НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК України

ІНСТИТУТ ГІДРОБІОЛОГІЇ

Смольський Олександр Сергійович

УДК 577.41/46 + 597.554

СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ АДАПТАЦЇЇ КРОВІ КОРОПА ДО ЕКСТРЕМАЛЬНИХ ФАКТОРІВ ВОДНОГО СЕРЕДОВИЩА

03.00.17 - гідробіологія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертацїї на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 1998

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії біохімії тварин кафедри хімії Чернігівського державного педагогічного університету імені Т. Г. Шевченка

Науковий керівник - доктор біологічних наук, доцент

Грубінко Василь Васильович,

Тернопільський державний педагогічний

університет імені Володимира Гнатюка,

Перший проректор, завідувач кафедрою

загальної біології

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук,

СОЛОМАТІНА Валентина Дмитрівна,

Інститут гідробіології НАН України, провідний науковий співробітник відділу екологічної фізіології водяних тварин

кандидат біологічних наук,

Курант Володимир Зеновійович, Тернопільський

державний педагогічний університет

імені Володимира Гнатюка, доцент

кафедри хімії

Провідна установа - Київський Національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет,

Міністерство освіти України

Захист дисертації відбудеться " 2 " лютого 1999 р. о 1000 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.213.01. при Інституті гідробіології НАН України за адресою: 254210, м. Київ-210, проспект Героїв Сталінграда, 12

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту гідробіології НАН України, м. Киів, проспект Героїв Сталінграда, 12

Автореферат розісланий " 24 " грудня 1998 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Смірнова Н.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Важливою складовою проблеми вивчення механізмів антропогенної деградації водних екосистем та розробки нових методів біоконтролю їх рівня і динаміки є дослідження реакції молекулярних та метаболічних систем організмів на дію лімітуючих екологічних факторів водного середовища. Відомо, що однією з найчутливіших та швидкореагуючих на їх зміну тканин організму є кров. Останнім часом на гематологічний аналіз, який дозволяє за морфо-функціональними та біохімічними характеристиками крові об’єктивно оцінити та передбачити наявність чи розвиток стресу задовго до прояву клінічних ознак патологїї, звертається суттєва увага (Серпунін, 1991). Особливо цінним є цей підхід при оцінці інтоксикацій (Котов, 1991, Телітченко та ін., 1988). Дослідження молекулярних механізмів структурної адаптації компонентів крові при інтоксикаціях, як зазначає Семенчева Е.М. (1972), дозволить розкрити механізми забезпечення функціонального гомеостазу крові. В зв’язку з цим вивчення адаптивних реакцій системи крові гідробіонтів та пошук тих інтегральних показників крові, які вказують на ключові зміни стану їх організму за екстремального впливу середовища, є актуальним для оцінки токсичного забруднення водних екосистем та біомоніторингу стану і ровитку інтоксикацій гідробіонтів.

Мета та завдання досліджень. Метою роботи було вивчення фізіолого-біохімічних механізмів регуляцїї функціональної активності гемоглобінової системи та особливостей енергетичного метаболізму крові риб в умовах стресу, викликаного дією абіотичних і антропогенних факторів водного середовища, та розробка і вдосконалення на цій основі методів моніторингу водних екосистем та інтоксикацій організму риб.

В завдання досіджень входило вивчення складу та фізіолого-біохімічних характеристик крові риб в умовах зимового голодування, при зміні рН водного середовища та за дії токсикантів. Досліджували вміст формених елементів крові; концентрацію форм гемоглобіну; структурні модификації білків крові та гетерогенність гемоглобіну; кінетику насичення гемоглобіну киснем та динаміку кислотної і лужної денатурації; рівень активності ферментних систем синтезу та метаболізму гему і енергетичного обміну в еритроцитах; вміст в крові фосфатів, включно макроергічних, як показників енергетичного стану крові і регуляторів функціональної активності гемоглобінової системи за дії факторів водного середовища.

Наукова новизна роботи. Вперше проведено комплексне дослідження реакцїї крові в умовах природного стресу, викликаного зимовим голодуванням за низьких температур, та за дії екстремальної зміни кислотності середовища і токсикантів органічної (фенол) і неорганічної (іони біогенних та небіогенних металів) природи за індивідуального та спільного (в сумішах) впливу. Встановлено загальні закономірності формування компенсаторно-адаптивної відповіді гемоглобінової системи. Вперше показано універсальність механізму підтримання структурно-функціональної цілісністі гемоглобіну при стресових впливах різної природи за рахунок амідування та глікування його молекули. Досліджено механізм регуляторного впливу на функціональний стан гемоглобіну крові риб макроергічних фосфатів та систем енергетичного метаболізму еритроцитів. Виявлено певні кореляційні залежності між дослідженими рівневими показниками крові, на основі чого зроблено висновок про те, що резистентність та адаптивність риб до екстремальних факторів визначається всім спектром потенційно існуючих компенсаторно-адаптивних механізмів захисту функціональних характеристик крові.

Практична цінність роботи. На основі одержаних результатів виявлено ключові показники крові, які можна використати для оцінки стану та розвитку інтоксикацій в організмі риб, а також для моніторингу забруднень водного середовища: співвідношення лігандних форм гемоглобіну; кореляція кінетики дисоціації оксигемоглобіну з рівнем АТФ в еритроцитах крові; рівень сульфгідрильных груп та ступінь амідування і глікування білків крові (гемоглобіну та білків плазми) як фактора екранування амінокислотних радикалів від токсикантів, особливо, іонів важких металів та токсикантів окиснювальної дії.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідалися на:

1. Міжвузівській науково-практичній конференції (Україна, Чернігів, ЧДПІ ім. Т.Г. Шевченка, 1995).

2. Міжвузівській науково-практичній конференції (Україна, Київ, УААН, 1996).

3. 7 Українському біохімічному з’їзді (Україна, Київ, 1997).

4. 2 з’їзді Гідроекологічного товариства України (Україна, Київ, 1997).

5. 1 Міжнародній науково-практичній конференції "Екологія и молодь" (Республіка Беларусь, Гомель, 1998).

6. 1 Всеукраїнській науковій конференції « Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах» (Україна, Тернопіль, 1998).

Публікації. По матеріалах дисертації опубліковано 13 робіт.

Структура и об’єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури (1 розділ), експериментальної частини (3 розділи), підсумків і висновків. Робота викладена на 168 сторінках, містить 25 рисунків, 9 таблиць, 220 літературних джерел, з яких 102 – на іноземних мовах.

Декларація конкретного внеску. Всі одержані результати дослідів, їх обговорення і висновки виконані дисертантом особисто.

1.

Проаналізовані фізіолого-біохімічні зміни в крові риб за дії різних факторів екстремального характеру, а також за різних умов існування. На основі цих даних зроблено висновок про необхідність комлексного вивчення відомих та встановлення можливих за даних умов існування механізмів структурно-функційної відповіді гемоглобінової системи крові риб та розробки нових методів біоконтролю токсичних станів в організмі гідробіонтів.

2. Матеріали і методи досліджень

Об’єктом дослідження були коропові риби (Cyprinus carpio L.) річного віку масою 120-150 г, яких витримували в природних ставках за нормального газового та гідрохімічного режимів. Досліди проведено в акваріумах об’ємом 200 л, в які розміщували по 6 особин риб. Період аклімації становив 14 діб. Вміст кисню коливався в межах 5,0-7,0 мг/л. Воду в акваріумах змінювали раз в чотири доби. Нашкірних збудників паразитарних хвороб та стрічкових паразитів в риб не виявлено.

Вивчали морфо-функціональний стан крові коропа за дії фенолу, іонів металів (магнію, міді, марганцю та свинцю) окремо та в сумішах з аміаком. Іони відібрано за принципом біологічної дії (біогенні та небіогенні). Дослідження впливу аміаку проводили в зв’язку з тим, що він, будучи метаболітом тварин, у високих концентраціях виявляє токсичну дію. Оскільки основним об’єктом досліджень є гемоглобін, функціональна активність якого значно залежить від внутрішньо- та зовнішньоеритроцитарного рН, вивчено також вплив зміни кислотності середовища (рН 6,4 + 0,1 та 8,1 + 0,1).

Токсичні рівні (2 рибогосподарських ГДК) речовин у воді акваріумів створювали внесенням їх розрахункових кількостей. Токсичну концентрацію аміаку в воді (0,1 мг/л - пороговий рівень) підтримували внесенням аміакової буферної суміші NH4OH: NH4Cl з рН 7,2; Pb2+ (0,2 мг/л) - ацетату свинцю; Cu2+ (0,2 мг/л) - сульфату міді; Zn2+ (2,0 мг/л) - сульфату цинку; Mg2+ (100,0 мг/л) - хлориду магнію з врахуванням природної твердості води; Mn2+ (2,41 г/л) - сульфату марганцю; фенолу (0,002 мг/л) - розчиненого свіжоперегнаного фенолу. Кислотний та лужний стрес створювали внесенням у воду HCl чи NaOH. Значення рН щодобово контролювали і корегували.

Кров відбирали із синуса зябрової вени з використанням як антикоагулянту гепарину з розрахунку 10 од/мл крові. Кількість формених елементів крові визначали в камері Горяєва (Гуминський і ін., 1990); гематокрит - центрифугуванням в гематокритній центрифузі МЦГ-8; загальний вміст гемоглобіну і його форм розраховували за диференціальними спектрами поглинання (Крикливий і ін., 1979). Розрахунок співвідношення окси-, дезокси- та мет- форм гемоглобину здійснювали за формулами Ymai K. et al. (1970), Benesh R. E. et al. (1973). Активність мітохондрійної d - амінолевулинатсинтетази печінки визначали за Granick S. (1966), а активність НAДH - залежної метгемоглобінредуктази крові - за Дервіз Г. В. (1975). Кінетику лужної та кислотної денатурації гемоглобіну вивчали за Стародуб Н. Ф. (1979). Спорідненість гемоглобину до кисню оцінювали за кривими дисоціації оксигемоглобіну (Кляшторін і ін., 1980). Вміст фосфатів (загального, неорганічного, зв’язаного в 2,3-дифосфогліцерат і нуклеотидного) визначали неферментним методом за Виноградовою І.Л. і ін. (1990). Для визначення вмісту АТФ, АДФ і АМФ використовували метод разділення в тонкому шарі силікагелю на пластинках ‘‘Silufol’’ UV-254 (Чехія). Для оцінки участі ATФ, AДФ, AMФ в метаболічній регуляції розраховано співвідношення АТФ/АДФ, АТФ/АМФ та аденілатний енергетичний заряд (Cтрайєр, 1984).

Вміст глюкози визначали фотометрично за Асатіані В. С. (1957). Рівень пірувату та лактату визначали ферментативно за Прохоровою М. І. (1982). Вміст вільних НАД-пар в еритроцитах розраховували на основі значень концентрацій субстратів лактатдегідрогеназної системи (Чаговець і ін., 1974).

Активність глюкозо-6-фосфатази в крові визначали за Ореховичем В. Н. (1968). Рівень неорганічного фосфору оцінювали за Фіске-Суббароу (1925). Активність лактатдегідрогенази в крові визначали як рекомендовано в Biochemica Information (1975), а глюкозо-6-фосфатдегідрогенази - за Bergmeyer H. U.(1963).

Структурні модифікації білків крові оцінювали за зміною відсотка глікованих білків гемолізату еритроцитів та плазми згідно рекомендацій Данилової Л. А. і ін. (1991). Ступінь амідування білків крові оцінювали за Пушкіною Н. В. (1979). Кількість незв’язаних сульфгідрильних груп крові визначали за Фоломеєвим В. Ф. (1981). Гетерогенність гемоглобіну оцінювали шляхом його електрофорезу в ПААГ (Сухомлинов і ін., 1972).

Кількість білку визначали по Lowry O. H. еt al. (1951). Одержані результати оброблено статистично з використанням методів варіаційної статистики та кореляційного аналізу (Лакін, 1990).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

3. Склад і функціональна активність крові риб

в період зимового голодування

В умовах зимового голодування в організмі риб розвивається температурний та ресурсодефіцитний стрес (Сорвачов, 1982). Відповіддю на нього є збільшення протягом зимівлі в 1,5 рази вмісту еритроцитів та величини гематокриту. Загальний вміст гемоглобіну знижуєтся в 2 рази, що корелює з даними про пряму залежність вмісту гемоглобіну в коропа від температури води (Серпунін, 1979). Це пояснюється зниженням в 4 рази активності мітохондріальної d-АЛС, яка лімітує швидкість біосинтезу гема. Загалом, дані зміни погіршують в період зимівлі забезпечення тканин киснем.

В кінці березня на початку квітня поряд з зниженням в 4 рази вмісту оксиформи гемоглобіну рівень дезоксиформи відносно лютого в 3 рази зростає. Вміст метгемоглобіну при цьому збільшується в 2 рази, що співвідноситься з різким зниженням спорідненості гемоглобіну до кисню. З даними змінами корелює швидкість дисоціації оксигемоглобіну. Максимальна швидкість дисоціації виявлена в жовтні, коли спорідненість є мінімальною, а мінімальна - в червні, коли спорідненість є максимальною. Сезонна динаміка дисоціації оксигемоглобіну підтверджує підвищення спорідненості гемоглобіну до кисню в період зимівлі.

Отже, слід відмітити взаємозв’язок між підвищенням спорідненості гемоглобіну до кисню, зниженням рівня метформи та зростанням вмісту його оксиформи. Значне зниження вмісту окси- та підвищення кількості метформи гемоглобіну, а також зміщення кривої дисоцації оксигемоглобіну вправо в кінці зимівлі свідчить про розбалансування системи транспорту кисню в цей період.

Оскільки біохімічна адаптація здійснюється як шляхом модифікації макромолекул, так і на рівні регуляторних факторів клітини (Хочачка, Сомеро, 1988), нами досліджено регуляцію функціональної активності гемоглобіну за допомогою АТФ, який є основним модулятором спорідненості гемоглобіну риб до кисню (Bunn, 1971). Протягом зимівлі рівень останнього знижувався в 2 рази, що співставляється с відміченим нами фактом збільшення спорідненості гемоглобіну коропа до кисню. Це узгоджується з зниженням в риб за низьких температур обміну речовин, рухливості, зменшенням споживання ними кисню та активацією гліколізу.

Нами виявлено, що з листопада до лютого в 1,3 рази зменшується рівень глюкози. При цьому активність гліколізу загалом зростає, крім січня, коли в риб, як відомо (Жиденко, 1992), активується глюконеогенез. Аналогічно змінюється співвідношення НАД+/НАДН, яке є регуляторним фактором гліколізу, глюконеогенезу та вуглеводного обміну в цілому. Це корелює з активацією біосинтетичних процесів в січні та окиснювальної здатності крові в другій половині зимівлі. Зниження даного співвідношення в середині зимівлі відмічено не тільки в крові, але й у м’язах, печінці та мозку риб (Калиничева, 1974) і ссавців (Великий і ін., 1982). Вказані закономірності підтверджуються також відповідними змінами активностей лактатдегідрогенази і глюкозо-6-фосфатдегідрогенази та динамікою АТФ, АДФ і АМФ в крові риб. Сума аденілових нуклеотидів та аденілатний енергетичний заряд протягом зимівлі зменшуються. Зазначене співвідноситься з відомим фактом енергозабезпечення організму риб в процесі зимівлі за рахунок ендогенних ресурсів (Сорвачов, 1982).

Перебудови енергетичного метаболізму відображаються на функціонуванні системи транспорту кисню шляхом впливу на структурно-функціональний стан гемоглобіну. Однією з суттєвих характеристик останнього є кінетика його лужної денатурації.

Найстійкішим гемоглобін є в червні (період активного живлення). Найзначнішою його денатурація є в жовтні та лютому, що є показником низької захищеності молекул від денатуруючих агентів.

В формуванні вищих рівнів структури білків важливу роль відіграють амідні групи (Гершенович і ін., 1966). Протягом зимівлі амідованість гемоглобіну підвищується в 2 рази. Амідованість білків плазми крові знижується в середині зимівлі, але зростає з лютого по квітень. Відомо (Калиничева, 1974), що з другої половини зимівлі як ендогенне джерело живлення в риб використовуються саме білки, в зв’язку з чим амідування гемоглобіну та білків плазми протягом зимівлі можна вважати засобом їх адаптивного захисту від протеолізу. Додатковим механізмом такого захисту є глікування (Данилова, 1991). Нами виявлено, що в середині зимівлі глікування гемоглобіну знижується, а в березні зростає майже в 3 рази. Білки плазми в часовій динаміці глікуються навпаки. Ввважаємо, що ступінь глікування може бути фактором, який з одного боку за несприятливих умов стабілізує білкові молекули, а з іншого - регулює інтенсивність вуглеводного обміну шляхом вилучення моносахаридів з окиснювального пулу. Збільшення ступеня амідування білків супроводжується зниженням відсотка їх глікування і навпаки. Ймовірно, що за рахунок цього максимально ефективно здійснюється стабілізація гемоглобіну. Одночасно з цим певну роль в захисті гемоглобіну під час зимівлі риб відіграють і сульфгідрильні групи. Проте їх роль, порівняно з описаними механізмами, нижча, оскільки вміст –SH груп протягом зимівлі змінюється мало. Незначну роль в даному процесі відіграє також і метгемоглобінредуктаза еритроцитів, активність якої зимою знижується в 2 рази, що корелює з зростанням вмісту метгемоглобіну.

Дані диск-електрофорезу гемоглобіну в ПААГ вказують на те, що виявлені механізми захисту забезпечують підтримання цілісності його молекул, оскільки кількість фракцій білка становить 3, як і в нормі.

Таким чином, в період зимового голодування молекула гемоглобіну та метаболізм в еритроцитах змінюються в напрямку забезпечення підтримання структурної цілісності та функціональної активності для забезпечення достатньої адаптованості до екстремальних умов зимівлі.

4. СКЛАД ТА ФУНКЦІональна АКТИВНІСТЬ КРОВІ РИБ ЗА ІНТОКСИКАЦІЙ

4.1 Морфо-функціональна характеристика крові коропа при інтоксикаціях

Збільшення кількості еритроцитів та гематокриту має місце за дії іонів свинцю окремо та спільно з аміаком, іонів марганцю, міді та фенолу, що супроводжується зменшенням вмісту в них гемоглобіну. За дії аміаку окремо та спільно з іонами магнію, марганцю, іонів цинку відмічено зворотню динаміку. Очевидно, що за дії токсикантів, особливо аміаку, іонів металів та фенолу має місце порушення синтезу гемоглобіну. Про це свідчить зменшення за дії аміаку, іонів свинцю та фенолу активності мітохондрійної d-АЛС. В інших випадках стан гемоглобіну визначається співвідношенням його лігандних форм. Зниження рівня оксигемоглобіну на спостерігали за дії іонів свинцю окремо та спільно з аміаком, марганцю, а також фенолу. Зворотній ефект мав місце тільки за впливу марганцю і аміаку. Вміст метгемоглобіну в більшості випадків змінюється на незначно (3-5%). При цьому між рівнями окси- и дезоксиформ відмічено зворотню залежність. Одержані дані свідчать про індивідуальність дії досліджуваних речовин, однак, спільною є тенденція до підтримання функційно достатнього рівня основних компонентів гемоглобінової системи.

Компенсаторно-адаптивними реакціями на токсичну дію можна вважати збільшення числа еритроцитів, активацію еритропоетичної активності тканин, зростання активності метгемоглобінвідновлюючої НАДH-залежної метгемоглобінредуктази, одного з основних ферментів блокування окислення гемового заліза.

Аналіз кривих дисоціації оксигемоглобіну свідчить про зниження спорідненості гемоглобіну до кисню за дії аміаку окремо та спільно з іонами магнію, іонів марганцю і міді, а також суміші іонів марганцю і аміаку. В умовах дії іонів свинцю, свинцю з аміаком, цинку, фенолу, а також при зміні кислотності середовища криві дисоціації зміщені вліво. В випадку зміщення кривих вправо за низької спорідненості дезоксигемоглобіну до кисню в крові збільшується вміст незв’язаного молекулярного кисню (Р50 зростає), внаслідок чого розвивається її надлишкова оксигенація, що в умовах активації гліколізу може привести до неконтрольованого використання кисню не на окиснення енергетичних субстратів, а на утворення пероксидних похідних ліпідів (Владимиров, 1972). Одержані дані корелюють з швидкістю дисоціації оксигемоглобіну, яка, в випадку зростання Р50, збільшується. З іншого боку, зростання спорідненості гемоглобіну до кисню за дії свинцю окремо та спільно з аміаком, цинку, фенолу, підкислення та залуження води розглядаємо як захисні зміни, спрямовані на пдтримання необхідної кількості функціонально активного гемоглобіну, оскільки надлишкова оксигенація, крім ПОЛ, може також сприяти окисненню гемового заліза.

Таким чином, збільшення спорідненості гемоглобіну до кисню може бути фактором підтримання функціонально необхідного рівня вільного кисню (дія іонів свинцю окремо та спільно з аміаком, іонів цинку, закислення і залуження води, вплив фенолу) та засобом запобігання неконтрольованих перекисних процесів.

Співставлення зміщення кривих дисоціації оксигемоглобіну та рівня АТФ в еритроцитах підтверджує його роль як основного модулятора функціональної активності гемоглобіну риб. Оскільки еритроцитарний АТФ утворюється гликолітично (Дударєв, 1979), то зміна швидкості гліколізу може впливати на кисневотранспортні можливості крові.

4.2 Стан вуглеводного та енергетичного обміну в крові коропа при інтоксикаціях

Узагальнюючи загальну динаміку рівня глюкози, пірувату, лактату, а також окиснених та відновлених форм нікотинамідних коферментів, можна виділити декілька напрямків змін вуглеводного та енергетичного метаболізму в крові коропа при інтоксикаціях. Збільшення рівня пірувату з одночасним зниженням вмісту лактату при дії іонів міді, суміші аміаку з іонами свинцю, зростання при цьому вмісту окиснених форм нікотинамідних коферментів свідчить про пригнічення гліколізу та одночасне посилення інших шляхів окиснення глюкози, участь пірувату в глюкозо-аланіновому циклі, роль якого полягає в підтриманні гомеостатичного рівня аміаку та глюкози. Рівень останньої за вказаних інтоксикацій вірогідно зростає.

Одночасне збільшення вмісту пірувату та лактату виявлено при дії аміаку та іонів цинку. Це свідчить як про активацію гліколізу, так і про використання пірувату в метаболізмі. Накопичення молочної кислоти при інтоксикації аміаком є необхідним для підтримання кислотно-основного балансу крові при небезпеці її залуження.

Зниження рівнів як пірувату, так і лактату при дії іонів свинцю, фенолу та марганцю окремо і спільно з аміаком може бути результатом зменшення інтенсивності гліколізу. За дії іонів свинцю і фенолу знижується відношення НАД+/НАДН, що свідчить про пригнічення окиснювальних процесів, а також про зміщення рівноваги лактатдегідрогеназної реакції вбік лактату, що корелює з зростанням рівня глюкози і підтверджує думку про зменшення її гліколітичного розщеплення.

Аналіз активності ключових ферментів вуглеводного обміну - ЛДГ, Г-6-Ф-ази и Г-6-Ф-Д-ази в крові риб дозволяє відмітити декілька основних напрямків змін в системі гліколіз - глюконеогенез – пентозофосфатний шунт (ПФШ):

- активацію всіх шляхів відмічено за дії аміаку і залуження води. При дії аміаку підтримання високого рівня глюкози і збільшення вмісту окиснених форм НАД підтверджує висновок Грубінко В. В. (1995) про посилення інтоксикації риб аміаком глюкозо-аланінового циклу. Наслідком зростання відношення НАД(Ф)+/НАД(Ф)Н є також активація ПФШ;

- активація гліколізу і глюконеогенезу та пригнічення пентозофосфатного шунта виявлено за спільної дії аміаку з іонами магнію. З цим може бути пов’язано зниження рівня глюкози;

- активацію гліколізу і пентозофосфатного шунта виявлено за дії сумішей аміаку з іонами свинцю та марганцю, а також іонів міді і цинку. Одержані дані свідчать про незначну роль глюконеогенезу за спільної дії аміаку та іонів свинцю, а також іонів міді;

- пригнічення гліколізу і активацію двох інших шляхів відмічено за дії іонів марганцю і закисленні води. За дії іонів марганцю дана метаболічна зміна пояснює відомий факт зниження рівня глюкози в крові (Сизоненко і ін., 1980);

- пригнічення гліколізу і пентозофосфатного шляху та активація глюконеогенезу проявляються тільки за дії іонів свинцю;

- активацію гликолізу та пригнічення інших процесів встановлено при дії фенолу. Унаслідок цього в крові накопичується лактат, знижується відношення вільних НАД-пар, а також використання глюкози.

Зміни швидкості і спрямованості реакцій вуглеводного обміну впливають на функціонування системи ресинтезу макроергічних сполук, особливо, аденілових нуклеотидів.

Виявлено зниження рівня всіх аденілатів в крові за дії іонів свинцю і фенолу, що свідчить про пригнічення процесів енергозабезпечення та, ймовірно, розвиток патології в організмі в цілому. Підвищення рівня АТФ і АМФ при одночасному зниженні концентрації АДФ має місце за дії іонів марганцю. При цьому, як і за дії іонів свинцю та фенолу, знижується рівень загального та мінерального фосфору. Тенденція до збільшення рівня АТФ і АДФ та зниження вмісту АМФ відмічена за дії аміаку разом з іонами магнію. При цьому зменшується рівень всіх фосфатів. Зниження вмісту АТФ з одночасним зростанням рівнів АДФ та АМФ спостерігається за дії іонів свинцю спільно з аміаком, а також іонів міді і цинку. Дані зміни свідчать про інтенсивне використання АТФ для підтримання адаптивних механізмов життєзабезпечення. Вірогідне збільшення вмісту АДФ і АМФ при активації гліколізу також є свідченням роз’єднання окиснення та субстратного фосфорилювання. Це корелює з даними Верещагіна В. М. і ін. (1980) про активуючу роль АДФ та, особливо, АМФ (рівень останнього за інтоксикацій дуже високий) на швидкість гліколізу. Динаміка аденілатів також співвідноситься з регуляторною роллю АТФ щодо функціональної активності гемоглобіну.

Зниження рівнів АТФ та АДФ при одночасному підвищенні вмісту АМФ відмічено тільки за дії аміаку. Враховуючи його специфічну дію на кров (Emerson et al., 1975; Wlasow еt al., 1990; Грубінко, 1995), можна передбачити АТФ-азне розщеплення АТФ для підтримання кислотно-основного гомеостазу при активації гліколізу (Мельничук, 1989). Аналогічі зміни мають місце також при закисленні водного середовища. При залуженні води активація гліколізу забезпечує як посилене утворення лактату, необхідного для витримування внутрішньоеритроцитарного рН, так і посилює ресинтез АТФ цим шляхом.

Таким чином, за дії суміші іонів свинцю та аміаку, аміаку окремо, іонів міді, цинку, при підкисленні води має місце глибоке розщеплення аденілатів, що приводить не тільки до погіршення енергозабезпечення, а також впливає на функціонування гемоглобіну. Дані зміни можна розглядати як патологію. Пригнічення активності аденілатної системи спостерігається за дії іонів свинцю і фенолу. У випадках дії сумішей аміаку з іонами марганцю та магнію, а також при залуженні води ймовірним є антагонізм токсикантів, бо рівень АТФ суттєво не змінюється. Іони марганцю активують процеси енергоутворення в еритроцитах.

4.3 Структурні модифікації білків крові коропа в екстремальних умовах

На основі аналізу одержаних даних можна запропонувати функціонування декількох механізмів захисту структурно-функціональної цілісності білків крові за дії стрес-факторів. При цьому рівень модифікуючої дії фактору та тип адаптації залежить від фізико-хімічних властивостей токсиканту та глибини його біологічної дії. За цим принципом досліджені фактори можна розподілити на 3 групи:

1. За дії іонів свинцю основна роль в захисті білків належить SH-групам, які зв,язують їх та знижують доступ до функціонально активних центрів. Аналогічні зміни викликаються за дії аміаку, іонів магнію та фенолу. При дії аміаку сульфгідрильні групи можуть використовуватися як донори протонів для його переводу в менш токсичну іонізовану форму.

2. За дії іонів міді, цинку та закислення води функціонує механізм, який полягає у конформаційних перебудовах білкових молекул. Вони виражаються в збільшенні вмісту сульфгідрильних груп з одночасним зниженням амідування унаслідок втрати легкогідролізованих груп аспарагіну та інтенсифікації процесів глікування амінокислотних залишків. В цих випадках основний захисний эфект забезпечується за рахунок глікування.

3.

Функціональною характеристикою модифікації молекул гемоглобіну за дії токсикантів є кінетика його лужної денатурації. У ссавців підвищення вмісту лужнорезистентного гемоглобіну виявлено при анемічній гіпоксії, викликаної інтоксикацією свинцем та сполуками ртуті (Семенчева, 1972). Ймовірно, що здатність до денатурації гемоглобіну залежить саме від його структурних перебудов. Аміак знижує стійкість гемоглобіну до дії 0,1 н лугу. Його суміш з іонами магнію підвищують цю здатність на відміну від випадків дії іонів свинцю окремо та в суміші з аміаком, а також іонів міді і цинку. Вплив іонів марганцю окремо і в суміші з аміаком, фенолу, підкислення та залуження середовища приводить до збільшення стійкості гемоглобіну до дії лугу. Очевидно, що стійкість гемоглобіну до незворотнього порушення нативної структури лугом визначає ступінь модифікованості його молекул. Найменшою стійкістю гемоглобін риб володіє за дії іонів важких металів і аміаку, що може бути пов’язано з ковалентною модифікацією молекул білков за рахунок амідування, утворенням малорозчинних металопротеїнових комплексів та залуженням внутрішньоеритроцитарного середовища. Останнє змінює заряд молекули білку та його функціональну активність. Підвищення стійкості гемоглобіну до лугу свідчить про залежність денатурації білку від характеру токсиканта та форми його знаходження в організмі, а також про захисне значення досліджених структурних модификацій. Свідченням останнього є те, що, незважаючи на достатньо широкий спектр токсикантів, електрофоретичними дослідженнями в ПААГ нами не виявлено зміни фракційного складу гемоглобінів риб за інтоксикації їх організму. Можна зазначити, що гемоглобін риб володіє значною структурною та функціональною стійкістю до дії екстремальних факторів водного середовища.

5. Взаємозв’язок структурних модифікацій та функціональної активності гемоглобінової системи коропа

В досліджених варіантах інтоксикацій не виявлено однотипної реакції посттрансляційних змін білків крові та функціональної активності гемоглобіну. При цьому відмічаємо, що в дослідних та контрольних варіантах кількість позитивних та негативних кореляцій відмінна ( +0,5 < К <- 0,5). Це свідчить про формування різних механізмів компенсаторно-адаптивної відповіді в нормі і при інтоксикаціях. Характерно, що найбільше позитивних кореляцій (4) виявлено за дії аміаку. Одночасно для суміші аміаку з іонами свинцю та марганцю виявлено відповідно 3 та 4 негативні кореляції. В першому випадку, очевидно, існує синхронна взаємозалежність виявлених змін та формування адаптивної системи детоксикації аміаку (Грубінко, 1995), до складу якої слід віднести і реакцію гемоглобінової системи. Спільна дія аміаку та іонів важких металів викликає розбалансування структурно-функціональної ланки адаптації гемоглобінової системи, ймовірно, як результат індивідуальної дії токсикантів на різні молекулярні мішені в клітині. У випадку дії іонів цинку, а також при підкисленні середовища сума корелятивних знаків дорівнює нулю, що свідчить на користь передбачення про відсутність синхронізації змін досліджених показників при цих інтоксикаціях. В інших досліджених випадках переважає позитивна кореляція, що є свідченням взаємозв’язку і взаємозалежності структурних і функційних змін при адаптивній відповіді організму риб на дію токсиканту.

ВИСНОвКИ

1.

2.

3. Встановлено, що при різних формах інтоксикацій в еритроцитах крові коропа змінюється співвідношення швидкостей окремих ланок вуглеводного обміну в системі гліколіз - глюконеогенез - ПФШ. Активація всіх шляхів має місце за дії аміаку та залуження води. Особливістю метаболізму при інтоксикації аміаком є функціонування глюкозо-аланінового циклу. Активація гліколізу і глюконеогенезу при одночасному пригніченні пентозофосфатного шунту виявлена за спільної дії аміаку та іонів магнію. Активація гліколізу та пентозофосфатного шунта з одночасним зниженням активності глюконеогенезу супроводжує дію сумішей аміаку з іонами свинцю і марганцю, а також іонів міді і цинку. Одержані результати свідчать про незначну роль глюконеогенезу при дії сумішей аміаку з іонами свинцю, а також іонами міді. Пригнічення гліколізу та пентозофосфатного шляху і активація глюконеогенезу відмічена тільки при дії іонів свинцю. Посилення гліколізу і пригнічення інших процесів встановлено при дії фенолу. Зміна швидкості і спрямованості реакцій вуглеводного обміну несприятливо впливає на функціонування системи ресинтезу макроергічних сполук, особливо, аденілових нуклеотидів.

4. Основними факторами регуляції спорідненості гемоглобіну до кисню за інтоксикацій є рівень органічних фосфатів, в першу чергу АТФ, і функціонування системи реакцій модифікації білків крові. Домінуючими механізмами модифікаційної регуляції і підтримки структурно-функціональної цілісності гемоглобіну риб від токсичного пошкодження є: екранування амінокислотних радикалів шляхом амідування; захист амідних груп за рахунок глікування; збільшення вмісту зв’язуючих іони важких металів сульфгідрильних груп.

5. Реакція крові риб на інтоксикацію визначається фізико-хімічними властивостями токсиканту. Іони свинцю і фенолу викликають в еритроцитах незворотні структурні і метаболічні зміни; іони марганцю, міді і цинку активують більшість процесів адаптивного захисту; аміак викликає відхилення на рівні адаптивної відповіді; спільна дія аміаку та іонів металів найчастіше є антагоністичною і виступає фактором зниження пошкоджуючої дії кожного токсиканта окремо.

6. Дія досліджених токсикантів в багатьох випадках є аналогічною впливу зимового голодування, що підтверджує гіпотезу про універсальність механізмів формування адаптивної відповіді на дію стрес-факторів природного і техногенного походження за рахунок одних і тих же макромолекул та метаболічних систем.

7. На основі проведеного дослідження одержано комплексне уявлення про реакцію крові риб на дію екстремальних факторів водного середовища, що дозволило виявити ключові характеристики компонентів крові і запропонувати їх як показники біоіндикації забруднення водного середовища.

Основні положення дисертації викладені в таких публікаціях:

1. Жиденко А.А., Грубинко В.В., Смольский А.С., Явоненко А.Ф. Влияние абиотических факторов среды на образование кетоновых тел у рыб // Гидробиол. журн. - 1994. - 30, № 2. - С. 87-92.

2. Жиденко А.О., Грубінко В.В., Смольський О.С., Явоненко О.Ф. Рівні біохімічної адаптації у ставкових риб в онтогенезі // Проблеми історичного і географічного краєзнавства Чернігівщіни: Тез. доп., Чернігів, 1995 р. - Чернігів: Чернігівське обл. відділ. Географ. тов.-ва УРСР, 1995. - Вип. 3. - С. 71.

3. Смольський О.С., Жиденко А.О., Явоненко О.Ф. Рівні біохімічної адаптації ставкових риб до абіотичних факторів середовища // Міжвузівська науково-практична конференція: Тез. доп., Чернігів, 1995 р. - Чернігів: ЧДПІ, 1995. - С. 266-268.

4. Грубінко В.В., Жиденко А.О., Смольський О.С., Леус Ю.В., Коновець І.М., Явоненко О.Ф. Фізіолого-біохімічні адаптації ставкових риб до екстремальних факторів середовища і їх корекція // Екологія, охорона природи, екологічна освіта і виховання. Збірник статей, присвячений 80-річчю Чернігівського державного педагогічного інституту ім. Т.Г.Шевченка: Зб. стат., Чернігів, 1996 р. – Чернігів: Чернігівське відділ. укр. біохім. тов.-ва, 1996. - С. 10-28.

5. Yu. Leus, A. Smolsky, V. Grubinko The role of haemoglobin patology in the induction of lipid peroxidation in fish under intoxication // 4th IUBMB Conference «The life and death of the cell».- Edinburg (UK). - 1996. -P. 542 (c80).

6. Грубінко В.В., Смольський О.С., Коновец І.М., Арсан О.М. Гемоглобін риб при дії аміаку та солей важких металів // Гідробіол. журн. - 1995. - 31, № 4. - С. 82-87.

7. Грубінко В.В., Смольський О.С., Явоненко О.Ф. Зміни морфо-функціональних характеристик крові коропових риб за інтоксикації аміаком // Фізіол. журн. - 1996. - 42, № 1-2. - С. 40-46.

8. Грубінко В.В., Смольський О.С., Леус Ю.В., Явоненко О.Ф.., Арсан О.М. Взаємозв'язок функціонування системи гемоглобіну та перекисного окислення ліпідів у крові коропа при інтоксикації // Доповіді НАН України. - 1997. - 2. - С. 146-150.

9. Грубінко В. В., Смольський О.С., Леус Ю.В. Перекисний статус та стан гемоглобіну крові риб за інтоксикації // Наукові записки Тернопільского пед. ун-ту., Серія "Біологія". - 1997. - № 1. - С. 50 - 53.

10. Смольський О.С. Структурно-функційні зміни гемоглобіну крові коропа за токсичної дії // 7 Український біохім. з'їзд: Тез. доп., вер. 1997 р. - К.: Укр. біохім. тов.-во, 1997. - Ч. 3. - С. 130-131.

11. Смольський О.С. Структурні модифікації білків крові риб за дії іонів важких металів // 2 з'їзд Гідроек. тов.-ва України: Тез. доп., 27-31 жовт. 1997 р. - К.: Гідроек. тов.-во України, 1997. - Т. 2. - С. 148-149.

12. Смольский А.С. Опосредованное функциональное влияние белков плазмы крови рыб на сродство гемоглобина к кислороду при действии экстремальных факторов окружающей среды // Экология и молодежь: Материалы 1 межд.-ной науч.-практ. конф., 17-19 марта 1998 г. - Гомель: БелГУТ, 1998. - Т. 1, Ч. 2. - С. 135-136.

13. Смольський О.С., Явоненко О.Ф. Система вуглеводного обміну еритроцитів як показник функціонування гемоглобіну крові коропа за дії екстремальних факторів водного середовища // Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах: Матеріали 1 Всеукраїнської наук. конф., 27-29 жовтня 1998р. – Тернопіль: ТДПУ, 1998. – С. 63-64.

Смольський О.С. Структурно-функціональні адаптації крові коропа до екстремальних факторів водного середовища. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.17 – гідробіологія. Інститут гідробіології НАН України, Київ. – 1998.

Досліджено комплексну реакцию крові коропа (вміст форм гемоглобіну, його кінетичні і функціональні показники та їх регуляцію, стан систем енергозабезпечення в еритроцитах і ін.) на дію абіотичних факторів водного середовища та за інтоксикацій. Встановлено, що реакція крові риб на інтоксикацію визначається фізико-хімічними властивостями токсиканту: іони свинцю і фенолу викликають в еритроцитах незворотні структурні і метаболічні зміни; іони марганцю, міді і цинку активують більшість процесів адаптивного захисту; аміак викликає відхилення на рівні адаптивної відповіді; спільна дія аміаку та іонів металів є антагоністичною і виступає фактором зниження пошкоджуючої дії кожного токсиканта окремо.

Виявлено ключові характеристики адаптивної відповіді компонентів крові риб на дію екстремальних факторів і запропоновано використовувати їх як показники біоіндикації забруднення водного середовища.

Ключові слова: екстремальні фактори; гемоглобін; спорідненість гемоглобіну до кисню; структурні модифікації білків крові; адаптація; токсикоз.

Смольский А.С. Структурно-функциональные адаптации крови карпа к экстремальным факторам водной среды. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.17 – гидробиология. Институт гидробиологии НАН Украины, Киев. – 1998.

Исследована комплексная реакция крови карпа (содержание форм гемоглобина, его кинетические и функциональные показатели и их регуляция, состояние систем энергообеспечения и др.) на действие абиотических факторов водной среды и при интоксикациях. Установлено, что реакция крови рыб на интоксикацию определяется физико-химическими свойствами токсиканта: ионы свинца и фенола вызывают в эритроцитах необратимые структурные и метаболические изменения; ионы марганца, меди и цинка активизируют большинство процессов адаптивной защиты; аммиак вызывает отклонения на уровне адаптивного ответа; совместное действие аммиака и ионов металлов является антагонистичным и выступает фактором снижения повреждающего действия каждого токсиканта отдельно.

Выявлены ключевые характеристики адаптивного ответа компонентов крови рыб на действие экстремальных факторов и предложено использовать их как показатели биоиндикации загрязнения водной среды.

Ключевые слова: экстремальные факторы; гемоглобин; сродство гемоглобина к кислороду; структурные модификации белков крови; адаптация; токсикоз.

Smolsky A.S. The structure-functional adaptation of carp blood to extremal influences of the water environment. - Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.17. - hydrobiology. The Institute of hydrobiology of National Academy of Sciences of Ukraine,