Київський науково-дослідний інститут гематології і трансфузіології
Академія медичних наук України
Інститут гематології та трансфузіології
СКРИПЕЦЬ Оксана Вячеславівна
УДК: 616.2.33/24-06:616.155.191/
191-021.3-06-079.4.08
ЦИТОХІМІЧНІ ТА ІМУНОЛОГІЧНІ ДИФЕРЕНЦІЙНО-ДІАГНОСТИЧНІ КРИТЕРІЇ СИМПТОМАТИЧНИХ ЕРИТРОЦИТОЗІВ ТА ЕРИТРОЦИТОЗІВ ПРИ ХРОНІЧНИХ МІЄЛОПРОЛІФЕРАТИВНИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ
14.01.31 — гематологія та трансфузіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ-2003
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Київській медичній академії післядипломної освіти ім. П. Л. Шупика МОЗ України
Науковий керівник — доктор медичних наук, професор
Гусєва Світлана Анатоліївна,
Київська медична академія післядипломної освіти ім. П. Л. Шупика,
професор кафедри гематології та трансфузіології
Офіційні опоненти: — доктор медичних наук, професор
Логінський Володимир Євстахович,
Інститут патології крові та трансфузійної медицини АМН України
м.Львів, завідувач лабораторії імунології
— доктор медичних наук, професор
Глузман Даниїл Фішелевич,
Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу
імуноцитохімії
Провідна установа — Науковий центр радіаційної медицини АМН України, м.Київ
Захист відбудеться 03.02. 2004 р. о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01 в Інституті гематології та трансфузіології АМН України (04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12)
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гематології та трансфузіології АМН України (04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12)
Автореферат розісланий 26.12.2003 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради КОМІССАРЕНКО В.Г.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Справжня поліцитемія (СП) відноситься до числа захворювань, діагностика яких все ще залишається скрутною (T.R.Lappin, I.N.Rih, 1996), бо у 20% хворих можуть бути відсутні такі важливі діагностичні ознаки, як спленомегалія, тромбоцитоз і лейкоцитоз (Демідова А.В., 2001; Martyre M.C.). У такій ситуації виникає необхідність диференціації СП та симптоматичних еритроцитозів (СЕ) (Pearson T.C., 1995; Besa E.C., Woermann, 2001).
Особливо великі труднощі при проведенні диференційної діагностики СП та СЕ виникають при наявності у хворих таких захворювань, як хронічні обструктивні захворювання легенів (ХОЗЛ), ішемічна хвороба серця, гіпертонічна хвороба, що самі по собі можуть бути причиною розвитку СЕ. Дуже часто ці ускладнення СП приймають за самостійні захворювання, а СП не діагностується протягом багатьох років. Діагностика СП утруднена за наявності одного з її ускладнень — позапечінкової портальної гіпертензії тромботичної природи (Flechtner L., 1994; Wasiluk K.R., 1991), при якій гіперспленізм, що розвивається, нівелює гематологічні прояви гіперпродукції клітин крові.
Результати трепанобіопсії клубової кістки при СЕ та у початковій стадії СП можуть істотно не відрізнятися внаслідок розвитку реактивної гіперплазії еритроїдного паростка кровотворення.
Діагностичні помилки можуть бути наслідком переоцінки гістоморфологічного дослідження кісткового мозку (Тіц Н., 1997; Bartl R., 1993; Bain B.J.,1996; Bauters F., 1998), зразки якого бувають невдалими за кількістю здобутого матеріалу та якістю його обробки. Стандартне фарбування препаратів не дозволяє диференціювати дрібні клітини і визначити тип проліферації (Blythe D., 1997).
Запропоновані для диференційної діагностики СП та СЕ вимір маси циркулюючих еритроцитів (Berlin N.I., Wasserman L.R., 1997), об’єму еритроцитів (Велік Л.В., 1992), вмісту в них мікроелементів (Видиборець С.В., 1990), рівня еритропоетину в сироватці крові (Beutler E., 2001) далеко не завжди дозволяють вирішити діагностичні сумніви внаслідок або недостатньо високої їхньої інформативності, або неможливості широкого застосування в клінічній практиці.
У хворих з еритроцитемічним варіантом ідіопатичного мієлофіброзу (ІМФ) та хворих на СП спостерігаються подібні морфологічні і клінічні ознаки, що утруднює проведення диференційної діагностики цих захворювань. В той же час необхідність точного розмежування цих захворювань обумовлена різною тактикою терапії.
Найбільш поширеним способом діагностики ІМФ та СП є вивчення кістковомозкового кровотворення за даними трепанатів клубової кістки (Ballas S.K., 1992). Однак у хворих на СП можливий розвиток вторинного мієлофіброзу, що значно знижує діагностичну цінність трепанобіопсії.
Загальновідомі особливості етіопатогенезу мієлопроліферативних захворювань (МПЗ) та СЕ, що розвиваються внаслідок реактивної гіперплазії кровотворення, дають підставу припускати, що функціональна активність клітин крові при МПЗ та СЕ може значно розрізнятися. Однак до цього часу практично не розроблені критерії диференційної діагностики еритроцитозів при МПЗ та СЕ, які засновані на функціональному зондуванні нейтрофілів периферичної крові (НПК), а також на даних імунологічного обстеження хворих.
Застосування для лікування СП та ІМФ цитостатичних препаратів, які мають мієлотоксичну дію і мутагенну активність, обумовлює початок терапії лише при точно встановленому діагнозі. Саме тому пошук інформативних цитохімічних та імунологічних критеріїв, які дозволяють проводити диференційну діагностику еритроцитозів при МПЗ та реактивних станів крові, є актуальним завданням.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Тема дисертації є фрагментом науково-дослідної роботи, яка виконувалась на кафедрі гематології та трансфузіології Київської медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика “Вивчення особливостей перебігу клініко-гематологічних рис та фенотипу субстратних клітин у пацієнтів з мієло- та лімфопроліферативними захворюваннями” (№ держ. реєстрації 0193U040741, ІПТ75.8).
Мета роботи. Метою роботи є обґрунтування цитохімічних та імунологічних найбільш інформативних методів диференційної діагностики симптоматичних еритроцитозів та еритроцитозів при хронічних мієлопроліферативних захворюваннях.
Для досягнення поставленої мети нами визначені наступні завдання.
1. Вивчити особливості імунологічної реактивності і функціональної активності нейтрофілів у хворих на справжню поліцитемію та еритроцитемічний варіант ідіопатичного мієлофіброзу.
2. Провести дослідження особливості імунного статусу і факторів неспецифічної резистентності організму у хворих на симптоматичні еритроцитози, які розвинулися на фоні хронічних обструктивних захворювань легень.
3. Провести порівняльний аналіз показників імунного статусу і функціональних характеристик нейтрофілів крові у хворих на симптоматичні еритроцитози та еритроцитози при справжній поліцитемії та ідіопатичному мієлофіброзі.
4. Обґрунтувати статистично найбільш інформативні імунологічні і цитохімічні критерії диференційної діагностики справжньої поліцитемії і симптоматичних еритро-цитозів, справжньої поліцитемії та еритроцитемічної стадії ідіопатичного мієлофіброзу.
Об’єкт дослідження: хворі на справжню поліцитемію IIA і IIБ стадій, на ідіопатичний мієлофіброз з еритроцитемічним варіантом, і пацієнти із симптоматичними еритро-цитозами, що розвинулися на фоні хронічних обструктивних захворювань легень.
Предмет дослідження: лімфоцити і нейтрофіли периферичної крові, сироватка крові хворих на СП, ІМФ і симтоматичні еритроцитози.
Наукова новизна. Вперше вивчені особливості імунологічної реактивності і функціональної активності нейтрофілів периферичної крові при симптоматичних еритроцитозах, які розвинулися на фоні хронічних обструктивних захворювань легень. Особливістю імунологічної реактивності при симптоматичних еритроцитозах є збільшення вмісту хелперної популяції Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів і підвищення концентрації IgА. Порушення неспецифічної резистентності виявляються посиленням літичної активності комплементу, опсонізації, киснезалежного метаболізму нейтрофілів на фоні збереженої фагоцитарної функції цих клітин. Уточнені особливості імунологічних порушень при еритроцитемічному варіанті ідіопатичного мієлофіброзу. Для еритроцитозів при МПЗ характерна перевага лімфоцитів із супресорною активністю, зменшення вмісту кілерних лімфоцитів та пригнічення гуморальної ланки імунітету. Порушення факторів неспецифічної резистентності організму при справжній поліцитемії і еритроцитемічному варіанті ідіопатичного мієлофіброзу виявляються посиленням спроможності клітин до хемокінезу, киснезалежного метаболізму нейтрофілів крові на фоні дефектності їхньої фагоцитарної функції.
Практичне значення отриманих результатів полягає в тому, що на основі аналізу проведених досліджень розроблені алгоритми диференційної діагностики симптоматичних еритроцитозів і справжньої поліцитемії IIA стадії, справжньої поліцитемії IIБ стадії та еритроцитемічного варіанта ідіопатичного мієлофіброзу. Встановлено, що в якості найбільш інформативних диференційно-діагностичних критеріїв, поряд із загальноприйнятими клінічними, доцільно застосовувати методи, які відображають функціональну активність нейтрофілів периферичної крові. Розроблені, захищені патентом і впроваджені в практику способи диференційної діагностики справжньої поліцитемії і симптоматичних еритроцитозів, справжньої поліцитемії та еритроцитемічної стадії ідіопатичного мієлофіброзу.
Результати досліджень впроваджені в клінічну практику гематологічного відділення Республіканського клінічного онкологічного диспансеру (м. Сімферополь), терапевтичного відділення першої міської лікарні імені М.І. Пирогова (м. Севастополь), а також у педагогічний процес кафедри гематології та трансфузіології Київської медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика.
Власний внесок здобувача. Автором самостійно визначена актуальність, наукова новизна теми дисертації. Проведено патентний пошук, обрані та освоєні методики досліджень, сформульовані мета і задачі досліджень, заплановані і виконані представлені в дисертації дослідження. Вивчення функціональних особливостей нейтрофілів крові, імунологічні дослідження проведені в клінічній лабораторії 1-ї міської лікарні імені М.І. Пирогова м. Севастополя.
Апробація роботи. Основні положення роботи представлені та обговорені: на науково-практичній конференції “Актуальні питання гематології та трансфузіології” (Санкт-Петербург, 2000); на науково-практичній конференції, присвяченій сучасним проблемам дитячої хірургії, урології, ортопедії, травматології, педіатрії, сімейної медицини, науково-дослідним і експериментальним роботам в галузі медицини (м. Київ, 2001); науково-практичній конференції радіологів та онкологів (м. Чернігів, 2002); ювілейній Російській науково-практичній конференції “Актуальні питання гематології та трансфузіології” (Санкт-Петербург, 2002), на V з’їзді гематологів та трансфузіологів Республіки Бєларусь „Актуальні питання гематології та трансфузіології” (м. Мінськ, 2003). Дисертаційна робота апробована на розширеному засіданні кафедри гематології та трансфузіології КМАПО імені П.Л.Шупика 26 березня 2003 року, протокол №6.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 друкованих праць, з них 5 статей у виданнях, рекомендованих ВАК України, у довіднику “Наследственные и приобретенные гематологические синдромы в клинической практике”. Отримано 2 патенти на спосіб диференційної діагностики.
Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 151 сторінці машинописного тексту, ілюстрована 20 таблицями і 10 рисунками. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису матеріала та методів, розділу власних досліджень, який включає два підрозділи, розділу аналізу та узагальнення результатів, висновків і практичних рекомендацій, списку літератури, що включає 251 джерело, з них 78 робіт вітчизняних і 173 закордонних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обґрунтована актуальність теми, визначені мета і задачі дослідження, його наукова новизна і практична значимість. Надана інформація щодо апробації роботи, впровадження її результатів, публікацій автора.
У першому розділі приведені дані літератури щодо етіології, патогенезу, клініки СЕ, які розвиваються при багатьох захворюваннях. Представлено класифікацію відносних та абсолютних еритроцитозів. Особлива увага приділена ролі еритропоетина у виникненні СЕ. Наведені різні точки зору щодо механізмів виникнення еритроцитозів при МПЗ: справжньої поліцитемії і хронічному ІМФ. Велика увага приділена методам диференціації СЕ та еритроцитозів при мієлопроліферативній патології.
Матеріал і методи дослідження. Матеріалом для дослідження слугувала периферична кров 60 хворих на СП, 36 хворих на ІМФ, 36 хворих СЕ, котрі знаходилися на лікуванні у терапевтичному відділенні 1-ї міської лікарні імені М.І. Пирогова (м. Севастополь) і гематологічному відділенні Кримського республіканського онкологічного диспансеру м. Сімферополя з 1999 по 2002 роки.
Діагноз СП базувався на виявленні еритроцитоза, гістологічного дослідження КМ, а також відповідно до критеріїв категорії А і В. Критерії категорії А: А1 — збільшення обсягу циркулюючих еритроцитів для чоловіків більше 36 мл/кг, а для жінок — більше 32 мл/кг маси тіла; А2 — нормальне насичення крові киснем; А3 — спленомегалія. Критерії категорії В: В1 — тромбоцитоз більше 400,0109/л; В2 — лейкоцитоз більше 12,0109 /л; В3 — збільшення вмісту лужної фосфатази при відсутності інфекції; В4 — рівень вітаміну В12 більше 900 пг/мл. Діагноз захворювання вважався достовірним, якщо у хворого виявляли всі три критерії категорії А або А1+А2 і будь-які два критерії з категорії В. У 40 хворих на СП діагностована IIА стадія, у 20 — IIБ стадія патологічного процесу.
Усього було обстежено 36 хворих на ІМФ, серед них було 20 чоловіків і 16 жінок. Тривалість захворювання була різною і варіювала від 1 до 5 років.
Діагноз ІМФ базувався на виявленні спленомегалії, лейко-еритробластичної картини периферичної крові (помірний лейкоцитоз, нейтрофільоз, зрушення формули вліво), наявності мієлофіброзу і/або остеомієлосклерозу в гістологічних препаратах КМ у поєднанні з мегакаріоцитозом, мієломегакаріоцитозом або панмієлозом.
Усього обстежено 36 пацієнтів із СЕ. Причиною розвитку еритроцитозу були ХОЗЛ: у 30 — хронічний обструктивний бронхіт, у 6 — бронхіальна астма. Тривалість неспецифічних захворювань легень була різною і коливалася від 3 до 10 років.
Контрольну групу склали 30 практично здорових осіб.
Гемограма хворих на СП та СЕ характеризувалася еритроцитозом, збільшенням вмісту гемоглобіну. При проведенні порівняльного аналізу вмісту формених елементів і лейкоцитарної формули нами не виявлено достовірних розходжень у вмісті еритроцитів, гемоглобіну, лейкоцитів, однак у хворих із СЕ спостерігалося достовірне, в порівнянні з даними у хворих на СП, збільшення кількості еозинофілів і моноцитів.
У хворих з СП IIБ стадією та еритроцитемічним варіантом ІМФ також не виявлено достовірних змін, за винятком підвищення вмісту у хворих на ІМФ паличкоядерних і сегментоядерних нейтрофілів, а також еозинофілів.
Аналіз показників мієлограми у хворих на СП та еритроцитемічним варіантом ІМФ не виявив змін. При аналізі показників мієлограми у хворих СЕ нами виявлене зменшення вмісту базофільних, поліхроматофільних та оксифільних нормоцитів, тоді як інші показники в обстежених хворих не відрізнялися.
Методи дослідження. Для встановлення діагнозу МПЗ використовували комплекс клінічних і лабораторних методів: кількісний підрахунок формених елементів крові, морфологічне дослідження крові, кісткового мозку, гістологічні (трепанобіопсія), цитохімічні, інструментальні (ультразвукове і електрокардіографічне) дослідження.
Мазки периферичної крові і кісткового мозку готували відповідно до загальноприйнятої методики. Підрахунок лейкоцитограми проводили з використанням світлової мікроскопії, під масляною імерсією зі збільшенням 907. За гематологічну норму ПК і КМ прийняті дані, отримані при обстеженні великої кількості здорових осіб (Тіц Н., 1997).
Хемокінетичну здатність НПК визначали за допомогою тесту спонтанного пошкодження нейтрофілів (СПН) за методикою, запропонованою М.І.Дворкіним і співавт. (1983).
Спонтанна НСТ-реакція проводилася за методикою Park (1968) у модифікації М.Г.Шубича і В.Г.Мєднікової (1978). При виконанні стимульованої НСТ-реакції як стимулятор застосований ліпополісахарид (E.coli Kroeger 08, Biochem, Krakow) (Клімов В.В., Коровкіна Т.В., 1982). Для оцінки інтенсивності НСТ-реакції клітини розділяли за ступенем вмісту формазана в цитоплазмі із визначенням середнього гістохімічного коефіцієнту (СГК) (Astaldi G.E., Verga L., 1957).
Інтегральну тетразолієву активність нейтрофілів (ІТАН) визначали за формулою, запропонованою Драннік Г.Н., Коваль О.В. (1985):
ІТАН = (ФПН,% Л СГК) : 100,
де: ФПН — відносна кількість формазан-позитивних нейтрофілів; Л — кількість лейкоцитів ПК (109/л); СГК — середній гістохімічний коефіцієнт НСТ-реакції; 100 — кількість переглянутих клітин.
Фагоцитарну активність НПК досліджували з використанням культури бактерій Micrococcus lysodeiticus, які містять за оптичним стандартом мутності 500 млн мікробних тіл у 1 мл (Житова Є.І. і співавт., 1974). Фагоцитарну активність нейтрофілів (ФАН) оцінювали за кількістю фагоцитуючих клітин на 100 і виражали у відсотках. Фагоцитарний індекс (ФІ), який характеризує інтенсивність фагоцитозу, визначали середнім числом фагоцитованих мікробів, що припадають на один нейтрофіл. Відношення числа активних нейтрофілів через 30 хвилин інкубації до числа їх через 15 хвилин інкубації послужило показником швидкості внутрішньоклітинного руйнування бактерій, тобто показника завершеності фагоцитозу (ЗФ).
Активність НАДФ-оксидази у нейтрофілах крові визначали за методом Novikoff, Masek (1958). Виявлення мієлопероксидази (МПО) у НПК проводили за методом Loele (1936). Середній гістохімічний коефіцієнт (СГК) обчислювали за формулою, запропонованою Astaldi і Verga (1957).
Визначення вмісту катіонних білків (КБ) у цитоплазмі НПК проводили за методом М.Г.Шубича (1974). Вираховували інтенсивність цитохімічної реакції (СГК) на КБ та індекс дегрануляції нейтрофілів крові за формулою:
(100 – А) 100%
Індекс дегрануляції нейтрофілів: = -------------------------,
100
де: А — кількість клітин, які містять катіонні білки;
100 — кількість переглянутих клітин.
Активність комплементу оцінювали з розрахунку фактичного лізису визначеного числа еритроцитів комплементом, який знаходиться в даному об’ємі сироватки (Турищев С.М., 1986). Опсонічну активність сироватки (ОАС) крові визначали за методом, запропонованим А.Н.Маянським і співавт. (1982). Об’єктом фагоцитозу при постановці реакції була 24-годинна культура бактерій Serratia Marcensens.
Концентрацію сироваткових імуноглобулінів класів IgG, IgA, IgM визначали методом радіальної імунодифузії в агарі (Mancini G. et al., 1965). Вміст циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) визначали методом осадження їх у поліетиленгліколі з мол. м. 6000 (Гашкова В. і співавт., 1978)
Оцінка імунного статусу містила в собі визначення субпопуляційного складу Т-лімфоцитів: загальної популяції Т-лімфоцитів (CD3+), Т-супресорів/кілерів (CD8+), Т-хелперів/індукторів (CD4+), імунорегуляторного індексу (CD4+/CD8+) і В-лімфоцитів (CD19+). До числа тестів оцінки імунного статусу включене також визначення кількості натуральних кілерних клітин (CD16+), активованих лімфоцитів (CD25+). Імунологічні дослідження виконувалися за допомогою метода непрямої імунофлуоресценції при візуальному контролі результатів з використанням моноклональних антитіл проти CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, СD25 (виробництво Статус К, Нижній Новгород).
Дані досліджень оброблені методом варіаційної статистики. Для кожного ряду розраховували середню арифметичну (М), середнє квадратичне відхилення (), помилку середньої арифметичної (m) за формулами, які наводяться в посібниках з варіаційної статистики (Боровіков В., 2001). Ймовірність зрушення (Р) визначали по таблицях Ст’юдента. У роботі застосовані непараметричні методи статистичної обробки матеріалу для визначення достовірних розходжень. У групах з невеликою кількістю спостережень використаний критерій Вілкоксона-Манна-Уітні (U). Оцінка зв’язку між якісними ознаками проводилася на підставі даних, отриманих при обчисленні критерію 2 і коефіцієнта А.А.Чупрова (С).
Для вибору показників, що найбільш відрізняються і використовуються для диференціації СП та СЕ, СП та еритроцитемічної фази ІМФ, обчислювали коефіцієнт діагностичної інформативності (Кі) (Земсков А.М., 1986) за формулою:
2 (д12 + д22)
Кі= ------------------------
М1 – М2
Чим менше величина Кі, тим більше даний показник відрізняється від порівнюваного.
Результати досліджень та їх обговорення. Результати наших досліджень у хворих СЕ виявили посилення літичної активності комплементу та опсонічної активності сироватки (ОАС) крові. Здатність нейтрофілів периферичної крові до хемокінезу (тест СПН) виявилася достовірно вищою, ніж у здорових осіб.
Фагоцитарна активність НПК у хворих СЕ виявилася достовірно нижчою, однак абсолютний рівень нейтрофілів, здатних до фагоцитозу, практично не відрізнявся від даних здорових осіб. Інтенсивність і завершеність фагоцитозу у хворих СЕ також не відрізнялися від аналогічних показників у групі здорових осіб.
У хворих СЕ відносний та абсолютний рівень формазан-позитивних нейтрофілів (ФПН) виявився статистично достовірно вищим за нормативні величини. Крім збільшення кількості нейтрофілів, які відновлюють НСТ, при СЕ інтенсивність НСТ-реакції виявилася статистично достовірно вищою від нормативних показників. Інтегральна тетразолієва активність у хворих СЕ значно перевищувала нормативні величини. Вміст ФПН у стимульованому НСТ-тесті у хворих СЕ перевищував нормативні величини, однак індекс стимуляції нейтрофілів у даної категорії хворих виявився статистично достовірно нижчим, ніж у здорових осіб. Це свідчить про зниження резервних можливостей у хворих СЕ на фоні ХОЗЛ.
У хворих СЕ активність МПО в НПК виявилася статистично достовірно нижчою, а НАДФ-оксидази нейтрофілів — вищою від даних здорових осіб. Виявлені нами зміни ферментативної активності НПК можуть бути пов’язані з постійним антигенним впливом на мембрану нейтрофіла у хворих з ХОЗЛ. Вміст КБ виявився достовірно нижче показників, а індекс дегрануляції КБ перевищував аналогічний показник здорових осіб у 3,8 рази. Виявлені нами зміни вмісту КБ можуть бути пояснені наявністю в організмі обстежених хворих СЕ постійної антигенної (бактеріальної) стимуляції нейтрофіла. Крім того, посилення дегрануляції КБ у даній клінічній ситуації може бути і причиною запального процесу в легенях, бо протеази, які входять до складу КБ, проявляють деструктивну дію на клітини організму.
Дослідження гуморальної ланки імунітету у хворих СЕ, які розвилися на фоні ХОЗЛ, виявило дисімуноглобулінемію, що виявляється в підвищенні вмісту IgА у сироватці крові на фоні нормальної концентрації IgG та IgM. Концентрація ЦІК у хворих СЕ також виявилася статистично достовірно вищою за нормативні величини.
Особливістю субпопуляційного складу лімфоцитів крові у хворих СЕ є те, що на фоні збереженої кількості Т-загальних (CD3+), Т-супресорів (CD8+), кілерних лімфоцитів (CD16+) та активованих Т-лімфоцитів (CD25+ клітини) вміст Т-хелперів (CD4+) і В-клітин (CD19+) виявився статистично достовірно вищим, ніж у здорових осіб. Величина імунорегуляторного індексу (CD4+/CD8+) у хворих СЕ статистично достовірно перевищувала нормативні величини, що може свідчити про наявність у хворих аутоімунного процесу.
В результаті наших досліджень встановлено, що у хворих на СП активність комплементу не відрізнялася, а опсонічні властивості сироватки виявилися достовірно нижчими за результати, отримані у здорових осіб.
Результати наших досліджень свідчать про підвищення у хворих на СП здатності НПК до хемокінезу. Кількість СПН перевищувала дані здорових осіб більш, ніж у 3 рази. На основі проведених досліджень розроблений “Спосіб диференційної діагностики еритремії і симптоматичних еритроцитозів” (Деклараційний патент на винахід 48666 А, Україна, МКІ G01 №33/68). Відповідно до даного способу, при наявності клінічних симптомів захворювання і значеннях індексу СПН від 5% до 10% діагностують СЕ, а при значенні індексу від 11% і вище - діагностують СП.
Відносна та абсолютна кількість фагоцитуючих нейтрофілів у хворих на СП виявилася вищою за дані здорових осіб. На фоні підвищення інтенсивності фагоцитозу у хворих на СП виявлене значне порушення здатності нейтрофілів до кілінгу поглинених мікроорганізмів. Про це свідчить значне (більш ніж на 50%) підвищення, в порівнянні з нормативними величинами, показника завершеності фагоцитозу.
Відносна кількість ФПН крові у хворих на СП IIА стадією практично в 2,7 рази перевищувала вміст цих клітин у здорових осіб. При порівнянні дослідженого показника НСТ-реакції у хворих виявилося, що вміст ФПН при СП значно перевищував рівень цих клітин при СЕ. Абсолютний вміст ФПН у хворих на СП виявився статистично достовірно вищим за дані здорових осіб і хворих СЕ. Середній гістохімічний коефіцієнт (СГК), який відображає інтенсивність НСТ-реакції, у хворих на СП практично в 3 рази перевищував нормативні величини. При порівнянні досліджуваного показника виявилося, що при СЕ СГК НСТ-реакції був нижче аналогічного показника хворих на СП. Інтегральна тетразолієва активність нейтрофілів крові у хворих на СП практично в 6 разів перевищувала аналогічний показник здорових осіб. При порівнянні ІТАН у хворих на СП та СЕ виявилося, що у останніх ця величина була нижчою, ніж у хворих на СП.
Кількість ФПН у стимульованому НСТ-тесті у хворих на СП практично в 2 рази була вищою, однак індекс стимуляції НПК виявився статистично достовірно нижчим, ніж у здорових осіб, що свідчить про зниження резервних можливостей НПК при даній патології.
Незважаючи на значне підвищення кількості ФПН у хворих на СП, при порівнянні досліджених показників стимульованої НСТ-реакції виявилося, що при СП індекс стимуляції нейтрофілів є статистично достовірно нижчим, ніж у хворих СЕ.
Активність МПО і НАДФ-оксидази НПК у хворих на СП виявилася достовірно вищою за дані здорових осіб. У хворих на СП вміст КБ у нейтрофілах крові був достовірно нижчим, а індекс дегрануляції НПК достовірно перевищував нормативні величини.
Таким чином, у хворих на СП IIA стадії спостерігається значна активація киснезалежного метаболізму НПК.
Вміст IgG у сироватці крові хворих на СП IIA стадії практично не відрізнявся від нормативних величин, а рівні IgA та IgM виявилися статистично достовірно вищими. Концентрація ЦІК у хворих на СП також була вищою за нормативні величини.
Порівняльний аналіз досліджених показників встановив, що у хворих СЕ концентрація IgG практично не відрізнялася, рівень IgA був статистично достовірно вищим, а вміст IgМ і ЦІК — нижчим за аналогічні показники, отримані у групі хворих на СП.
При дослідженні субпопуляційного складу у хворих на СП IIA не виявлено істотних, у порівнянні з нормативними величинами, розходжень у вмісті Т-лімфоцитів (CD3+), В-клітин (CD19+) і Т-хелперів (CD4+). В той же час у хворих на СП IIА стадією виявлено статистично достовірне, в порівнянні з даними здорових осіб, збільшення кількості Т-супресорів (CD8+) і зменшення вмісту в крові рівня кілерних (CD16+) та активованих (CD25+) лімфоцитів. Незважаючи на підвищення кількості Т-супресорів, величина імунорегуляторного індексу (CD4+/CD8+) у хворих на СП практично не відрізнялася від нормативних величин.
Особливості етіопатогенезу СП (мієлопроліферативний процес) та СЕ (інтактність мієлоїдного паростка кровотворення) дають підставу думати, що стан імунологічної реактивності організму при цих двох формах еритроцитозів може значно розрізнятися.
Для вибору показників, які найбільш відрізняються та використовуються для диференціації СП та СЕ, нами був обраний коефіцієнт діагностичної інформативності (Кі), який обчислювали за формулою (Земсков А.М., 1986):
Кі = 2 (12 + 22) : (М1 – М2).
Результати обчислення коефіцієнта діагностичної інформативності показників неспецифічної резистентності та імунологічної реактивності у хворих СЕ і СП представлені в табл. 1.
Таблиця 1
Діагностична інформативність показників неспецифічної резистентності
та імунологічної реактивності у хворих з СЕ, на СП та ІМФ
Показники неспецифічної резистентності організму | Показники імунологічної реактивності організму
Показники | Кі | Показники | Кі
СЕ та СП | СП та ІМФ | СЕ та СП | СП та ІМФ
Кількість лейкоцитів | 33,81 | 16,29 | IgG | 5,856 | 15,895
Кількість нейтрофілів, % | 41,73 | 14,43 | IgA | 1,006 | 0,523
Кількість нейтрофілів, 109/л | 520,46 | 2,28 | IgM | 0,232 | 2,418
Активність комплементу | 130,14 | 51,09 | ЦІК | 131,29 | 335,34
ОАС | 0,375 | 0,458 | CD3 | 235.3 | 132,99
Кількість СПН | 0,013 | 0,072 | CD4 | 5.108 | 258,11
ФАН, % | 12,003 | 9,75 | CD8 | 87.13 | 102,53
ФАН, 109/л | 5,167 | 97,65 | CD4/CD8 | 1,49 | 22,52
ІФ | 4,474 | 8,043 | CD16 | 4.49 | 76,604
ЗФ | 0,283 | 0,153 | CD19 | 11.99 | 108,53
ФПН, % | 7,925 | 4,63 | CD25 | 4.42 | 14,9
ФПН, 109/л | 1,165 | 2,7———
СГК НСТ-реакції | 0,246 | 0,19———
ІТАН | 1,318 | 0,28———
НСТ стимул. | 17,95 | 21,95———
ІСН НСТ-реакції | 2,81 | 1,67———
Продовження табл. 1
МПО | 0,162 | 0,1026———
НАДФ-оксидази | 2,3 | 0,175———
Вміст КБ | 0,24 | 0,959———
Індекс дегрануляції КБ | 2,06 | 3,36———
На підставі аналізу проведених досліджень нами розроблений алгоритм диференційної діагностики СП та СЕ (табл. 2).
Таблиця 2
Алгоритм диференційної діагностики справжньої поліцитемії і симптоматичних еритроцитозів при гематокриті >55% та вище
Морфологія еритроцитів
Нормальна
А. МЦЕ — нормальна або менш, ніж
на 25% вища за нормативні
Діагноз: Відносний (гемоконцентра-ційний) еритроцитоз | Мікроцитоз, гіпохромія еритроцитів
Б. МЦЕ __ підвищена
Діагноз : Абсолютний еритроцитоз
Рекомендації.
Корекція або усунення причинних факторів:
- паління;
- ожиріння;
- прийому диуретиків;
- лікування гіпертонічної хвороби;
- виявлення і корекція факторів ризику ішемічної хвороби серця. | Рекомендації.
Пошук доказів на користь СП:
- тромбоцити > норми;
- лейкоцити > 12,0?109/л
- стан активації нейтрофілів
Тест спонтанного пошкодження нейтрофілів (СПН)
5_10% | > 11%
Спостереження гематолога-1 раз на 6 міс. | Діагноз: симптома-тичний еритроцитоз | Діагноз: справжня поліцитемія
Таким чином, найбільш інформативними додатковими диференційно-діагностичними критеріями є наступні (розташовані в порядку зниження їхньої діагностичної значимості): кількість СПН (Кі=0,013), активність МПО (Кі=0,162), вміст у нейтрофілах КБ (Кі=0,24), СГК НСТ-реакції (Кі=0,246), показник завершеності фагоцитозу (Кі=0,283), абсолютна кількість ФПН (Кі=1,165), ІТАН (Кі=1,318), індекс дегрануляції КБ (Кі=2,06), активність НАДФ-оксидази (Кі=2,3). З гуморальних факторів неспецифічної резистентності організму найбільш значимим диференційно-діагностичним тестом є опсонічна активність сироватки крові (Кі=0,375). При проведенні диференційної діагностики СЕ та СП як додаткові критерії діагностики доцільно використовувати визначення концентрації IgА (Кі=1,006) та IgМ (Кі=0,232). Застосування для диференціації СЕ і СП параметрів клітинної ланки імунітету не має сенсу внаслідок їх низької диференційно-діагностичної значимості.
У хворих на ІМФ в еритроцитемічній стадії активність комплементу виявилася вищою, а ОАС значно нижчою за нормативні величини. У хворих еритроцитемічним варіантом ІМФ вміст СПН перевищував нормативні величини більш, ніж на 60%. Відносний вміст нейтрофілів, здатних до фагоцитозу, у хворих на ІМФ практично не відрізнявся, але абсолютна їхня кількість перевищувала нормативні величини більш, ніж у 2,5 рази. Інтенсивність фагоцитозу (ІФ) виявилася підвищеною і у пацієнтів з еритроцитемічним варіантом ІМФ. Завершеність фагоцитозу (ЗФ) була порушеною у всіх обстежених хворих, про що свідчить значне, в порівнянні з нормативним, підвищення його величини.
Дослідження параметрів НСТ-реакції у хворих з еритроцитемічним варіантом ІМФ виявило наступні закономірності: в обстежених хворих спостерігалося збільшення загальної кількості лейкоцитів, зниження відносної і підвищення абсолютної кількості НПК у порівнянні з нормативними величинами. Відносний та абсолютний вміст клітин, здатних відновлювати НСТ (ФПН), у хворих на ІМФ перевищував дані здорових осіб у 1,9 і 2,7 рази відповідно. Інтенсивність НСТ-реакції (СГК) у хворих на ІМФ перевищувала аналогічний показник у здорових осіб у середньому в 1,6 рази. ІТАН у хворих на ІМФ перевищувала аналогічний показник здорових осіб у 6,5 разів.
У хворих еритроцитемічної фази ІМФ активність МПО і НАДФ-оксидази не відрізнялася від нормативних показників, вміст КБ виявився статистично достовірно нижчим, але індекс дегрануляції КБ достовірно перевищував дані здорових осіб.
Концентрація IgG, IgA та IgM у сироватці крові хворих з еритроцитемічною фазою ІМФ практично не відрізнялася, а рівень ЦІК значно (більш ніж у 2 рази) перевищував нормативні показники.
У хворих на ІМФ в еритроцитемічній стадії виявлено статистично достовірне зниження вмісту CD3+, CD25+ лімфоцитів. Кількість CD4+ і СD19+ лімфоцитів не відрізнялася від показників здорових осіб, тоді як вміст CD8+ лімфоцитів виявився вище нормативних величин. Величина CD4/CD8 у хворих в еритроцитемічній стадії ІМФ практично не відрізнялася від аналогічного коефіцієнта у здорових осіб.
У хворих на СП IIБ стадії ОАС виявилася нижчою, а активність комплементу вищою за дані нормативних значень. Кількість спонтанно пошкоджених нейтрофілів у хворих з СП IIБ стадією значно (більш ніж у 2 рази) перевищувала нормативні величини.
Як показали результати проведених досліджень, відносна кількість ФПН була достовірно підвищеною, а абсолютна кількість ФПН у хворих на СП виявилася вищою нормативних більш, ніж у 2 рази. Інтенсивність фагоцитозу виявилася підвищеною у хворих на СП. Завершеність фагоцитозу була порушеною у всіх обстежених хворих на СП, про що свідчить значне, в порівнянні з нормативними, підвищення його величини.
Дослідження НСТ-реакції у хворих з СП IIБ стадією свідчить про підвищення киснезалежного метаболізму НПК. Відносний та абсолютний вміст клітин, здатних відновлювати НСТ, у хворих на СП перевищував дані здорових осіб у 2,3 та 3,9 відповідно. Інтенсивність НСТ-реакції (СГК) у хворих на СП перевищувала аналогічний показник у здорових осіб у середньому в 1,85, а ІТАН — у 8,0 разів. У хворих на СП вміст ФПН у стимульованому НСТ-тесті крові значно перевищував, у той же час індекс стимуляції нейтрофілів виявився статистично достовірно нижчим за нормативні величини, що свідчить про значне зниження резервних можливостей НПК.
Активність МПО і НАДФ-оксидази в НПК у хворих на СП виявилася статистично достовірно вищою, ніж у здорових осіб. Вміст у хворих на СП КБ виявився достовірно нижчим, а індекс дегрануляції КБ - вищим за нормативні величини.
Концентрація IgG у сироватці крові хворих на СП практично не відрізнялася, вміст у сироватці крові IgA та IgM у хворих на СП виявився вищим за нормативні величини. Концентрація ЦІК у хворих на СП значно (більш ніж у 2 рази) перевищувала нормативні показники.
Результати проведених досліджень встановили відсутність істотних розбіжностей у хворих на СП IIБ стадії щодо вмісту CD4, CD19 позитивних лімфоцитів у порівнянні з нормативними показниками. В той же час у хворих на СП нами виявлене статистично достовірне збільшення вмісту Т-супресорів (CD8+), тоді як величина імунорегуляторного індексу (CD4/CD8) у хворих на СП практично не відрізнялася від нормативних показників. Вміст у крові хворих на СП кілерних лімфоцитів (CD16+) та активованих Т-лімфоцитів (CD25+) виявився статистично достовірно нижчим за нормативні величини.
Таким чином, аналіз отриманих нами даних дозволив встановити, що як у хворих на СП IIБ стадією, так і у пацієнтів з еритроцитемічною стадією ІМФ спостерігаються порушення неспецифічної резистентності та імунологічної реактивності організму.
Показники гуморальної ланки неспецифічної резистентності організму свідчать про активацію літичної активності комплементу і зниження ОАС, як у хворих на СП та ІМФ. При порівнянні активності комплементу в обстежених хворих не виявлено достовірних розбіжностей у хворих на СП та ІМФ, тоді як при порівнянні опсонічних властивостей сироватки нами виявлене статистично достовірне її підвищення у хворих на СП. Оцінка кількісних характеристик і функціональних властивостей фагоцитуючих клітин у хворих на СП та ІМФ виявила неоднозначні зміни. При СП IIБ стадії спостерігається посилення хемокінетичної і фагоцитарної функції нейтрофілів, на фоні зниження здатності нейтрофілів крові до завершеного фагоцитозу (кілінгу мікроорганізмів).
Для СП IIБ стадії характерним є активація киснезалежного метаболізму на фоні зниження резервних можливостей нейтрофілів крові, про що може свідчити достовірне зниження індексу стимуляції нейтрофілів у стимульованому НСТ-тесті. При еритроцитемічному варіанті ІМФ також спостерігається активація киснезалежного метаболізму, про що свідчить значне, в порівнянні з нормативними показниками, збільшення показників НСТ-реакції. Статистичний аналіз у хворих з еритроцитемічним варіантом ІМФ виявив достовірне, в порівнянні з аналогічними величинами у хворих на СП IIБ стадії, зменшення показників НСТ-реакції.
У процесі спостереження за хворими було виявлено, що значення ІТАН 0,76 і нижче зустрічається у хворих еритроцитемічним варіантом ІМФ, тоді як значення ІТАН більш 0,77 характерні для СП IIБ стадії. На підставі аналізу змін величини ІТАН нами був розроблений і захищений патентом спосіб диференційної діагностики еритроцитемічної стадії ІМФ і СП “Спосіб диференціальної діагностики еритроцитемічної стадії сублейкемічного мієлозу та еритремії” (Деклараційний патент 45136 А Україна, МКІ G01 №33/68).
Незважаючи на підвищення показників, які відображають киснезалежний метаболізм, у всіх обстежених хворих виявлене значне зниження резервних функцій НПК, про що свідчить зниження індексу стимуляції нейтрофілів у стимульованому НСТ-тесті.
Дослідження ферментативної активності НПК показало, що активність МПО і НАДФ-оксидази у хворих на СП перевищувала відповідні значення в нормі, тоді як у пацієнтів з еритроцитемічним варіантом ІМФ практично не відрізнялася від нормативних величин. Вміст КБ у хворих на СП і еритроцитемічним варіантом ІМФ був нижчим, але індекс дегрануляції КБ у хворих на СП та ІМФ — вищим показників здорових осіб.
Аналіз гуморальної ланки імунологічної реактивності організму встановив відсутність достовірних розбіжностей у вмісті IgG і підвищення концентрації IgA та IgM, ЦІК у хворих на СП IIБ стадії у порівнянні з нормативними величинами. У пацієнтів з еритроцитемічною фазою ІМФ не виявлено достовірних змін вмісту сироваткових імуноглобулінів, тоді як концентрація ЦІК виявилася значно вищою, ніж у здорових осіб.
Аналіз імунного статусу показав, що при СП має місце зниження CD3+, CD16+ і СD25+ лімфоцитів, збільшення популяції СD8+ клітин, тоді як рівень СD4+ і СD19+ лімфоцитів, а також величина імунорегуляторного індексу (СD4/СD8) практично не відрізнялася від даних здорових осіб. При еритроцитемічній стадії ІМФ виявлені ті ж зміни у вмісті лімфоцитів, що і у хворих на СП, проте при ІМФ не спостерігалося достовірних, у порівнянні з нормативними показниками, змін СD16 лімфоцитів.
Обчислення коефіцієнта діагностичної інформативності з метою визначення найбільш значимих додаткових диференційно-діагностичних критеріїв між СП та еритроцитемічним варіантом ІМФ (див. табл. 1) визначило високу інформативність гуморальних і клітинних факторів неспецифічної резистентності організму.
При проведенні диференційної діагностики доцільно застосовувати наступні показники (розташовані в порядку зниження діагностичної інформативності): кількість спонтанно пошкоджених нейтрофілів (Кі=0,072), активність МПО (Кі=0,1026), показник завершеності фагоцитозу (Кі=0,153), активність НАДФ-оксидази (Кі=0,175), СГК НСТ-реакції (Кі=0,19), ІТАН (Кі=0,28), вміст КБ (Кі=0,959), індекс стимуляції в стимульованій НСТ-реакції (Кі=1,67), кількість нейтрофілів, які відновлюють НСТ (%) (Кі=4,63), індекс дегрануляції КБ (Кі=3,36) та абсолютна кількість ФПН (Кі=2,7). З гуморальних факторів НРО та імунологічної реактивності найбільшу диференційно-діагностичну значимість має визначення опсонічної активності сироватки крові (Кі=0,458), концентрації IgА (Кі=0,523) та IgМ (Кі=2,418). Визначення показників клітинної ланки імунологічної реактивності не має сенсу внаслідок їхньої низької диференційно-діагностичної значимості.
Отримані дані покладені в основу розробленого нами алгоритму диференційної діагностики СП та еритроцитемічного варіанту ІМФ (табл. 3).
Таблиця 3
Алгоритм диференційної діагностики справжньої поліцитемії
та еритроцитемічного варіанту ідіопатичного мієлофіброзу
Спленомегалія
Дослідження крові:
- еритроцитоз ;
- лейкоцитоз (або нормальний вміст лейкоцитів)
- тромбоцитоз (або нормальний вміст тромбоцитів)
Гістологічне дослідження кісткового мозку (трепанобіопсія):
мієлофіброз (остеомієлосклероз) в кістковому мозку
Дослідження показників НСТ-реакції :
- абсолютна кількість формазан-позитивних нейтрофілів;
- інтенсивність НСТ-реакції;
- інтегральна тетразолієва активність (ІТАН)
ІТАН — 0,76 та нижче | ІТАН — 0,77 та вище
Діагноз: Еритроцитемічний варіант ідіопатичного мієлофіброзу | Діагноз: Справжня поліцитемія IIБ стадії
Таким чином, проведені нами дослідження свідчать, що при наявності труднощів диференційної діагностики симптоматичних еритроцитозів і справжньої поліцитемії, справжньої поліцитемії та еритроцитемічного варіанту ідіопатичного мієлофіброзу допомогою в діагностиці може бути дослідження функціональної активності нейтрофілів.
ВИСНОВКИ
1. У хворих з еритроцитозами спостерігається комплекс клініко-імунологічних порушень, обумовлених характерними для кожної нозологічної форми розладами гемопоеза.
2. Для справжньої поліцитемії характерне зниження опсонічних властивостей на фоні збереженої активності комплементу, значне підвищення функціональної активності нейтрофілів, яка виявляється підвищенням здатності клітин до хемокінезу, відновленню НСТ та активності МПО і НАДФ-оксидази. При еритроцитемічній стадії ідіопатичного мієлофіброзу спостерігається активація літичної активності комплементу, зниження опсонічних властивостей сироватки крові і підвищення функціональних властивостей нейтрофілів периферичної крові.
3. Основними проявами порушень неспецифічної резистентності у хворих симптоматичними еритроцитозами є активація комплементу, опсонічних властивостей сироватки крові, киснезалежного метаболізму при збереженій здатності фагоцитарної функції нейтрофілів периферичної крові.
4. У
