ІНСТИТУТ АГРОеКОЛОГії Та БіОТЕХНОЛОГії

Ісаєнко Володимир Миколайович

УДК (579.64:591.5)+ (636.03:504)

БІОЛОГІЧНО АКТИВНІ РЕЧОВИНИ

АНТИПАРАЗИТАРНОЇ ДІЇ В АГРОЕКОСИСТЕМАХ

03.00.16 -екологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі екології Національного авіаційного університету МОН України

Науковий консультант: доктор технічних наук, професор, член-кореспондент АТН України МАРИНЧЕНКО Віктор Опанасович, Національний університет харчових технологій, професор кафедри біотехнології продуктів бродіння, екстрактів і напоїв

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, ПОПОВА Елеонора Михайлівна, Інститут агроекології та біотехнології УААН, головний науковий співробітник

доктор біологічних наук, професор, ГВОЗДЯК Ростислав Ілліч, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, завідувач відділу фітопатогенних бактерій

доктор біологічних наук, професор КУЗЬМЕНКО Михайло Ілліч, Інститут гідробіології НАН України, завідувач відділу радіоекології

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка

Захист відбудеться “5” квітня 2004р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.317.01 Інституту агроекології та біотехнології УААН за адресою: 03143 м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології та біотехнології УААН.

Відгуки на автореферат у двох примірниках, завірені печаткою, просимо надсилати за адресою:, вул. Метрологічна, 12, м. Київ, Україна 03143.

Автореферат розісланий “4” березня 2004р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат хімічних наук Г.В. Заякіна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Однією з найпріоритетніших проблем сучасної екології є розробка методів зменшення антропогенного впливу на навколишнє середовище, пов’язаного, зокрема, з веденням сільського господарства. Суттєвим джерелом екологічних ризиків є застосування засобів захисту сільськогосподарських рослин і тварин від шкідників (пестициди, гербіциди, інсектициди тощо) як обов‘язкового елемента сучасних агротехнологій. Хімічні препарати, які використовуються з цією метою, в більшості випадків діють нецілеспрямовано і шкідливі для людини та навколишнього середовища. Так наприклад, пестициди хлорорганічної природи зберігаються у ґрунті десятки років, накопичуються в рослинах і організмі тварин і, як наслідок, потрапляють в організм людини. Більшість з них має мутагенну, канцерогенну і тератогенну активність. Тому актуальним завданням є розробка екологічно безпечних технологій виготовлення препаратів нового покоління, що не мають вищевказаних недоліків.

Досвід найбільш розвинених країн світу показує, що попередити можливі негативні наслідки застосування засобів хімізації, в тому числі для боротьби із шкідниками рослин і тварин, можливо лише за умови використання речовин природного походження. Серед них важливе місце належить антибіотикам, до складу яких входить відносно недавно відкрита група речовин ? авермектини. Вони характеризуються широким спектром інсектицидної, акарицидної та нематоцидної активності. Авермектини ефективні при нормах витрати на один-два порядки нижче у порівнянні з багатьма інсектицидами, що дозволяє значно знизити пестицидне навантаження в агроценозах. Крім того, швидкий розпад цих речовин (до 2?3 тижнів) на рослинах і в організмі тварин та нетоксичність їх для теплокровних організмів дозволяють передбачити екологічну безпечність препаратів на основі авермектинів та їх перспективність для використання в агропромисловому комплексі України. Отже, організація вітчизняного виробництва антипаразитарних препаратів на основі авермектинів для України є важливим народногосподарським завданням.

Оскільки на сьогодні в Україні відсутній науково обґрунтований комплекс технологій з виробництва авермектинів, актуальність виготовлення на їх основі антипаразитарних препаратів і необхідність оцінки їх екологічної безпеки визначає доцільність проведення цієї роботи.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження здійснювались протягом 1992?2003 р.р. відповідно до науково-технічної Програми Кабінету Міністрів України № 31 "Будова, склад, властивості і перетворення рослинної сировини як основи створення поліфункціональних добавок, збагачувачів і модулів для одержання продуктів з новими властивостями, які забезпечують продовольчу безпеку населення України", за темами “Розробка способів підготовки живильних середовищ для мікроорганізмів з використанням електроактивування” (№ держреєстрації 0194U005441), “Розробка нових технологій живильних середовищ для мікробного синтезу біологічно активних речовин з використанням фізико-хімічної обробки нетрадиційної сировини” (№ держреєстрації 0195U002792), “Розробка біотехнології вітчизняних препаратів лікувально-профілактичної дії на основі авермектинів” (№ держреєстрації 0198U000540), включених в координаційний план Міністерства освіти України "Будова, склад, властивості і перетворення компонентів рослинної сировини".

Мета і завдання досліджень. Метою роботи була розробка засобів комплексного теоретичного і експериментального аналізу методів захисту тварин і рослин, результати яких дозволяють одержати екологічно безпечні біологічно активні речовини, що є основою антипаразитарних препаратів широкого спектру дії на паразитів сільськогосподарських видів.

Відповідно до поставленої мети досліджень було сформульовано такі завдання:

· вивчити розповсюдженість ознаки здатності до авермектиноутворення серед стрептоміцетів;

· здійснити скринінг стрептоміцетів – продуцентів авермектинового комплексу;

· розробити параметри фізико-хімічних чинників мутагенної дії для селекції стрептоміцетів – продуцентів авермектинів з метою оптимізації компонентного складу авермектинового комплексу;

· створити високоефективний екологічно безпечний штам-продуцент авермектинів та забезпечити його продуктивність шляхом оптимізації компонентів культурального середовища;

· розробити лабораторний регламент біосинтезу екологічно безпечних біологічно активних речовин авермектинового комплексу;

· розробити біотехнології синтезу авермектинів та режими екологічної безпечності їх використання;

· розробити математичні моделі з метою оптимізації основних етапів технології авермектинів;

· створити нові біопестицидні препарати на основі авермектинвмісних компонентів для боротьби із шкідниками рослин і тварин з урахуванням екологічної безпечності їх використання;

· здійснити оцінку екологічної безпечності нових авермектинвмісних препаратів щодо біоти різних трофічних рівнів;

· обґрунтувати економічну та соціально-екологічну ефективність застосування біологічно активних речовин антипаразитарної дії в агроекосистемах.

Об’єкти досліджень – природні та колекційні культури стрептоміцетів з колекції Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України; процес біосинтезу авермектинів штамом-продуцентом.

Предмет досліджень – технологічні режими та умови одержання сухого міцелію продуцента авермектинів, їх екстрактів, готових антипаразитарних препаратів, їх екологічна безпечність.

Методи досліджень – традиційні і спеціальні мікробіологічні, генетичні - для селекції продуцента, фізико-хімічні - для визначення основних показників біосинтезу (якісного і кількісного складу авермектинів, концентрації біомаси, рН, продуктивності культури), екологічні - для оцінки ступеня ризику впливу на біоту на різних трофічних рівнях.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше доведено, що здатність продукувати авермектинвмісний комплекс не є таксономічною ознакою, оскільки, крім серії Chromogenes, до якої належить типовий штам S. avermitilis, його продукують також стрептоміцети серій Achromogenes, Chrysomallus та Fuscus.

Використання в селекції стрептоміцетів ультрафіолетового і гама-випромінювання, рентгенівських променів і антибіотиків дозволило винайти штам S. аvermitilis УКМ Ас 2161 з підвищеною в 10-30 разів здатністю до синтезу авермектинів. Екологічна безпечність штаму забезпечується відсутністю синтезу олігоміцину.

Розроблено склад поживного середовища, який сприяє синтезу авермектинів на основі гідролізатів компонентів топінамбура. Показано, що двостадійне внесення вуглеводів до поживного середовища дозволяє скоротити тривалість процесу культивування на 25-30%.

Встановлено, що екологічний ризик від застосування розроблених авермектинвмісних препаратів в антипаразитарних концентраціях мінімальний. Розроблено послідовність аналізу екологічної небезпечності авермектинвмісних препаратів з використанням як біоіндикаторів видів тварин і рослин з різною тривалістю життєвих циклів. Визначені недіючі, медіанні та летальні концентрації препаратів дозволяють віднести їх за дією на водорості та вищі рослини до класу “слаботоксичних”, на безхребетних і риб – “помірнотоксичних”, на теплокровних тварин – “малотоксичних” речовин.

Практичне значення одержаних результатів. Виділений з грунту перший вітчизняний штам Streptomyces avermitilis УКМ Ас 2161 – продуцент авермектинів – рекомендовано для практичного використання в агропромисловому виробництві.

Розроблені біотехнології біологічно активних речовин авермектинового ряду дозволяють рекомендувати у виробництво:

· склад поживних середовищ для підвищення біосинтетичної активності S. avermitilis з використанням нетрадиційної сировини – топінамбура, сухих пивних дріжджів, зернової барди, які сприяють збільшенню виходу кінцевих продуктів біосинтезу — авермектинів;

· двостадійний спосіб внесення глюкози та гідролізату топінамбура до поживного середовища при ферментації авермектинів, який дозволяє більше ніж у 1,5 раза підвищити продуктивність процесу біосинтезу;

· спосіб екстрагування авермектинів з біомаси S. avermitilis – продуцента біологічно активних речовин антипаразитарної дії;

· засоби захисту сільськогосподарських і домашніх тварин та рослин від шкідників.

Соціально-екологічне значення розроблених технологій полягає в тому, що використання авермектинвмісних препаратів дозволить на один-два порядки знизити навантаження інсектицидів на агроценози. Швидка деструкція авермектинів (2–3 доби при температурі вище +25оС) в агроекосистемах та їх низька токсичність свідчать про екологічну безпечність препаратів на їх основі для людей і тварин.

Результати роботи використані при розробці навчальних робочих програм – “Вступ до фаху”, “Моніторинг і методи вимірювання параметрів навколишнього середовища”, “Екологія людини”, а також увійшли до курсу лекцій з цих дисциплін, які читаються автором на факультеті охорони довкілля Національного авіаційного університету.

Особистий внесок здобувача. Дисертант особисто визначив напрям наукових досліджень, розробив і обгрунтував план і робочі програми науково-дослідних робіт, методики проведення досліджень, виконав експериментальну частину досліджень, узагальнив одержані результати в друкованих працях, патентах на винаходи, наукових звітах, технологічних регламентах, технічних умовах, навчальних програмах і посібниках. Дисертант висловлює глибоку подяку вченим Національної академії наук України, Національного університету харчових технологій, Національного авіаційного університету за співпрацю та надану мені методичну і консультаційну допомогу.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались і обговорювались на Всеукраїнській науково-технічній конференції "Розробка та впровадження прогресивних технологій та обладнання у харчову та переробну промисловість" (Київ, 1995); IX Міжнародній науково-технічній конференції "Удосконалення процесів та апаратів хімічних, харчових та нафтохімічних виробництв" (Одеса, 1996); Міжнародній науково-технічній конференції "Энерго-ресурсосберегающие технологии переработки сельскохозяйственного сырья" (Минск, 1996); Міжнародній науково-технічній конференції "Розроблення та впровадження прогресивних ресурсоощадних технологій та обладнання у харчову та переробну промисловість" (Київ, 1997); XV Miedzynarodova Konferencja Naukowa “Inzynieria procesova w ochronie srodowiska” (Opole-Turawa – czerwiec 1998); 10-й міжнародній науково-технічній конференції “Вдосконалення процесів та апаратів хімічних та харчових виробництв” (Львів, 1999); Шостій міжнародній науково-технічній конференції “Проблеми та перспективи створення і впровадження нових ресурсо- та енергоощадних технологій, обладнання в галузях харчової і переробної промисловості” (Київ, 1999); Міжнародній конференції “Микробиология и биотехнология на рубеже ХХІ столетия” (Минск, 2000), ІІІ Мікробіологічному з’їзді України (Чернігів, 2000), VII Міжнародній науково-технічній конференції “Пріоритетні напрями впровадження в харчову промисловість сучасних технологій, обладнання і нових видів продуктів оздоровчого та спеціального призначення” (Київ, 2001), І Науково-методичній конференції “Безпека життя і діяльності людини – освіта, наука, практика” (Київ, 2002), V Міжнародній науково-технічній конференції “АВІА – 2003” (Київ, 2003).

Публікації. Основні теоретичні та експериментальні результати дисертації викладені у 51 науковій публікації, з яких 25 – у фахових виданнях, 8 є патентами на винаходи.

Структура та обсяг роботи. Дисертацію викладено на 368 сторінках друкованого тексту, вона містить 48 рисунків, 79 таблиць. Складається із вступу, 9 розділів, висновків, списку літератури, що містить 381 найменувань. Додатки представлені на 94 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми, визначені мета та основні завдання досліджень, наведені наукова новизна і практична цінність одержаних результатів.

ОГЛЯД ТА АНАЛІЗ ЛІТЕРАТУРНИХ ДЖЕРЕЛ

У розділі розглянуто основні відомі препарати антипаразитарної дії, механізми їх впливу на паразитів, технології та способи виробництва біологічно активних речовин для сільського господарства, медицини, харчової промисловості, їх екологічна безпечність.

На підставі аналізу літературних джерел зроблено висновки, що у світовій практиці найбільш перспективним напрямом виробництва та використання антипаразитарних препаратів є розробка технологій препаратів біологічного походження – фітогормонів, екдізонів і особливо авермектинів.

ОБ`ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктами досліджень були природні (201) та колекційні (438) культури стрептоміцетів з Інституту мікробіології та вірусології НАН України, а також продуценти авермектинів: штами НВО “Фармбиомед” (м. Москва) Streptomyces avermitilis штамів 103, ВКМ Ас 1301, ВНИИСХМ-51 та -54 та їх поживні середовища, вітчизняний штам Streptomyces avermitilis УКМ Ac 2161. В процесі проведення скринінга досліджено морфологічні, культуральні, фізіологічні і біохімічні показники понад 3000 ізолятів. Токсичність штаму досліджено на 50 лабораторних мишах. В роботі використовували топінамбур сорту “Радість”, екстракти (ЕТ) і гідролізати екстрактів з коренеплодів топінамбура (ГТ), приготування яких здійснювали за допомогою фізичних та хімічних методів із застосуванням мікрохвильової напівпромислової установки “Артеміда” з частотою хвиль 2450 МГц, ультразвукової установки “Медітон” з частотою хвиль 44 кГц, ультразвукового диспергатора УЗДА з частотою хвиль 22 кГц, електроактиватора ящикового типу (ЕА) з перфорованими електродами та склеєною діафрагмою.

Аутентичність авермектинів встановлювали методом тонкошарової хроматографії з використанням пластинок “Silufol” фірми “Merk”. (Дриняев, 1994). Вміст авермектинів в екстрактах з культуральної рідини S. avermitilis визначали колориметричним методом при взаємодії авермектинів з орцином в органічній фазі (Мосин, 1993). Концентрацію авермектинів виражали в мікрограмах на см3 спиртового екстракту, одержаного за стандартною методикою (мкг/см3) або в мікрограмах на см3 культуральної речовини (КР) – вологої чи висушеної біомаси продуцента авермектинів. Вміст окремих авермектинів в авермектиновому комплексі визначали на рідинному хроматографі високого тиску “Waters 990” фірми “Мілліпор” (США) при порівнянні із стандартними зразками авермектинів А1а, А2а, В1а, В2а, А1в, А2в, В1в, В2в (Черменский, 1991).

Видову приналежність, фізіологічні і морфологічні ознаки, патогенні властивості, токсигенність, вірулентність ізольованого вітчизняного штаму визначали з використанням стандартних методик (Методические рекомендации, 1980).

Вітаміни групи В встановлювали мікробіологічними методами (Билай, 1982). Вміст амінокислот визначали на амінокислотному аналізаторі АКА – 339 (Билай, 1982), вміст органічних кислот - за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) на хроматографі “Laboratorni Pristroje” (УкрНДІспиртбіопрод, 1995).

Культивування Streptomyces avermitilis здійснювали таким чином. Вегетативний посівний матеріал вирощували на поживному середовищі для ВПМ постадійно у мікробіологічних матрацах або у качалочних колбах при температурі 28–30°С, n=220–280 хв-1 протягом 48 год при постійній аерації та в інокуляторі при температурі 28–30°С, n=120–160 хв-1 протягом 36 год. Після цього вегетативний посівний матеріал у кількості 10% переносили у ферментер для культивування.

Джерелом ультрафіолетових променів (УФ) були дві лампи БУВ-15, розташовані паралельно (Лаврінчук, 1997). Опромінювання моноспорової суспензії S. avermitilis 2161 рентгенівськими променями здійснювали в рентгенівському стаціонарному апараті ДРОН-УМ1. При дослідженні впливу ?-випромінювання на S. avermitilis 2161 як джерело ?-квантів використовували тепловиділяючі елементи відпрацьованого 235U (Campbell, 1989). Після дії мутагенних чинників досліджено понад 6700 ізолятів.

Визначення токсичності авермектинвмісних препаратів проводили за встановленими в Україні вимогами (КНД 211.1.4.054-97, 22.1.4.057-97, 211.1. 4.058-97). Дослідження провели на 470 екз. гуппі Poecilia reticulatus L., 470 екз. карася Cаrassius auratus L., 4050 ікринках коропа Cyprinus carpio, 1500 екз. гіллястовусих ракоподібних Daphnia magna S. і Ceriodaphnia affinis L., 720 пробах водоростей Scenedesmus quadricauda, 120 пробах цибулі Allium cepa L. Концентрацію авермектинвмісних препаратів виражали в см3 на дм3 водного розчину або в мг на дм3 розчину.

Математичне моделювання досліджуваних процесів здійснювали з використанням чисельних методів і програм. Для побудови математичної моделі та оптимізації процесу екстракції авермектинів застосовували метод нелінійної апроксимації з мінімізацією середньоквадратичного відхилення, узагальнений матричний метод регресійного аналізу багатофакторної моделі процесу екстракції, коміркову модель структури потоку, градієнтні методи багатокритеріальної оптимізації (Волков, 1987). Статистичну обробку результатів експериментальних досліджень проводили з застосуванням критерію Стьюдента (Бирюков, 1985).

СКРИНІНГ СТРЕПТОМІЦЕТІВ – ПРОДУЦЕНТІВ АВЕРМЕКТИНОВОГО КОМПЛЕКСУ

Здатність продукувати авермектиновий комплекс згідно з висунутою концепцією була досліджена у 438 колекційних культур та 201 природному ізоляті стрептоміцетів, виділених із сірого опідзоленого грунту Київської та Житомирської областей. Ці стрептоміцети, за Гаузе (1983), відносяться до 5 секцій і 16 серій. Особлива увага приділялась представникам секції Cinereus, а саме серії Chromogenes, до якої належить типовий штам-продуцент авермектинів – Streptomyces avermitilis, та близьким до неї серіям Achromogenes i Chrysomallus. Після триступеневого відбору були визнані перспективними 16 штамів (табл. 1).

Відібрано дві культури (робочі номери 1312 і 1313), які продукують складові авермектинового комплексу А1, А2, В1 і В2 з більш високим вмістом. Встановлено, що ці штами синтезують 30–36 мкг авермектинів в 1 см3 спиртового екстракту. Аналіз спиртових екстрактів з допомогою рідинної хроматографії (рис.1) показав, що культури 1312 і 1313 синтезують окремі компоненти авермектинів у такому співвідношенні: А1–4,8; А2–85,7; В1–4,8; В2–4,8 (%).

Таблиця 1

Систематичний розподіл досліджених культур стрептоміцетів

Секції | Серії | Кількість культур

перевірених | авермектинсинтезуючих

Albus | Albus | 20 | 0

Albocoloratus | 34 | 0

Cinereus | Achromogenes | 107 | 2

Chromogenes | 150 | 3

Chrysomallus | 102 | 2

Aureus | 47 | 0

Violaceus | 37 | 0

Helvolo-Flavus | Flavus | 13 | 0

Helvolus | 26 | 0

Roseus | Lavendulae-Roseus | 27 | 0

Fradiae | 7 | 0

Fuscus | 21 | 9

Roseoviolaceus | 13 | 0

Ruber | 10 | 0

Azureus | Glaucescens | 23 | 0

Coerulescens | 2 | 0

Всього | 639 | 16

Рис.1. Хроматограми вмісту авермектинів в культурах 1312 і 1313, одержані методом ВЕРХ.

Подальші дослідження проводили лише з культурою 1313 (її ізольовано з чорнозему типового малогумусного Попельнянського району Житомирської області), оскільки її біосинтетична здатність вища, ніж культури 1312.

На основі культуральних і фізіолого-біохімічних ознак штам Streptomyces sp. 1313 віднесено до виду “avermitilis”. Цей штам зберігається в Колекції культур мікроорганізмів Інституту мікробіології та вірусології НАН України під номером УКМ Ас 2161.

Результати досліджень щодо визначення патогенних властивостей (вірулентність, токсичність та інвазійність) дозволяють охарактеризувати штам як авірулентний, нетоксичний, нетоксигенний, не здатний до інвазії у внутрішні органи досліджених теплокровних тварин та віднести його за ступенем небезпеки штамів мікроорганізмів до 4-го класу.

ЕКОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ СЕЛЕКЦІЇ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ СТРЕПТОМІЦЕТІВ – ПРОДУЦЕНТІВ АВЕРМЕКТИНІВ

Для підвищення біосинтетичної здатності культури до конкурент-носпроможного рівня було проведено комплекс селекційних робіт з викорис-танням послідовно фізичних, фізико-хімічних і хімічних мутагенів (рис. 2).

Рис. 2. Схема одержання варіантів S. avermitilis Ac 2161 з підвищеною біосинтетичною здатністю.

Для підвищення біосинтетичної активності штаму avermitilis УКМ Ac 2161 застосовували мутагенний фактор – УФ-промені. Опроміненню піддавали один із моноізолятів штаму S. avermitilis УКМ Ac 2161 під робочим номером 2–3, одержаний шляхом двоступеневого відбору спонтанних мутантів культури 1313. Досліджуваний штам досить чутливий до дії УФ-променів. Навіть обробка цим мутагеном спорової суспензії протягом 5 с спричинила зниження її виживання більш ніж у 2 рази.

На авермектинсинтезуючу здатність було перевірено 350 ізолятів, виділених після УФ-опромінення з використанням різних експозицій. Виявлено, що 57% від загальної кількості перевірених варіантів синтезували на 100-180% більше авермектинів, ніж неопромінена культура. В результаті перевірки цих варіантів на здатність синтезувати окремі компоненти авермектинового комплексу було відібрано варіанти, які завдяки вищому вмісту найбільш біологічно активного компоненту В1 в міцелії характеризувалися кращим компонентним складом порівняно з іншими дослідженими варіантами. Враховуючи ці дані, а також результати перевірки варіантів на стабільність, подальшу селекційну роботу проводили з 31-м варіантом, оскільки його продуктивність становила 120 мкг/см3 і не знизилась після чотирьох пасажів.

З метою підвищення біосинтетичної активності варіанту 31 здійснювали подальше УФ-опромінення моноспорової суспензії 14-добової культури в інтервалі від 10 до 480 с. Результати досліджень впливу УФ-опромінення на виживання цього штаму свідчать, що він досить чутливий до його дії. Опромінення протягом 10 с викликало 63%-ну загибель спор.

Основною метою досліджень з вивчення впливу УФ-опромінення на штам було визначення експозицій, при яких виживання культури становить менше 1%, оскільки найвищий мутагенний ефект УФ-променів досягається саме при таких значеннях виживання (Лаврінчук, 1997). Тому відбір варіантів з підвищеною біосинтетичною здатністю (“плюс”-варіантів) проводили серед тих моноізолятів, виживання яких після опромінення протягом 180–480 с становило 0,01–0,005%. Всього було перевірено 190 моноізолятів. Встановлено, що найбільша мінливість даної культури за ознакою авермектиноутворення (від 0 до 260%) спостерігалася при експозиції 180 та 210 с , а найменша (від 40 до 200 %) – при експозиції 270с.

Встановлено, що досліджені варіанти синтезують всі вісім компонентів авермектинового комплексу і відрізняються між собою за процентним співвідношенням окремих компонентів. Поряд з авермектинами деякі штами синтезували антибіотик фунгіцидної дії – олігоміцин. Перевагу надавали штамам з підвищеною біосинтетичною активністю (120 мкг/см3 авермектинів), максимальним вмістом компоненту В1 і відсутністю синтезу олігоміцину.

На наступному етапі селекційних робіт з вітчизняним продуцентом авермектинів як мутагенний чинник було використано рентгенівське опромінення інтенсивністю 0,9 Р/с яке викликало лише тимчасове підвищення біосинтетичної активності, але не сприяло появі перспективних мутантів.

Наступним кроком підвищення продуктивності S. avermitilis 2161 був відбір мутантів (“плюс”-варіантів), одержаних при вирощуванні даного штаму на середовищі з метаболітами досліджуваної культури – авермектинами. Всього було перевірено 120 колоній, 30% яких за біосинтетичною здатністю перевищували вихідний варіант (31-й) у 2– 2,5 раза. Оскільки більшого підвищення активності досягти не вдалося, для подальшої селекційної роботи було використано варіант під робочим номером 12Аv з активністю понад 120 мкг/см3.

Надалі для ступінчастого відбору використали в якості мутагенного фактора ?-випромінювання, створюючи потужність поглинутої дози від 50 до 600 Гр. За результатами проведених досліджень одержано ізолят, біосинтетична активність якого порівняно з вихідним варіантом збільшилась на 58-62% при вирощуванні продуцентів на твердому середовищі. Одержаний нами найбільш активний штам продуцента S. avermitilis активністю понад 270 мкг/см3 ( варіант 1392) використали для розробки біотехнології синтезу авермектинів.

РОЗРОБКА ЛАБОРАТОРНОГО РЕГЛАМЕНТУ БІОСИНТЕЗУ АВЕРМЕКТИНІВ

Паралельно з пошуком високопродуктивних штамів здійснювали розробку технології приготування поживних середовищ. В основу цієї роботи було покладено результати досліджень фізіолого-біохімічних ознак штаму з утилізації джерел вуглецю. Як основну складову поживних середовищ використовували екстракти топінамбура, які містять широкий спектр хімічних речовин, в першу чергу фруктозу, необхідних для стимулювання росту і збільшення біосинтетичної активності продуцентів авермектинів. Необхідно зазначити, що інулін, низько- та високомолекулярні фруктозиди, білки топінамбура можуть споживатись більшістю мікроорганізмів лише після попереднього гідролізу їх до мономерів. У зв”язку з цим нами були проведені дослідження з розробки шляхів оптимізації для культур–продуцентів складу джерел вуглеводів, амінокислот, вітамінів, фосфору.

Оптимальні умови гідролізу поліфруктозидів екстрактів коренеплодів топінамбура (ЕКТ) визначали із застосуванням НВЧ-поля, ультразвуку, електричного струму.

Електрохімічна обробка екстракту за оптимальних умов дозволила підвищити вміст редукуючих речовин (РР) на 22–26%.

Розроблено параметри ультразвукової обробки екстракту з коренеплодів топінамбура, що сприяло значному скороченню, у порівнянні з контролем, тривалості процесу (з 40–60 хв до 2–6 хв) та зниженню до 50–70°С температури обробки. При цьому в одержаних гідролізатах топінамбура вміст РР збільшується у порівнянні з такими за традиційною технологією на 24–29%.

При дослідженні умов проведення гідролізу ЕКТ під дією НВЧ-поля визначено оптимальні параметри гідролізу поліфруктозидів ЕКТ: температура екстракту – 75–86°С, питома потужність установки – 0,04–0,06 кВт/дм3, вміст H2SO4 в ЕКТ – 0,3–0,4 об.%, тривалість обробки – 20–25хв. Кількість редукуючих речовин у гідролізатах, одержаних при дії НВЧ-енергії, перевищує їх вміст у гідролізатах, одержаних при використанні контактного нагріву, на 29–32%.

В процесі досліджень встановлено, що мікрохвильова обробка ЕКТ дозволяє збільшити кількість амінокислот та амінного азоту при гідролізі у порівнянні з необробленим екстрактом на 90%, електро- та ультразвукова обробка – на 53–54%. Оптимізацію процесу гідролізу ЕКТ під впливом розглянутих фізичних та хімічних чинників здійснювали методами математичного моделювання.

Використання високоефективних фізичних і фізико-хімічних чинників, поряд з технологічним ефектом, сприяло збереженню в гідролізатах топінамбура біологічно активних речовин. Так, при використанні ультразвуку та НВЧ-поля в гідролізатах втрачається менше вітаміну С та вітамінів групи В – відповідно на 18–20% і 35–40% ніж у контролі. У гідролізатах, виготовлених за допомогою електроактивування, зберігається більше, ніж у контролі таких вітамінів, як тіамін, нікотинова кислота та біотин. Вміст органічних кислот у гідролізатах, виготовлених при застосуванні мікрохвильової обробки, ультразвуку та електроактивування перевищувало контроль у 1,5–2 рази.

Проведені теоретичні розробки дозволили перейти до етапу практичних технологій.

Виготовлені за допомогою електрохімічної, ультразвукової та мікрохвильової обробки гідролізати з коренеплодів топінамбура (надалі відповідно ГТЕЛ, ГТУЗ та ГТНВЧ ) були досліджені з метою вивчення їх використання в якості добавки до основного поживного середовища при культивуванні S. аvermitilis. Ефективність дії ГТЕЛ, ГТУЗ та ГТНВЧ визначали у порівнянні з добавкою гідролізатів, одержаних класичним способом (ГТКЛ). Було визначено оптимальну кількість добавок, яка становить 1,0–1,5%. У таблиці 2 наведено експериментальні дані щодо впливу добавок у кількості 1,5% та екстрактів коренеплодів (ЕКТ), листя (ЕЛТ) і стебел (ЕСТ) топінамбура до основного поживного середовища на біосинтетичну активність продуцента авермектинів. Встановлено, що стимуляція останньої на 35%, спостерігається при додаванні до культурального середовища (КС) гідролізату топінамбура, одержаного за допомогою мікрохвильової обробки.

Таблиця 2

Біосинтетична активність продуцента S. Аvermitilis під впливом добавки гідролізатів топінамбура до основного поживного середовища

Склад поживного середовища | Біомаса продуценту, г/дм3, w=10% | Вміст авермектинів,

мкг/см3 КР | % до контролю

КС | 40,76 | 697 | 100,0

КС+ГТКЛ | 37,94 | 885 | 126,9

КС+ГТНВЧ | 36,74 | 940 | 135,0

КС+ГТУЗ | 37,86 | 910 | 130,6

КС+ГТЕЛ | 37,86 | 899 | 128,9

КС+ЕКТ | 38,12 | 883 | 126,7

КС+ЕЛТ | 39,54 | 907 | 130,1

КС+ЕСТ | 39,19 | 703 | 100,8

З метою вивчення впливу амінокислот на синтез авермектинів кожну амінокислоту додавали до поживного середовища окремо. Показано, що значне підвищення біосинтетичної активності продуцента авермектинів відбувалося при внесенні до поживного середовища аланіну (на 126%), ізолейцину (на 115%), глютамінової кислоти (на 78%). Цей факт пояснює підвищення біосинтетичної активності штаму при використанні в якості добавки до основного поживного середовища гідролізатів коренеплодів топінамбура, наявністю в них значної кількості саме зазначених амінокислот, одержаних при НВЧ-обробці.

До 1998 р. в промисловості у ферментаційні середовища вносили білково-вітамінний концентрат (БВК), але в зв’язку з припиненням його виробництва постало питання добору дешевого вітчизняного джерела азоту. Досліджували вплив таких добавок: сухого кормового лізину, сухих кормових дріжджів, сухих медичних пивних дріжджів, вологих хлібопекарських дріжджів. Математичне моделювання цього процесу дозволило оптимізувати склад поживного середовища для культивування S. аvermitilis за джерелами азотного живлення. За допомогою методому Джордана – Гауса була одержана система рівнянь:

Сухі медичні пивні дріжджі:

F(x) = 116,652+ 1569,37x – 104,37x2 – 221,54x3 + 28,57x4;

Сухі кормові дріжджі:

F(x) = -718,96 + 2607,41x - 1764,21x2 + 474,25x3 – 47,48x4;

Сухий кормовий лізин:

F(x) = -4757,33 + 16026,30x – 14692,97x2 + 5268,08x3 – 657,42x4;

Хлібопекарські дріжджі:

F(x) = 489,71 – 67,43x + 52,97x2 + 106,71x3 – 41,30x4;

Оптимізація процесу біосинтезу авермектинів при різних видах азотної складової поживних середовищ виконувалась шляхом максимізації емпіричних функцій F(x), які характеризують накопичення авермектинів у міцелії продуцента в залежності від концентрації у ферментаційному середовищі досліджених джерел азоту. Оптимальні значення функції F(x), яка характеризує біосинтетичну активність продуцента при використанні досліджених джерел азотного живлення, є такими:

Сухі пивні дріжджі:

Fmax = 1640,28; xopt = 1,6 %;

Сухі кормові дріжджі:

Fmax = 595,49; xopt = 1,3 %;

Сухий кормовий лізин:

Fmax = 1189,60; xopt = 0,97 %;

Хлібопекарські дріжджі:

Fmax = 767,66; xopt = 2,11 %.

Результати досліджень свідчать про те, що рівноцінною заміною БВК можуть бути як сухі пивні дріжджі, так і кормовий лізин.

Були також проведені дослідження впливу добавки гідролізатів топінамбура до основного поживного середовища при культивуванні S. avermitilis на компонентний склад авермектинового комплексу (табл. 3).

Таблиця 3

Вплив добавки ГТНВЧ до основного поживного середовища на компонентний склад авермектинового комплексу

Поживне

середовище | Вміст окремих компонентів авермектинового комплексу, %

В2В | В2а | А2а | А2В | В1В | В1а | А1а

Контрольне середовище (КС) | 4,4 | 51,0 | 5,0 | 11,5 | 11,0 | 12,0 | 5,1

КС+ЕКТ | 3,7 | 48,4 | 5,6 | 11,0 | 10,5 | 15,1 | 5,7

КС+ГТКЛ | 4,5 | 49,3 | 5,7 | 10,0 | 11,4 | 15,3 | 3,8

КС+ГТНВЧ | 4,2 | 47,0 | 6,2 | 9,4 | 12,0 | 16,2 | 5,0

КС+ГТУЗ | 3,9 | 48,2 | 5,5 | 10,3 | 11,8 | 15,6 | 4,7

Встановлено, що добавка до поживного середовища гідролізатів топінамбура, одержаних за допомогою НВЧ-обробки, викликає збільшення на 35% вмісту найактивнішого компоненту авермектинового комплексу – авермектина В1а.

Згідно з існуючою технологією, глюкозу вносять у поживне середовище у кількості 7,0% одноразово на початку культивування S. аvermitilis. Але відомо, що біосинтез авермектинів відбувається в два етапи. На першому етапі (36–48 год) накопичується біомаса продуцента до досягнення ним стаціонарної фази росту. На другому – при біосинтезі накопичення біомаси авермектинів здійснюється повільно. Було досліджено вплив двостадійного внесення вуглеводного компонента у ферментаційне середовище при культивуванні S. аvermitilis на тривалість процесу біосинтезу авермектинів. Встановлено, що при внесенні глюкози у поживне середовище S. аvermitilis двостадійно – на початку процесу та через 48 год у співвідношенні відповідно 70 і 30% – максимальна біосинтетична активність продуцента авермектинів досягається після 5-ї доби ферментації, в той час як за існуючою технологією це можливо лише по закінченні 7-ї доби культивування. Таким чином, двостадійне внесення глюкози забезпечило скорочення тривалості культивування на 30% і підвищення біосинтетичної активності продуцента – на 35%.

БІОТЕХНОЛОГІЯ ОДЕРЖАННЯ ПРОДУКТІВ АНТИПАРАЗИТАРНОЇ ДІЇ ТА ЇХ ЕКОЛОГІЧНА СПРЯМОВАНІСТЬ

Процес одержання препаратів авермектинів складається з двох відносно незалежних технологій: технології продукування біомаси (напівпродукту) та технології виділення (екстрагування) аверсектину. Розробка цих технологій здійснювалась поетапно і незалежно.

На основі проведених досліджень нами розроблена технологія напівпродукту антипаразитарних препаратів (НАП), яка включає в себе стадії вирощування вегетативного посівного матеріалу S. аvermitilis, підготовки компонентів поживного середовища, двостадійної ферментації S. avermitilis на поживному середовищі з добавкою біостимулятора рослинного походження (екстракт або гідролізат топінамбура), фільтрації, висушування, подрібнення біомаси, розфасовки продукту.

Вирощування вегетативного посівного матеріалу S. avermitilis здійснюється у два етапи: перший – в качалочних колбах, другий – в інокуляторі.

Ферментацію також проводили в два етапи. Перший етап здійснювали при температурі середовища 28–30С протягом 36–48 год з внесенням 70% від загальної кількості глюкози, біостимулятора і 100% всіх інших компонентів поживного середовища. На другому етапі ферментації – після закінчення стаціонарної фази росту продуцента (48 год) – додавали решту 30% глюкози. Весь процес ферментації S. avermitilis тривав 120 год при постійній аерації стерильним повітрям та перемішуванні.

НАП є висушеним і подрібненим міцелієм продуцента авермектинів. Але на виробництві трапляються ситуації, коли неможливо одержану вологу біомасу відразу просушити на сушарці. Тому нами досліджувались умови зберігання вологої біомаси (W=88%) для максимального збереження вихідної активності авермектинового комплексу. З цією метою запропоновано вносити до вологої біомаси такі органічні розчинники як етанол і бутанол. Результати проведених досліджень показали, що під шаром розчинника волога біомаса (при співвідношенні 1:1 або 1:2) добре зберігається протягом 10-15 діб.

Важливим етапом у виробництві товарних препаратів на основі авермектинів є стадія вилучення їх з НАП шляхом екстракції, оскільки цей комплекс антибіотиків накопичується всередині клітин продуцента. Досліджували вплив органічних розчинників (етанол, ацетон, хлороформ, етилацетат, толуол і бутанол) як екстрагентів на якість і тривалість процесу екстракції. Встановлено, що найкращими екстрагентами за таких умов є толуол, ацетон та етанол. З міркувань екологічної безпеки доцільно використовувати етанол.

В подальшому проводили оптимізацію процесу екстракції. Визначальними параметрами процесу були такі співвідношення твердої фази та розчинника, які дискретно змінювалось k {1:3; 1:4; 1:5;…1:50}; концентрація органічного розчинника с [0,50; 0,98], об. %; тривалість екстракції ф [0; 20] год; кількість етапів процесу N {1, …6}. Головними результуючими факторами процесу була сумарна кількість виділених у розчин авермектинів – z або залишкова концентрація авермектинів у напівпродукту – у. Головними обмеженнями процесу були ті, які обумовлені вимогами його економічності. Вилучення авермектинів з концентрацією нижче ніж 1% призводило до надмірних витрат на концентрування виділеного препарату. Залежно від початкової концентрації авермектинів у НАП (с) були одержані параметричні криві (рис. 3,4), які відповідають тривалості екстракції 2 год. Для визначення оптимальної кількості етапів екстрагування були проведені розрахунки його економічної ефективності екстрагування з урахуванням сукупності витрат на його проведення. Для оптимізації процесу було запропоновано вибрати за критерій оптимізації сумарний прибуток від вилучення авермектинів з НАП при різній кількості етапів екстрагування (рис. 5) та кратності співвідношення твердої фази (НАП) та розчинника (рис. 6), а також поточних витрат при екстрагуванні (рис. 7).

Рис. 5. Залежність вмісту авермектинів у НАП і нормованої

прибутковості процесу від кількості етапів екстрагування.

Рис. 6. Залежність нормованого залишкового вмісту авермектинів

у НАП від тривалості екстракції при різній кратності розведення.

Рис.7. Залежність залишкового вмісту авермектинів у НАП і

нормованих поточних витрат від тривалості екстрагування.

Методом кількісної апроксимації була знайдена залежність прибутковості технологічного процесу екстракції авермектинів з НАП від його параметрів:

Р (N, ф, k) = a1*N + a2*ф + a3*k + a4*N*k + a5*ф*N + a6*ф*k + a7*N*ф*k.

В межах ? [2; 4]; N [2; 4]; k [1:5; 1:10] цей поліном має точку максимального прибутку.

В результаті лабораторних досліджень було показано доцільність використання у поживному середовищі продуцента авермектинів екстракту та гідролізатів топінамбура, виготовлених з допомогою електроактивування, ультразвукової та мікрохвильової обробки, а також застосування двостадійного внесення вуглеводного компоненту у ферментаційне середовище S. avermitilis.

З метою виробничої перевірки одержаних результатів та для виробництва НАП з використанням удосконаленої технології приготування поживного середовища на Плахтянському дослідному заводі ветеринарних препаратів була розроблена та змонтована технологічна лінія виготовлення екстракту та гідролізату топінамбура (рис. 8). Початковим етапом в технології приготування нових поживних середовищ для культивування продуцента авермектинів є виготовлення біологічно активного гідролізату з коренеплодів топінамбура. В ході виробничих випробувань нами був перевірений вплив параметрів обробки ЕКТ в електроактиваторі, ультразвуковій та мікрохвильовій установках на якісний склад одержаних гідролізатів топінамбура.

Рис. 8. Апаратурно-технологічна схема виробництва НАП:

1 – лопатева мийна машина; 2 – барабанна мийна машина; 3 – стрічковий конвейєр; 4 – похилий конвейєр; 5 – дробарка; 6 – екстрактор; 7 – насос; 8 – фільтр-прес; 9 – резервуар для екстракту; 10 – апарат для гідролізу; 11 – змішувач-стерилізатор; 12 – змішувач-стерилізатор для глюкози; 13 – змішувач; 14 – інокулятор;15 – ферментер; 16 – насос; 17 – фільтр-прес; 18 – сушарка; 19 – молоткова дробарка; 20 – автоматичні ваги.

Виготовлені за допомогою перелічених способів гідролізати підлужувались 40%-ним розчином NaOH до рН 6,8–7,0. Після цього кожен з гідролізатів та ЕКТ окремо стерилізували при t = 116С, Р = 0,18 МПа впродовж 20 хв. В одержаних гідролізатах та екстракті з коренеплодів топінамбура визначали вміст редукуючих речовин, амінного азоту, органічних кислот, вітамінів групи В та С до та після стерилізації (табл. 4).

Таблиця 4

Якісні показники екстрактів коренеплодів і гідролізатів топінамбура, виготовлених у виробничих умовах

Умови проведення гідролізу | Вміст редукуючих речовин | Вміст амінного азоту, мг/дм3 | Сума органічних кислот, г/дм3 | Сума вітамінів групи В, мг/ 100 см3 | Вітамін С,

мг/ 100 см3

% | % до контролю

Без гідролізу | 1,00,02 | 14,6 | 2003,0 | 0,260 | 1,51 | 3,80,10

Хімічний гідроліз | 6,810,14 | 100,0 | 3004,5 | 0,064 | 0,60 | 0,90,03

Електрообробка | 8,470,17 | 124,4 | 3044,6 | 0,066 | 0,53 | 0,90,03

Ультразвукова обробка | 8,690,17 | 127,6 | 3274,9 | 0,106 | 0,78 | 1,60,05

Мікрохвильова обробка | 8,850,18 | 129,9 | 3765,6 | 0,122 | 0,95 | 2,60,08

Виготовлені згідно з запропонованою технологією екстракт та гідролізати топінамбура були використані як добавки до поживного середовища S. аvermitilis за умов лабораторного регламенту. Була підтверджена їх ефективність у виробничих умовах.

Проведені виробничі випробування дозволяють зробити такі висновки:

· використання високоефективних фізичних способів приготування гідролізату топінамбура у порівнянні з класичним хімічним способом дозволяє скоротити тривалість процесу гідролізу ЕКТ з 40 до 4–20 хв;

· внесення ЕКТ та ГТ до поживного середовища S. avermitilis дає можливість підвищити активність продуцента на 26–35%, двостадійне внесення глюкози скорочує процес біосинтезу авермектинів на 30%. З допомогою запропонованих способів можна збільшити в 1,67 раза річний об`єм виробництва напівпродукту антипаразитарних препаратів при зниженні його собівартості на 24%;

· вітчизняний штам-продуцент авермектинів S. avermitilis у промислових умовах дозволяє одержати стандартну продукцію з вмістом авермектинів понад 20 г в 1кг НАП.

ЕКОЛОГІЧНІ ОСНОВИ ВИКОРИСТАННЯ АВЕРМЕКТИНІВ У АГРОПРОМИСЛОВОМУ КОМПЛЕКСІ

Авермектини характеризуються надзвичайно високою активністю і широким спектром антипаразитарної дії. Вони активні щодо екзо- і ендопаразитів тварин (кліщів, нематод, бліх, вошей тощо), а також фітонематод і комах – шкідників рослин. Механізм дії авермектинового комплексу принципово відрізняється від дії відомих пестицидів і зумовлений його здатністю блокувати передачу нервового імпульсу в нервово-м”язовому синапсі, що призводить до паралічу і загибелі шкідників. Авермектини ефективні при нормах витрати на 1–2 порядки нижчих у порівнянні з таким більшості інсектицидів. При цьому період піврозпаду комплексу в природних умовах при температурі