НАЦIОНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКРАЇНИ

Вiддiлення регуляторних систем клiтини Iнституту бiохiмiї

iм. О.В. Палладiна НАН України

МАЙДАН Микола Миколайович

УДК 577.150.87

РОЗРОБКА КЛІТИННИХ БIОЕЛЕМЕНТІВ СЕНСОРIВ ТА ферментативних методів ДЛЯ АНАЛІЗУ МЕТАНОЛУ, ЕТАНОЛУ ТА ФОРМАЛЬДЕГIДУ

03.00.04 - бiохiмiя

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертацiї на здобуття наукового ступеня

кандидата бiологiчних наук

Львiв - 1998

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі біохімічної генетики Вiддiлення регуляторних систем клiтини Iнституту бiохiмiї iм. О.В. Палладiна НАН України (м. Львів).

Науковi керiвники:

доктор бiологiчних наук, професор

Сибiрний Андрій Андрійович

Вiддiлення регуляторних систем клiтини Iнституту бiохiмiї iм. О.В. Палладiна НАН України, зав. відділом біохімічної генетики

кандидат хiмiчних наук, доцент

Гончар Михайло Васильович

Вiддiлення регуляторних систем клiтини Iнституту бiохiмiї iм. О.В. Палладiна НАН України, старший науковий співробітник

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Луцик Максим Дмитрович

Вiддiлення регуляторних систем клiтини Iнституту бiохiмiї iм. О.В. Палладiна НАН України, провідний науковий співробітник

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Магеровський Юрій Васильович

Львівський НДІ патології крові та трансфузійної медицини,

старший науковий співробітник

Провідна установа: Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (м. Київ), відділ фітопатогенних бактерій

Захист відбудеться "22" грудня 1998 року о 1530 на засіданні спеціалізованої вченої ради К35.238.01 у Вiддiленні регуляторних систем клiтини Iнституту бiохiмiї iм. О.В. Палладiна НАН України за адресою: 290005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Вiддiлення регуляторних систем клiтини Iнституту бiохiмiї iм. О.В. Палладiна НАН України.

Автореферат дисертації розісланий "03" жовтня 1998 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Федорович Д. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Проведення швидкого і надійного аналізу таких сполук як метанол, етанол та формальдегід є необхідним в медицині, фармакології, хімічних та біотехнологічних виробництвах, у справі контролю стану оточуючого середовища. Для аналізу цих сполук використовується кілька підходів, і серед них все більшого застосування набувають новітні ферментативні та біосенсорні методи. На сьогодні відомо декілька біосенсорних систем для аналізу спиртів та формальдегіду, в яких чутливим елементом є інтактні клітини. Слiд зазначити, що такі системи мало селективнi [Wiseman, 1992], а це вимагає використання нових підходів при роботі в цьому напрямку.

Гончаром М.В. із сп. [1996] на прикладі метилотрофних дріжджів показано перспективність застосування при розробці аналітичних систем генетичного конструювання мутантних штамів мікроорганізмів із наперед заданими порушеннями певних ланок метаболізму. Скерована зміна біохімічної відповіді мутантних клітин на наявність певних сполук відкриває перспективу створення клітинних елементів сенсорів, які би володіли перевагами ферментних елементів (швидкий відгук, висока селективність) і біоелементів на основі інтактних клітин (простота одержання, низька собівартість).

У зв'язку з цим видалось актуальним провести пошук штамів дріжджів, придатних для використання в аналітичних цілях, та дослідити можливість створення високоселективних клітинних біосенсорних пристроїв, чутливих до метанолу, етанолу та формальдегіду, на основі генетично сконструйованих та природних штамів різних видів дріжджів із застосуванням електрохімічних та напівпровідникових перетворювачів.

У аналітичній біохімії широко використовується ферментативний підхід для фотометричного визначення різноманітних речовин. Відомі фірми “Boehringer Mannheim” та “Sigma” пропонують великий асортимент тест-наборів для фотометричного аналізу низькомолекулярних сполук. Слід зазначити, що аналiтичнi дiагностикуми у структурi ринку бiотехнологiчних продуктiв розвинутих країн займають у вартiсному вираженнi провідне мiсце, тоді як вiтчизняна промисловiсть випускає незначний асортимент продуктiв такого типу, незважаючи на гостру потребу в них.

Аналiтичнi набори для кiлькiсного визначення етанолу, метанолу та формальдегiду в Україні, як i в країнах СНД, взагалi вiдсутнi, а імпортні набори для аналiзу етанолу дуже дорогi, а тому часто не доступнi вiтчизняним споживачам. Для визначення метанолу використовують, як правило, газо-рiдинну хроматографiю, обладнання для якої є недоступним для більшості лабораторій. У зв‘язку з цим створення вiтчизняних аналiтичних дiагностикумів для ферментативного визначення етанолу, метанолу, формальдегiду видається актуальним питанням.

Зв‘язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є частиною досліджень відділу біохімічної генетики Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ за конкурсними проектами Державного фонду фундаментальних досліджень №5.3/1 "Екструзія протонів та перекису водню клітинами метилотрофних дріжджів та модуляція цих процесів на генетичному та метаболічному рівнях" і №5.2/70 "Регуляція утворення та детоксикації перекису водню у метилотрофних дріжджів", та Департаменту науково-прикладних програм Міністерства у справах науки та технологій №2.12-03617 “Розробка ферментативних дiагностикумiв для кiлькiсного визначення етанолу, метанолу, формальдегiду та глюкози в бiологiчних рiдинах та харчових продуктах”.

Мета та завдання дослiдження.

Метою даної роботи було:–

створення лабораторних моделей бiосенсорiв на основi клiтин дрiжджiв для кількісного визначення метанолу, етанолу та формальдегiду;–

розробка ферментативних методів аналізу вищевказаних сполук.

Основними завданнями роботи було:

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Наукова новизна та практична цiннiсть роботи. Виявлено штами дрiжджiв з метаболічно детермiнованою селективнiстю до формальдегiду, проведено їх аналiз та охарактеризовано природу окислення формальдегiду в клітинах метилотрофних та неметилотрофних дріжджів. Вперше показано роль мітохондріальної альдегіддегідрогенази в окисленні in vivo екзогенного формальдегіду, що може служити одним із механізмів його детоксикації.

Вперше клiтини неметилотрофних дрiжджiв Candida maltosa та Saccharomyces cerevisiae застосовано як основу бiоелементів чутливих до формальдегіду сенсорів, створено лабораторнi моделi клiтинних бiосенсорiв на основi зазначених вище клiтин та рН-ПТ як трансдукторiв для визначення формальдегiду.

Розроблено біоелементи О2- і Н2О2-датчиків для аналізу алкоголю на основі пермеабілізованих клітин мутантних штамів метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha.

Розроблено метод селективного визначення метанолу за формальдегідом, який утворюється у алкогольоксидазній реакції, із застосуванням 4-аміно-3-гідразино-5-меркапто-1,2,4-тріазолу. Аналiтичний метод може бути призначено для контролю стану навколишнього середовища і сертифiкацiї харчових та фармацевтичних продуктiв.

Безпосередня практична цiннiсть роботи полягає у розробці нових біосенсорних та ферментативних методів аналiзу спиртів (метанолу та етанолу) і формальдегiду та створенні нового біотехнологічного продукту – ферментативного діагностикуму "АЛКОТЕСТ” для визначення алкоголю в біологічних рідинах людини, харчових продуктах та бродильних рідинах. Набір "АЛКОТЕСТ” рекомендовано Фармакологічним комітетом МОЗ України для серійного виробництва.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини, результатів та їх обговорення, висновків та списку літератури, який включає 182 найменування. Робота викладена на 126 сторінках машинописного тексту і містить 29 рисунків та 12 таблиць. 3 рисунка та 3 таблиці винесено на окремі сторінки. Список літератури розташований на 18 сторінках.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Дисертантом розроблено програму проведення експериментів та підібрано методи вирішення поставлених завдань. Дослідження аналітичних параметрів формальдегідного аналізатора проводилось у співпраці зі співробітниками відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАНУ (м. Київ), які є співавторами наукових праць здобувача. Обговорення та аналіз результатів досліджень проведено з науковими керівниками.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідались на І установчому (VIII) з'їзді Українського мікробіологічного товариства, (Одеса, 1993), 7-ому міжнародному симпозіумі з генетики промислових мікроорганізмів (Монреаль, Канада, 1994), 2-ому симпозіумі з судово-медичних наук "Кримінальні сліди" (Краків, Польща, 1994), Конгресі "Мікробна фізіологія та генна регуляція" (Гаага, Нідерланди, 1995), VII Українському бiохiмічному з'їзді (Київ, 1997), 19-ому міжнародному спеціалізованому симпозіумі з дріжджів (Брага, Португалія, 1998).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 2 статті, 1 патент України, 1 технічні умови, 10 тез доповідей.

МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕНЬ

У роботi використовували наступні штами мікроорганізмів:

Hansenula polymorpha 356 (leu2) лінії DL1 (дикий тип), люб'язно переданий для досліджень д-ром Л. П. Тихоміровою (Пущіно, Росiя); H. polymorpha 356-83 (fdh) – мутант, дефектний за формальдегіддегідрогеназою; H. polymorpha С1 (leu2, fdh) – сегрегант гібрида 356-83 та leu2 лінії CBS4732; H. polymorpha К-105 (gcr1, cat) безкаталазний мутант зі знятою катаболітною репресією (конститутивний синтез алкогольоксидази при рості на глюкозному середовищі); H. polymorpha 33-7-4А (gcr1); Candida maltosa (ade2, дикий тип); Saccharomyces cerevisiae FH4С (дикий тип) з колекції відділу біохімічної генетики Відділення Інституту біохімії.

Клiтини культивували до середини логарифмiчної фази росту в колбах при 300С на качалці при постiйнiй аерацiї (240 об./хв) у мінеральному середовищi наступного складу, г/л: КH2PO4 – 1; (NH4)2SO4 – 3,5; MgSO4 x 7H2O – 0,5; CaCl2 – 0,1. Середовище містило дрiжджовий екстракт "Дiфко" (0,05%) як джерело мікроелементів та вітамінів. В окремих випадках дріжджовий екстракт додавали у 0,3% концентрації. При необхідності в середовище додавали відповідні фактори росту – лейцин або аденін (0,004%). Як джерело вуглецю використовували окремо 1% (v/v) метанол, 1% (v/v) етанол, 1% (w/v) глюкозу або сумiш 0,2% (v/v) глiцерину з 20 мМ формiатом натрію. Біомасу визначали за мутністю розведених суспензій шляхом їх фотометрування.

Визначення закислювальної здатності клітин дріжджів проводили при постійному перемішуванні у незабуференій водній суспензії клітин, попередньо відмитих від середовища. рН середовища вимірювали потенціометрично за допомогою іонометра ЕВ-74. Зміни рН реєстрували за допомогою самописця.

Активності ферментів визначали у безклітинних екстрактах, отриманих руйнуванням клітин у планетарному дезінтеграторі за допомогою скляних кульок. Концентрацію білка визначали за методом Лоурі. Аналіз форміату проводили ферментативно.

Хімічну пермеабілізацію клітин проводили як описано [Zhang and Wang, 1994] та [Луста и др., 1993]. Ліофільне висушування клітин проводили на промисловому ліофілізаторі на базі Львівського заводу лікарських препаратів.

Аналіз етанолу, метанолу та формальдегіду здійснювали за допомогою транзисторних елементів виробництва НДІ "Мікропроцесор" (м. Київ), перекисного датчика Model 27 та кисневого датчика Model 5330 виробництва Yellow Springs Instruments (США).

При розробці методів ферментативного аналізу спиртів використовували алкогольоксидазу, яку виділяли із безклітинного екстракту мутантного штаму H. polymorpha К-105, висолюючи фермент сульфатом амонію.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Використання клітин дріжджів мутантних штамів H. polymorpha як біоелементів електрохімічних сенсорів для аналізу спиртів.

Перспективним об’єктом для створення систем аналізу алкоголю є метилотрофні дріжджі. Вибір метилотрофних дріжджів зумовлений їх здатністю до надзвичайно високого рівня синтезу алкогольоксидази (АО). Це забезпечує інтенсивне поглинання кисню клітинами та продукцією перекису водню в присутності спиртів, що можливо реєструвати за допомогою електрохімічних датчиків.

Ранiше у відділі біохімічної генетики Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАНУ шляхом ступінчатого УФ-мутагенезу був отриманий мутант метилотрофних дрiжджiв Hansenula polymorpha К-105 [Gonchar et al., 1990] із повним блоком каталази та конститутивним синтезом АО в середовищі з глюкозою. Клітини цього штаму продукують перекис водню в присутності етанолу та метанолу. Обробка поверхнево-активними речовинами (бромід цетилтриметиламонію або дигітонін) призводила до підвищення Н2О2-екскретуючої активності безкаталазних мутантних клітин приблизно втричі. Активність продукування перекису водню у перерахунку на 1 мг сухої ваги оброблених клітин складала 1-1,2 мкмоль/хв. Позитивний ефект пермеабілізації пояснюється порушенням бар'єрної функції цитоплазматичної мембрани.

Оскільки у сухому стані біоелементи проявляють найвищу стабільність, вивчались умови приготування сухих клітинних препаратів та вплив деяких речовин на активність АО під час їх висушування та зберігання. Перед ліофілізацією до суспензії клітин додавались наступні сполуки: дульцит, сорбіт, сахароза, інозит. За наявності дульциту, сахарози, інозиту під час ліофілізації зберігалось 100% вихідної активності АО. Сорбіт не проявляв помітного стабілізуючого ефекту – під час висушування активність АО знижувалась на 40-45%, як і у контрольному варіанті без добавок. Показано високу стабільність АО в сухих препаратах клітин: варіант із стабілізатором демонстрував зниження активності в перші 5 діб інкубації при 370С лише на 14-20% і збереження цього рівня активності протягом 3-ох наступних тижнів.

Висока алкоголь-індукована Н2О2-продукуюча активність дозволила використати клітинні препарати штама К-105 як чутливий до спиртів елемент перекисного датчика. Чутливу мембрану формували розміщенням суспензії виготовлених клітинних препаратів між полікарбонатною (зовнішня) та целюлозоацетатною (внутрішня) мембранами. Одержану мембрану типу "сендвіч" закріплювали на чутливій поверхні Н2О2-електроду.

При додаванні розчину спирту до робочої комірки реєстрували амперометричний сигнал. Досягнення стаціонарної фази відгуку займало коло 1,5 хв. Величина сигналу прямо пропорційно змінювалась в межах концентрації 0,4-4,0 мМ для етанолу і 0,05-1,2 мМ для метанолу (рис. 1). Більша чутливість сенсора до метанолу пояснюється кращими кінетичними характеристиками АО по відношенню до метанолу.

Для біоелементів на основі клітин безкаталазного штаму показано, що при проведенні 20-25 аналізів на добу протягом двох-трьох днів відгук зберігається на постійному рівні і поступово зменшується протягом наступних 4 днів до 80% від початкового рівня (рис. 2).

Рис. 1. Залежність величини сигналу клітинного Н2О2-біосенсора від концентрації етанолу (о) та метанолу ().

Для створення біосенсора для аналізу спиртів на основі кисневого датчика, було використано клітини мутантного штаму H. polymorpha 33-7-4A. Певна регуляторна мутація дала змогу підвищити рівень клітинного синтезу АО в середовищі з глюкозою і, таким чином, збільшити швидкість поглинання кисню у присутності алкоголю до 1,3 мкмоль О2/хв мг клітин, що в 4 рази перевищує рівень, характерний для штаму дикого типу.

Максимальне споживання кисню спостерігалось для інтактних клітин, вирощених на глюкозі, при використанні спиртів (метанолу або етанолу) як дихальних субстратів. У присутності глюкози рівень споживання кисню приблизно в 10 разів менший, ніж за наявності спиртів у інкубаційній суміші.

Хімічна обробка клітин поверхнево-активними речовинами (дигітонін або бромід цетилтриметиламонію) сприяє щезанню дихання в присутності глюкози, у той же час дихання в присутності спиртів залишається на високому рівні. Це, очевидно, зумовлено виходом з клітин кофакторів та гліколітичних ферментів, необхідних для окислення глюкози, а індуковане спиртами дихання викликане поглинанням кисню за участю алкогольоксидази, яка зберігає внутрішньоклітинну локалізацію після пермеабілізації клітин.

Рис. 2. Операційна стабільність біоелементів сенсорів на основі клітин H. polymorpha К-105 (o) та H. polymorpha 33-7-4А ().

Отже, введення певних мутацій та хімічна обробка мутантних клітин сприяє підвищенню селективності дихального відгуку клітин. Препарат клітин штаму 33-7-4А було застосовано як селективний елемент О2-датчика для аналізу спиртів. Сухі клітинні препарати штаму 33-7-4А було виготовлено за методикою, описаною для клітин штаму К-105, з використанням сахарози як стабілізуючого агента. Результати дослідження стабільності АО в таких препаратах виявили подібну закономірність, яка спостерігалась для ліофілізованих клітин H. polymorpha К-105. За умов зберігання при 370С у перші 6 днів активність АО поступово знижувалась до 80% від вихідної, а потім залишалась незмінною протягом наступних трьох тижнів.

Клітинні препарати іммобілізували в гелі альгінату кальцію між тефлоновою та полікарбонатною мембранами і закріплювали на чутливій поверхні кисневого електроду. Додавання спирту в робочу комірку сенсора веде до локальної зміни концентрації кисню на чутливій поверхні датчика, що призводить до падіння сили струму. Для відгуку біосенсора характерно, що сигнал розвивався швидше, ніж у випадку Н2О2-електроду, і досягав стаціонарного рівня менш ніж за 0,5 хв.

Лінійний діапазон залежності зміни сили струму від концентрації спирту в аналізованому розчині складав 0,2-1,2 мМ для етанолу і 0,03-0,35 мМ для метанолу (рис. 3). Стабільність біоелемента на основі клітин штаму 33-7-4А подібна до тієї, яка спостерігалась для клітин штама К-105. Величина сигналу не змінювалась протягом двох днів і поступово зменшувалась до 80% від вихідного рівня протягом наступних 4 днів експлуатації (див. рис. 2). Відносна стандартна похибка паралельних вимірювань для обох біосенсорів не перевищувала 7%.

Рис. 3. Залежність величини амперометричного сигналу клітинного О2-біосенсора від концентрації етанолу (о) та метанолу ().

Імовірно, що подальший прогрес у конструюванні селективних біосенсорів для диференційного аналізу спиртів і альдегідів може бути досягнутий створенням мембран із заданою проникливістю (розділення спиртів та альдегідів) або скерованою зміною субстрат-зв'язуючих центрів алкогольоксидази методами білкової інженерії.

Вивчення ферментативної природи окислення екзогенного формальдегіду в клітинах дріжджів.

Порівняно недавно було виявлено сильно виражену здатність інтактних клітин метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha закислювати середовище інкубації у відповідь на внесення формальдегіду. Крім теоретичного аспекту, це явище має прикладний інтерес. Адже висока селективність даного процесу дозволяє розглядати продукцію кислих метаболітів як специфічну клітинну відповідь на наявність у середовищі формальдегіду. Тому було вирішено провести пошук штамів дрiжджiв iз пiдвищеною закислювальною здатністю, індукованою формальдегідом, з метою використання відібраних штамів для створення сенсорiв на основi рН-чутливих польових транзисторів (рН-ПТ) для визначення формальдегіду.

Раніше для метилотрофних дріжджів було показано залежність індукованого формальдегідом закислення інкубаційного середовища від активності ферментів прямого шляху окислення метанолу [Гончар и др., 1994]. Тому очевидним здається твердження, що окислення формальдегіду до мурашиної кислоти каталізує глутатіонзалежна формальдегіддегідрогеназа (ФдДГ) за схемою [Fujii & Tonomura, 1972]:

спонтанно ФдДГ ФДГ

НСНО + GSH GS-CH2ОН HCOOH СО2

Н2О GSH NAD+ NADН(Н+)

NAD+ NADH(H+)

ФДГ – форміатдегідрогеназа HCOO– + H+

Синтез ФдДГ індукується при рості дріжджів у середовищі з метанолом і репресується етанолом і глюкозою [Sahm, 1977]. Тим не менше, мутантні клітини H. polymorpha 356-83 та С1, позбавлені активності ФдДГ, зберігали здатність до формальдегідзалежного закислення середовища (табл. 1). На основі цього було зроблено припущення, що в клітині існує альтернативний, неспецифічний до природи альдегідів фермент, який здатен окислювати формальдегід in vivo. Незважаючи на відсутність ФдДГ (табл. 2) у цих штамів, повного блокування індукованої формальдегідом екструзії мурашиної кислоти у них не спостерігалось. Для штаму дикого типу ефективність викиду протонів варіювала в залежності як від ростового субстрату, так і "індуктора" закислення, тоді як величина швидкості цього процесу мало змінювалась у мутантних штамів метилотрофних дріжджів. Вона складала 18-40% від максимального рівня, характерного для штаму дикого типу при метилотрофному рості, що практично співмірно зі швидкістю закислення середовища клітинами дикого типу в умовах репресії ФдДГ глюкозою і етанолом.

Екструзія протонів із паралельним нагромадженням у середовищі іонів форміату притаманна також і парафінутилізуючим дріжджам Candida maltosa і пекарським дріжджам Saccharomyces cerevisiae (див. табл. 1), хоча у цих видів мікроорганізмів не виявляється характерна для метилотрофів глутатіонзалежна ФдДГазна активність. Виявлено, що клітини цих дріжджів, вирощені на середовищі з етанолом, здатні до інтенсивної екструзії протонів у відповідь на внесення формальдегіду у середовище інкубації. Швидкість закислення позаклітинного простору співрозмірна з величиною, характерною для метилотрофно вирощених дріжджів дикого типу H. polymorpha (див. табл. 1). Як у випадку індукованого формальдегідом закислення клітинами метилотрофних дріжджів H. polymorpha, виділення Н+ клітинами неметилотрофних дріжджів при інкубації з формальдегідом супряжено з викидом форміат-аніонів. Після 5 хв інкубації клітин (1 мг/мл) ферментативним аналізом у середовищі виявлено 0,1-0,15 мкМ форміат.

Одержані результати можна пояснити участю у процесі окислення формальдегіду у метилотрофних дріжджів, крім глутатіонзалежної ФдДГ, іншого ферменту, здатного окислювати формальдегід. Парафінутилізуючі дріжджі C. maltosa та пекарські дріжджі S. cerevisiae, які здатні in vivo окислювати екзогенний формальдегід і екскретувати мурашину кислоту, також володіють подібним ферментом, малоселективним до природи альдегіду. Відповідний фермент тісно пов'язаний з обміном етанолу, оскільки індукується цим спиртом, а вирощені на глюкозному середовищі клітини володіють цією здатністю значно меншою мірою.

Таблиця 1

Залежність швидкості закислення від метаболічного стану клітин дріжджів диких і мутантних штамів та індуктора закислення (M m, n = 5)

Штам | Ростовий субстрат | Питома швидкість закислення,

нмоль Н+ хв-1 мг-1 клітин

формальдегід | бензальдегід

H. polymorpha 356 |

глюкоза

етанол

гліцерин+

форміат

метанол | 4,6 0,32

5,7 0,37

15,9 1,2

17,0 1,4 | 4,2 0,33

4,0 0,29

-

5,2 0,37

C. maltosa |

глюкоза

етанол | 1,7 0,13

14,8 1,1 | 1,4 0,12

14,2 1,1

S. cerevisiae |

глюкоза

етанол | 1,5 0,11

21,0 1,2 | 1,2 0,12

20,3 1,3

H. polymorpha 356-83 |

глюкоза

етанол

гліцерин+

форміат

метанол | 3,2 0,23

3,4 0,25

3,6 0,22

3,0 0,18 | 3,0 0,16

4,0 0,27

-

3,1 0,16

H. polymorpha С1 |

глюкоза

етанол

гліцерин+

форміат

метанол | 4,6 0,33

6,2 0,37

6,6 0,35

5,4 0,28 | 4,6 0,19

5,3 0,27

-

5,0 0,29

Позначення: "-" – не аналізували.

Таблиця 2

Залежність активності деяких ферментів обміну спиртів та альдегідів від метаболічного стану клітин дріжджів диких та мутантних штамів (M m, n = 5)

Штам | Ростовий субстрат | Питома активність ферментів,

мкмоль. хв-1 мг-1 білка

ФдДГ | ФдР | АдДГ

H. polymorpha 356 |

глюкоза

етанол

гліцерин+

форміат

метанол | 0,042 0,003

0,034 0,002

0,40 0,024

0,58 0,042 | 0,45 0,014

0,43 0,017

0,45 0,021

0,70 0,029 | 0,028 0,003

0,044 0,003

0,026 0,011

0,043 0,004

C. maltosa |

глюкоза

етанол | 0,00

0,00 | 0,10 0,009

3,12 0,12 | 0,031 0,004

0,29 0,017

S. cerevisiae |

глюкоза

етанол | 0,00

0,00 | 0,15 0,009

5,11 0,13 | 0,030 0,003

0,56 0,029

H. polymorpha С1 |

глюкоза

етанол

гліцерин+

форміат

метанол | 0,00

0,00

0,00

0,00 | 2,18 0,092

1,61 0,11

1,62 0,093– |

0,046 0,003

0,050 0,017

0,041 0,015–

H. polymorpha 356–83 |

глюкоза

етанол

гліцерин+

форміат

метанол | 0,00

0,00

0,00

0,00 | 1,21 0,068

1,56 0,060

1,55 0,071– |

0,030 0,003

0,039 0,004

0,032 0,003–

Позначення: ФдДГ – глутатіонзалежна формальдегіддегідрогеназа; ФдР – формальдегідредуктаза; АдДГ – альдегіддегідрогеназа, “-“ – не аналізували у зв'язку зі слабким ростом клітин.

Для C. maltosa і S. cerevisiae виявлено зв‘язок цього процесу з рівнем активності неспецифічної альдегіддегідрогенази (АдДГ), активність якої значно зростає при рості на середовищі з етанолом (див. табл. 2). На рис. 4 показано, як у процесі росту клітин C. maltosa у періодичній культурі відбувається зміна активності АдДГ, яка корелює з відповідним рівнем закислюючої здатності клітин. Для метилотрофних клітин індукції даного фермента етанолом практично не спостерігалось (див.табл. 2), що відображується в однаковому рівні закислювальної здатності клітин метилотрофних дріжджів, вирощених на цих субстратах.

Рис. 4. Залежність швидкості закислення середовища інтактними клітинами дріжджів C. maltosa та питомої активності АдДГ від фази росту в періодичній культурі (ростовий субстрат – етанол).

Для клітин S. cerevisiae спостерігалась аналогічна залежність.

На основі наведених даних можна припускати, що ферментом, який здійснює окислення екзогенного формальдегіду до мурашиної кислоти, є АдДГ, яка каталізує другий етап утилізації етанолу в клітинах дріжджів. Дріжджова АдДГ має широку субстратну специфічність до альдегідів [Steiman et al., 1968], що відображується у практично однакових рівнях закислення, ініційованого формальдегідом і бензальдегідом, для клітин C. maltosa, S. cerevisiae та мутантних штамів H. polymorpha (див. табл. 1). Цей фермент може розглядатися як компонент системи окислення формальдегіду та екструзії мурашиної кислоти у досліджуваних дріжджів, що служить, вірогідно, формою детоксикації формальдегіду і доповнює уже відомі шляхи забезпечення резистентності клітин дріжджів до екзогенного формальдегіду через необоротне відновлення до метанолу продуктом гену ADH1 [Grey et al., 1996] та його окислення за участю алкогольдегідрогенази, кодованої геном ADH5 [Wehner et al., 1993].

Вивчення робочих характеристик клiтинних бiосенсорiв на основi рН-ПТ для аналізу формальдегіду.

Клiтини C. maltosa i S. cerevisiae, вирощенi на етанолi, володiють сильно вираженою здатнiстю до екструзiї мурашиної кислоти при iнкубацiї їх з формальдегiдом завдяки iндукцiї у клiтин неспецифiчної АдДГ. Метанол у таких клiтин не викликає закислення через вiдсутнiсть фермента, здатного окислювати цю сполуку. Тому клiтини цих дріжджів було застосовано для розробки високочутливого методу аналiзу формальдегiду.

Додавання аналiзованого розчину формальдегіду в робочу комірку сенсора викликало локальне закислення середовища клiтинами, iммобiлiзованими в альгінатному гелі на затворі рН-чутливого польового транзистора. Закислення зумовлено окисленням клітинами формальдегіду до мурашиної кислоти і екструзією її у позаклітинний простір. Локальна зміна рН спричиняє змiну заряду на поверхнi iон-селективної мембрани. На рис. 5 зображено типову криву вiдгуку сенсора, чутливого до формальдегіду. Вона характеризувалась наявнiстю незначного лаг-перiоду. Через 3-5 хв вiдгук досягав

Рис. 5. Характерна крива вiдгуку клiтинного бiосенсора на основi рН-ПТ.

Вимірювання проводили у дистильованiй водi. Концентрацiя клiтин (S. cerevisiae) – 15 мг/мл.

стаціонарного рiвня. Вiдновлення базової лiнiї вiдгуку біосенсора спостерігалось при промиванні протягом 10-20 хв. У зв'язку з вiдносно повiльним розвитком сигналу вимiри проводились у кiнетичному режимi за максимальною швидкістю зміни потенціалу [dU/dt]макс. На рис. 6 представлено залежність сигналу клiтинного сенсора від концентрації формальдегiду для незабуферених водних розчинiв. Лiнiйна залежність швидкості вiдгуку бiосенсорiв вiд концентрацiї формальдегіду знаходилась в дiапазонi 1-75 мМ напiвлогарифмiчної шкали як при використанні клітин C. maltosa, так i S. cerevisiae. Мiнiмальна концентрація, яку можна визначити, в обох випадках складала 0,3 мМ.

Дослiджено залежнiсть величини вiдгуку мiкробного сенсора вiд кратностi його застосування. Промiжок часу мiж вимiрюваннями не перевищував 20 хв. Операцiйна стабiльнiсть за таких умов складала не менше 5-х годин. Протягом цього часу спостерігалась хороша відтворювальність величин потенцiометричних сигналiв – відносний коефіцієнт варіації вимiрiв при тiй самiй мембранi не перевищував 7%. Стандартне вiдхилення величин потенцiометричних сигналiв для мембран, сформованих на поверхнi перетворювача de novo, складало близько 10%.

Рис. 6. Залежність сигналу клiтинних бiосенсорiв на основi рН-ПТ від концентрації формальдегіду.

Вимірювання проводили у дистильованій воді. Концентрацiя клiтин (1 - S.cerevisiae; 2 - C. maltosa) у бiомембранi – 15 мг/мл.

Величина відгуку клiтинного сенсора сильно зменшувалась при збiльшеннi буферної ємностi аналiзованого розчину, оскільки компоненти буферу, дифундуючи у мембрану з іммобілізованими клітинами, зменшують концентрацiю вiльних протонiв.

Створений бiосенсор є високоселективним по відношенню до формальдегiду. Серед протестованих речовин реєструвався позитивний потенцiометричний сигнал тільки на формальдегід та бензальдегід і негативний на метанол, етанол, пропанол, бутанол, ізопропанол, лактат, глюкозу.

Розробка ферментативного методу кількісного аналізу алкоголю.

Алкогольоксидаза, крім метанолу, здатна окислювати і інші первинні аліфатичні спирти, зокрема, етанол:

СН3СН2ОН + О2 СН3СН=О + Н2О2

На останній реакції грунтується аналітичне використання АО для визначення етанолу за утвореним перекисом водню. Останній окислює в пероксидазній реакції хромоген до забарвленого продукту (барвника), концентрацію якого вимірюють фотометрично:

Пероксидаза

H2O2 + SH2 S + 2H2O

Хромоген Барвник

Для розробки діагностикуму для ферментативного аналізу етанолу на основі алкогольоксидазно-пероксидазного методу як прототип було відібрано спосiб визначення активності пероксидази iз використанням як хромогена неканцерогенного дигiдрохлориду 3,3',5,5'-тетраметилбензидину (ТМБ) [Holland et al., 1974].

При відробці стандартних умов брались до уваги чутливість, зручний час проведення аналізу (10-25 хв), економічність затрат. При підборі умов визначення етанолу показано, що в режимі "плато" межі аналізованих концентрацій алкоголю зміщуються в область малих значень (0,2-6 мкг етанолу в 4 мл реакційної суміші). Така висока чутливість вносить деяку незручність при рутинних аналізах, бо при цьому більшість зразків потребує додаткового розведення. Кінетичний режим дозволяє адаптувати чутливість методу до конкретних вимог об'єкту (цільна кров, сироватка). У кінцевому варіанті аналізу вміст АО в реакційній суміші складав 0,06 од./мл. Для швидкого перетворення перекису водню, який утворюється в алкогольоксидазній реакції, пероксидаза додавалась в надлишку (за активністю). Як буферну систему було вибрано 50 мМ К-фосфатний буфер, рН 7,0, при якому активність АО є максимальною і добре виражено блакитне забарвлення суміші, що легко ідентифікується візуально.

Фотометрування згідно із розробленим методом здійснювалось при рН 1,8 після додавання соляної кислоти до кінцевої концентрації 0,1 М. Це пояснюється необхідністю зупинки реакції та більшим коефіцієнтом екстинкції продукту окислення ТМБ при низьких значеннях рН. На рис. 7 наведено типову калібрувальну криву для визначення етанолу в модельних розчинах за розробленою методикою. Відтворювальність результатів паралельних вимірювань аналізувалась на модельних сироватках із різним вмістом алкоголю. У залежності від концентрації алкоголю, коефіцієнт варіації паралельних вимірювань коливається від 1% (3,6 г/л) до 12% (0,1 г/л). При концентраціях, що перевищують юридично допустимий рівень (1 г/л), цей параметр не більший 3%.

На основі розробленого методу створено аналітичний набір "АЛКОТЕСТ". Випробування набору проводились на базі лабораторії токсикології Київського НВО швидкої допомоги та медицини катастроф і лабораторії судмедекспертизи Київського гарнізону МО України. Було досліджено проби крові та сироватки 42-х пацієнтів на наявність алкоголю паралельно трьома методами: газо-рідинною хроматографією, алкогольдегідрогеназним (набір фірми "Sigma"), алкогольоксидазним (набір "АЛКОТЕСТ"). Виявлено високу кореляцію результатів одержаних трьома методами (на рис. 8 приводяться дані для двох методів).

Рис. 7. Типова залежність значення оптичної густини від концентрації етанолу в фотометрованій пробі.

Рис. 8. Кореляція результатів аналізу етанолу (г/л), одержаних АО і АДГ методами.

Термін зберігання набору "АЛКОТЕСТ" визначається стабільністю ферментів. Для перевірки терміну придатності один набір витримували при кімнатній температурі (~200С), другий при 40С. Для першого набору майже повна інактивація (на 95%) відбувалась за 12тижнів. Зберігання при 40С протягом 10 місяців не виявило суттєвої зміни активності ферментів.

Розробка ферментативно-хімічного методу кількісного аналізу метанолу.

Фотометричний метод визначення метанолу за генерованим у алкогольоксидазній реакції перекисом водню не дає можливості розрізнити метанол на фоні етанолу, що актуально в токсикологічній практиці. Тому було застосовано інший підхід при розробці методу аналізу метанолу, а саме, за другим продуктом окислення метанолу алкогольоксидазою – формальдегідом.

Для розробки методу визначення метанолу було вибрано спосiб визначення альдегідів iз використанням 4-аміно-5-гідразино-3-меркапто-1,2,4-тріазолу (АГМТ), який в реакцiї з альдегiдами формує забарвлений продукт [Avigad, 1983]. Спектр поглинання продукту взаємодiї цієї сполуки з формальдегiдом (максимум поглинання при =548 нм) рiзко вiдрiзняється вiд спектра поглинання продукту реакції з ацетальдегiдом та іншими альдегідами (максимум поглинання при =349-355 нм). Чутливiсть даного методу дозволяє визначати формальдегід в діапазоні концентрацій 0,5-50 нмоль у 1 мл пробі.

Рис. 9. Калібрувальні криві для визначення метанолу ферментативно-хімічним методом (1 - оптична густина при =548 нм; 2 - при =355 нм)

А - у модельних розчинах метанолу;

Б - у суміші метанол + етанол (у співвідношенні 1:10)

Аналіз проводився у напівкінетичному режимі. Реакція зупинялась додаванням лужного розчину АГМТ для розвитку специфічної кольорової реакції на альдегіди. За таких умов за 10 хв. інкубації окислювалось ~30% метанолу при проведенні аналізу в концентраційному діапазоні 0,3-3,0 мкг (~10-100 нмоль) у фотометрованій суміші. У разі наявності етанолу можливість кількісного визначення метанолу у суміші із етанолом зберігалось при їх співвідношенні 1:10 за молярною концентрацією (рис. 9). При таких концентраціях етанол практично не конкурує з метанолом в алкогольоксидазній реакції.

ВИСНОВКИ

1.

1.

1.

1.

1.

1.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

1.

1.

1.

5.

1.

1.

1.

анотація

Майдан М.М. Розробка клітинних біоелементів сенсорів та ферментативних методів для аналізу метанолу, етанолу та формальдегіду. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Вiддiлення регуляторних систем клiтини Iнституту бiохiмiї iм. О.В. Палладiна НАН України, Львів, 1998.

У дисертаційній роботі представлено результати роботи по створенню лабораторних моделей клітинних біосенсорних систем та ферментативних методів для кількісного визначення метанолу, етанолу і формальдегіду.

Для підвищення селективності і чутливості біосенсорів на основі електрохімічних (О2- і Н2О2-електроди) і напівпровідникового (рН-чутливі польові транзистори) перетворювачів використано спеціально сконструйовані мутантні штами різних видів дріжджів. Досліджено залежність величини сигналу біосенсорів від буферної ємності розчину, рН, концентрації клітин у чутливих мембранах та ряд інших аналітичних характеристик.

Розроблено фотометричні методи аналізу етанолу і метанолу з використанням алкогольоксидази метилотрофних дріжджів. На основі алкогольоксидазно-пероксидазного підходу створено аналітичний набір "АЛКОТЕСТ” для аналізу етанолу в клінічній практиці.

Ключові слова: аналіз, біосенсор, метанол, етанол, формальдегід, рН-чутливі польові транзистори, О2- і Н2О2-електроди, дріжджі, алкогольоксидаза.

аннотация

Майдан Н.Н. Разработка клеточных биоэлементов сенсоров и ферментативных методов для анализа метанола, этанола и формальдегида. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Отделение регуляторных систем клетки Института биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Львов, 1998.

В диссертационной работе представлены результаты работы по созданию лабораторных моделей клеточных биосенсорных систем и ферментативных методов для количественного анализа метанола, этанола и формальдегида.

Для повышения селективности и чувствительности биосенсоров с использованием электрохимических (О2- и Н2О2-электроды) и полупроводникового (рН-чувствительные полевые транзисторы) преобразователей использованы специально сконструированные мутантные штаммы различных видов дрожжей. Исследованы зависимость величины сигнала биосенсоров от буферной ёмкости раствора, рН, концентрации клеток в чувствительных мембранах и ряд других аналитических характеристик.

Разработаны фотометрические методы анализа этанола и метанола с использованием алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей. На основе алкогольоксидазно-пероксидазного подхода создан аналитический набор "АЛКОТЕСТ” для анализа этанола в клинической практике.

Ключевые слова: анализ, биосенсор, метанол, этанол, формальдегид, рН-чувствительные полевые транзисторы, О2- и Н2О2-электроды, дрожжи, алкогольоксидаза.

summary

Maidan M.M. Development of cell sensor bioelements and analytical methods for analysis of methanol, ethanol and formaldehyde. – Manuscript.

Dissertation for the degree of Candidate of Biological Sciences, specialization 03.00.04 – biochemistry. – Division of Cell Regulatory System of A.V. Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv, 1998.

The thesis contains the results on elaboration of laboratory prototype of cell-based biosensor systems and enzymatic methods for quantitative assays of methanol, ethanol and formaldehyde.

For enhancement of selectivity and sensitivity of biosensors based on electrochemical (О2- and Н2О2-probes) and semiconductor (рН-sensitive field effect transistors) transducers specially constructed mutant strains of different yeasts have been used. The influence of sample buffer capacity, pH and cell content in sensitive membrane on the sensors’ response, and other analytical characteristics have been investigated.

The photometric methods for ethanol and methanol assays by use of alcohol oxidase have been elaborated. The alcohol oxidase-peroxidase approach has been used for development of the analytical kit “alcotest” for ethanol assays in clinical medicine.

Key words: analysis, biosensor, methanol, ethanol, formaldehyde, рН-sensitive field effect transistors, О2- and Н2О2-probes, yeasts, alcohol oxidase.