ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ В.Н. КАРАЗІНА

ПИЛИПЕНКО ВІКТОРІЯ ВЯЧЕСЛАВІВНА

УДК 577.32

МАС-СПЕКТРОМЕТРИЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

СТЕРОЇДНИХ ГЛІКОЗИДІВ ТА ЇХ КОМПЛЕКСОУТВОРЕННЯ З КОМПОНЕНТАМИ БІОПОЛІМЕРІВ

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Харків – 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі мас-спектрометрії та біофізики в Інституті прикладної фізики Національної академії наук України, м. Суми.

Науковий керівник доктор фізико-математичних наук, професор

Суходуб Леонід Федорович

Інститут прикладної фізики НАН України, м. Суми

заступник директора інституту з наукової роботи.

Офіційні опоненти:_

доктор фізико-математичних наук, професор

Семенов Михайло Олексійович,

Інститут радіофізики і електроніки ім. О.Я. Усікова НАН України,

старший науковий співробітник відділу біофізики (м. Харків);_

доктор фізико-математичних наук, професор

Покровський Валерій Олександрович,

Інститут хімії поверхні НАН України,

заступник директора інституту з наукової роботи (м. Київ).

Провідна установа

Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна

НАН України, відділ молекулярної біофізики, м. Харків.

Захист відбудеться 24.10.2003 р. о 13 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 Харківського національного

університету ім. В.Н. Каразіна, 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці

Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна за адресою:

61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий 22.09.2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останніми роками значно активізувалися біофізичні дослідження біологічно активних речовин рослинного походження – стероїдних глікозидів (СГ) (Хостетманн (Hostetmann) 1995, Камерницкий та інші 1986, Кинтя та інші 1987, 1996, Ахов та інші 1998, Тенцова 1985). Зацікавленість молекулярних біофізиків у вивчення цієї групи сполук пов`язана, перш за все, з моделюванням фармакологічної активності СГ на молекулярному рівні. Сьогодні відомо понад 200 різноманітних препаратів на основі СГ (Хостетманн (Hostetmann) 1995). Очевидною є також тенденція до подальшого збільшення частки лікарських засобів, основою яких є натуральні речовини у порівнянні з синтетичними препаратами, оскільки фармацевтичні засоби рослинного чи тваринного походження мають більшу біологічну сумісність і менший побічний вплив на організм пацієнта. Велике значення має також використання біоактивних речовин рослинного походження у сільському господарстві при розробці гербіцидів та препаратів захисту рослин. Актуальними є розробки харчових та косметичних добавок на основі екстрактів та кріоподріблення рослинної сировини. У зв’язку з цим однією з основних задач сучасної молекулярної біофізики є поглиблене вивчення молекулярних механізмів активності сполук рослинного походження з високим рівнем фізіологічної активності щодо людини, тварин чи мікроорганізмів. При цьому найбільша увага приділяється саме виявленню сталих кореляцій між хімічною будовою вторинних метаболітів рослин та їхніми біологічними властивостями, що в свою чергу розширює можливості для їхнього практичного використання. Це обумовлює практичну необхідність створення цілого комплексу біофізичних засобів вивчення цих речовин. Це, перш за все, подальше удосконалення методів екстракції та очищення, отримання оперативної вичерпної інформації про структуру та склад рослинної сировини з задовільною чутливістю та якістю. Розробка і створення біофізичних модельних експериментів націлюваних на виявлення і дослідження шляхів впливу цих речовин на метаболізм клітини, визначення як позитивних, так і негативних наслідків їхньої присутності. Рентабельність такого типу широкомасштабних досліджень може бути забезпечена тільки у разі використання надійних, відносно дешевих та універсальних фізико-хімічних методів дослідження. Одним з таких методів, що відповідає вказаним вимогам є мас-спектрометрія. Мак-Лаферти (McLafferty, 1997), аналізуючи переваги мас-спектрометрії перед традиційними аналітичними методами, акцентує на трьох “S”: “specificity, sensitivity and speed”, тобто специфічність, чутливість та швидкість. Дійсно, оскільки базовою характеристикою будь-якої природної сполуки є молекулярна маса мас-спектрометрію вочевидь вважають одним з універсальних методів ідентифікації природних сполук (Лу (Loo) 1997, Хостетманн (Hostetmann) 1997, Каі (Саі) 2002, Суходуб 1991, Фаул (Faul) 1970). Сучасна мас-спектрометрія поряд з молекулярною масою надає також інформацію про хімічну структуру досліджуваної молекули при мінімальних затратах речовини і часу. Умови вільного середовища високого вакууму забезпечують ідеальну методологічну базу для досліджень модельних систем комплексоутворення різноманітних біомолекул (Лу (Loo) 1997, Фаул (Faul) 1970, Шалей (Shaley) 2001, Суходуб 1991, 1987, 1994, 1995, Веркин 1985, Вінсенті (Vincenti) 1995, 1998, Андрієвський 1991, Міхауд (Michaud) 1990).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. З моменту утворення відділу мас-спектрометрії та біофізики в Інституті прикладної фізики НАН України ведуться роботи з дослідження фізико-хімічних властивостей біомолекул та бімолекулярних комплексів з використанням м`якоіонізаційних методів мас-спектрометрії, які були започатковані у Фізико-технічному інституті низьких температур НАН України І.К. Янсоном та Л.Ф. Суходубом. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт Інституту прикладної фізики НАН України в рамках держбюджетних наукових тем: “Дослідження структури та фізико-хімічних властивостей біополімерів та їх компонентів з біологічно активними речовиними” (№ держ. реєстр. 0193U032627, 1995-1999), “Вивчення термодинамічної стабільності і мікроелементного складу біооб`єктів за допомогою розробок м`якоіонізаційної мас-спектрометрії та ядерного мікрозонду ” (№ держ. реєстр. 0100U000068, 2000-2002).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягає у біофізичному вивченні молекулярних основ біоактивності СГ методом плазмово-десорбційної мас-спектрометрії з іонізацією уламками поділу 252Cf (ПДМС) шляхом дослідження їхнього комплексоутворення з компонентами протеїнів та нуклеїнових кислот та виявленні впливу будови вуглеводної та стероїдної частинки молекули СГ та складу біомолекули на процес комплексоутворення. Для досягнення поставленої мети розв’язувалися такі задачі:

1. Створити методику ПДМС - експрес аналізу СГ та генінів. Виявити шляхи фрагментації та закономірності іоноформування СГ та генінів за умов ПДМС експерименту.

2. Провести ПДМС дослідження низки препаратів СГ і генінів та створити каталог мас-спектрів СГ та генінів.

3. Обґрунтувати та реалізувати модельний експеримент для вивчення молекулярних шляхів біологічної активності СГ через їхнього комплексоутворення з біомолекулами-мономерами протеїнів та нуклеїнових кислот. Провести ПДМС дослідження модельних систем за типом СГ + біомолекули.

4. На основі ПДМС даних визначити відносну інтенсивність комплексів СГ та біомолекул. Виявити залежність між структурою стероїдної та вуглеводневої частки молекули СГ та хімічною структурою біомолекули і відносною інтенсивністю комплексів.

Об`єкт дослідження: процеси утворення міжмолекулярних комплексів СГ та їхніх генінів з компонентами протеїнів та нуклеїнових кислот.

Предмет дослідження: механізми формування іонів і фрагментації СГ та генінів, а також механізми формування гетерокластерних сполук між СГ та біомолекулами-мономерами РНК та білків в умовах ПДМС.

Методи дослідження: ПДМС для вивчення складу та структури стероїдних глікозидів та генінів і дослідження утворення комплексів між стероїдними глікозидами та компонентами протеїнів та РНК.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в:

- вперше розроблено методику експресного мас-спектрометричного вивчення методом ПДМС препаратів рослинного походження - СГ і генінів;

- визначено молекулярну масу, структуру стероїдної та вуглеводної складових серії препаратів СГ і генінів методом ПДМС;

- вперше створено базовий каталог мас-спектрів СГ і генінів;

- обґрунтовано і реалізовано біофізичну модель мас-спектрометричного вивчення молекулярних шляхів активності СГ та генінів через їхнє нековалентне комплексоутворення з біомолекулами- мономерами біополімерів;

-вперше проведено модельні дослідження взаємодії СГ чи генінів з біомолекулами-мономерами протеїнів та нуклеїнових кислот: амінокислотами, рібонуклеозидами, нуклеозидмонофосфатом;

- вперше визначено відносну інтенсивність комплексів СГ з біомолекулами за даними ПДМС та показано її залежність від хімічного складу та структури стероїдної і вуглеводної частини молекули СГ а також складу та структури відповідної біомолекули;

Практичне значення одержаних результатів. Методика ПДМС вивчення СГ і генінів передбачає подальше її застосування для проведення експрес-скринінгу рослинного матеріалу на предмет наявності та складу СГ для з`ясування перспективності рослинної сировини, що може бути використана у промислових масштабах. Методика також має значення для виявлення новітніх структур СГ. Передбачається також подальше застосування методики при вивчені інших сполук рослинного походження. Каталог мас-спектрів СГ і генінів дозволяє проводити швидкий порівняльний аналіз нових препаратів СГ і генінів та їхню ідентифікацію. Це значно полегшує задачу щодо виявлення і дослідження складу і структури нових СГ. Інформація про реакційну здатність СГ і генінів стосовно біологічно важливих молекул має суттєве значення при виборі та розробці нових фармакологічних препаратів з заданими медико-біологічними властивостями. Комплексоутворення СГ і біомолекул проливає світло на механізми біоактивності цих сполук на молекулярному рівні, що має неабияке значення для виявлення та інтерпретації їхнього фармакологічного впливу та пояснення і запобігання можливих небажаних ефектів.

Особистий внесок здобувача. В наукових роботах опублікованих у співавторстві зі здубовачем [1-15] особистий внесок полягає у пошуку і аналізі літературних даних, участі у формуванні мети задач вивчення [1-15], проведені експериментальних досліджень СГ і створені каталогу мас-спектрів [4, 6, 12-15], участь в розробці моделі дослідження взаємодії СГ з компонентами біополімерів, аналізі та інтерпретації даних мас-спектрів модельних систем СГ з біомолекулами, виявлені комплексоутворення та участі у формуванні висновків досліджень [1-3, 5-15].

Апробація результатів дисертації. Основні положення і результати дисертації представлені та обговорені на ІІ з’їзді українського біофізичного товариства (Харків, Україна, 1998), Міжнародній конференції “Saponins in food feedstuffs, and medicinal plants” (Пулави, Польща, 1999); Міжнародній конференції ARGUS-99 (Одеса, Україна, 1999); XIV міжнародній школі-семінарі “Spectroscopy of molecules and crystals” (Одеса, Україна, 1999); ІІІ з’їзді українського біофізичного товариства (Львів, Україна, 2002), Міжнародному симпозіумі “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources” (Никитський ботанічний сад, Ялта, Україна, 2002); Міжнародній конференції для молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології і генетики, присвяченій відкриттю українського молекулярно-біологічного товариства (Київ, Україна, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 друкованих робіт, в тому числі 6 статей в провідних фахових наукових журналах і 9 тез доповідей на міжнародних і національних наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, чотирьох розділів, висновків, списку використаних джерел та додатків. Повний обсяг дисертації складає 191 с., список використаних джерел - 22 с., (195 посилань), додатки займають 36 с. Дисертація містить 91 рисунків, з них 4 на окремих сторінках та 50 подані у додатках, 16 таблиць, з них 8 на окремих сторінках та 6 у додатках, 2 схеми.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність теми, сформульовано мету і задачі дослідження, вказано новизну отриманих результатів, наведено основні положення роботи.

В розділі 1 представлено літературний огляд щодо розповсюдження СГ серед рослин та інших організмів, структуру та номенклатуру сполук класу СГ, а також методи екстракції, очищення та дослідження складу, структури і фізико-хімічних властивостей СГ. Проаналізовано також застосування фізичних аналітичних методів, зокрема мас-спектрометрії, у виченні СГ та молекулярні механізми біоактивності СГ. У цьому розділі сформульовано мету і задачі дослідження.

В розділі 2 Проаналізовано фізичні основи ПДМС. Приведено принципову схему біохімічного мас-спектрометру МСБХ-1 на основі ПДМС виробництва (SELMI, Суми, Україна), режими запису мас-спектрів, дані про склад, молекулярну масу та сруктуру досліджуваних речовин. Описано способи приготування зразків та модельних сумішей для ПДМС і умови експериментів. Усі ПДМС експерименти проводилися з препаратами СГ, їхніми прогенінами та агліконами, які були отримані з лабораторії проф. П.К. Кінті, Інститут генетики НАН Молдови. СГ, прогеніни та аглікони екстраговані з стебел, коріння та насіння рослин: Nicotiana rustica L., Nicotiana tabacum L., Datura stramonium L., Petunia hybrida Hort., Atropa belladonna L., Lilium regale Wills, Lycopersicon esculentum Mill., Solanum melongena L., Agave sisalana L.

В розділі 3 Описано розроблену методику ПДМС дослідження СГ та їхніх генінів, представлено результати її застосування щодо вивчення 40 різноманітних зразків СГ та генінів. Викладено результати досліджень та виявлені на їхній основі особливості процесів іоноформування та фрагментації СГ в ПДМС. На основі аналізу мас-спектрів СГ та генінів створено первинний базовий каталог мас-спектрів, який представлений у додатках В, Д, Е, і Ж дисертаційної роботи – він складається з 40 спектрів. Результати ПДМС аналізу СГ та генінів зібрані у 4 таблицях.

Молекула СГ складається з стероїдної частки аглікону похідного спіростану чи фуростану та приєднаного до нього вуглеводного ланцюгу (рис.1). Моносахари з’єднуються складноефірним, ефірним та глікозидним зв’язком через один чи два ланцюги, утворюючи відповідно монодесмозидні чи бідесмозидні СГ. Кількість моносахаридних залишків у ланцюгу може бути від 1 до 7, але інколи їх буває до 11. Місцем приєднання вуглеводного компоненту до аглікону, як правило, є оксигрупа при С3, але зустрічаються СГ в яких вуглеводні ланцюги зв’язуються при С1, С2, С5, С6 і С11.

Рис. 1. Загальна хімічна структура генінів: а - спіростанів; б - фуростанів; R - цикли А, В, С, D і Е, що є однакові за складом для генінів похідних спіростану і фуростану.

В мас-спектрах генінів спостерігалися інтенсивні піки, що відповідають молекулярній масі геніну. Для СГ було виявлено, що фрагментація вуглеводного ланцюгу в ПДМС спектрах СГ відповідає шляхам їхнього розщеплення при кислотному гідролізі. Це надало змогу шляхом розрахунків виявити склад і послідовність приєднання сахарів у ланцюзі. Наприклад, мас-спектр СГ петуніозидіу Д (ПД) (рис. 2) демонструє інтенсивні піки протонованого іону [M+Н]+ m/z 758 та [M+Na]+ m/z 780 і [M+K]+ m/z 780. Він також містить інтенсивні піки фрагментів аглікону – гітогеніну (Гіт): [аглікон+Н]+ m/z 433, [аглікон-Н2О]+ m/z 415, [аглікон-2Н2О]+ m/z 396 та пік монозиду гітогеніну з відщепленою гексозою [M-гексоза (162)]+ m/z = 596. Завдяки такій фрагментації вдалося встановити, що вуглеводний ланцюг ПД складається з двох гексоз, а стероїдний компонент за масою відповідає Гіт і має в своєму складі одну додаткову гідроксогрупу. Аналогічні розрахунки проведені для всіх мас-спектрів СГ і вони дозволили виявити і підтвердити склад їхнього вуглеводного компонента та ідентифікувати стероїдну частину СГ. Фрагментація у вуглеводному ланцюзі дозволила виявити також послідовність приєднання сахарів у вуглеводному ланцюгу. Була також виявлена фрагментація агліконів СГ з відщепленням гідроксогруп.

Рис. 2 Мас-спектр ПД - біозиду Гіт, записаний при позитивній напрузі. Інтенсивні піки відповідають таким іонам [аглікон-2Н2О]+, m/z = 396, [аглікон-Н2О]+, m/z = 415, [аглікон+Н]+, m/z = 433, [М-1гексоза]+, m/z = 596, [М+Н]+, m/z = 758, [М+Na]+, m/z = 780 та [М+К]+, m/z = 796.

В розділі 4 Обгрунтовано і реалізовано біофізичну модель ПДМС-вивчення утворення комплексів СГ з компонентами біополімерів – протеїнами та нуклеїновими кислотами. Представлено результати ПДМС вивчення модельних систем нековалентної взаємодії СГ та їхніх генінів (неотігогеніну (Нео), Гіт, монозиду неотігогеніну (Мнео), біозиду неотігогеніну (БНео), тріозиду неотігогеніну (ТНео) та ПД) з біомолекулами мономерами біополімерів клітини: 20 амінокислотами та СГ (БНео, ТНео та ПД); 5 рібонуклеозидами (Ado, Cyd, Guo, Thd, Urd) та СГ (Гіт, МНео, БНео, ТНео та ПД); аденозинмонофосфатом (АМФ) та СГ (Гіт, Нео, МНео, БНео та ПД). Виявлено вплив складу вуглеводного ланцюгу та складу аглікону СГ на взаємодію з зазначеними біомолекулами. Зафіксовані комплекси охарактеризовані їхніми відносними інтенсивностями.

Як референтну речовину у дослідженнях використано БНео. З метою виявлення впливу на комплексоутворення змін у хімічному складі вуглеводного ланцюгу були проведені модельні експерименти з МНео (М - Glc) та Тнео (М + GLc), а також з вільним агліконом – Нео. Вплив додаткових кисневих замісників у складі аглікону на комплексоуворення був виявлений у модельних системах ПД з біомолекулами, котрий має ідентичний с БНео вуглеводний ланцюг і відрізняється лише додатковою групою ОН у складі аглікону. Також були проведені дослідження взаємодії аглікону Гіт з біомолекулами.

Загальна кількість різноманітних модельних сумішей СГ чи їхніх агліконів з біомолекулами (амінокислоти, рібонуклеозиди, АМФ), що були досліджені у роботі, дорівнює 89 (60 – СГ+амінокислоти, 25 – СГ+рібонуклеозид та генін+рібонуклеозид, 4 – СГ+АМФ, генін+АМФ). Кожна модельна суміш готувалася окремо і досліджувалася п’ять разів для отримання статично достовірних результатів. Таким чином, було отримано 445 мас-спектрів модельних сумішей типу “СГ+біомолекула”. Результати аналізу мас-спектрів зібрані у трьох таблицях. Рис. 3 демонструє мас-спектр модельної суміші БНео+Urd, як типовий приклад.

Рис. 3 Мас-спектр суміші БНео з Urd (позитивна прискорююча напруга). Інтенсивні піки відповідають наступним іонам: [М+Н]+, m/z = 741, [М+Na]+, m/z = 762, [М+К]+, m/z = 779, [Urd+H]+, m/z = 245, [Urd+Na]+, m/z = 267, [Urd+K]+, m/z = 284, [2Urd+Na]+ m/z = 511, [2Urd+K]+ m/z 528, [аглікон+Н]+, m/z = 417, [аглікон-Н2О]+, m/z = 399 і [М+Urd+K]+,

m/z = 1023.

Для виявлення специфічності взаємодії СГ з біомолекулами на основі існуючих теоретичних положень про фізичні процеси в ПДМС розроблених Макфарлайном (Macfarlane 1978, 1994, 1999), Сундквістом (Sundqvist 1991), Бітенскі (Bitensky 1987), Хаканссоном (Hakansson 1982), Енсом (Enc 1989), Ліном (Lin 1983), Ерікссоном (Eriksson 1995), Дайа (Daya 1992) та іншими авторами та з використанням відомих математичних підходів проведено аналіз відносних інтенсивностей комплексів (Ycom) між СГ та дослідженими біомолекулами, виходячи з даних мас-спектрів за формулою:

де Іс - сума інтенсивностей піків комплексів [СГ+біомолекла+H]+, [СГ+біомолекула+Na]+ та [СГ+біомолекула+К]+; Іs - сума інтенсивностей піків СГ: [СГ+Н]+, [СГ+К]+, [СГ+Na]+.

Біофізичним моделюванням процесів комплексоутворенння в ПДМС встановлено, що Ycom можна також надати через сталі асоціацій комплексів у твердофазному зразку (К1) та газовій фазах (К2), з урахуванням вірогідності збереження цілостності комплексів (Wc) згідно відомого виразу:

Встановлено також, що вірогідність збереження цілосності комплексу Wc та сталих асоціацій К1 та К2 пропорційні та залежить від сили зв`язків утворених комплексів:

Звідси відносна інтенсивність комплексів Ycom модельних систем СГ+біомолекула, досліджених ПДМС в деякій мірі віддзеркалює спорідненість СГ до біомолекул. На рис. 4 представлено діаграми значеннь Ycom для комлексів СГ з амінокислотами. Послідовність розміщення амінокислот на осі абсцис відповідає поступовому збільшенню значення Ycom для комплексів “БНео + амінокислота”. Та ж послідовність розміщення амінокислот на осі абсцис для інших діаграм дозволяє провести порівняння значеннь Ycom для СГ. За значенням Ycom комплекси СГ з амінокислотами можна розбити на чотири групи: 1) Ycom 0,3 – дуже сильна взаємодія; 2) 0,3 Ycom 0,2 – сильна взаємодія; 3) 0,2 Ycom 0,1 – середня взаємодія; 4) 0,1 Ycom 0 – слабка взаємодія. Послідовність розміщення у групі – в бік поступового зменшення Ycom. Таким чином маємо для БНео: 1) Ser, Val, Ala, Gly; 2) Thr, Asp, Phe, Leu; 3) Cys, Asn, Hyp, Glu, Gln, Ile; 4) Tyr. Для ТНео відповідно 1) Ala; 2) Gly, Gln, Ser, Asp, Val; 3) Hyp, Asn, Thr, Glu, Phe, Cys, Ile; 4) Leu, Tyr. У разі ПД: 1) Ala, Gly, Asn, Thr; 2) Ser, Gln, Phe, Asp, Val, Hyp; 3) Ile, Leu, Glu, Trp, Tyr. Звідси видно, що найстійкіші комплекси для всіх СГ реалізовуються з Ala, близько до нього розміщуються Gly, Ser та Val. Найменшу спорідненість усі СГ виявили до Tyr. На відміну від БНео та ТНео, для петуніозиду Д були знайдені комплекси з Trp, в той же час взаємодія з Cys для нього не була зафіксована. Цікавою також виявилася особлива його спорідненість з Asn, котра відповідає третій групі для інших СГ. При порівнянні значень Ycom було виявлено, що у разі ПД відносна інтенсивність має менші коливання у значенні і знаходиться в більшості випадках від 0,2 до 0,3. Було також знайдено підвищення значення Ycom для комплексів ТНео з деякими амінокислотами.

Рис. 4. Діаграма значень Ycom комплексів БНео+амінокислота, ТНео+амінокислота та ПД+амінокислота.

На основі цих результатів було зроблено висновок, що збільшення вуглеводного ланцюгу та додаткові гідроксогрупи у агліконі СГ підвищують спорідненість СГ до деяких амінокислот ймовірно за рахунок утворення додаткових водневих та електростатичних зв’язків. Спостерігається також залежність взаємодії СГ з амінокислотами від заряду останньої. За ПДМС даними СГ проявляють бiльшу здатнiсть щодо взаємодiї з амiнокислотами, які при фiзiологiчному pH мають полярнi негативно зарядженi та полярнi незарядженi радикали, i демонструють нижчу здатнiсть щодо взаємодiї з неполярними амiнокислотами. У мас-спектрах СГ з полярними позитивно зарядженими амiнокислотами утворення гетерокластерних сполук взагалi не було зафiксовано.

Найбільша інтенсивність піків комплексів СГ з рібонуклеозидами спостерігалася у спектрах сумішей з Urd та з Cyd. Пік гетерокластерного комплексу у мас-спектрі ПД і Urd має більшу інтенсивність у порівнянні з таким же піком у спектрі БНео і Urd. Цікавим є, на відміну від БНео, відсутність явної взаємодії ПД з Cyd, але наявність піку, що відповідає комплексу, в мас-спектрі з Guo наступного складу: [М+Guo+K]+ m/z = 1079. МНео та вільні аглікони не проявляють здатності до комплексоутворення з рібонуклеозидами за умов ПДМС експерименту. Отриманий результат корелює з літературними даними про біологічну активність СГ та генінів: останні та монозиди, як правило, майже неактивні. Для мас-спектрів модельних сумішей ПД з Ado, Cyd та Thd та БНео з Guo або з Thd характерна дуже низька інтенсивність піків в області мас, що відповідають утворенню комплексів цих сполук, яка недостаня для чіткого визначення маси комплексу та відповідно Ycom. Цей результат свідчить, принаймні, про значно нижчу спорідненість та стійкість комплексів даних СГ з цими рібонуклеозидами. В таблиці 1 надані значення Ycom для комплексів “БНео + рібонуклеозид” та “ПД + рібонуклеозид”.

Нуклеозид

(М) | Ycom

(Бнео+М) | Ycom

(ПД+М)

Ado | 0,049 | -

Cyd | 0,226 | -

Guo | - | 0,062

Thd | - | -

Urd | 0,073 | 0,089

Таблиця 1.

Значення відносної інтенсивності комплексів Ycom модельних систем (СГ + рібонуклеозид) розраховані згідно експериментально отриманих даних мас-спектрів. Помилка Ycom 10 %.

Дослідження модельних сумішей СГ + АМФ та генін +АМФ показали, що, як і у випадку з рібонуклеозидами, вільні геніни не проявляють здатності до комплексоутворення з АМФ. Натомість СГ утворюють гетерокластерні сполуки з АМФ. Ycom для системи БНео+АМФ дорівнює 0,092, а для системи ПД+АМФ – 0,125. Значення Ycom для БНео та АМФ майже вдвічі більші ніж для БНео і Ado (0,049). ПД взагалі мав дуже низьку здатність до взаємодії з Ado. Таким чином, збільшення значень Ycom комплексів нуклеотидмонофосфату з СГ у порівняні з комплексами його нуклеозиду з цими ж СГ цілком можна пояснити за рахунок впливу фосфатної групи АМФ, яка очевидно стабілізує комплекси внаслідок утворення додаткової електростатичної взаємодії та водневих зв’язків. Те ж саме стосується і вищої стабільності комплексів ПД і АМФ, оскільки аглікон ПД має додаткову гідроксигрупу у своєму складі у порівнянні з агліконом БНео. Таким чином, встановлено, що СГ проявляють більшу здатність до не ковалентної взаємодії з нуклеозидамимонофосфатами, аніж з вільними рібонуклеозидами. Отриманий результат свідчить про здатність СГ до комплексоутворення з вільними нуклеотидмонофосфатами у клітині або ж навіть з нуклеїновими кислотами, що може викликати відповідні зміни у метаболізмі клітини.

ВИСНОВКИ

В даній роботі методом ПДМС проведено експериментальне дослідження складу, частково структури та комплексоутворення з мономерами РНК та білків біологічноактивних препаратів рослинного походження - СГ та їхніх генінів. Отримані результати розширюють діапазон аналітичних можливостей ПДМС і дають поштовх для подальшого розвитку мас-спектрометричного вивчення рослинних екстрактів. Результати модельних експериментів з вивчення комплексів СГ та біомолекул розкривають аспекти молекулярних основ біоактивності СГ та генінів, що є актуальним питанням для біофізики стероїдів. Виявлені залежності утворення комплексів від хімічної структури СГ та біомолекули мають значення для окреслення груп фармакологічноактивних СГ та для розвитку уявлень про вплив СГ на функціонування клітин і організмів. Ці результати важливі для біофізики клітини, а також для пошуку і розробки нових лікарських засобів на основі природних рослинних екстрактів.

Таким чином у роботі:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ НАУКОВИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

АНОТАЦІЯ

Пилипенко В.В. Мас-спектрометричні дослідження стероїдних глікозидів та їх комплексоутворення з компонентами біополімерів.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2003.

Розроблено методику дослідження молекулярної маси та структури речовин рослинного походження стероїдних глікозидів (СГ) та їхніх генінів методом плазмово-десорбційної часопролітної мас-спектрометрії з іонізацією уламками поділу 252Cf (ПДМС). Створено каталог мас-спектрів 40 досліджених зразків СГ та генінів. Методом ПДМС досліджено модельні системи СГ та їхніх генінів з біомолекулами. Виявлено формування не ковалентнозв`язаних комплексів СГ з відповідними біомолекулами такого складу [СГ+біомолекула+Н], [СГ+біомолекула+К], [СГ+біомолекула+Na] у співвідношені 1:1:1. Визначені відносні інтенсивності комплексів СГ та біомолекул. Знайдено, що збільшення вуглеводного ланцюгу СГ та додаткові кисневмісні замісники в агліконі впливають на специфічність взаємодії з біомолекулами та для низки комплексів збільшують їхню стабільність, вільні аглікони та монозиди не утворюють комплексів.

Ключові слова: мас-спектрометрія стероїдні глікозиди, комплекси, компоненти біополімерів.

АННОТАЦИЯ

Пилипенко В.В. Масс-спектрометрические исследования стероидных гликозидов и их комплексообразования с компонентами биополимеров. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2003.

Разработана методика изучения молекулярной масы и структуры веществ растительного происхождения стероидных гликозидов (СГ) и их генинов методом плазменно-десорбционной масс-спектрометрии с ионизацией осколками деления 252Cf (ПДМС). Создан каталог масс-спектров 40 исследованых образцов СГ и генинов. Методом ПДМС исследованы модельные системы СГ и их генинов с биомолекулами. Выявлено формирование комплексов между СГ и соответствующими биомолекулами следующего состава [СГ+биомолекула+Н], [СГ+биомолекула+К], [СГ+биомолекула+Na] в соотношении 1:1:1. Получены относительные интенсивности комплексов СГ и биомолекул. Найдено, что увеличение углеводной цепи СГ и дополнительные кислородсодержащие заместители в составе агликона влияют на специфичность взаемодействия с биомолекулами и для ряда комплексов увеличивают стабильность, свободные агликоны и монозиды не образовывали комплексов.

Ключевые слова: масс-спектрометрия, стероидные гликозиды, комплексы, компоненты биполимеров.

SUMMARY

Pylypenko V.V. Mass spectrometric investigations of steroid glycosides and their complexation with biopolymers components. – Manuscript.

Thesis for a Candidate`s degree of Physical and Methematical Sciences in Biophysics - Speciality 03.00.02 - V.N. Karazin Kharkіv National University, Kharkiv, 2003.

Steroid glycosides (SGs) are glycosylated secondary metabolites that commonly occur in higher plants. They are essential for the manufacturing of steroid hormone. SGs attained considerable biological and pharmacological interest in the last decade as shown by the results of many in vitro and in vivo tests systems. A number of studies suggest that SGs have wide biological activities, such as antitumor, antioxidant, antimicrobil, fungicidal, and virucidal effects, and the ability to reduce the cholesterol level in blood. So, they represent one of most promising classes of pharmacological substances. In the same time it must be stressed that most of SGs preparations used in phytotherapy are either extracts or mixtures. In many of these preparations, the exact SGs composition is not known and extrapolation of the activity of monosubstances to the SGs-containing product may be risky. In view of this problem, there is a tendency to move towards the use of pure substances because they can be directly analyzed and standardized. Rapid and unambiguous identification of SGs and sapogenins in plant extracts has always presented a challenge, because most of them are thermally labile, polar and nonvolatile compounds and are present in a plant in only trace amounts. At present mass spectrometry especially when using soft ionisation methods, is one of the most sensitive methods of molecular analysis, and has the potential to yield information on molecular weight as well as on structure of the variety of molecules and even their aggregates. In this work the methodic of molecular mass and structure elucidation of SG and their genins by time-of-flight plasma desorption mass spectrometry with ionization by 252Cf fission fragments (TOF-PDMS) was discovered. TOF-PDMS was applied to characterization of pure and standard samples of SGs and their genins as well as for analysis of native plant extracts. These investigations and detailed analysis of mass spectra permitted to make conclusions about the main features of TOF-PDMS spectra of SGs measured. The mass spectral database of 40 investigated samples of SGs and genins was created. The database allows i) distinguishing between SGs in the crued plant extracts ii) as well as determination of aglycone (genin) and carbohydrate chain constitution of SGs molecule. In order to study mechanisms of biological activity of SG at molecular level biophysical model experiment was created, which permitted to investigate complexation of SG and their genins with biomolecules: 20 amino acids, 5 nucleosides, 1 nucleotide monophosphate. According to TOF-PDMS mass spectra data, SGs can interact with biomolecules to form complexes of the type [SG + biomolecule+ H]+, [SG + biomolecule + Na]+, [SG + biomolecule + K]+ with relation 1:1:1. From TOF-PDMS data relative intensities of complexes of SG with biomolecules were determined, which reflected specificity of SGs interaction with biomolecules, degree of affinity and stability of complexes. It was shown that the affinity of SGs for biomolecules depends on the structures of both the SG carbohydrate chain and the SG aglycone, and on the chemical structure of biomolecule. SGs with a larger carbohydrate component and extra oxygen containing substitution in the steroid part of molecule (aglycone) have some specific in interaction with biomolecules also in many cases for such SGs a greater stability of complexes was observed. It was found that structure of aglycone play more critical role for complexation in comporison with carbohydrate component. Aglycones and monosides have no ability to form complexes with the studied biomolecules. This result may be useful for the explanation of SG ability to interact with native biopolymers (RNA or protein) or with their single components (nucleosides, nucleotides or amino acids). If SG can participate in the transmembrane transport of amino acids, the cell pool of amino acids can be altered due to this interaction, stimulating synthesis of certain cell structures, thereby influencing the functions of the cell. For example, complexes formed by SGs with glycoplastic (Ala, Gly, Glu, His, Pro, Ser, Thr) and ketoplastic (Leu, Phe, Tyr) amino acids may be the cause of the SG effect on gluconeogenesis and KoA synthesis in a cell, respectively. Also this work could help understanding of the mechanisms and the sites underlying SG binding with membrane and blood proteins.

Key words: mass spectrometry, steroid glycosides, complexes, components of biopolymers.