КИЇВСЬКИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

СЛИНЯВЧУК ГАЛИНА ДМИТРІВНА

УДК 632.581.143:76.355.4

КІНЕТИКА РИТМІЧНИХ ЯВИЩ У РОСЛИН ПРИ ДІЇ ІОНІЗУЮЧОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ

НА ПРИКЛАДІ КОЛЕОПТИЛІВ ВІВСА (Avena sativa L.)

03.00.01 – радіобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії

НАН України.

Науковий керівник:

доктор біологічних наук,

професор, академік НАН України

ГРОДЗІНСЬКИЙ Дмитро Михайлович,

Інститут клітинної біології та генетичної

інженерії НАН України

завідувач відділу біофізики та радіобіології, м. Київ

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Булах Анатолій Андрійович,

Міжнародний Соломонів університет,

завідувач кафедри біології, м. Київ

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Орлов Олександр Олександрович

Поліський філіал Українського науково-дослідного

інституту лісового господарства та

агролісомеліорації ім. Г. М. Висоцького ДКЛГ України,

заступник директора з наукової роботи,

завідувач лабораторії радіоекології лісу, м. Житомир

Провідна установа:

Національний аграрний університет Кабінету Міністрів України, м. Київ

Захист відбудеться “26“ червня 2003 року 0 1400 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 у

Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

за адресою: Київ, вул. акад. Глушкова 2, біологічний факультет, ауд 215.

Поштова адреса: 01033, Київ – 33, вул. Володимирська, 64,

наукова частина.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці

Київського національного університету імені Тараса Шевченка

за адресою: Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “26” травня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук, Матишевська О. П.

професор

Актуальність теми. Ритмічність функціонування біологічних систем на різних рівнях організації є невід’ємною характеристикою, яка відбиває їх взаємодію з ритмікою чинників довкілля. Періодичні зміни біохімічних та фізико-хімічних процесів, які відбуваються в живих організмах протягом життя, називають “біологічним годинником”. Систематизуються біоритми перш за все за їх тривалістю і за ступенем залежності від чинників довкілля. Одні з біоритмів (наприклад, серцебиття, дихальні рухи грудної клітини у тварин, тощо) відносно самостійні, інші відповідають циклічним змінам інтенсивності чинників довкілля. Період біоритмів коливається в широких межах – від декількох секунд (біохімічні реакції) до багатьох днів і навіть місяців. Серед ритмів окремо виділяють білядобові (циркадні), припливні, місячні тощо. Деякі біологічні ритми зберігаються і за умов штучної підтримки постійного освітлення, температури, вологості, атмосферного тиску тощо [Dunlap,1996, Elhai, 1990, Frank, 1992].

Найбільша кількість публікацій і досить багато досліджень в області біоритмології припадає на 60-ті роки минулого століття. Але починаючи з другої половини 70-х років інтерес до проблеми біологічних ритмів почав утрачатися, і тільки в останні роки почав знову підійматися з новим розмахом.

З літературних джерел відомо, що “біологічний годинник” є в кожній клітині, що в багатоклітинних організмах усі годинники всіх клітин повинні йти узгоджено, створюючи ієрархічну систему: годинник окремих клітин керується годинником органу, годинник всіх органів налаштовується за годинником центральної нервової системи (якщо вона є), а в ній - у мозку - є головний годинник організму. Також відомо, що “біологічні годинники” активні (на відміну від сонячного годинника) і ендогенні, тобто вони "йдуть" самі - усередині кожної клітини є свій "маятник", "коливальний контур", періодичний процес, що відмірює одиниці часу [Dunlap,1999, Golden, 2001, Elhai, Wolk, 1990; Devlin, 2002]. Проте досить мало відомо про дію випромінювань на біологічний годинник, а разом з тим відомо, що тривалість онтогенезу в живих системах істотно змінюється під впливом опромінення. Очевидно, що порушення біологічних ритмів під дією опромінення відбувається не безпосередньо, а внаслідок вторинних або третинних реакцій, які відбулися в організмі після етапу первинної взаємодії іонізуючого випромінювання з біологічним об’єктом, тобто порушення подібні тим порушенням, які відбуваються в онтогенезі при старінні.

При опроміненні у рослин може спостерігатися зміна довжини вегетаційного періоду, хоча, як відомо, регуляторні системи, які контролюють темпи проходження фаз розвитку, відрізняються великим консерватизмом і залежать переважно від чинників, сприйняття котрих відповідає за відлік “біологічно часу”. Однак, крім орієнтації на хід зовнішніх геофізичних чинників розвиток рослин підчиняється і ендогенному відліку часу. В результаті накладання сигналів, котрі поступають ззовні, і внутрішнього контролю темпів розвитку і відбувається чіткий перебіг процесів онтогенезу в часі. Визначивши механізми, які керують біологічними ритмами, можна отримати змогу змінювати ритмічні параметри відповідно до штучно створених умов. Це дасть нам можливість контролювати перебіг фізіологічних процесів в організмі. Одним із шляхів для досягнення цієї мети є вивчення впливу на біоритми іонізуючого випромінювання і екзогенного гетероауксину, який розповсюджується в колеоптилях ритмічно і відповідає за ростові процеси. Подальший аналіз дозових залежностей дозволить розрахувати параметри мішені, що можливо відповідає за ритмічні процеси.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі біофізики та радіобіології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України згідно з планом науково-дослідних робіт інституту за темою: “Хронічне опромінення рослин як фактор нестабільності геному та вивчення здатності рослин до радіоадаптації, індукованої хронічним опроміненням ” (№ Державної реєстрації 01U 02.12\5590).

Мета та задачі дослідження. Метою даної роботи було дослідити вплив іонізуючого випромінювання на ритміку ростових процесів колеоптилів вівса. Було поставлено такі задачі: з’ясувати закономірності впливу іонізуючого випромінювання на ритмічний приріст колеоптилів вівса; дослідити вплив іонізуючого випромінювання на ритміку мітотичних поділів клітин у твірних тканинах колеоптилів вівса; дослідити вплив іонізуючого випромінювання на ритміку ростових процесів колеоптилів вівса за умов дії екзогенного гетероауксину і сприйняття індоліл-3-оцтової кислоти (ІОК) клітинами колеоптилів вівса після їх опромінення.

Об’єкт дослідження – ритмічні механізми, що визначають коливальні процеси біологічних систем.

Предмет дослідження – фактори модифікації кінетики ритмічних процесів іонізуючим випромінюванням

Методи дослідження: біометричні дослідження ритмічних процесів приростів у колеоптилів вівса; цитологічний аналіз ритмічних процесів колеоптилів вівса; статистичний аналіз отриманих результатів; математичний аналіз дозових залежностей з використанням теорії мішені.

Наукова новизна одержаних результатів. Дана робота є однією з перших, в якій було використано дію іонізуючого випромінювання для дослідження механізмів ритмічних процесів у рослин. Вперше показано, що вплив іонізуючого випромінювання на насіння вівса приводить до зміни ритмічних процесів в колеоптилях. Встановлено характер дозових залежностей цих процесів. Показано, що при дозі опромінення в 40 Гр спостерігається тимчасова зупинка ритмічного приросту колеоптилів вівса, тривалість якої залежить від дози. Аналіз отриманих результатів показав, що зміна ритміки ростових процесів колеоптилів вівса в першу чергу залежить від порушення процесу поділу клітин, і як наслідок цього - порушення розтягування і власне нормального ритму приросту. Було також встановлено, що дія іонізуючого випромінювання за умов впливу екзогенного гетероауксину не викликає зупинки ритмічних процесів приросту у колеоптилів вівса. За допомогою математичного аналізу теорії мішені було обчислено приблизний розмір структури, що може зумовлювати розлад ритмічних ростових процесів в колеоптилях вівса.

Практичне значення роботи. Результати даної роботи окреслюють характер клітинних механізмів біологічного годинника, зокрема, доводять провідну роль процесів поділу клітин колеоптилів вівса та здатності до сприйняття екзогенного гетероауксину у функціонуванні структур, які беруть участь у підтриманні ритмічних процесів в клітинах рослини.

Аналіз ритмічних процесів, який було проведено в роботі, був початковим етапом в дослідженні біологічного годинника. Щоб проводити дослідження на біохімічному або генетичному рівнях, потрібно визначити приблизно, що буде досліджуватись і яка ланка в складному механізмі клітинних процесів зазнала ушкодження. Експерименти з гамма-випромінюванням і використання дозових залежностей допомагають визначити розміри об’єкту для подальшого дослідження і скорочують обсяг зайвих пошуків. Використання дії іонізуючого випромінювання на роботу ритмозадавача вигідне тим, що ця дія неспецифічна і залежить від місця попадання кванту енергії випромінювання, що дає можливість застосувати теорію мішені. Це значно полегшить подальшу роботу по ідентифікації центрального “часозадавача”, тобто водія ритму. Отже, теорію мішені можна застосовувати не тільки для вивчення реакції клітин у формі їх інактивації, але й для окремих генів, зокрема, тих структур які причетні до ритмів.

Отримані дані можуть бути використані в дослідницьких роботах по визначенню регуляції ритмічних процесів у рослин при дії радіації та використані в навчальному процесі при викладені нормативного курсу “Радіобіологія” та спецкурсів, зокрема “Радіобіологія рослин” та “Сільськогосподарська радіобіологія”.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана під керівництвом доктора біологічних наук, академіка НАН України Д. М. Гродзінського і є самостійним дослідженням здобувача. Результати виконаних автором досліджень відображені у публікаціях в співавторстві з науковим керівником, студентами Куян І. О., Громак О. О. та самостійних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи відображені у матеріалах і доповідались: Науково-практична конференція молодих вчених: “Інтегративність функцій рослинного організму”, Київ, Україна, 5-7 серпня, 1998; I Всеукраїнська наукова конференція “Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах”, Тернопіль, Україна, 27-29 жовтня, 1998; II Всеукраїнська науково-практична конференція студентів, аспірантів та молодих вчених: “Екологія. Людина. Суспільство”, Київ, Україна, 13-14 травня 1999; IV Съезд общества физиологов растений России, Москва ИФР РАН, Россия, 4-9 октября, 1999; European Society for New Methods in Agricultural Research, London, 7-12 September, 1999; 12th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology, Hungarian (Budapest), 25-27 August 2000; Международная конференция “Биорад-2001”. Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды, Сыктывкар (Россия) – 20-24 марта, 2001.

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено у 5 статтях та 7 тезах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію побудовано за загальною структурою. Дисертація викладена на 140 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 36 рисунками та однією таблицею, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів, розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих даних, висновків та списку використаних джерел, який містить 204 літературних джерела.

Матеріали та методи дослідження

Об’єкт дослідження та характеристика умов опромінення. Об’єктом дослідження були колеоптилі вівса Avena sativa L (сорт Чернігівський). Об’єкт був підібраний, виходячи з наявності у нього ритмічних процесів росту і мітотичної активності [Мэзия, 1963, Ермакова, 1990, Avery, 1938, Ball, 1957]. Колеоптиль являє собою перший листок, модифікований як захисна структура, і відіграє важливу роль у початковому розвитку злаків. Колеоптилі дуже чутливі до зовнішнього подразнення і досить добре вивчені з точки зору біохімії, анатомії і фізіології. У колеоптилів вівса спостерігається чітка межа між процесами поділу і розтягування. На початку проростання колеоптилі ростуть в основному за рахунок процесів розтягування колеоризи і термінальних клітин і перші мітози спостерігаються в колеоптилі, який досягає 2 мм. Активність клітинних поділів колеоптилів вівса досить висока протягом 24-28 годин і процес є синхронним. Приблизно через 30 годин після проростання насіння мітотична активність в колеоптилях падає, і рослини починають рости за рахунок не тільки клітинних поділів, а й процесів розтягування. Через 120 годин у клітинах колеоптилів припиняється синтез ауксину та інших біологічно важливих речовин. В результаті цього колеоптиль стає нечутливим до зовнішніх чинників і його ріст припиняється [Кефели, 1981].

Враховуючи згадані дані, дослідження ритміки ростових процесів і процесів поділу клітин ми проводили протягом доби. Насіння пророщували на зволоженому фільтрувальному папері в повній темряві при 25° С. В дослідах використовували 4-и денні проростки з довжиною колеоптилів 2-3 мм.

Сухе насіння опромінювали на установці “Исследователь” гамма-променями 60Со в діапазоні доз від 10 до 200 Гр, при потужності дози 5,4 10-2 Гр/с. Діапазон доз був підібраний, виходячи з даних про значення напівлетальних доз гамма-опромінення для насіння вівса. Насіння контрольного варіанту пророщували при згаданих вище умовах і не опромінювали.

Методика дослідження динаміки приросту колеоптилів вівса. Колеоптилі, які досягли розміру 2 мм, щогодини вимірювали штангенциркулем протягом доби. В кожному досліді використовували по 3 повторності, кожна з яких складається з 30 проростків вівса, як для контролю, так і для варіанту з опроміненням. Приріст розраховували за формулою:

ДL=Li-Lі-1,

де ?L – загальний приріст колеоптилів за год, Lі i Lі-1 – довжина колеоптиля, а і – номер виміру.

Для кількісної оцінки впливу опромінення на приріст колеоптилів скористалися двома параметрами одержаних дозових кривих. По-перше, це максимальне значення приросту опромінених колеоптилів, виражене в процентах від максимального значення приросту у неопромінених колеоптилів. По-друге – відношення інтегралу (площі, обмеженої кривою і віссю абсцис) дозової кривої приросту опромінених колеоптилів до даного показника у неопроміненого контролю. Це можна представити у вигляді функції

Fi (D) = | (?Li /?ti)опр.D | ,

(?Li /?ti)к

де ?ti (і = 1, 2, 3…) – послідовні проміжки часу, протягом котрого визначають лінійний приріст колеоптиля (?L) в опроміненому і неопроміненому варіантах, відповідно (?Li /?ti)опр.D і (?Li /?ti)к.

Методика дослідження ритміки мітотичної активності колеоптилів вівса. Оскільки одним з базових процесів, що лежать в основі росту рослин, є поділ клітин їх меристем, було досліджено вплив гамма-випромінювання на ритмічність мітотичної активності апікальної меристеми колеоптилів вівса. Відбір проб починали о 8 00 ранку і закінчували через 2 доби в той самий час. Для досліду брали тільки верхню, апікальну частину колеоптилів, кожного разу у нової рослини. Колеоптилі зрізали і відразу ж фіксували, отже ефект “поранення” виключається. Фіксування відбувалось протягом години у розчині Карнуа (3 частини 96% етилового спирту і 1 частина льодяної оцтової кислоти). Зафіксований матеріал промивали 80% етиловим спиртом протягом 1 години, після чого заливали спиртом такої ж концентрації. З зафіксованих колеоптилів готували тимчасові давлені препарати за загально прийнятою методикою і обчислювали мітотичний індекс. Як в контрольному, так і в дослідному матеріалі брали по три повторності по 20 колеоптилів на кожну годину.

Методика аналізу ритмічного приросту колеоптилів вівса за умов дії екзогенної індоліл-3-оцтової кислоти (ІОК). У колеоптилів, розмір яких досягнув 2 мм, декапітували верхівку, тобто меристематичну частину. На місце верхівки поміщали 3% агар пластинки, який містив ІОК в концентрації 10-5 М/л. Через 1 годину після цього досліджували ростову реакцію у колеоптилів, які не зазнали декапітації (контрольні варіанти), і колеоптилів, котрі були декапітовані. Разом з цим вивчали вплив гамма-випромінювання на ростові процеси у колеоптилів зазначених варіантів. Дослідження проводили в трьох повторностях, в кожній з яких використовували по 20 проростків.

Методика розрахунку об’єму мішені, відповідальної за ритмічні процеси в колеоптилях вівса. Для того, щоб розрахувати розмір мішені, необхідно вибрати відповідну розмірність одиниці дози опромінення. Так, при дозі 1 Гр поглинена енергія складає 6,24 1015 еВ г-1 речовини. Якщо припустити, що середня енергія, яка витрачається на пошкодження мішені, складає 60 еВ [Гродзинський, 2000], то поглинена доза в числі попадань складає

1 Гр = | 6,241015 | = 1,04 1014 г-1.

60

Виходячи з параметрів для одноударних дозових залежностей, масу мішені (в г), можна розрахувати використовуючи співвідношення

m = | 0,96 10-14 | г.

D37(Гр)

Якщо число влучань, які інактивують клітину, більше одиниці, то криві, які відповідають рівню виживаності, мають сигмоїдний характер. У таких кривих в напівлогарифмічному масштабі спостерігається “плече”, розмір якого збільшується із зростанням числа влучень.

Визначимо значення дози, при якій виживаність зменшується в е раз. Числу е-1 (e – основа натурального логарифму, чисельно дорівнює 2, 706) відповідає виживаність 37% клітин від вихідного значення. Позначимо дозу, при котрій виживання складає 37%, D0. Тоді vD0 = 1, і об`єм мішені дорівнює величині, яка обернена дозі, тобто v = 1/D0. Якщо дозова залежність не має “плеча”, D0 рівна 37 - %-вій дозі - D37 . для дозових залежностей, які описуються кривими з “плечем”, D37 рівна D0 тільки в інтервалі доз, коли дозова залежність прямолінійна. Для області доз, котрі починаються з нуля, D37 більша ніж D0.

Криві, які мають плече, крім величини D37, яка визначає нахил їх лінійної частини, характеризуються ще так званим екстраполяційним числом n. Воно визначається в точці перетину ординати з екстрапольованою прямолінійною частиною дозової залежності. У випадку, коли дозова залежність не має “плеча”, число n=1, що свідчить про майже повну відсутність процесів відновлення. Отже, мірою здатності клітин у багатоклітинному організмі до репопуляційного відновлення є величина плеча, яка кількісно вимірюється квазіпороговою дозою Dq. Вона вимірюється значенням дози, котра відповідає відрізку прямої, паралельної осі абсцис, яка проведена на рівні 100%-вої виживаності від осі ординат до точки перетину з екстрапольованою ділянкою логарифмічної частини кривої виживаності [Ярмоненко, 1988].

Виходячи з вище вказаних розрахунків і параметрів дозової кривої (D37, Dq, n), було обчислено розміри мішені для досліджуваного об’єкту. Якщо мішень не одноударна, а екстраполяційне число кривої дозової залежності більше одиниці, то маса мішені по дозовій кривій, що має плече, розраховується за принципом Д. Лі [Ли, 1963]. Для дозової залежності, що має плече потрібно розрахувати величину LD37 (доза при котрій загибель клітин складає 37 %), яка дорівнює різниці D37 - Dq. Далі, на графіках, розроблених Д. Лі, знаходимо відповідну залежність між LD37 і діаметром мішені для гамма-променів. По одержаним результатам розраховуємо масу мішені: m = V с, ?е ? – середня щільність внутрішньоклітинного вмісту і дорівнює приблизно 1,2 г/см3.

На графіках нанесені величини довірчих інтервалів, які відповідають 95% - вому рівню достовірності з урахуванням критерію Стьюдента.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив іонізуючого випромінювання на кінетику росту колеоптилів вівса. В контрольних варіантах протягом 24 годин можна було спостерігати чітку двогодинну динаміку приросту колеоптилів вівса з трьома чіткими найбільш вираженими піками приросту (рис. 1А).

Опромінення насіння в діапазоні доз 10 - 200 Гр суттєво вплинуло на ритмічні процеси росту колеоптилів вівса. Вже в перші години після того, як опромінене насіння проросло і колеоптилі досягли 3-4 мм, спостерігалося порушення амплітуди росту і її фази (рис.1А-Г). Так, при опроміненні в дозі 10 Гр спостерігалось загальне збереження ритмічності приросту, проте середня тривалість періоду коливань становила не 2 год, як у контрольному варіанті, а приблизно дорівнювала 3 год (рис. 1). При дозах 20-30 Гр спостерігається значне зменшення амплітуди та порушення ритму коливань приросту колеоптилів у перші 9 годин після проростання опроміненого насіння, що відповідає 800 - 1700 годині експерименту. У проміжок часу з 1700 до 2300 год відбувається сплеск ростової

активності та відновлення ритміки приросту колеоптилів майже до контрольного рівня. Ймовірно, це пояснюється радіаційним пошкодженням не системи задавача ритму, а механізмів реалізації програми, яку задає водій ритму.

Встановлений ефект підтверджує літературні дані про те, що стресовий фактор в першу чергу в ритмічних процесах впливає на амплітуду і фазу ритмічного приросту колеоптилів вівса, але ритм може відновитись через певний проміжок часу.

В нашому випадку, процеси відновлення ритміки колеоптилів вівса до контрольного рівня ми спостерігали лише в діапазоні доз 10 – 30 Гр. З підвищенням дози ритміка приросту колеоптилів не досягала контрольного рівня, очевидно, іонізуюче опромінення, в порівнянні з іншими фізичними та хімічними стресовими факторами, нанесло ритмічним процесам незворотних пошкоджень.

.Суттєві відхилення амплітуди коливань ритмічного приросту колеоптилів вівса від контролю спостерігаються при дозах опромінення 40 Гр і більше (рис.1Б). В перші 9 годин після проростання опроміненого насіння спостерігаються порушення динаміки приросту колеоптилів вівса, аналогічні до тих, які спостерігалися при

опроміненні в дозах 20-30 Гр. Проте, починаючи з десятої год після проростання (1700 год) замість описаного вище сплеску ростових процесів швидкість приросту залишалась при дозі 40 Гр постійною та мінімальною протягом трьох год і зростала зі збільшенням дози (рис. 2). Після чого відбувалося відновлення спотвореного у порівнянні з контролем ритму.

Гальмування росту колеоптилів вівса, яке спостерігається, віддзеркалює ступінь пошкодження клітин їх меристеми. Тобто, починаючи з дози 40 Гр і більше, мова може йти про радіаційне пошкодження не тільки механізмів власне ростових процесів, що відбуваються в інтерфазі клітинного циклу, але й про

порушення нормальної мітотичної активності. Це є наслідком добре відомого та дослідженого ефекту радіаційної затримки мітозів [Гродзинський, 1989, Гудков, 1985] і, десинхронізації клітинних поділів у меристемі рослин. Якщо розвиток рослин як послідовний ряд морфологічних подій потребує утворення певного числа клітин, які генеруються апікальними меристемами, то, очевидно, гальмування клітинних поділів повинно супроводжуватись гальмуванням розвитку рослин. Якщо для контрольного варіанту ми спостерігали чіткі двогодинні коливання приросту колеоптилів вівса, тобто 12 повних коливань за 24 год, то після опромінення їх частота зменшується (рис. 3). Так, при дозі 20-150 Гр кількість коливань стає рівним 6 і дозова залежність в цьому діапазоні доз виходить на плато.

Дозова крива, побудована нами за параметром інтегральної величини приросту колеоптилів (рис. 4), містить плече, що свідчить про функціонування репаративної системи. Dq=60 Гр, а D37= 150 Гр, екстраполяційне число в даному випадку дорівнює 2. Виходячи з одержаних параметрів і знаючи, що середня маса ядра для колеоптилів вівса приблизно становить 882 ? 10-12 г, розрахували масу мішені. Діаметр мішені [Ли, 1963] складає 70 ммкм, радіус 35 ммкм або 35 ? 10-7 см. Отже об’єм мішені приблизно дорівнюватиме 0,18 ? 10-15 см3, а маса 0,21 ? 10-15 г.

Для того, щоб порівняти, які біологічні структури можуть бути відповідальними за дисбаланс в ритмічних процесах, розрахували, яку масу має ядро клітини в колеоптилях вівса, тобто ми виміряли параметри ядра колеоптилів, яке має форму кулі, за допомогою окуляр-мікрометра для того щоб порівняти з даними одержаними за дозовими залежностям.

Порівнювали з ядром орієнтуючись на літературні дані про те, що воно приблизно в три рази чутливіше за цитоплазми чи пластом [Гродзинський, 1989, Гродзинський, 2000].

Діаметр ядер в середньому дорівнює приблизно 11,2 0,5 мкм, тоді розрахуємо об’єм, який буде становити 735 10-12 см3, а маса ядра для колеоптилів вівса 882 10-12 г.

Розрахуємо масу мішені для колеоптилів вівса за системою Д. Лі [Ли, 1963]. Діаметр мішені для гамма-променів за дозовою залежністю дорівнюватиме 70 ммкм, а об’єм мішені 0,18 10-15 см3, маса відповідно 0,21 10-15 г.

З вище наведених розрахунків, ми можемо дійти висновку, що маса мішені менша за величину ядра але досить велика. Припустимо, якщо ядро має приблизно 105 генів [Сингер, 1998], то маса одного гену в середньому є 10-18 – 10-19 г. Приймаючи це до уваги, ми можемо припустити, що модифікувалося в середньому 103 - 104 генів. Виходячи з цих даних ми можемо приблизно розрахувати скільки пар нуклеотидів відповідає масі 10-15 г. Іншими словами, якщо ядро, як уже згадувалось вище містить приблизно 105 генів, то при середньому розмірі кодуючого гену 1200 пар нуклеотидів геном повинен містити всього лише приблизно 108 пар нуклеотидів [Сингер, 1998], іншими словами, якщо інактивувалося приблизно 103 – 104 генів – даній мішені відповідає приблизно 106 - 107 пар нуклеотидів. Отже, можливо, в даному випадку ми маємо справу з комплексом генів, які контролюють ритмічні процеси.

Величина максимального значення ритмічних приростів колеоптилів (рис. 5) із збільшенням дози падає. Такі порушення приросту колеоптилів, як буде показано далі, обумовлені порушенням поділу клітин їх меристеми.

Дозова залежність, одержана для максимального значення приростів колеоптилів є лінійною (рис. 5), що свідчить про її одноударність. Тому, для розрахунку розміру мішені ми скористалися формулою для одноударної мішені, тобто маса можливої мішені в даному випадку приблизно дорівнюватиме 0,05 10-15 г.

Використавши вище згадані розрахунки, можемо приблизно розрахувати, скільки пар нуклеотидів відповідає масі 10-15 г. Якщо інактивувалося приблизно 103 – 104 генів – даній мішені відповідає приблизно 106 - 10 7 пар нуклеотидів.

Очевидно, в обох розглянутих випадках відповідальним за ритмічність ростових процесів колеоптилів вівса є однакові молекулярні структури, які є досить великими, але меншими за масу ядра. Хоча, не виключено, що порушення ритмічних процесів викликається пошкодженням тільки однієї пари нуклеотидів одного з генів, які є первинним сигналом для створення ланцюга послідовних подій, що виражається в пошкодженні ритміки.

Вплив гамма-випромінювання на динаміку мітотичної активності колеоптилів вівса. В колеоптилях вівса спостерігаються ритмічні процеси не тільки ростової, а й мітотичної активності. В неопромінених колеоптилях процеси поділів більш менш синхронні і, як відзначалося раніше, тривають приблизно 24 год. Протягом цього часу в контрольному варіанті спостерігалися три чіткі піки мітозів через кожні 8 год (рис. 6).

Оскільки мітотичний цикл у клітин колеоптилів вівса триває більше ніж 24 години (час, протягом котрого спостерігаються ритмічні), то маємо справу з першим мітозом.

Перший пік мітозів в меристемах колеоптилів проростків, одержаних з опроміненого насіння, наступав на годину пізніше, ніж у контролі. Аналогічна картина спостерігалась і при опроміненні в діапазоні доз від 10 до 30 Гр (рис. 6А).

Починаючи з дози 40 Гр, протягом 24 годин спостерігаються лише 2 піки мітотичної активності, але в даному випадку перший пік мітозу наступив через 14 год на відміну від контролю, де він спостерігався приблизно через 8 годин після проростання насіння (рис. 6Б, рис.7). Слід відзначити, що чим вищою була доза тим пізніше спостерігався перший пік мітозу (рис. 6Г). З підвищенням дози до 70 Гр (рис. 6В, рис. 8), за 24 години фіксувався тільки один пік мітозу, другого і третього, які спостерігались в контрольному варіанті, не було виявлено. Зменшення частоти

коливань мітотичної активності колеоптилів вівса при зростанні дози так само як і зсув фази, які очевидно пов`язані між собою, можна пояснити змінами довжини G1- фази клітинного циклу. Це в свою чергу призводить до того, що вірогідність входження клітин до синтетичної (S) фази у першу добу дослідження падає, тобто вихід із G1 стадії клітинного циклу тимчасово блокується [Гудков, 1985, Ермаков, 1990] і G1-фаза подовжується. Інакше кажучи, десинхронізація клітинних поділів за умов дії іонізуючого випромінювання наступає швидше, ніж було запрограмовано природою.

Дозова залежність мітотичної активності в колеоптилях (рис. 9) вівса має сигмоїдний характер, екстраполяційне число якої трохи більше одиниці, D37 = 160 Гр, а Dq - величина плеча, що характеризує здатність меристеми колеоптилів вівса до репопуляції після опромінення, дорівнює 21 Гр. Отже, об’єм мішені приблизно дорівнює 0,3 ? 10-16 см3, а маса приблизно 0,36 ? 10-16 г. Маса мішені для мітотичних поділів колеоптилів вівса, в даному випадку менша за величину ядра. Кількість генів і пар нуклеотидів, які контролюють процеси мітотичного поділу, в даному випадку будуть приблизно такими ж як і для ростових процесів колеоптилів, тобто, кількість генів приблизно 102 – 103, а кількість пар нуклеотидів 105 – 106. Імовірно, ритміку як для поділу клітин так і для ростової динаміки колеоптилів контролює майже весь геном.

Оскільки процеси поділу є найбільш радіочутливою частиною ростових процесів, то величина, що характеризує репопуляційні властивості колеоптилів вівса, тобто Dq, для них менша ніж для процесів росту колеоптилів, які включають в себе поділ клітин і розтягування. В зв’язку з тим, що стадія розтягування клітин більш радіостійка, ніж стадія проліферації, загальна крива для ритміки ростових процесів колеоптилів вівса має Dq більшу, ніж для мітозів (рис. 4). Із співвідношення між величиною плеча дозових кривих для загального ростового процесу і для мітотичної активності, можна визначити внесок в цей процес стадії розтягування і оцінити, наскільки процес клітинного поділу більш чутливий по відношенню до дії гамма-випромінювання.

З простих міркувань, які враховують, якщо величину Dq інтегралу ритміки ростових процесів колеоптилів вівса поділити на Dq мітотичної активності, виходить, що процеси поділу приблизно в 2,8 рази є чутливішими за процес розтягування. Якщо звернути увагу на радіорезистентність, яка характеризується D37 (рис. 4 і рис. 9), то можемо припустити, що ростові процеси більш радіочутливі до дії іонізуючого випромінювання (D37 дорівнює 150 Гр), але здатні до відновлення процесів росту тоді, як меристематична тканина колеоптилів вівса має більшу радіорезистентність, відповідно D37 = 160 Гр, і менші можливості до відновлення. Але, враховуючи попередні математичні розрахунки, ми можемо припустити, що ритмічні процеси колеоптилів вівса контролює єдиний механізм, який складається із певних молекулярних структур, які схожі за розміром.

Вплив екзогенної ІОК на динаміку ростових процесів колеоптилів вівса за умов дії іонізуючого випромінювання. Порівняльний аналіз ростових процесів колеоптилів вівса, у яких апікальні меристеми були замінені агаровими пластинками з ауксином в концентрації 10-5 М/л, і проростків з інтактною меристемою показав, що в перші години вимірювання ритмічний приріст колеоптилів, у яких меристеми були

замінені на агарові пластинки з гетероауксином, пригнічувався (рис. 10), але до кінця доби вимірювання досягав рівня контрольного варіанту і навіть перевищував його.

Очевидно, пригнічення ритмічного приросту колеоптилів вівса було викликано ефектом поранення рослини, внаслідок видалення апікальної меристеми колеоптилю. Тому в перші години спостереження за процесом приросту колеоптилів після декапітації меристематичної частини спостерігалося пригнічення, а пізніше стимуляція росту колеоптилів, що пояснюється відновленням і посиленням синтезу РНК, білка і зміною інтенсивності новоутворень окремих білків, що є компенсаторною реакцією після механічного пошкодження [Жаботинский, 1974, Кулаева, 1982, Kacser, 1981]. Декапітація верхівки колеоптиля вівса ніяк не впливала на ритмічний приріст, якщо не брати до уваги впливу механічного поранення рослини, тобто в описаних умовах ритміка приросту колеоптилів вівса в присутності екзогенного гетероауксину зберігалася.

Опромінення насіння вівса, навіть в незначних дозах, а потім видалення меристеми і заміна її на агарову пластинку, яка містить ІОК, в згаданій вище концентрації, викликало порушення ритмічного процесу росту (рис.10). Це проявлялось в тому, що на відміну від варіантів, де опромінення не було застосовано, а лише використовувався екзогенний гетероауксин, ритмічний приріст колеоптилів вівса втрачав свій чіткий двогодинний характер, що було характерно для проростків вівса, як в присутності ІОК, так і без нього. При порівнянні приросту колеоптилів за умов дії іонізуючого опромінення (рис.1) з приростом колеоптилів вівса, де після опромінення було застосовано гетероауксин (рис.10), не спостерігається тимчасової зупинки ритміки приросту в залежності від дози опромінення (рис. 2), хоча чіткої ритмічності після дії радіації також не було.

Дозова крива для впливу іонізуючого випромінювання на процеси приросту колеоптилів у присутності ІОК має сигмоїдний характер (рис.11). В діапазоні доз від 10 до 40 Гр на кривій знаходиться плече, що, ймовірно, характеризує репопуляційні властивості тканини. Dq, і D37 складають, відповідно, 30 Гр і 108 Гр. Подальший вихід кривої на плато може свідчити про втрату клітинами колеоптилю здатності до сприйняття гетероауксину, внаслідок втрати відповідних рецепторів до ІОК [Жабтинский, 1974, Кулаева, 1982]. Об’єм мішені, розрахований за дозовою залежністю, буде дорівнювати 0,24 ? 10-15 см3, а молекулярна маса 0,29 ? 10-15 г. Отже, в даному випадку ушкодження зазнали структури менші за ядро, які за попередніми розрахунками співпадають з розміром мішені для мітотичного поділу і ростових процесів колеоптилів вівса без екзогенної дії гетероауксину.

ІОК активує два процеси: поділ клітин та їх розтягування [Полевой, 1991]. Будь-який з цих процесів може бути об’єктом для дії іонізуючого випромінювання. Проте виключення різних ділянок цього складного ланцюга, призводить до різних порушень. Слід також взяти до уваги, що гетероауксин використовувався нами через певний час після (на 4 добу після проростання насіння) опромінення, що дало змогу ділитися клітинам, які вижили. Це має велике значення, адже важлива не швидкість поділу, а здатність клітин ділитися після опромінення, що ми й спостерігали на відрізку кривої в діапазоні від 10 до 40 Гр. При опроміненні проростків в діапазоні доз від 40 до 70 Гр ІОК виступає в ролі радіосенсибілізатора, очевидно в даному випадку мішенню для дії гамма-випромінювання є ІОК-залежний білковий синтез, але не пошкоджується рецепторна ланка та механізм передачі сигналу, які запускають даний синтез. При збільшенні дози опромінення критичною стає система, що відповідає за зв’язування гетероауксину та передачу сигналу на відповідну систему-ефектор. Розмір мішені, відповідальної за ритміку, залишається незмінною і являє собою структури з великою молекулярною масою, але менші за клітинне ядро, що, імовірно може бути пов’язано і з мембранними елементами клітини. При цьому слід пам’ятати про присутність гетероауксину і його специфіку дії і рецепторні зв’язки. Тому можна припустити, що при дії іонізуючого випромінювання було вражено, все таки, ДНК-мембранний комплекс, який має досить велику за розмірами молекулярну структуру. Навіть, дуже імовірно, що пошкодження згаданого вище комплексу стимулює ініціацію генів, котрі можуть відповідати як за ростову активність так і за мітотичну [Эйдус, 2001].

З точки зору теорії мішені у всіх розглянутих вище випадках, як в присутності модифікатора (ауксину в даному випадку), так і при його відсутність, система керування ритмічними процесами у колеоптилів вівса протягом доби, являє собою складний, багатоланковий, проте єдиний механізм. Щодо ритмічних процесів з меншим (секунди, хвилини, години) або більшим (декілька діб, місяців тощо) періодом коливань, то дослідження таких процесів, ймовірніше за все, підтвердять дане твердження. У будь-якому разі, дані, отримані в ході виконання цієї роботи, можуть стати серйозною теоретичною базою для вирішення проблем, пов’язаних з порушенням біологічного ритму і є значним кроком вперед на шляху розкриття таємниці біологічного годинника

ВИСНОВКИ

Вперше встановлено, що іонізуюче випромінювання викликає порушення ритміки ростових процесів у рослин вівса. Порушення ритміки є дозозалежним процесом і знаходить свій прояв в тимчасовому припиненні росту і відновленні його ритміки зі зміненою амплітудою і частотою.

Зміна ритмічних параметрів віддзеркалює десинхронізацію клітинних поділів, яка гіпотетично обумовлена радіаційним ушкодженням “задавача” ритму.

Зміна амплітуди ритмічних змін мітотичної активності пояснюється тим, що частина пошкоджених клітин меристеми взагалі не вступає в наступний поділ, а частина клітин зазнає затримки мітозу. В результаті клітинний потік послаблюється і зменшується число клітин, які досягають зони розтягування.

Використанням гетероауксину доведено, що підтримка частоти коливань ростових процесів пов’язана з впливом апікальної меристеми і регуляція за допомогою ІОК відбувається на рівні організму.

На різних рівнях організації організму ритмічні процеси контролюються різними структурами. Ці структури функціонально підпорядковані одне одному, а їх впливи на ритмічні процеси всього організму в деяких випадках дублюють одне одного або діють за принципом синергізму.

Характер дозових залежностей дає підстави застосувати теорію мішені для оцінки розмірів “задавача” ритму. Виявилось, що розмір цієї структури характеризується значною молекулярною масою, яка перевищує середні молекулярні маси генів і є меншою за масу клітинного ядра. Не виключно, що критичною структурою може бути, як частина геному так і мембранні структури. Не виключено, що критичною структурою може бути, як частина геному так і мембранні структури.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Г. Д. Слинявчук, Д. М. Гродзінський, І. О. Куян. Ростові процеси за умов дії іонізуючого випромінювання на ритміку колеоптилів Avena sativa // Доповіді НАН України. - 1999 . - № 12. - С. 169-172.

Г. Д. Слинявчук, Д. М. Гродзінський. Динаміка ритмічних змін росту у колеоптилів вівса під впливом іонізуючого випромінювання // Вісник київського університету імені Тараса Шевченка. – 2000. - № 31. - С. 26-28.

Слинявчук Г. Д., Громак О. О. Механізми впливу іонізуючого випромінювання на молекулярно біологічні системи, пов’язані з біологічними ритмами. Фізіологія рослин в Україні на межі тисячоліття: В 2 т./ Під ред. В. В. Моргуна – 2001. – Т. 2. – С. 102 – 106.

Г. Д. Слинявчук, Д. М. Гродзінський. Кінетика ритмічних явищ в мітотичній активності колеоптилів вівса за умов дії іонізуючого випромінювання // Цитология и генетика. – 2001. - Т.35, № 4. - С. 12 –17.

Г. Д. Слинявчук. Вплив екзогенного гетероауксину (ІОК) на динаміку ростових процесів колеоптилів вівса (Avena sativa L.) за умов дії іонізуючого випромінювання // Збірник наукових праць інституту ядерних досліджень. – 2002. - № 1 (7). - С. 121-131.

Г. Д. Слинявчук, Д. М. Гродзінський. Особливості ростових процесів колеоптилів вівса за умов впливу іонізуючого випромінювання // Тези доповідей науково-практичної конференції молодих вчених “Інтегративність функцій рослинного організму”. - Київ (Україна). - 1998. С. 37-39 с.

Г. Д. Слинявчук, Д. М. Гродзінський. Вплив іонізуючого випромінювання на ритмічний ріст колеоптилів вівса