до регенерації в культурі недостиглих зародків фуркатної лінії сорту Одеський 100, сорту Геліос, а також отриманих від їх схрещування зародків генерацій F1, F2, B1, та морфобіологічними ознаками рослин цих генерацій. Висока достовірна кореляція на 0,01 рівні спостерігалася між частотою регенерації та такими ознаками, як число пагонів (r=0,95) і довжина головного колоса (r=0,97). Виявлено також високу кореляцію між частотою регенерації і висотою рослини (r=0,89) та довжиною бокового колоса (r=0,91), доостовірну на 0,05 рівні. Наявність кореляції між регенераційною здатністю і загальною кущистістю не викликає подиву, оскільки основним джерелом регенерації у нашому експерименті є меристеми кущіння, та дозволяє прогнозувати регенераційну здатність in vitro різних генотипів ячменю.

Отже, у групі генотипів ячменю, що вивчалися, ознака “регенерація рослин” у культурі недостиглих зародків ячменю контролюється адитивно-домінантною системою з переважанням ефектів наддомінування. Виявлено достовірну позитивну кореляцію між даною ознакою та ознаками вегетативної потужності рослин ячменю.

ОСОБЛИВОСТІ АНДРОГЕНЕЗУ В КУЛЬТУРІ ПИЛЯКІВ ЯЧМЕНЮ

Для оцінки здатності до андрогенезу сортів місцевої селекції нами використано високоефективну технологію культивування пиляків, яка запропонована A. Jahne-Grtner та H. Lorz [1995]. У перебігу удосконалення даної методики ми підвищили концентрацію мальтози у середовищі для індукції калюсу до 120 г/л. Також було проведено вивчення впливу строків холодової обробки пиляків на частоту індукції новоутворень. Найоптимальнішою в нашому експерименті була двотижнева холодова обробка пиляків при +4 0С.

Загальну схему морфогенетичних процесів, що спостерігалися в культурі пиляків, зображено на рис. 3. При аналізі індукції морфогенезу вже протягом першого тижня культивування пиляків на середовищі для індукції калюсу після холодової обробки можна було спостерігати появу багатоядерних структур. Подібні структури, що зупинилися в розвитку, виявлено і в неморфогенних пиляках на шестидесяту добу культивування. Основна частина новоутворень через три-шість тижнів після початку культивування пиляків in vitro була представлена глобулярними структурами розміром 0,5-1,5 мм, які в подальшому слугували джерелом калюсоутворення. Прямий ембріоїдогенез спостерігався дуже рідко; формування ембріоїдів прямим шляхом відбувалося беспосередньо на середовищі для індукції калюсу, ще до перенесення культур на безгормональне середовище. Таке явище в незначній мірі характерне для всіх генотипів. При перенесенні глобулярних структур у рідке безгормональне середовище в більшості випадків також відмічалася поява

мікроспора

утворення пилку стрес (2 тижні

in vitro +4 єС та 2 доби при

+32 єС)

пилкове

зерно глобулярні

структури

неморфогенний морфогенний

калюс калюс

органогенез ембріоїдогенез

РОСЛИНИ

Рис.3. Шляхи морфогенезу і культурі пиляків

калюсних агрегатів. Безпосереднє формування ембріоїдів в цих умовах, як і на твердому середовищі, було досить рідким явищем. Як і в культурі недостиглих зародків, джерелом регенерації слугували ділянки калюсу, які не мали безпосереднього контакту з живильним середовищем. На поверхні таких калюсних структур відбувалося формування ембриоїдів. Утворення зародків можна було спостерігати і на середовищі для індукції калюсу, ще до переносу на середовище для регенерації, також з ділянок калюсу, які не мали безпосереднього контакту з живильним середовищем. В таких калюсних агрегатах, цілком імовірно, виникали гормональні градієнти, сприятливі для ембріоїдогенезу, які тяжко відтворити штучним шляхом.

Серед генотипів, що вивчалися, найбільша частота індукції новоутворень була характерна для контрольної лінії сорту Одеський 100 (табл. 6). Виявлено чимале зниження здатності до андрогенезу ізогенних ліній даного сорту. Умови вирощування рослин-донорів не мали особливого впливу на частоту індукції новоутворень. Істотне збільшення даного показника в польових умовах у порівнянні з умовами фітотрона спостерігалося лише для сортів Адапт і Геліос. В цілому ж зміна умов вирощування не внесла істотних змін у розподіл генотипів за показником, що вивчається: більшість сортів слід віднести до групи генотипів з низькою здатністю до гаплопродукції. При

Таблиця 6

Ефективність індукції новоутворень

та регенерації рослин в культурі пиляків ярого ячменю

Генотип | Умови ви- рощування | Высаджено пиляків, | Частота індукції новоутворень, | Одержано регенерантів,

рослин- | шт. | % | шт.

донорів | | | Зелених | Альбиносів

Адапт | фітотрон | 215 | 15,312,46 | 0 | 5

поле | 93 | 38,725,05** | 2 | 7

Галатея | фітотрон | 110 | 19,643,78 | 1 | 5

поле | 95 | 16,793,84 | 2 | 3

Геліос | фітотрон | 137 | 5,101,88 | 0 | 4

поле | 193 | 21,202,94** | 5 | 8

Мішка | фітотрон | 150 | 4,891,75 | 0 | 1

поле | 170 | 5,311,72 | 1 | 3

Південний | фітотрон | 188 | 13,302,48 | 2 | 0

поле | 132 | 20,533,51 | 2 | 4

Сталкер | фітотрон | 329 | 17,882,12 | 1 | 10

поле | 199 | 21,112,89 | 5 | 11

Одеський 115 | фітотрон | 244 | 14,302,24 | 3 | 2

поле | 111 | 19,763,78 | 1 | 6

Одеський 100 | фітотрон | 192 | 72,893,15 | 18 | 32

поле | 260 | 87,382,03 | 20 | 38

К | фітотрон | 445 | 3,800,91 | 3 | 2

поле | 92 | 8,722,94 | 4 | 7

ari-a12 | фітотрон | 212 | 0,0 | 0 | 0

поле | 195 | 0,0 | 0 | 0

nec1a | фітотрон | 87 | 27,604,79 | 1 | 4

| поле | 135 | 23,743,66 | 2 | 2

v r | фітотрон | 60 | 21,695,32 | 2 | 5

поле | 98 | 39,624,61 | 3 | 9

B o | фітотрон | 173 | 16,752,84 | 3 | 4

поле | 120 | 25,804,00 | 4 | 1

v log1 | фітотрон | 83 | 16,924,11 | 2 | 3

поле | 75 | 13,333,92 | 6 | 11

Сталкер х Мішка | фітотрон | 502 | 57,402,21 | 19 | 35

Сталкер х Південний | фітотрон | 548 | 67,683,99 | 12 | 47

Адапт х Мішка | фітотрон | 310 | 25,812,49 | 0 | 12

Геліос х К | фітотрон | 141 | 42,634,16 | 9 | 13

Примітка. Внутрішньогенотипові відмінності між показниками індукції новоутворень при різних умовах вирощування рослин-донорів достовірні при ** Р 0,01.

цьому всі гібридні комбінації, використовувані в експерименті, значно переважали батьківські генотипи за частотою індукції новоутворень.

Показники регенерації в нашому експерименті значно поступалися показнику індукції новоутворень у кількісному відношенні, хоча в цілому кількість морфогенних пиляків корелювала з кількістю отриманих регенерантів (r=0,72). Співвідношення зелених регенерантів та альбіносів в середньому за генотипами склало 1:2. При оцінці впливу на кількісний вихід альбіносів генотипу та умов вирощування рослин-донорів, а також спільного впливу цих чинників методом двофакторного дисперсійного аналізу нульова гіпотеза спростовується лише стосовно першого чинника з імовірністю P 0,95. Проте сила впливу даного чинника – 7 %, тобто незначна. Отже, якщо індукція новоутворень в значній мірі визначається генотипом, вплив цього чинника на появу регенерантів-альбіносів в запропонованих умовах культивування незначний.

Для визначення взаємозв’язку між здатністю до індукції новоутворень у культурі пиляків та низкою ознак рослин ячменю (довжина головного колоса, щільність головного колоса, маса тисячи зерен, час виходу флагового листа, довжина колосоносного міжвузля, число пагонів, число зерен в колосі, довжина головного пагона, продуктивна кущистість) використовували сорти Адапт, Галатея, Сталкер, Мішка, Південний, Одеський 100 та Одеський 115. Спостерігається висока достовірна негативна кореляція (r=-0,79) між показником, що вивчається, та часом виходу флагового листа (дана ознака є індикатором стадії розвитку мікроспор), тобто чим менший часовий інтервал між появою паростків і виходом флагового листа, тим вища частота індукції новоутворень. Не виключено, що гени, які контролюють індукцію новоутворень в культурі пиляків ячменю, зчіплені з генами, які контролюють швидкість проходження етапів органогенезу, або дані ознаки контролюються одними й тими ж генами. Величини інших коефіцієнтів кореляції свідчать про незначний зв’язок індукції новоутворень з морфобіологічними ознаками рослин ячменю. Наявність високої негативної кореляції між часом виходу флагового листа і частотою індукції новоутворень в культурі пиляків дає змогу очікувати більш високі показники регенерації при культивуванні пиляків ранньостиглих сортів ячменю.

ВИСНОВКИ

1. У популяції сортів та ліній ярого ячменю, що вивчалися, ківлькісні відмінності за здатністю до індукції регенераційних процесів при культивуванні недостиглих зародків і пиляків обумовлені генотипом рослини-донора. В той же час спрямованість регенераційних процесів у культурі недостиглих зародків залежить від фізіологічного стану експлантів.

2. В запропонованих нами умовах культивування недостиглих зародків ячменю (MS з доданням 16 мг/л 2,4-Д та 1 г/л гідролізату казеїну для індукції калюсу, та середовище MS з доданням 6 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л ХФО та 1 г/л гідролізату казеїну для проліферації калюсу) регенерація рослин здійснюється внаслідок проліферації меристем експлантів; при цьому спостерігається як прямий органогенез, так і регенерація з морфогенного калюсу шляхом стеблового морфогенезу і соматичного ембріогенезу. Зародки розміром 1 – 1,7 мм знаходяться в оптимальній стадії розвитку для індукції морфогенного калюсу з меристематичних осередків експланта, проте межі оптимуму можуть змінюватися залежно від умов вирощування рослин донорів.

3. Підвищена здатність до регенерації недостиглих зародків фуркатної лінії сорту Одеський 100 пов’язана з мутацією в гомеобокс-гені ячменю, що впливає на проліферацію меристем. Плейотропний ефект даної мутації проявляється в підвищенні здатності до кущіння, а також у збільшенні довжини головного пагона, головного колоса та колосоносного міжвузля.

4. Ознака “регенерація рослин” в культурі нодостиглих зародків контролюється адитивно-домінантною генетичною системою з переважанням ефектів домінантних генів. Здатність до регенерації в культурі недостиглих зародків тісно пов’язана з низкою ознак вегетативної потужності рослин.

5. Оптимізовано умови одержання морфогенного калюсу та регенерації рослин при культивуванні ізольованої щиткової тканин (середовище Гамборга В5 з доданням 1 мг/л 2,4-Д та 30 г/л мальтози, освітлення 2 клк). Така методика може бути використана у випадку низької частоти індукції морфогенного калюсу в культурі інтактних зародків.

6. Встановлено оптимальні терміни холодової обробки пиляків (2 тижні при +4 С). Серед сортів, що вивчалися, Одеський 100 характеризується найвищою частотоюіндукції новоутворень та регенерації рослин у культурі пиляків.

7. Гібридні