Міністерство освіти і науки України

Таврійський національний університет ім. В.І. Вернадського

Гідулянов Антон Олександрович

УДК547.963.4:577

ПОРІВНЯЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ГЕМОГЛОБІНІВ ТА ПОКАЗНИКІВ ЕРИТРОЦИТАРНОГО МЕТАБОЛІЗМУ У ПРЕДСТАВНИКІВ КЛАСУ ССАВЦІВ І КЛАСУ РИБ

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Сімферополь - 2004

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у Таврійському національному університеті

ім. В.І. Вернадського Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Коношенко Світлана Володимирівна

Таврійський національний університет

ім. В.І. Вернадського, завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, член-кор. НАН України

Шульман Георгій Євгенович

Інститут біології південних морів

ім. О.О. Ковалевського, завідувач відділу фізіології тварин і біохімії

доктор медичних наук, професор

Кірюхін Ігор Федорович

Кримський державний медичний університет

ім. С.І. Георгієвського, професор кафедри біохімії

Провідна установа

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, кафедра біохімії

Захист відбудеться “12“ січня 2004 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 52.051.04 у Таврійському національному університеті ім. В.І. Вернадського (пр. Вернадського, 4, м. Сімферополь, 95007) у конференц-залі.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського (пр. Вернадського, 4, м. Сімферополь, 95007)

Автореферат розіслано “ 9 ” грудня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук В. С. Мартинюк

Актуальність теми. Дані молекулярної еволюції дозволяють нам глибше зрозуміти філогенетичні закономірності розвитку органічного світу. Результати всебічного вивчення гетерогенних систем білків набувають загальнобіологічну значимість, оскільки дозволяють судити про специфіку процесів адаптації на рівні окремих молекул, взаємозалежності структури і функції біополімерів, молекулярних основах біохімічної еволюції живого. Гетерогенна система гемоглобіну служить надзвичайно зручною моделлю для філогенетичних і біологічних досліджень, про що говорять численні публікації, присвячені цьому білку (Алякринська І.О., 1979; Алякринська І.О., 1986; Горбенко М. П., 1996; Алякринська І.О., 1996).

Одним із важливих і актуальних аспектів вивчення гемоглобіну є вивчення його структурних властивостей у тварин, які знаходяться на різних рівнях еволюційних етапів. Це дозволяє не тільки оцінити, які зміни параметрів внутрішньомолекулярної структури відбувалися в результаті філогенезу даного класу тварини, але й який вплив здійснювали на його функціональну активність. Стан перекисного окислення та антиоксидантної системи у пойкілотермних тварин вивчено значно менше у порівнянні з гомойотермними. Оскільки більшість досліджень перекисного окислення ліпідів стосується ссавців, цікаво порівняти ці результати з отриманими для риб із метою більш глибокого розуміння процесів пероксидації як у гідробіонтів, так і у наземних хребетних (Бобкова А.Н., 1997; Грубінко В.В., Леус Ю.В., Арсан О.М., 1996; Грубінко В.В., Леус Ю.В., 2001). Практично не вивчені філогенетичні особливості процесів пероксидації в еритроцитах. Вплив активованих кисневих метаболітів на молекулу гемоглобіну вивчено недостатньо. У зв'язку з цим вивчення впливу АФК на цей гемопротеїн як в умовах іn vіtro, так і іn vіvo представляється дуже важливим і актуальним завданням. Немає даних про процеси окислювальної модифікації гемоглобінів у представників різних класів хребетних і залежності цих процесів від характеру внутрішньомолекулярної структури гемоглобінів. Вивчення еритроцитарного метаболізму у філогенетичному аспекті також є важливим, оскільки дослідження в цьому напрямку можуть дозволити краще зрозуміти механізми молекулярної еволюції, взаємозв'язок обмінних процесів в еритроцитах, та їх вплив на структурно-функціональний стан гемоглобіну (Маслова М.Н., Солдатов А.А., Тавровська Т.В., 1988; Маслова М.Н., Тавровська Т.В., 1991).

Зв'язок роботи з програмами і планами, темами.

Дана робота є продовженням багаторічних досліджень із порівняльно-еволюційного вивчення білків крові, у тому числі і гемоглобіну, що проводяться на кафедрі біохімії Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського. Номер держреєстрації 0101U005237.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було дати філогенетичну оцінку розходжень у структурних параметрах гемоглобіну, інтенсивності процесів пероксидації та активності антиоксидантної системи, а також процесів утилізації глюкози в еритроцитах у представників двох класів хребетних - ссавців і риб.

При цьому було необхідно вирішити наступні задачі:

1. Вивчити ступінь гідрофобності центральних ділянок молекул гемоглобінів і охарактеризувати загальний об'єм їхніх гідрофобних порожнин.

2. Вивчити інтенсивність процесів пероксидації ліпідів (ПОЛ) у плазмі крові, мембранах і гемолізаті еритроцитів.

3. Вивчити активність антиоксидантних ферментів (супероксид-дисмутази, каталази і глутатіонредуктази) у гемолізаті еритроцитів.

4. Вивчити вміст карбонільних похідних гемоглобінів та оцінити стійкість гемоглобінів до окислювальної модифікації в умовах ініціації процесів окислювання іn vіtro.

5. Визначити можливий взаємозв'язок між ступенем окислювальної модифікації гемоглобіну та його структурних параметрів.

6. Вивчити активність гексокінази і глюкозо-6-фосфат-дегідрогенази в еритроцитах.

7. Вивчити концентрацію гемоглобіну, метгемоглобіну і рівень його глікозильованої форми в еритроцитах хребетних.

Об'єкт дослідження. Філогенетичні особливості структури гемоглобіну та еритроцитарного метаболізму у окремих представників класу риб і класу ссавців. Предметом дослідження стали структурні параметри гемоглобіну, їх окислювальна модифікація, стан антиоксидантної системи в еритроцитах і процесів перекисного окислення ліпідів у плазмі, мембрані і гемолізаті еритроцитів, внутрішньоеритроцитарний метаболізм глюкози.

Для вирішення поставлених задач було застосовано наступні методи дослідження: фізико-хімічні (флуоресцентна спектрометрія, солюбілізація бензолу білком), біохімічні (активність ферментів, зміст метаболітів, продуктів ПОЛ і окислювальної модифікації гемоглобіну), статистичні методи. Математичну обробку результатів проводили за допомогою стандартних методів статистики.

Наукова новизна роботи полягає в тому, що вперше подано порівняльний аналіз параметрів внутрішньомолекулярної структури головних і мінорних фракцій гемоглобінів окремих представників класу ссавців і риб, що характеризують рівень гідрофобності і щільність упакування білкових макромолекул.

Уперше вивчено рівень продуктів окислювальної модифікації в головних фракціях гемоглобінів досліджених видів хребетних, стійкість головних фракцій гемоглобінів до окислювальної модифікації в умовах її ініціації іn vіtro.

Уперше показано зв'язок окислювальної модифікації гемоглобінів із характером їхньої внутрішньомолекулярної структури.

Дано порівняльний аналіз стану процесів пероксидації ліпідів у плазмі крові, мембранах і гемолізаті еритроцитів окремих представників пойкілотермних і гомойотермних хребетних. Вивчено стан антиоксидантної системи в гемолізаті еритроцитів.

Уперше зроблено порівняльну оцінку окремих показників обміну глюкози в еритроцитах представників класу ссавців і класу риб. Встановлено зв'язок обміну глюкози з перекисним окисленням ліпідів в еритроцитах.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів.

Результати досліджень не тільки доповнюють, але й поширюють існуючі уявлення про молекулярну еволюцію, про взаємозв'язок окремих молекулярних систем та біохімічних процесів у таких спеціалізованих клітинах, як еритроцити. Можливе їх застосування у біохімічній систематиці. Отримані результати рівня процесів пероксидації та антиоксидантної системи в плазмі крові і еритроцитах хребетних тварин можуть бути використані для еколого-біохімічного тестування і моніторингу стану особин. Матеріали дисертації використовуються при викладанні спецкурсів “Біохімія крові", "Біохімія вуглеводів і ліпідів", "Структурно - функціональні властивості білків" і "Структурна організація і функції біомембран".

Особистий внесок. Автор самостійно провів досліди на біологічному матеріалі. Обговорення і аналіз результатів дослідження проведені за участю наукового керівника. Дисертант самостійно провів статистичну обробку результатів досліджень, аналіз літературних джерел. Здобувачем самостійно написані всі розділи дисертації та автореферат.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень і основні положення роботи були представлені і обговорені на щорічних наукових конференціях професорсько-викладацького складу Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського (2001-2003 р.), науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження акад. І.Н. Буланкіна (Харків, 2001), на Х, ХІ і XІІ Міжнародних симпозіумах “Нетрадиційне рослинництво. Еніологія. Екологія і здоров'я" (2001, 2002, 2003 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 наукових робіт
(5 статті у фахових виданнях, а також 5 тез доповідей).

Структура і обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 171 стор. тексту і складається з 4 розділів, у яких представлене огляд літератури, об'єкт, предмет і методи досліджень, експериментальні результати та їх обговорення, завершення і висновки, а також список літератури, який складається із 399 джерел, 146 з яких на іноземній мові. Роботу ілюстровано 27 рисунками і 7 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми, визначено мету та завдання дослідження, розкрито наукову новизну і практичне значення роботи, особистий внесок здобувача, наведено інформацію про апробацію результатів дослідження.

У розділі „Огляд літератури" проаналізовано і узагальнено наукові дані про структуру гемоглобіну, еволюції цього білка, процесів пероксидації як ліпідів, так і білків, станів антиоксидантної системи клітини в нормі.

У розділі „Матеріали і методи" обґрунтовано і розкрито методи дослідження та статистичного аналізу.

В експериментах використовували кров окремих представників двох класів хребетних.

Клас ссавців: людина (Homo sapiens), бик (Bos taurus), свиня (Sus scrofa). Клас кісткові риби: короп (Cyprinus carpio), карась(Carassius auratus gibelio), судак (Lucioperca lucioperca).

У кожній видовій групі класу було не менше 30 ти особин.

Матеріалом досліджень були плазма крові, мембрани і гемолізат еритроцитів, а також головні і мінорні фракції гемоглобінів. Гемоглобін виділяли з еритроцитів за методом Драбкіна (Drabkin, 1949), але без толуола, щоб попередити утворення метгемоглобіну. Концентрацію гемоглобіну в гемолізатах визначали уніфікованим геміглобінціанідним методом, який використовується в практиці клінічної біохімії. Електрофоретичну гетерогенність гемоглобінів визначали методом диск-електрофорезу в
7%-му поліакріламідному гелі (Davis, 1964). Електрофоретично гомогенні фракції гемоглобінів виділяли за допомогою препаративного електрофорезу в блоках 7% ПААГ, використовуючи спеціально виготовлені камери (Ажицький М. Ю., Багдасарьян С.Н., 1975). Аналіз чистоти і гомогенності препаративно виділених фракцій проводили методом аналітичного електрофорезу в 7% ПААГ (Davis, 1964). Визначення кількісного вмісту метгемоглобіну проводили ціанметгемоглобіновим методом (Кушаковський, 1970). Кількісній вміст глікозильованої форми гемоглобіну визначали колориметричним методом (Данилова, Лопатіна, 1986). Кількісне визначення вмісту аденозінтрифосфата у гемолізаті еритроцитів проводили за методом як описано (Алейникова Т.А., Рубцова М. В., 1988). Визначення активності гексокінази спектрофотометричним методом (Кочетов М.А., 1980). Визначення активності каталази проводили за методом як описано (Королюк М.А., Іванова Л.І., Майорова И.Г. та ін., 1988). Визначення активності супероксид-дисмутази проводили за (Nishikimi M., Rao N.A., Yagi K., 1972). Визначення активності глутатіонредуктази проводили за методом як описано (Юсупова Л.Б., 1989). Визначення активності глюкозо-6-фосфат-дегідрогенази проводили спектрофотометричним методом як описано (Кочетов М. А., 1980). Одержання еритроцитарних мембран проводили за методом Сербінової Т.А. (1980). Первинні продукти перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) (дієнові кон'югати і кетони) оцінювали за методом Плацер З. у модифікації Гаврилова В.Б. і Мішкорудної М.Л., (1983); вміст вторинних продуктів ПОЛ (ТБК-активних продуктів) за реакцією з тіобарбітуровою кислотою (Ohkava Н., Ohishi N., Yagi K., 1979). Визначення загальних ліпідів проводили за методом як описано (Покровський А.А., 1969). Загальний об'єм гідрофобних порожнин у гемоглобінах визначали методом солюбілізації вуглеводню за методом Ізмайлової В.Н. і Ребіндер П.А. (1974). Внутрішньомолекулярну гідрофобність гемоглобінів оцінювали за інтенсивністю флуоресценції зонда N-фенілнафтіламіну (ФНА) за методом як описано (Остоловський Е.М., Боцянський А.Д., Задорожний Б.А., 1988). Окислювальну модифікацію фракцій гемоглобінів вивчали без ініціації та з ініціацією окислювальних процесів за методом, описаним в літературі (Дубініна Е.Е., Бурмістров С.О., Ходов Д.А., Поротов І.Г., 1995). Цифрові дані, які одержували в результаті досліджень, статистично обробляли за методом малих вибірок (Бейлі, 1964). Для встановлення тісноти взаємозв'язку між двома показниками визначали коефіцієнт кореляції (r).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Зміст загальних ліпідів і продуктів їх перекисного окислення в плазмі, мембранах і гемолізаті еритроцитів окремих представників класу ссавців і класу риб

Як показали наші дослідження, у вмісті загальних ліпідів і продуктів перекисного окислення в плазмі, мембранах і гемолізаті еритроцитів окремих представників класу ссавців і класу риб простежується видова специфічність (таблиця 1). Так, якщо в плазмі крові представників ссавців вміст загальних ліпідів варіює в межах від 1,85-2,98 мг/мл, то в плазмі риб концентрація загальних ліпідів помітно вища і варіює від 2,99 до 8,42 мг/мл. У групі представників ссавців мембрани еритроцитів людини бика і свині характеризувалися практично однаковим рівнем вмісту загальних ліпідів (1,25 мг/мл, 1,47 мг/мл і 1,52 мг/мл). Цей факт представляє істотний інтерес оскільки, свідчить про вияв консервативної дії природного добіру, спрямованої на підтримку оптимального структурно-функціонального статусу еритроцитарних мембран. Вміст загальних ліпідів у мембранах еритроцитів вивчених риб характеризується видовою специфічністю і варірює в діапазоні 1,33 мг/мл - 3,61 мг/мл. Згідно з отриманими даними в гемолізаті еритроцитів представників класу риб концентрація загальних ліпідів у середньому в 6 раз менше в порівнянні з ссавцями. Однак в межах класів діапазон відмінностей невеликий.

Визначення первинних продуктів перекисного окислення ліпідів у плазмі крові відповідних представників ссавців показало, що рівень їх вмісту характеризується близькими величинами. У групі представників класу риб рівень гідроперекисів у плазмі крові знаходився практично на одному рівні у коропа і судака та в два рази менше значення даного показника відзначено для плазми крові карася.

У групі представників ссавців в еритроцитах людини вміст гідроперекисів в 3,8 разів вище в мембранах і в 2 рази нижче в гемолізаті в порівнянні з еритроцитами бика і свині, і ці відмінності носять реципрокний характер із високим рівнем негативної кореляції (r= -0,95). Даний факт представляє інтерес, оскільки свідчить про можливість функціонування певного регуляторного механізму, який підтримує динамічну рівновагу між процесами ПОЛ всередині еритроцитів і в їх мембранах. При визначенні вмісту гідроперекисів у мембранах і гемолізаті риб виявилося, що характер змін показників повторюється для всіх трьох вивчених видів риб. Максимальні величини відзначені для карася, мінімальні для коропа.

Таблиця 1

Концентрація загальних ліпідів, гідроперекисів і ТБК-активних продуктів перекисного окислення ліпідів в плазмі крові, мембранах еритроцитів і гемолізаті еритроцитів окремих представників класу ссавців і класу риб (n=30, M±m)

Об'єкт дослідження | Загальні ліпіди

мг/мл | Гідроперекиси

ум.од/мг.ліпідів | ТБК-активні продукти

ум.од/мг.ліпідів

ПЛАЗМА КРОВІ

Людина | 2,98±0,042 | 0,075±0,011 | 0,043±0,0012

Бик | 2,42±0,018 | 0,056±0,004 | 0,017±0,0023

Свиня | 1,85±0,019 | 0,037±0,003 | 0,037±0,0016

Короп | 2,99±0,26 | 0,258±0,006 | 0,070±0,007

Карась | 8,42±0,36 | 0,120±0,006 | 0,043±0,0023

Судак | 7,05±0,23 | 0,269±0,004 | 0,032±0,002

МЕМБРАНИ ЕРИТРОЦИТІВ

Людина | 1,25±0,032 | 0,27±0,07 | 0,069±0,0025

Бик | 1,47±0,027 | 0,062±0,008 | 0,068±0,0024

Свиня | 1,52±0,028 | 0,080±0,0011 | 0,133±0,0027

Короп | 2,95±0,090 | 0,143±0,005 | 0,128±0,0028

Карась | 3,61±0,095 | 0,364±0,005 | 0,214±0,0024

Судак | 1,33±0,075 | 0,236±0,011 | 0,229±0,011

ГЕМОЛІЗАТ ЕРИТРОЦИТІВ

Людина | 2,85±0,012 | 0,098±0,002 | 0,153±0,010

Бик | 1,18±0,011 | 0,198±0,008 | 0,264±0,0023

Свиня | 1,56±0,027 | 0,175±0,02 | 0,175±0,0072

Короп | 0,44±0,045 | 0,88±0,021 | 0,542±0,036

Карась | 0,267±0,025 | 1,83±0,041 | 1,57±0,096

Судак | 0,22±0,021 | 1,56±0,035 | 1,168±0,079

Загалом, простежується добре виражена залежність інтенсивності реакцій ПОЛ від видової приналежності ссавців і риб, про що свідчать показники вмісту продуктів пероксидації в плазмі, мембранах і гемолізаті еритроцитів. Показано, що у людини виявляється найбільш високий вміст продуктів ПОЛ і корелююче з цим найбільш низький вміст загальних ліпідів у мембранах еритроцитів. У бика, свині, коропа і судака подібна залежність простежується у відповідних показниках гемолізата. Становлять інтерес дані отримані при вивченні ПОЛ у мембранах еритроцитів карася: при високому вмісті продуктів пероксидації ліпідів відзначено високий рівень вмісту загальних ліпідів. Ці дані можуть свідчити про одну з видових особливостей еритроцитарних мембран людини і карася: підтримка певного рівня ліпідів при порівняно високій інтенсивності протікаючих в них реакцій ПОЛ, що може бути зумовлено високою швидкістю оновлення ліпідного біслоя еритроцитарних мембран.

Аналізуючи отримані дані можна зробити висновок про те, що простежується чітко виражена філогенетична особливість протікання реакцій пероксидації, що виявляється в стабільному переважанні рівня гідроперекисів у плазмі, мембранах і гемолізаті еритроцитів риб у порівнянні з еритроцитами ссавців. Як показали наші дослідження, рівень вмісту ТБК активних продуктів у плазмі, мембранах і гемолізаті еритроцитів загалом вищий у представників класу риб в порівнянні з ссавцями. Крім того, привертає до себе увагу той факт, що збільшення вмісту ТБК активних продуктів йде у напрямі: плазмамембрана еритроцитівгемолізат еритроцитів.

Привертають до себе увагу дані, що відображають рівень ТБК активних продуктів у гемолізаті еритроцитів. Так, простежується чіткий взаємозв'язок між рівнем вмісту гідроперекисів і вторинних продуктів пероксидації. Рівень кореляції для ссавців склав (r= +0,99), для риб (r= +0,48).

Рівень продуктів окислювальної модифікації гемоглобіну в еритроцитах окремих представників хребетних. Як випливає з даних таблиці 2, практично всі головні фракції гемоглобіну представників ссавців і риб містять альдегідні і кетонні угрупування амінокислотних залишків, які взаємодіють з 2,4-динитрофенілгідразином і реєструються при 356 нм і 370 нм (продукти окислювальної модифікації нейтрального характеру) і при 430 нм і 530 нм (продукти окислювальної модифікації основного характеру). Незважаючи на те, що в нашому дослідженні було звернуто увагу в основному на стан окислювальної модифікації головних фракцій гемоглобіну, ми розглядаємо також і 1у мінорну фракцію гемоглобіну коропа, оскільки її вміст від загального становить 35%. Головні фракції гемоглобіну ссавців і риб характеризуються видовими відмінностями за вмістом продуктів окислювальної модифікації.

Аналізуючи отримані дані можна зазначити, що серед узятих представників класу ссавців найбільшим вмістом продуктів окислювальної модифікації характеризується гемоглобін людини, причому це характерно як для продуктів нейтрального, так і основного характеру (р<0,05). Заслуговують уваги відмінності у вмісті продуктів окислювальної модифікації, відзначені для гемоглобіну риб. У цьому випадку продукти окислювальної модифікації нейтрального характеру (?=356 нм) не реєструвалися в головній фракції гемоглобіну карася і 1й мінорній фракції гемоглобіну коропа. Звертає на себе увагу той факт, що в порівнянні з гемоглобінами ссавців, для яких характерно переважання продуктів окислювальної модифікації нейтрального характеру, у представників класу риб є гемоглобіни як з переважанням продуктів окислювальної модифікації нейтрального характеру: короп (2,049 од.опт.пл і 0,530 од.опт.пл) і судак (0,505 од.опт.пл і 0,135 од.опт.пл), так і фракції з переважанням продуктів окислення основного характеру: карась (0,376 од.опт.пл і 0,097 од.опт.пл) і 1а мінорна фракція гемоглобіну коропа (0,260 од.опт.пл і 0,041 од.опт.пл).

Таблиця 2

Вміст продуктів окислювальної модифікації гемоглобіну в еритроцитах окремих представників класу ссавців і класу риб (од.опт.пл) (M±m)

Об'єкт дослідження | 356нм | 370нм | 430нм | 530нм

Головна фракція Hb людини | 0,374±0,0032 | 0,382±0,0024 | 0,206±0,0022 | 0,046±0,0020

Головна фракція Hb бика | 0,080±0,0024 | 0,088±0,0011 | 0,072±0,0033 | 0,024±0,0010

Головна фракція Hb свині | 0,098±0,0056 | 0,116±0,0032 | 0,101±0,0049 | 0,018±0,0022

Головна фракція Hb коропа | 2,049±0,0023 | 0,530±0,0037 | 0,157±0,0036 | 0,039±0,0064

Головна фракція Hb карася | --- | 0,327±0,0038 | 0,376±0,0076 | 0,097±0,0058

Головна фракція Hb судака | 0,505±0,0023 | 0,135±0,0025 | 0,032±0,0011 | 0,016±0,0023

1а мінорна фракція Hb коропа | --- | 0,280±0,0044 | 0,260±0,0062 | 0,041±0,0047

Загалом у групі риб більш високий сумарний вміст окислювальних продуктів нейтрального характеру виявлений в Hb коропа. Найбільш високий рівень продуктів окислювальної модифікації основного характеру відзначений для головної фракції гемоглобіну карася. Незважаючи на перекривання значень показників окислювальної модифікації гемоглобіну, простежується добре виражена тенденція до їх переважання у риб у порівнянні з ссавцями.

Рівень продуктів окислювальної модифікації гемоглобіну в умовах ініціація процесів окислення in vitro. З отриманих у цих умовах даних звертають на себе увагу передусім ті, які відображають рівень продуктів окислювальної модифікації основного характеру, що реєструються при довжині хвилі 530 нм (таблиця 3). З цих даних видно, що в головних фракціях гемоглобіну людини і карася вміст відповідних продуктів окислювальної модифікації практично не мінявся в порівнянні з їх рівнем до ініціації окислювальних процесів. Разом із цим, у інших представників хребетних відзначалося помітне зростання вмісту окислювальних продуктів. Так, вміст карбонільних похідних гемоглобінів, що реєструються при 530нм у бика і свині збільшувалося в 2,5 і 1,9 рази відповідно. У гемоглобіні коропа, судака, і в 1й мінорній фракції Hb коропа вміст продуктів окислювальної модифікації збільшився в 1,43; 6,2 і 2,31 рази. Цей факт заслуговує уваги, оскільки в початковому стані гемоглобін людини і карася відрізнявся найбільш високим вмістом продуктів окислювальної модифікації у порівнянні з гемоглобінами інших представників ссавців і риб.

Аналіз даних (таблиця 3), що відображають рівень вмісту карбонільних похідних після ініціювання металкаталізованої окислювальної модифікації показав, що для всіх вивчених фракцій гемоглобіну характерно як збільшення, так і зменшення вмісту аж до відсутності реєстрації продуктів окислювальної модифікації у порівнянні з початковим станом. Можна передбачити, що певні дільниці молекул одного гемоглобіну досягають максимального рівня окислювальної модифікації в еритроцитах, тоді як у інших є резерв амінокислотних залишків, доступних для окислювальних реакцій в умовах їх ініціації.

Таблиця 3

Вміст продуктів окислювальної модифікації гемоглобіну в еритроцитах окремих представників класу ссавців і класу риб в умовах ініціації окислювальних процесів in vitro (од.опт.пл) (M±m)

Об'єкт дослідження | 356нм | 370нм | 430нм | 530нм

Головна фракція Hb людини | 0,192±0,006** | 0,220±0,0068** | 0,192±0,0054** | 0,048±0,0050

Головна фракція Hb бика | 0,097±0,003* | 0,098±0,0040* | 0,127±0,0029* | 0,060±0,0048*

Головна фракція Hb свині | 0,072±0,005** | 0,108±0,0052 | 0,146±0,0074* | 0,034±0,0039*

Головна фракція Hb коропа | ---** | ---** | 0,110±0,0020** | 0,056±0,0023*

Головна фракція Hb карася | --- | ---** | 0,118±0,0058** | 0,090±0,0046

Головна фракція Hb судака | 1,744±0,0023* | 0,288±0,0055* | 0,069±0,0057* | 0,099±0,0016*

1а мінорна фракція Hb коропа | --- | 0,154±0,0028** | 0,352±0,0034* | 0,095±0,0027*

Примітка: *  достовірне збільшення продуктів окислювальної модифікації у порівнянні з початковим станом (р<0,05), ** - достовірне зменшення продуктів окислювальної модифікації у порівнянні з початковим станом (р<0,05).

Характеристика структурних параметрів гемоглобіну. Як випливає з даних в таблиці 4, головні і мінорні фракції гемоглобіну у взятих представників двох класів хребетних характеризуються достовірними філогенетичними відмінностями за інтенсивністю флуоресценції в них зонда N-фенілнафтіламіну (ФНА).

Найбільш високий рівень флуоресценції ФНА показаний для гемоглобіну представників класу риб (p<0,05). При цьому мінорні фракції гемоглобіну риб характеризуються найбільш високим рівнем флуоресценції. Інтенсивність флуоресценції зонда в головних і мінорних фракціях гемоглобіну ссавців знаходиться практично на одному рівні, без достовірних відмінностей між ними.

Таблиця 4

Інтенсивність флуоресценції (F) зонду ФНА і солюбілізація бензолу головними і мінорними фракціями гемоглобіну окремих представників класу ссавців і класу риб (M±m)

Об'єкт дослідження | F, max | Sya

(мл/100мл) | Міра поглинання бензолу білком (N;моль/моль) | Загальний об'єм

гідрофобних порожнин

(V, Е3)

Головна фракція Нb людини | 41,83±3,56 | 0,473±0,039 | 433±15 | 63400±3630

Головна фракція Hb

бика | 39,78±3,13 | 0,533±0,040 | 522±20 | 76389±3840

Головна фракція Hb свині | 41,66±6,64 | 0,414±0,029 | 346±11 | 50562±3300

1а мінорна фракція

Hb людини | 33,63±1,44 | 0,373±0,020 | 287±29,88 | 41928±4363

2а мінорна фракція Hb людини | 44,73±7,47 | 0,459±0,0089 | 414±13,31 | 60584±1944

Мінорна фракція Hb бика | 35,77±2,24 | 0,450±0,021 | 402±32,38 | 58749±4727

Мінорна фракція Hb свині | 35±4,48 | 0,463±0,014 | 423±21,38 | 61815±3070

Головна фракція Hb коропа | 172±1,0 | 0,375±0,004 | 288±5,98 | 42065±873

Головна фракція Hb карася | 187±10,52 | 0,349±0,018 | 250±26,58 | 36512±3908

Головна фракція Hb судака | 177,5±4,17 | 0,384±0,0037 | 302±5,57 | 44149±813

1а мінорна фракція Hb коропа | 184±12,26 | 0,456±0,017 | 408±25,22 | 59594±3683

2амінорна фракція Hb коропа | 320±5,61 | --- | --- | ---

Мінорна фракція Hb карася | 221±6,36 | --- | --- | ---

Мінорна фракція Hb судака | 293±9,25 | --- | --- | ---

Враховуючи, що зонд ФНА є гідрофобним за своєю природою і проникає, в основному, в центральні дільниці білкової глобули, можна передбачити, що центральні дільниці молекул фракцій гемоглобіну риб відрізняються більшою гідрофобністю в порівнянні з аналогічними фракціями гемоглобіну ссавців. Разом з цим, простежується добре виражена консервативність рівня гідрофобності центральних зон молекули гемоглобіну у представників одного і того ж класу хребетних.

Крім рівня внутрішньомолекулярної гідрофобності досліджували також щільність упаковки молекул гемоглобіну, яку оцінювали за загальним об'ємом гідрофобних порожнин, застосувавши метод солюбілізації вуглеводню (бензолу) головними і мінорними фракціями гемоглобіну. Встановлено, що величина зв’язування бензолу вивченими гемоглобінами має видову залежність. Розрахунок середнього значення загального об'єму гідрофобних порожнин білкових молекул показав, що головні фракції гемоглобіну риб характеризуються меншою величиною даного структурного параметру в порівнянні з представниками класу ссавців. Так, якщо у ссавців середнє значення загального об'єму гідрофобних порожнин становить - 63449 A3, то у представників класу риб - 40909 A3. У більш ранніх роботах кафедри на основі даних ЯМР-релаксації в протонних системах показано, що внутрішньомолекулярна динаміка гемоглобіну характеризується філогенетичними особливостями. Зокрема встановлено, що в процесі філогенезу відбувалося закономірне збільшення внутрішньомолекулярної рухливості молекул гемоглобіну хребетних (Коношенко С.В., Байала Іссо, 1994).

На основі представлених результатів можна зробити висновок про те, що в ході еволюції зазнавали однонаправлені зміни такі структурні параметри гемоглобіну, як щільність упакування білкових глобул, так і ступінь їх внутрішньомолекулярної гідрофобності. Порівняльний аналіз отриманих даних дозволив встановити, що у представників класу ссавців простежується добре виражена позитивна кореляція (r= +0,95) між загальним об'ємом гідрофобних порожнин молекул головних фракцій гемоглобіну і рівнем продуктів окислювальної модифікації основного характеру, що реєструються при ?= 530 нм після ініціації окислювальних процесів. У представників класу риб відзначається негативна кореляція між об'ємом гідрофобних порожнин білкових молекул і рівнем продуктів окислювальної модифікації основного характеру, які реєструвалися при ? = 430 нм (r= -0,9) і при ? = 530 нм
(r= -0,95) до ініціації окислювальних процесів.

Таким чином, отримані дані можуть свідчити про те, що процеси окислювальної модифікації гемоглобіну в еритроцитах в певній мірі залежать від структурної організації білка. Оскільки для гемоглобіну ссавців показаний більший об'єм гідрофобних порожнин, а, отже, і менша щільність упакування білкових молекул у порівнянні з гемоглобіном риб, можна передбачити, що в такому гемоглобіні для окислювальної модифікації доступні не тільки поверхневі, але і більш глибокі шари білкової глобули. У зв'язку з цим, цілком очевидно, що менш “компактні" білкові глобули в більшій мірі піддаються впливові активних форм кисня.

Гемоглобіни риб відрізняються як великим рівнем гідрофобності центральних дільниць молекул, так і меншим об'ємом гідрофобних порожнин. Можливо, внаслідок більш “жорсткого" упакування гідрофобних дільниць їх молекул доступними для окислювальної модифікації можуть бути в більшій мірі поверхневі і прилеглі до них “рихлі" шари білкових глобул. Цілком ймовірно, що із збільшенням компактності упакування центральних дільниць гемоглобіну риб зростає об'єм периферичних, найменше гідрофобних і полярних зон білкової глобули, що і створює умови для більш активної окислювальної модифікації амінокислотних залишків, що знаходяться в них.

Вміст гемоглобіну, метгемоглобіну і рівень глікозильованого гемоглобіну в еритроцитах досліджених видів хребетних. Результати дослідження показали, що ссавці характеризуються більш високим вмістом гемоглобіну у порівнянні з представниками класу риб. Дані про вміст глікозильованого гемоглобіну і метгемоглобіну в еритроцитах хребетних представлені в таблиці 5.

Таблиця 5

Вміст загального гемоглобіну, глікозильованого гемоглобіну і

метгемоглобіну в еритроцитах окремих представників класу ссавців і класу риб (n=30, M±m)

Об'єкт дослідження | Гемоглобін, г/л | Глікозильований гемоглобін, % | Метгемоглобін, %

Людина | 140±3,41 | 5,90±0,23 | 3,64±0,1

Бик | 123,54±3,92 | 2,21±0,122 | 7,54±0,60

Свиня | 103,1±3,72 | 3,05±0,14 | 12,94±0,76

Короп | 68,57±1,36 | 2,35±0,1 | 32,31±1,02

Карась | 83,17±4,07 | 3,70±0,156 | 27,46±2,52

Судак | 54,27±3,23 | 2,46±0,17 | 26,15±2,10

Вміст глікозильованого гемоглобіну характеризується видовою специфічністю і не має явно виражених філогенетичних особливостей. Діапазон відмінностей у вмісті глікірованної форми гемоглобіну для ссавців показаний у межах від 2,21% до 5,9%, для представників класу риб - від 2,35% до 3,70%.

Як відомо з літератури, при певних умовах рівноважне зв’язування кисню може переключатись на реакцію безповоротного аутоокисленя Hb до метHb. Цей процес представляє основне джерело кисневих вільних радикалів в еритроциті. При вивченні вмісту метгемоглобіну встановлено, що у ссавців цей показник характеризується значною варіабельністю. У групі риб виявляється менша варіабельність, але більш високий рівень окисленої форми гемоглобіну, який перевершує вміст метгемоглобіну у ссавців в середньому в 3,5 рази (p<0,05).

Активність антиоксидантних ферментів: супероксиддисмутази, каталази і глутатіонредуктази в еритроцитах представників класу ссавців і класу риб. Як показав порівняльний аналіз, активність супероксиддисмутази (СОД) в еритроцитах риб в 1,5 рази вище в порівнянні з еритроцитами ссавців (таблиця 6). Представляє інтерес виражений взаємозв'язок між активністю СОД і вмістом продуктів ліпопероксидації в гемолізаті еритроцитів, які характеризуються чіткими філогенетичними відмінностями. Так, якщо в групі ссавців спостерігається негативна кореляція між активністю СОД і рівнем гідроперекісів (r= -0,98), то в групі риб відзначена позитивна кореляція цих параметрів (r= +1).

При вивченні активності каталази були отримані наступні дані. Активність цього ферменту у людини і бика знаходиться практично на одному рівні: 0,7 мМ/хв на 1М Hb і 0,8 мМ/хв на1М Hb, відповідно. Максимальна активність в групі ссавців спостерігається у свині - 1,44 мМ/хв на 1 М Hb (p<0,05). У групі представників класу риб рівень активності каталази в еритроцитах варіює в широких межах. Активність каталази в еритроцитах судака була достовірно нижче в порівнянні з еритроцитами коропа: 3,64 мМ/хв на 1 М Hb і 4,29 мМ/хв на 1 М Hb, відповідно (p<0,05). Найменша активність ферменту виявляється у карася і практично сумірна з такою у людини і бика- 0,77 мМ/хв на 1 М Hb.

Таблиця 6

Активність ферментів антиоксидантної системи: супероксиддисмутази, каталази і глутатіонредуктази в еритроцитах окремих представників класу ссавців і класу риб (n=30, M±m)

Об'єкт дослідження | Активність
СОД (міра гальмування відновлення тетразолія нітросинього, %) | Активність каталазы

(мМ/хв на 1М Hb) | Активність глутатионредуктази

(моль перетворення НАДФН в 1с на 1М Hb)

Людина | 49,73±3,52 | 0,7±0,024 | 0,575*10-3±0,0257*10-3

Бик | 35±1,93 | 0,8±0,033 | 0,304*10-3±0,0153*10-3

Свиня | 40,80±1,68 | 1,443±0,064 | 0,653*10-3±0,0311*10-3

Короп | 54,74±1,51 | 4,29±0,118 | 0,393*10-3±0,0375*10-3

Карась | 70,10±1,98 | 0,775±0,050 | 2,31*10-3±0,13*10-3

Судак | 65,50±2,15 | 3,64±0,083 | 0,339*10-3±0,017*10-3

Важлива роль в ефективному захисті еритроцитів від активованих кисневих метаболітів відводиться глутатіонзалежній антиоксидантній системі. Центральне місце в метаболізмі глутатіону і всієї його системи займає фермент глутатіонредуктаза (Барабой В.А., Сутковой Д.А., 1997). Згідно з проведеними дослідженнями в групі ссавців мінімальна активність ферменту виявлена в еритроцитах бика (0,304*10-3 М НАДФН в 1с/1М Нb) (p<0,05), значення активності ферменту у людини і свині були близькі і не мали вірогідних відмінностей (0,575*10-3 і 0,653*10-3 НАДФН в 1с/1М Нb, відповідно). При визначенні активності глутатіонредуктази у риб виявилося, що її активність у коропа і судака знаходиться практично на одному рівні (0,393*10-3 і 0,339*10-3 М НАДФН в 1с/1М Нb) і сумірна з такою у ссавців. Звертають на себе увагу цікаві дані отримані при визначенні активності глутатіонредуктази в еритроцитах карася. Активність ферменту була майже в 10 раз більш висока в порівнянні з іншими дослідженими представниками хребетних і становила 2,31*10-3 М НАДФН в 1с/1М Нb.

Активність гексокінази, глюкозо-6-фосфат-дегідрогенази і вміст АТФ в еритроцитах окремих представників хребетних. Як свідчать результати досліджень, активність гексокінази в еритроцитах риб загалом є більш високою в порівнянні з еритроцитами ссавців, хоч і незначно (таблиця 7).

Таблиця 7

Активність ферментів обміну глюкози: гексокінази і глюкозо-6-фосфат-дегідрогенази в еритроцитах окремих представників класу ссавців і класу риб (n=30, M±m)

Об'єкт дослідження | Активність гексокінази, нмоль/мл·хв. | Активність глюкозо-6-фосфат- дегідрогенази, нмоль/мл·хв. | АТФ, мг% Фн

Людина | 1,9±0,016 | 0,062±0,0049 | 0,55±0,051

Бик | 2,37±0,085 | 0,057±0,0036 | 0,69±0,053

Свиня | 2,48±0,080 | 0,041±0,0043 | 0,79±0,052

Короп | 2,78±0,121 | 0,117±0,0058 | 1,093±0,056

Карась | 2,63±0,098 | 0,201±0,0061 | 1,024±0,050

Судак | 2,58±0,055 | 0,121±0,0075 | 1,017±0,039

Визначення концентрації АТФ показало, що в еритроцитах риб концентрація цієї макроергічної сполуки більше, ніж у ссавців, в середньому, в 1,5 рази. Спостерігається позитивна кореляція між вмістом АТФ і рівнем активності гексокінази в еритроцитах хребетних. Рівень кореляції для ссавців склав (r= +0,97), для риб (r= +0,98). Відсутність чітко виражених видових відмінностей в активності гексокінази може свідчити про вияв консервативної дії природного добіру, що доводить значущість даного ферменту в забезпеченні нормального функціонального статусу еритроцитів. Крім гліколітичного шляху Ембдена-Мейергофа-Парнаса в еритроцитах має місце утилізація глюкози, що йде шляхом пентозофосфатного циклу. Нами показано переважання активності глюкозо-6-фосфат-дегідрогенази в еритроцитах риб в порівнянні з ссавцями (в середньому 2,76 рази). Великий інтерес представляє прямий взаємозв'язок, що спостерігається між рівнем продуктів пероксидації ліпідів у гемолізаті еритроцитів і активністю глюкозо-6-фосфат-дегідрогенази. У представників класу риб ця залежність має більш високий рівень.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що процеси пероксидації і стан антиоксидантного захисту в еритроцитах окремих представників класу риб і класу ссавців мають певний зв'язок із внутрішньоеритроцитарним метаболізмом глюкози і характеризуються видовою і філогенетичною специфічністю.

2. Показано перевагу рівня гідроперекисів і ТБК-активних продуктів у плазмі крові, мембранах і гемолізаті еритроцитів риб у порівнянні із ссавцями. Для всіх досліджених видів хребетних збільшення вмісту ТБК-активних продуктів спостерігається у напрямку: плазмамембрани еритроцитів гемолізат еритроцитів.

3. Встановлено, що всі досліджені гемоглобіни піддаються окислювальної модифікації. У більшій мірі ці процеси здійснюються в еритроцитах представників класу риб. Показано, що процеси окислювальної модифікації гемоглобінів, деякою мірою, залежать від характеру їхньої внутрішньомолекулярної структури.

4. Показано добре виражену консервативність рівня гідрофобності центральних зон молекули гемоглобінів у межах одного класу хребетних. Гемоглобіни риб відрізняються більшою щільністю упакування центральних ділянок молекули і меншим об’ємом гідрофобних порожнин у порівнянні з гемоглобінами ссавців, що характеризуються великим об’ємом гідрофобних порожнин і меншою гідрофобністю зон сорбції ФНА.

5. Встановлено, що еритроцити ссавців характеризуються більшим вмістом гемоглобіну у порівнянні з еритроцитами риб. Процес неферментативного глікозилювання гемоглобіну має універсальний характер. У низці вивчених хребетних найбільш значним вмістом метформи гемоглобіну характеризуються еритроцити риб.

6. У порівнянні із ссавцями еритроцити риб характеризуються більш високим рівнем активності антиоксидантних ферментів (супероксиддисмутази і каталази). Встановлено філогенетичні особливості залежності активності супероксиддисмутази від вмісту гідроперекисів у гемолізаті еритроцитів. Для представників класу риб залежність даних біохімічних показників має прямий характер, тоді як для представників класу ссавців - зворотний.

7. Для еритроцитів риб показана порівняно висока інтенсивність процесів утилізації глюкози. Актівність гексокінази і глюкозо-6-фосфат-дегідрогенази і рівень АТФ в еритроцитах риб вище у порівнянні з еритроцитами ссавців.

СПИСОК ПРАЦЬ,
ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гидулянов А.А., Коношенко С.В. Сравнительная характеристика показателей перекисного окисления липидов в плазме крови, в мембранах и гемолизате эритроцитов у представителей класса млекопитающих // Ученые записки ТНУ. – 2001. – Т.14(53),№1. – С.60 – 64.

2. Гидулянов А.А., Коношенко С.В. Зависимость окислительной модификации гемоглобинов отдельных представителей класса млекопитающих от характера их внутримолекулярной структуры // Ученые записки ТНУ. – 2001. – Т.16(55),№1. – С.52 – 54.

3. Гідулянов А.О., Коношенко С.В. Внутрішньомолекулярна структура та окиснювальна модифікація головних фракцій гемоглобінів окремих представників ссавців // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. – 2002. – №4(20). – С.10 – 14.

4. Коношенко С.В., Гидулянов А.А. Зависимость окислительной модификации гемоглобина от его внутримолекулярной структуры и перекисного окисления липидов в эритроцитах // Труды крымского государственного медицинского университета им. С.И. Георгиевского /Проблемы, достижения и перспективы развития медико – биологических наук и практического здравоохранения / – 2001. – Т.137,№1. – С.193 – 196.

5. Коношенко С.В., Гидулянов А.А. Внутримолекулярная структура и окислительная модификация главных фракций гемоглобинов отдельных представителей млекопитающих и рыб // Біополімери і клітина. – 2003. – Т.19,№6. – С.521 – 525.

6. Гидулянов А.А., Коношенко С.В. Сравнительная характеристика показателей перекисного окисления липидов в плазме крови, в мембранах и гемолизате эритроцитов у представителей класса рыб и млекопитающих // Материалы Х международного симпозиума “Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология и здоровье”. Алушта. – 2001. – С.907 – 908.

7. Гидулянов А.А., Коношенко С.В. Исследование структуры главных фракций гемоглобинов отдельных представителей позвоночных // Материалы ХI международного симпозиума “Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология и здоровье”. Алушта. – 2002. – С.773 – 774.

8. Гидулянов А.А., Коношенко С.В. Внутримолекулярная гидрофобность и окислительная модификация главных фракций гемоглобинов отдельных представителей млекопитающих // Труды научной конференции, посвященной 100 – летию со дня рождения акад. И.Н.Буланкина. Харьков. – 2001. – С.34 – 35.

9. Гидулянов А.А., Коношенко С.В. Активность гексокиназы, глюкозо – 6 – фосфат – дегидрогеназы и содержание АТФ в эритроцитах млекопитающих и рыб // Материалы ХII международного симпозиума “Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология и здоровье”. Алушта. – 2003. – С.862 – 864.

10. Гидулянов А.А., Коношенко С.В. Активность супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионредуктазы в эритроцитах млекопитающих и пресноводных рыб // Материалы ХII международного симпозиума “Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология и здоровье”. Алушта. – 2003. – С.865 – 866

Гідулянов А.О. Порівняльна характеристика структурних властивостей гемоглобінів та показників еритроцитарного метаболізму у представників класу ссавців і класу риб. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за