НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

Азізпур Халіль

УДК 576.8.52 579.083.13

Оптимізація процесів культивування у виробництві

пробіотичних препаратів на основі лактобацил

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2004

Дисертація є рукописом.

Робота виконана на кафедрі промислової біотехнології Національного технічного університету України НТУУ “КПІ” Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: | кандидат біологічних наук, доцент

Шинкаренко Любов Миколаївна, Національний технічний університет України НТУУ “КПІ”, завідувач кафедри промислової біотехнології

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, Горовий Леонтій Федорович, Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, завідувач лабораторією клітинної біології і біотехнології грибів

кандидат біологічних наук, Рубежняк Ірина Георгіївна, науково-дослідний інститут соціально-економічних проблем міста, провідний науковий співробітник відділу екологічної політики

Провідна установа: | Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України

Захист відбудеться 27 01 2005 р. о 15-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148.

Автореферат розісланий 23.12.2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.А. Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пробіотичні властивості бактерій родини Lactobacillaceae роду Lactobacillus у даний час широко використовуються як регулятори стану нормальної мікрофлори шлунково-кишкового тракту в птахівництві, тваринництві і медицині (Львова, 2000; Haller, Colbus, 2001). Препарати лактобактерій позитивно впливають на стан здоров'я людини і тварин, пригнічуючи розмноження умовно патогенних і патогенних мікроорганізмів.

Аналіз потенційних оздоровчих властивостей пробіотичних культур свідчить про те, що вони, у парадигмі сучасної превентивної медицини, здатні виконувати для макроорганізму значно ширшу роль, ніж тільки коректорів нормофлори. Їм також притаманна роль медіаторів, що, досягаючи призначення в тканинах, органах або системах органів хазяїна, прямо або опосередковано взаємодіють з відповідними рецепторами чи структурами, ферментативними системами. Наслідком такої взаємодії є позитивні для макроорганізму зміни в його біохімічних реакціях або фізіологічних функціях. При цьому медіаторами виступають структурні компоненти пробіотичної клітки або продукти метаболітичної діяльності пробіотичних штамів, які, по Б.А. Шендерову, можна розглядати як мініатюрні біотехнологічні комплекси, що створюють різноманітні біологічні речовини – медіатори (Шендеров, 2001).

Використання в якості лікарських засобів і харчових добавок-препаратів, що містять живі клітки деяких бактерій роду Lactobacillus, є актуальним і перспективним з точки зору як профілактики і лікування дисбактеріозів при порушенні балансу нормальної мікрофлори, так і створення препаратів, що підтримують захисні сили організму (Saarela et al., 2001).

Серед різних представників екзогенної мікрофлори бактерії роду Lactobacillus характеризуються рядом переваг, що дозволяють вважати їх найбільш ефективними у виробництві нових біопрепаратів (Підгорський, Коваленко, 2004; Заболотний, Шинкаренко, та ін, 2004). Це, насамперед, високий рівень безпеки для макроорганізму; можливість спрямованої селекції штамів, біологічна, в тому числі антагоністична активність яких більш виражена і виявляється по відношенню до ширшого спектра патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів, ніж у інших представників екзогенної й ендогенної мікрофлори; висока ферментативна активність молочнокислих бактерій, що дозволяє істотно стимулювати і регулювати травлення, здійснювати імуномодулюючу, протиалергенну та антитоксичну дію на організм людини; технологічність у великомасштабному виробництві та екологічна безпека (Vaughan, 2002).

Ряд виявлених в останні роки біологічних властивостей лактобактерій є також надзвичайно перспективними для вивчення можливості впливу цих мікроорганізмів і на процеси канцерогенезу (Report of the Joint FAO/WHO, 2001).

Механізми онкопротекторної дії пробіотиків на основі Lactobacillus вивчені вкрай недостатньо. Мало вивчені і механізми взаємодії кліток пробіотичного препарату і макроорганізму. Однак, реалізація цього феномену, безумовно, представляє науковий інтерес і є надзвичайно актуальною для сучасної профілактичної медицини, так і мікробної біотехнології.

Крім того, на сьогоднішній день недостатньо теоретично обґрунтованим і розробленим в науковому і практичному плані є і уявлення про умови оптимального промислового культивування лактобактерій і проблеми керування біосинтетичними процесами з метою підвищення та закріплення оздоровчих і лікувальних властивостей молочнокислих бактерій.

Встановлення кількісних параметрів вуглецевого й азотного харчування, а також з'ясування умов, що впливають на формування метаболітного пулу клітини, який реалізується в терапевтичних властивостях готових продуктів, розроблених на їх основі препаратів, дозволить підвищити ефективність процесів одержання біомаси з високою біологічною активністю. Це, у свою чергу, забезпечить розширення можливостей виявлення та реалізації цінних біологічних властивостей молочнокислих бактерій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась в рамках фундаментальних науково-дослідних робіт кафедри промислової біотехнології: №8189-01-2001 “Розробка технології нового пробіотичного препарату для отоларингології” (№ державної реєстрації 0101U004427); №М/454-2003 “Розробка технологій нових пробіотиків, імунокоректорів, ад’ювантів” (№ державної реєстрації 0103U007799); №4-02 “Оптимізація технологій отримання субстанцій для нового вітчизняного препарату “Бластен” (№ державної реєстрації 0101U006113), а також в рамках договору про науково-технічне співробітництво ДП “ЕНЗІМ” і ФБТ НТУУ “КПІ” від 15.03.2003 р.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є розробка оптимальних технологічних умов культивування мікроорганізмів роду Lactobacillus з максимальним накопиченням біомаси і високим ступенем лізуємості з метою удосконалення промислової технології вирощування лактобактерій у виробництві біопрепаратів–пробіотиків у відповідності з ТЗ ДП “ЕНЗІМ” на основі виробничих штамів L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 і L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86.

В зв’язку з цим необхідно було вирішити такі основні задачі:

-

-

-

-

Об’єкт дослідження – Оптимізація процесів культивування у виробництві пробіотичних препаратів на основі лактобацил.

Предмет дослідження – технологічні режими та умови культивування лактобактерій у виробництві біопрепаратів на їх основі.

Методи дослідження – традиційні, спеціальні мікробіологічні, стандартні біохімічні, імунологічні, біологічні, фізико-хімічні методи для визначення основних показників біосинтезу – концентрації біомаси, pH, вмісту білка, сухих речовин, амінного азоту, амінокислот, редукуючих речовин та показників біологічних властивостей.

Наукова новизна роботи. Вперше проведено комплексне вивчення впливу основних технологічних параметрів та умов культивування виробничих штамів лактобактерій на накопичення біомаси, лізуємість клітин та рівень прояву антагоністичної, онкопротекторної і імуномодулюючої активності вихідної субстанції для наступного використання для отримання препаратів з широким спектром терапевтичної активності готових препаратів.

Вперше визначена можливість проведення керованого біосинтезу для одержання у виробничих умовах біомаси молочнокислих бактерій з переважно заданими властивостями – поряд з антибіотичною дією показана можливість зміни рівня онкопротекторної і імуномодулюючої активності. Продемонстрований високий рівень індивідуальної мінливості клітин продуцентів, показана необхідність розширення критеріїв для відбору культур-претендентів для віднесення їх до пробіотичних штамів. Запропонована додаткова характеристика чутливості клітин до дії літичних ферментів як один з показників стабільності властивостей пробіотичної культури.

Показана залежність чутливості клітин до дії літичного ферментного комплексу і лізоциму від умов культивування – складу ферментаційного середовища і ряду технологічних параметрів.

Показана різнонаправленість регулювання процесів накопичення біомаси, формування антагоністичного комплексу і імуномодулюючого потенціалу продуценту.

Практичне значення одержаних результатів. Проведена селекційна робота щодо відновлення виробничого штаму L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 і одержаний варіант L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86 з унікальним рівнем імуномодулюючої і онкопротекторної активності, а також широким спектром антагоністичної дії.

На основі вивчення і систематизації експериментального матеріалу удосконалена технологія культивування продуцентів з метою максимального накопичення активної біомаси у виробничих умовах.

Розроблені технологічні рекомендації отримання клітинної маси з високою біологічною активністю, яка може бути застосована для удосконалення промислової технології вирощування лактобацил у виробництві біопрепаратів-пробіотиків для медицини, ветеринарії, косметики з метою одержання різних пробіотичних і сімбіотичних препаратів і продуктів для позитивного впливу на стан здоров’я людини і тварин.

Показано, що при призначенні пробіотичних препаратів необхідно враховувати ряд індивідуальних показників стану здоров’я пацієнта, які можуть впливати на прояв життєздатності пробіотичних клітин і реалізацію їх терапевтичних властивостей.

Особистий внесок здобувача полягає в розробці завдань досліджень, проведенні всіх основних експериментів і дослідів, їх обробці та інтерпретації, аналізі літератури, підготовці та написанні наукових статей. Спільно з науковим керівником розроблено напрямок та концепцію досліджень, основні ідеї роботи, структуру дисертаційної роботи, проведено вибір об'єктів і методів дослідження.

Більша частина мікробіологічних та біотехнологічних експериментів виконана особисто автором.

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи були викладені і обговорювались на I Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2002 р., м.Київ), III Міжнародній науково-практичній конференції “Медицина. Фармація. Біотехнологія” (21-23 травня 2003 року, м.Харків), II Міжнародній науково-практичній конференції “Динаміка наукових досліджень’ 2003” (20-27 жовтня 2003 року, м.Дніпропетровськ), Міжнародній науково-практичній конференції “Пробіотики-XXI століття. Біологія. Медицина. Практика” (20-22 травня 2004 року, м. Тернопіль).

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи були викладені у 5 статтях та 5 тезах доповідей, відображені в нормативно-технічній документації (ТР) на виробництво біомаси L. delbrueckii subsp. bulgaricus.

Структура та обсяг дисертації. Робота викладена на 122 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, чотирьох розділів, висновків, списку використаної літератури і додатків.

Дисертація містить 27 таблиць, проілюстрована 29 рисунками.

Список використаної літератури містить 193 джерела, в тому числі 147 – іноземних.

Матеріали та методи досліджень

В роботі використані штами бактерій роду Lactobacillus (L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 і L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86, які знаходяться в музеї культур мікроорганізмів кафедри промислової біотехнології факультету біотехнології і біотехніки НТУУ “КПІ”. Штам L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 був одержаний для проведення науково–дослідницьких та дослідно-промислових робіт від ДП “ЕНЗІМ”.

Для порівняння використовувались культури, отримані з міжнародних і приватних колекцій мікроорганізмів, а також з музею культур Інституту мікробіології і вірусології ім.Д.К. Заболотного НАН України. Для визначення антагоністичної активності використовувались штами Staphylococcus aureus УКМ В 4001 (АТСС 65388) і Escherichia coli УКМ В-906 (АТСС 25922).

У зв’язку із задачею досліджень більшість експериментів проводилось на першому етапі в умовах лабораторії з використанням для культивування колб (V=0,75л) і в дослідно-промислових умовах з використанням ферментаційного устаткування (V=20л і V=100л).

Коефіцієнт заповнення в усіх варіантах відповідав 0,65-0,75V/V.

Культивування молочнокислих бактерій для визначення особливостей росту, біосинтетичних властивостей і антагоністичної активності проводили при 390С на рідких поживних середовищах MRS (середовище Де Мана і співробітників, 1960), MRSt, MRSj, MRSjt, а також на середовищах, складених з ферментативних гідролізатів промислової сировини – казеїну (ГОСТ 17626-81), соєвого борошна (ГОСТ 3898-56), технічного цукру, гідролізованого кислотним методом, ряду солей і дріжджового автолізату картопляного крахмалю, гідролізованого ферментами.

Використововали концентрат “Йодіс”, з вмістом йоду 17,5 мг/дм3 для утворення концентрації йоду в живильному середовищі на рівні рекомендованих 0,1-0,3 мг/дм3 (спільний проект МПК “Ярк – Київ” і НВК “Йодіс”, 2002 р.).

В якості гідролізуючих ферментів використовували лужну протеіназу Г20x і протакрин Г20x з активністю 100000 од/г, L-амілазу Г20Х та глюковоморим Г20Х (ДП “ЕНЗИМ”, Україна).

Для дослідження впливу дози посівного материалу на розвиток L. delbrueckii supsp. bulgaricus 51 на ферментаційних середовищах використовували посівний матеріал 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30 и 35% від об’єму середовища: вивчали вплив початкових значень рН на зростання і наступну лізуємість клітин L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 лізоцимом при використанні поживних середовищ з початковим значенням рН 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 и 8,0. Вплив температури перевіряли при 32, 37, 40, 45 и 50°С.

Вплив інтенсивності аерації на розвиток і рівень лізису клітин досліджували при вирощуванні культури в колбах Ерленмейєра об’ємом 500 мл при 220 об/хв. з різним об’ємом середовища. Використовували сульфітний метод (Low, 1996).

У якості джерел вуглецю використовували глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, галактозу, маннозу, гідролізати сахарози та картопляного крохмалю.

У якості різних джерел органічного азоту вводили в середовище пептон, дріжджовий і кукурудзяний екстракти, сухе молоко, цистін, цистеін, гідролізати соєвого борошна і казеїну з молока.

Джерелами неорганічного азоту в кількості 0,01% (по азоту) виступали нітрати калію, натрію, магнію, аммонія, хлориду і сульфату аммонія, а також натрій-аммоній фосфату.

Для вивчення впливу мікроелементів використовували: сульфати марганцю, кобальту, міді, цинку, заліза 2-х і 3-х валентного, нікель – у вигляді хлориду, молібден – у вигляді молібдату аммонія, які додавали в кількості 0,001%, за виключенням марганцю, який вносили в кількості 0,01%. Вплив іонної сили вивчали додаванням в середовище натрію хлористого до концен-трації (%): 0,5; 1,0; 1,5 і 2,0.

Вплив вітамінів перевіряли додаванням біотину, тіаміну, пантотенової і аскорбінової кислот в кількості 0,0001%.

Мікробіологічну чистоту і морфологічну характеристику культури контролювали мікроскопічними методами та висівами розведень на контрольного середовища.

Життєздатність клітин лактобактерій після ліофілізації визначали шляхом підрахунку колоній після висіву суспензії на чашки з щільним поживним середовищем. У виробничих умовах життєздатність клітин ліофілізованої біомаси досліджували методом, який заснований на здатності молочнокислих гомоферментативних бактерій окислювати глюкозу в молочну кислоту, що призводить до зниження рН суспензії мікроорганізмів (Кігель, 2003).

рН середовища вимірювали за допомогою рН-метру рН-150. Визначення інтенсивності аерації вивчали сульфітним методом. Активність кислотоутворення визначали тітрометричним методом з розрахунком градусів Тернера. Кількість білка в культуральній рідині визначали за методом Лоурі.

Вміст вуглеводів в середовищі визначали за кількістю редукуючих речовин (РВ), вміст амінного азоту - методом формольного титрування.

Визначення амінокислотного складу ферментативних середовищ, культуральних рідин і клітинних лізатів проводили методом рідинної іонообмінної колоночної хроматографії (Low, 1996).

Визначення антагоністичної активності культур лактобaцил проводили на щільному поживному середовищі МRS за допомогою лунок, які робили свердлом (d=5 мм). Оцінку антагоністичної активності лактобацил визначали за затримкою росту тест-культур і виражали в мм.

Антагонізм лактобактерій визначали також при їх спільному вирощуванні з тест-культурами на бульоні МРS методом дворазових серійних розведень.

З метою вибору стандартних умов проведення ферментативного гідролізу клітин L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 лізоцимом і відпрацювання методики визначення ступеню літичної чутливості клітин, досліджували вплив різних концентрацій лізоциму, температури і тривалості процесу гідролізу.

Були також підібрані навантаження літичного ферментного комплексу на 1 мл суспензії клітин різних штамів лактобактерій.

Вихідна концентрація розчину ферментного препарату з Act. recifensis var. lyticus 2435 (“Рефензим”) з активністю 140000 ЛЕ/г складала 60 мг/мл.

Протипухлинні властивості досліджували згідно вимог ФК України на нелінійних мишах лінії ДВА/2 обох статей розводки віварію ІЭПОР ім. Р.Е. Кавецького НАН України (Low, 1996).

Імунологічна активність визначалась за індексом стимуляції фагоцитозу (Reddy, 1993).

Наведені результати є середнім значенням дослідів, здійснених не менше ніж в трьох повторностях.

Статистичні розрахунки. Статистичну обробку проводили за стандартною методикою (Лакин, 1980). Вірогідність різниці оцінювали за допомогою критеріїв Стьюдента або Фішера. Різниця визнавалася вірогідною при P=0,95.

Результати досліджень та їх обговорення

Визначення впливу умов культивування. Узагальнюючи результати досліджень, направлених на з’ясування оптимальних технологічних параметрів культивування штаму L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 і одержання сприйнятливої до дії лізоциму біомаси встановлено, що процес культивування у виробничих умовах доцільно проводити при 39±10С, при вихідному значенні рН середовища 6,5?7, вносячи молодий посівний матеріал в кількості не менше 10% від об’єму ферментаційного поживного середовища. Культивування слід проводити без примусової аерації, але при перемішуванні в режимі 40 об/хв, коефіцієнті заповнення ферментатора 0,75% і використанні багатоярусної мішалки (рис.1-3).

Рис.1. Вплив умов культивування (pH, температури і аерації) на рост і лізуємість кліток L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51

Рис.2. Вплив віку і дози посівного матеріалу на рост L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 на ферментаційних середовищах

Рис.3. Вплив аерації на ріст L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 в ферментері V=20л (коефіцієнт заповнення 0,75 v/v)

Визначення впливу окремих компонентів складу поживних середовищ.

Оскільки основним об’єктом даного дослідження була виробнича культура, яка введена в технологічні процеси більше 30 років тому з метою одержання речовин, які мають протипухлинну активність, і яка знаходилась довгий період в анабіотичному стані лабораторного зберігання, задача, що постала перед нами, насамперед, полягала в визначенні рівня збереження цінних біологічних властивостей у відновленої культури. Було потрібно, також, з'ясування технологічних параметрів, що дозволяють встановити оптимальні умови культивування для продуцента. Слід зазначити, що штам пропонувався автором тільки як джерело протипухлинних речовин і тому раніше не була проведена комплексна оцінка його біологічних властивостей. Крім того, було визначено досить мало показників, що характеризували його харчові потреби і ростові процеси (рис.4).

Рис.4. Вплив джерел вуглеродного і органічного азотного харчування на ріст і лізуємість L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51

В результаті проведених лабораторних дослідів з’ясовано, що ріст L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 покращується при використанні в якості джерела вуглецю - глюкози, при додаванні в середовище джерел органічного азоту: пептону, сухого молока і цистіну в кількості 0,1% і екстракту дріжджів в кількості від 0,1 до 1,0%, накопичення біомаси культурою посилюється, також, при наявності в середовищі біотину і іонів Fe2+. Ріст L. delbrueckii subsp. bulgaricus – 51 інгібують: екстракт куку-рудзи, неорганічні джерела азоту (KNO3, NaNO3, Mg(NO3)2, NH4Cl, (NH4)2SO4,NH4NaSO4, іони Co2+ і Zn2+ .

Рівень літичної чутливості клітин значно збільшується при лімітуванні вуглецевого субстрату і при збільшенні іонної сили поживного середовища, і досягає значення ступеню лізису клітин первинної культури L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51, одержаної Богдановим (1961).

Розробка виробничого варіанта ферментаційного середовища для L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51

Реалізація основної мети культивування відновленого штаму L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 - створення оптимальних умов для формування і прояву протипухлинної дії дозволила розробити прийнятну технологічну схему, що включає одержання ферментолізатів соєвого борошна і казеїна молока.

Вивчення динаміки розвитку продуцента L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 на ферментаційних середовищах при проведенні культивування у ферментаційному апараті V=20 л із дотриманням встановлених раніше технологічних параметрів, показало, що найбільш продуктивними для накопичення біомаси були ферментаційні середовища, до складу яких входили ферментолізати соєвого борошна, отримані після обробки комплексом ферментних препаратів (рис.5).

Рис.5. Вплив складу поживного середовища на ріст культури L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51(V ферм. 20 л)

На середовищах, що містили казеїнові ферментолізати, процеси накопичення біомаси і її якісні характеристики істотно відрізнялися від показників, що досягалися при використанні соєвих ферментолізатів.

Найбільш істотне уповільнення накопичення клітин продуцента спостерігали на середовищах із гідролізатом казеїна, обробленим лужною протеазою.

Швидкість росту складала в цьому випадку не більш 78%, а накопичення біомаси до 12 години росту досягало тільки 45% від контрольного варіанту. В той же час, інші варіанти ферментаційних середовищ дозволили досягти практично однакового рівня продуктивності з накопичення біомаси.

Найбільш сприяло розвитку культури і швидкому накопиченню біомаси введення до складу ферментаційного середовища комплексного гідролізата соєвого борошна і казеїна після обробки сумішшю протеолітичних ферментів. Встановлено оптимальну тривалість процесу культивування, що у виробничих умовах складає 8-12 годин.

Оцінка чутливості клітин культури (рис.6), отриманих у різних умовах культивування, показала, що найбільш стійкі до дії лізоциму клітини продуцента формувалися на середовищі MRS.

Рис.6. Чутливість клітин L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 вирощених на різних середовищах до дії лізоциму

У два рази більшу чутливість до дії лізоциму виявили клітини, що виросли на комплексних гідролізатах, що містять продукти гідролізу соєвого борошна і казеїна, оброблених сумішшю ферментних препаратів.

Як відомо, амінокислоти є одним із найважливіших елементів живлення, який визначає напрямок розвитку будь-якого організму - від мікроорганізму до людини. Найбільша роль належить так званим незамінним амінокислотам - метіоніну, лейцину, ізолейцину, фенілаланіну, треоніну, триптофану і валіну, що не синтезуються організмом людини і потреба в яких може бути задоволена продуктами харчування, спеціальними добавками або медичними препаратами.

Як вдалося встановити, культуральні рідини штама L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51, отримані в результаті розвитку продуцента на комплексних ферментаційних середовищах, містили в значних кількостях весь спектр незамінних амінокислот (табл.1).

Так, усі варіанти ферментолізатів забезпечували накопичення гістідіна, що необхідний для запобігання розвитку анемій, дерматитів і тощо.

Культуральні рідини можуть слугувати джерелами лейцина (синдром недостатності: ураження нирок і щитовидної залози, гіпопротеінемія і т.д), фенілаланіна (синдром недостатності: порушення тиреоїдної функції і недостатності мозкової речовини і т.д.), лізіна (синдром недостатності: анемія, міодистрофія, остеопороз і т.д.) (Зайчик, 2000).

Утворення значних кількостей тріптофана забезпечувалося на комплексі гідролізатів казеїна і соєвого борошна після обробки лужною протеазою.

Культуральні рідини містили інші амінокислоти в дещо менших кількостях, але були дефіцитні по тірозіну і частково по гліцину й аргініну. На ферментаційному середовищі, що включає комплекс ферментолізатів, відбувалося істотне збільшення вмісту таких амінокислот як треонін (210%), аланін (196%), глутамін (174%), серін (149%) і лізін (142%).

Таблиця 1

Характеристика амінокислотного складу культуральних рідин при вирощуванні L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51

Амінокислота | Кількість амінокислот, мкг/мл

MRS | Казеїн (лужна протеаза) | Казеїн (суміш ферм.) | Соєве борошно (лужна протеаза) | Соєве борошно + (суміш ферм.) | Казеїн+

соєве борошно (лужна протеаза) | Казеїн+ соєве борошно (суміш ферм.)

Треонін | 3,4±0.1 | 1,5±0.1 | 1,7±0.1 | 2,5±0.1 | 2,2±0.1 | 2,5±0.1 | 2±0,1

Серін | 1,9±0.1 | 0 | 1,1±0.1 | 1,0±0.1 | 1,5±0.1 | 0 | 1,3±0,1

Глутамінова кислота | 3,3±0.1 | 2,4±0.1 | 3,3±0.1 | 3,3±0.1 | 3,5±0.1 | 3,5±0.1 | 3,3±0,1

Гліцин | 4,0±0.2 | 0 | 0 | 0 | 0,6±0.01 | 0 | 0

Аланін | 8,0±0.2 | 1,4±0.1 | 1,6±0.1 | 2,8±0.1 | 2,2±0.1 | 2,2±0.1 | 1,8±0,1

Валін | 5,5±0.2 | 2,1±0.1 | 2,4±0.1 | 1,5±0.1 | 1,2±0.1 | 2,1±0.1 | 1,8±0,1

Метіонін | 0 | 2,5±0.1 | 4,4±0.1 | 1,1±0.1 | 1,1±0.1 | 3,0±0.1 | 3,1±0,1

Ізолейцин | 4,9±0.2 | 0,84±0.01 | 0,9±0.02 | 1,3±0.1 | 1,5±0.1 | 1,2±0.1 | 1,1±0,1

Лейцин | 10±0.2 | 8,8±0.2 | 10,9±0.5 | 5,9±0.2 | 7,1±0.3 | 9,3±0.5 | 9,3±0,2

Тірозін | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0

Фенілаланін | 4,8±0.2 | 4,3±0.2 | 5,8±0.1 | 3,0±0.2 | 5,5±0.2 | 4,6±0.2 | 5,7±0,2

Триптофан | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9,9±0.2 | 0

Гістідін | 6,5±0.2 | 15,7±0.5 | 19,6±0.8 | 12,6±0.8 | 13,3±0.5 | 16,7±0.5 | 16,4±0,5

Орнітін | 3,5±0.2 | 0 | 4,5±0.1 | 1,6±0.1 | 2,8±0.1 | 1,3±0.1 | 3,6±0,1

Лізін | 4,6±0.2 | 1,9±0.1 | 5,8±0.2 | 1,8±0.1 | 1,6±0.1 | 2,0±0.1 | 4,7±0,2

Аргінін | 1,2±0.2 | 0 | 0 | 0 | 1,1±0.1 | 0 | 0

Разом | 58,3 | 41,4 | 62,0 | 38,4 | 45,8 | 58,3 | 54,7

% контроля | 100 | 71,0 | 106,3 | 65,8 | 78,5 | 100 | 93,8

Таким чином, проведені нами експерименти дозволили встановити ряд особливостей розвитку культури L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 на середовищах різного складу, продемонструвати вплив технологічних процесів, пов'язаних із приготуванням виробничих середовищ, а також показати рівень впливу джерел органічного азотного живлення і головну роль окремих амінокислот у формуванні клітинної маси та її біологічних характеристик.

Проведені нами роботи дозволили відновити біологічну активність вихідного продуцента й одержати новий варіант культури, що перевершував вихідний штам за рядом показників (L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86).

Перевірка здатності живих клітин, їх лізатів, а також культуральних рідин до гальмування росту пухлини саркоми S-180 підтвердила збереження і стабілізацію вихідного протипухлинного потенціалу культури L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 і у варіанта L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86. Нами також переконливо показана залежність формування носіїв протипухлинної активності в клітинах лактобацил від складу поживного середовища і, насамперед, від природи органічного джерела азотного харчування. Цілком ймовірно, соєве борошно і продукти його ферментативної переробки є джерелом сполук, що індукують утворення субстанцій, які відповідальні за прояв протипухлинної дії (табл.2).

Таблиця 2

Вплив живих клітин і продуктів метаболізму штамів L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 і L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86 на гальмування росту саркоми S 180 у мишей при пероральному введенні

Зразок | Відсоток гальмування росту пухлини (%) через 7 діб

MRS | Гідролізати

Казеїна + соєвого борошна |

Гідролізати казеїна

1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2

Живі клітини | 14±0.8 | 12±0.8 | 65±2.3 | 76±3.1 | 17±1.1 | 22±1.2

Лізат (лізис “Рефінзимом”) | 16±0.9 | 18±1 | 80±3.8 | 89±2.2 | 20±1.1 | 36±1.2

Лізат (лізис “лізоцимом”) | 15±1.1 | 12±0.7 | 72±3.6 | 76±3.4 | 32±1.3 | 34±1.1

Культуральна рідина | 21±1,0 | 16±0.8 | 47±1.9 | 54±2.1 | 35±1.2 | 35±1.3

Примітка: 1. L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51; 2. L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86

Варіанти клітин і їх лізати, отримані після культивування на ферментаційних середовищах, що містять тільки ферментолізат казеїну, виявляли протипухлинну активність у 2,4-4 рази меншу.

Середовище МRS, яке забезпечує найбільше накопичення клітинної маси обох штамів, сприяло блокуванню утворення речовин, відповідальних за протипухлинну активність. Можливо, ця реакція обумовлена окремими метаболітами, у синтезі яких беруть участь амінокислоти, що входять до складу пептону.

Слід зазначити, що в культуральній рідині обох штамів зберігався досить високий рівень протипухлинної дії, яка у випадку використання казеїнових ферментолізатів більш, ніж у 1,5 рази перевищувала здатність до гальмування росту пухлини живих клітин і їх лізатів.

Поряд із протипухлинною активністю одним із головних показників терапевтичного потенціалу біомаси було визначення імуностимулюючої дії, для характеристики якої був обраний індекс стимуляції фагоцитозу.

Середовища культивування, до складу яких входили ферментолізати казеїна, забезпечують утворення клітинної маси з вираженою імуностимулюючою дією. Лізати культури L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86 виявляли значно більш виражену здатність до імуностимуляції в порівнянні з продуктами ферментоліза клітин L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 (табл.3).

Гідролізати клітин обох штамів, отримані при культивуванні продуцентів на середовищі MRS, виявляли, як і у випадку визначення протипухлинної дії, мінімальну імунологічну активність.

Таблиця 3

Імуностимулюючий ефект лізатів штамів L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 і L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86 в залежності від умов культивування

Середо-вища | Рівень активності при розведенні:

10-5 | 10-6 | 10-7

1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2

Фермен-толізат казеїну | + + | + + | + + + | + + + + | + + | + +

Фермен-толізат соєвого борошна | + | + + | + | + + | + | +

Суміш фермен-толізат | - | + + | + | + + + | + | +

MRS | - | + | + | + | - | + +

Імуностимулюючий ефект перевіряли методом визначення індекса стимуляції фагоцитів.

Примітка: 1. L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51; 2. L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86

Позначення: (-) відсутність стимулюючого ефекта; (+) слабкий стимулюючий ефект; (++) середній стимулюючий ефект (+++) сильний стимулюючий ефект (++++) дуже сильний стимулюючий ефект.

В той же час, показник антагоністичної активності виявив найменшу залежність від складу середовища культивування.

Таким чином, проведені експерименти дозволили одержати порівняльні характеристики двох варіантів штамів-продуцентів, що володіють комплексом цінних біологічних властивостей, визначити технологічні умови і параметри, що впливають на їх формування в процесі культивування як у лабораторних, так і у виробничих умовах, показати визначальну роль процесу попередньої обробки джерел сировини і вплив природи ферментативного протеолітичного комплексу.

Дослідження впливу ряду показників на прояви біологічних властивостей лактобактерій

Слід зазначити, що специфіка пробіотиків як “живих ліків” вимагає особливої уваги до проблем, пов'язаних із розробкою рекомендацій лікувального призначення пробіотиків. Ці рекомендації повинні дозволити реалізувати з максимальною повнотою спектр терапевтичної дії кожного штама – продуцента в умовах in vivo.

У зв'язку з цим нами досліджувався вплив окремих показників, що можуть бути присутніми як елементи дієти пацієнта і впливати на реалізацію біотерапевтического потенціалу пробіотичної культури. У якості показників впливу були обрані твін-80 і йодид калію.

Отримані результати підтвердили, насамперед, індивідуальний характер реакції кожного зі штамів, включених до цієї серії експериментів.

Присутність твіна-80 викликала різке гальмування розвитку штама L. dеlbrueckii subsp. bulgaricus 86, зберігаючи цю тенденцію і у сполученні з йодною композицією. Культура L. dеlbrueckii subsp. bulgaricus 51 значно активніше реагувала на внесення цих сполук у середовище, присутність яких практично в два рази інтенсифікувала накопичення біомаси і скоротила фазу експоненційного розвитку з 24 годин до 12-16 годин.

Позитивний вплив цей варіант культивування спричинив і на штам L. acidophilus (К), який істотно прискорював процеси поділу в присутності твіна-80 і іонів йоду.

Цікаво відзначити відмінність реакції штамів L. dеlbrueckii subsp. bulgaricus 86 і L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 на присутність у середовищі твіна-80 і йодної сполуки. Хоча ці штами мають однакове походження, тривалий період спокою для L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 і селекційні навантаження L. dеlbrueckii subsp. bulgaricus 86 призвели до істотних відмінностей у фізіолого-біохімічних реакціях. Це підтверджено великим розходженням ростової активності у відповідь на присутність активуючих чинників. Твін-80 практично не вплинув на динаміку розвитку L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51, тоді як йодний компонент, що стимулював накопичення біомаси практично всіх культур, виявився інгібітором процесу його розвитку.

Найвищого рівня накопичення біомаси досягли штами L. delbrueckii NCDO 213 і L. acidophiluc (K), перевищивши контрольні значення в 1,5-1,8 разив.

Динаміка зміни кислотності всіх штамів у певній мірі корелює з динамікою росту і зміни рН на кожному з середовищ.

Дослідження динаміки зміни рівня білка в супернатантній рідині штамів лактобактерій на різних модифікаціях середовища MRS показало їх індивідуальний характер.

Загальним для усіх варіантів середовищ і культур був хвилеподібний характер зміни вмісту білка в культуральних рідинах.

Цікаво відзначити, що, незважаючи на завершення процесів росту всіх культур в межах 16-20 години, зміни концентрації білкових сполук спостерігалися й у наступні години культивування, виявляючи індивідуальний характер.

Вплив твіна-80 і йодида калію на антагоністичну активність штамів лактобактерій

Дослідження залежності антагоністичного потенціалу штамів лактобактерій від складу поживного середовища показало, що для штаму L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 присутність іонів йоду підсилювала пригнічення росту Staphylococcus aureus УКМ В 4001 (табл.4-5).

Сполучення йоду і твіну-80 приводило до ще більш вираженого гальмування його росту. Іони йоду чинили подібну дію на культуру L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86 і L. delbrueckii NCDO 213.

У той же час у L. acidophilus (К) утворення антагоністичного комплексу, який активно пригнічує розвиток Staphylococcus aureus УКМ В 4001 відбувалось в присутності твіна-80. Слабкий ріст починав виявлятися тільки при 8- кратному розведенні культуральної рідини. Наявність іонів йоду в середовищі MRS приводила до деякої втрати антагоністичної активності.

Дещо інший характер прояву антагоністичних властивостей спостерігався у відношенні грамнегативної тест-культури Escherichia coli УКМ В-906. Штам L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51, в умовах росту на середовищі MRS, при внесенні йодної сполуки і сполучення її з твіном-80 виявився здатний до утворення високоактивного антагоністичного комплексу.

Таблиця 4

Антагоністична активність штамів лактобактерій відносно Staphylococcus aureus УКМ В 4001 на модифікованих середовищах MRS

Штами лакто-бактерій | Ріст тест-культури S.aureus УКМ В 4001 на різних разведеннях супернатанта

MRS | MRSt | MRSj | MRSjt

1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16

1 | - | ++ | ++ | ++ | - | ++ | ++ | ++ | - - | + | ++ | ++ | - - | - - | ++ | ++

2 | - - | - - | ++ | ++ | - - | - | ++ | ++ | - - | - - | - | ++ | - - | - - | ++ | ++

3 | - - | - | ++ | ++ | - - | - - | ++ | ++ | - - | - - | - | ++ | - - | - - | ++ | ++

4 | - | ++ | ++ | ++ | - - | - - | - | ++ | - - | - | ++ | ++ | - - | - - | + | ++

Примітка: 1. L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51; 2. L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86;

3. L. delbrueckii NCDO 213; 4. L. acidophilus (K)

Позначення: “- - ” відсутність росту; “- ” слабкий ріст; “+ ” середній ріст; “++ ” сильний ріст.

Таблиця 5

Антагоністична активність штамів лактобактерій по відношенню до Escherichia coli УКМ В-906 на модифікованих середовищах MRS

Штами лакто-бактерій | Рsст тест-культури Escherichia coli УКМ В-906 на різних розведеннях супернатанту

MRS | MRSt | MRSj | MRSjt

1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16

1 | + | ++ | ++ | ++ | - | ++ | ++ | ++ | - - | - | ++ | ++ | - - | - - | - | ++

2 | - - | - - | ++ | ++ | - - | - - | ++ | ++ | - - | - - | ++ | ++ | - - | - - | ++ | ++

3 | - - | - | + | ++ | - - | - - | + | ++ | - - | - - | - | ++ | - - | - - | - | ++

4 | - | ++ | ++ | ++ | - - | - - | - | ++ | - - | - | ++ | ++ | - - | - - | - | ++

Примітка: 1. L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51; 2. L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86;

3. L. delbrueckii NCDO 213; 4. L. acidophilus (K)

Позначення: “- - ” відсутність росту; “- ” слабкий ріст; “+ ” середній ріст; “++ ” сильний ріст.

У той же час, культура L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86 не змінила характеристики антагоністичної дії, зумівши зберегти однаковий рівень активності на усіх варіантах середовищ.

Таким чином, отримані нами дані продемонстрували можливість істотної зміни антагоністичної активності (у 4-8 рази) пробіотичних штамів.

Подібне явище служить ще одним підтвердженням необхідності проведення глибоких досліджень біологічних властивостей лактобактерій і встановлення рівня їх стабільності при розробці технологій одержання пробіотиків як медичних препаратів.

Літична чутливість штамів лактобактерій у значній мірі залежала від складу середовища культивування. Чутливість до ферментного комплексу культур - L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51, L. acidophilus (К), L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86 була значно вище на модифікованих середовищах, ніж на вихідному середовищі MRS.

Виняток становив штам L. delbrueckii NCDO 213, для якого твін-80 і “йодіс”, навпаки, призвели до зменшення відсотка лізису в порівнянні з контролем (рис.7).

Рис.7. Залежність літичної чутливості штамів лактобактерій від умов культивування на модифікованих середовищах MRS

Отримані дані свідчать про те, що чутливість клітин молочнокислих бактерій до дії літичних ферментів визначається не тільки видовими відмінностями в структурі їх клітинних стінок, але і залежить від наявності індукуючих факторів у ростовому середовищі, які впливають на формування поверхневих структур клітини.

Таким чином, отримані нами результати комплексного дослідження властивостей ряду культур молочнокислих бактерій, проведені з метою створення ефективного біотехнологічного процесу одержання на їх основі біопрепаратів, у тому числі і пробіотиків, дозволили розробити технологічні рекомендації для включення в нормативно – технічну документацію на виробництво біомаси L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 і L. delbrueckii subsp. bulgaricus 86.

Крім того, вони включені у вихідні дані розробки рекомендацій щодо застосування пробіотичних