Національна академія наук України

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології

ім. Р.Є. Кавецького

Міністерство охорони здоров’я України

Український науково-дослідний інститут онкології та радіології

Сидоренко СвІтлана ПавлІвна

УДК: 616-006[.441+.446]:616-097

НОВІ ПОВЕРХНЕВІ АНТИГЕНИ КЛІТИН, ЩО

ВИЯВЛЯЮТЬСЯ МОНОКЛОНАЛЬНИМИ АНТИТІЛАМИ СЕРІЇ ІПО,

ПРИ ЛЕЙКОЗАХ ТА ЛІМФОМАХ

14.01.07 - онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 1998

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Науковий консультант - доктор медичних наук, професор

Глузман Данило Фішелевич,

завідувач відділу імуноцитохімії

Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Офіційні опоненти: - член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Дяченко Наталія Сергієвна,

зав. відділом молекулярної біології вірусів Інституту мікробіології та вірусології

ім. Д.К. Заболотного НАН України

- доктор біологічних наук

Смірнова Ірина Андріянівна, провідний науковий співробітник відділу молекулярних механізмів лейкозогенезу Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України

- доктор біологічних наук, професор

Позур Володимир Костянтинович,

професор кафедри мікробіології та імунології Київського університету імені Тараса Шевченка

Провідна установа - Науковий центр радіаційної медицини АМН України,

Інститут клінічної радіології,

відділ імунології, м. Київ

Захист відбудеться “_23_” грудня 1998 р. о 13.30.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (252022, Київ-22, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту експерименталь-ної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Автореферат розісланий “_19_” листопада 1998 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук І.В. Абраменко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Актуальність проблеми. Більшість лімфоїдних форм лейкозів та лімфом людини - це злоякісні новоутворення В-клітинного походження. Вони включають В-клітинні варіанти гострого лімфобластного лейкозу (ГЛЛ), хронічний лімфолейкоз (ХЛЛ), різноманітні цитологічні варіанти В-клітинних негоджкінських злоякісних лімфом (НЗЛ), волосатоклітинний лейкоз (ВКЛ) та мієломну хворобу (МХ) (Foon K.A. et al., 1988; Барышников А.Ю. и др., 1989; Пинчук В.Г. и др., 1990; Greaves M.F., 1997; Stein H., 1997). Клітинами, що зазнають злоякісну трансформацію, звичайно стають недиференційовані клітини-попередники, в яких процеси проліферації пов’язані з реаранжуванням генів. На цих стадіях диференціювання виникають геномні порушення, які часто проявляються у реаранжуванні між локусами генів імуноглобулінів та прото-онкогенів, тим самим порушуючи процеси проліферації та диференціювання (Бутенко З.А., 1988, 1995; Kipps T., 1993; Korsmeyer S.J., 1988, 1995; Evan G., Littlewood T., 1998). Внаслідок цього різні цитологічні варіанти В-клітинних лейкозів та лімфом характеризуються накопиченням патологічних В-клітин, блок диференціювання яких виник на окремих специфічних стадіях дозрівання (Pinto A. et al., 1994; Foon, 1995; Ghia, Nadler, 1997). Тому вивчення клітинних та молекулярних маркерів, асоційованих з різноманітними стадіями диференціювання лімфоцитів, є ключовим моментом для розуміння клональної проліферації злоякісних клітин та розробки підходів до діагностики, класифікації і терапії лейкозів та лімфом.

На початку 70-х років імунологічні методи почали доповнювати класичні морфологічні та цитохімічні підходи у вивченні стадій диференціювання лімфоцитів, діагностиці та класифікації лейкозів та лімфом. Впровадження гетероантисироваток та реакції розеткоутворення відкрило нові перспективи для лейкозології та заклало основи імунофенотипування лімфоїдних клітин в нормі і при патології (Глузман Д.Ф., 1978; Глузман Д.Ф. и др. 1982; Пинчук В.Г. и др., 1990).

Розробка гібридомної технології отримання моноклональних антитіл (МКАТ) у 1975 році (Kohler G., Milstein C., 1975) розпочала новий етап у розвитку біології. Вчені отримали унікальний інструмент, за допомогою якого можна маніпулювати окремими молекулами і, навіть, окремими антигенними детермінантами, які розпізнаються МКАТ. Це стало сильним стимулом до розвитку онкогематології і особливо ідентифікації та імунофенотипування патологічних клітин при різних цитологічних варіантах лейкозів та лімфом людини (Филатов А.В. и др. 1989; Кадагидзе З.Г., 1990; Барышников А.Ю. и др., 1998; Климович В.Б., 1998).

Пошук нових антигенів лімфоцитів, вивчення їх експресії та функцій, створення панелей МКАТ для імунофенотипування лімфоцитів є одним з головних напрямків розвитку онкогематології та складає основу сучасної диференціальної діагностики, класифікації та імунотерапії лімфоїдних форм лейкозів та лімфом людини. Ці завдання були поставлені в програмах ДКНТ України та Міністерства України у справах науки і технологій, планах науково-дослідних робіт Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України 0.69.05.02.01 Д(с), та 0194UO17021, шифр проблеми 2.28.2.8, а також в міжнародних грантах Американського протиракового товариства (ACS) і Медичного інституту ім. Говарда Х’юза (HHMI грант 75195-548101).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала у розробці нових підходів до підвищення ефективності імунофенотипування лімфоїдних клітин і диференціальної діагностики, класифікації та імунотерапії лейкозів та лімфом людини на основі вивчення нових антигенів диференціювання В-лімфоцитів людини.

До задач дослідження входило:

1. Oтримати панель МКАТ до антигенів диференціювання лімфоцитів людини для використання в онкогематологічних дослідженнях.

2. Вивчити специфічність отриманих МКАТ на різних клітинах-мішенях, що включають лінії клітин різного походження, клітини крові і кровотворних органів в нормі та при різних цитологічних варіантах лейкозів та лімфом людини.

3. З’ясувати динаміку експресії антигенів, що виявляються за допомогою МКАТ серії ІПО (Інститут проблем онкології) при активації та диференціюванні лімфоцитів.

4. Провести біохімічний аналіз антигенів, що розпізнаються МКАТ серії ІПО, з метою їх ідентифікації та кластерування з МКАТ до відомих молекул.

5. Визначити функції антигенів, що виявляються МКАТ серії ІПО.

6. Розробити підходи та рекомендації для імунофенотипування патологічних В-клітин при ГЛЛ, ХЛЛ, ВКЛ, НЗЛ та МХ.

Наукова новизна одержаних результатів.

Виявлено 2 нових поверхневих антигени CD95 та CDw150. Створено першу вітчизняну панель МКАТ до антигенів диференціювання лімфоцитів людини. Вперше одержані МКАТ ІПО-3 проти нового антигена CDw150. Bизначена експресія, структура та функції цього антигена (АГ). Ідентифіковані молекули, що асоційовані з CDw150, та показана роль цього АГ у регуляції диференціювання та запрограмованої смерті клітин, або апоптозу.

Вперше отримані МКАТ ІПО-4 до активаційного АГ СD95, що медіює апоптоз. Вивчена експресія цього антигена в нормі і при лімфоїдних формах лейкозів та лімфом, а також охарактеризовані функціональні особливості СD95. Знайдено, що сигнал через CD40 модулює CD95-опосередкований апоптоз в В-клітинах в нормі та при ХЛЛ.

Показано, що МКАТ ІПО-10 розпізнають поліморфну детермінанту HLA-DR та мають важливе значення для диференціальної діагностики ГЛЛ В-клітинного походження, підваріантів ХЛЛ та високодиференційованих НЗЛ.

Доведено, що МКАТ ІПО-24 виявляють СD37 антиген, та охарактеризована експресія цього АГ в нормі, при активації В-лімфоцитів, а також при різних цитологічних варіантах лімфоідних форм лейкозів і лімфом людини.

За допомогою МКАТ серії ІПО виділені підваріанти В-I ГЛЛ та В-клітинного ХЛЛ, що відрізняються за рівнем диференціювання патологічних клітин, встановлені фенотипічні особливості пухлинних клітин при ВКЛ та високодиференційованих НЗЛ.

Практичне значення одержаних результатів. На основі результатів вивчення експресії антигенів, що виявляються за допомогою МКАТ серії ІПО, моноклональні антитіла ІПО-3, ІПО-4, ІПО-10 та ІПО-24 запропоновані для імунофенотипування, діагностики, класифікації та імунотерапії лімфоїдних форм лейкозів та лімфом людини. Ця панель МКАТ широко використовується для імунофенотипування В-лімфоцитів людини в нормі і при патології в 67 науково-дослідних та практичних закладах України, Росії, Білорусії, Латвії, Литви, Естонії, Грузії, Республіки Куба, Голландії, Великобританії та США. Під керівництвом автора принципами та методами застосування МКАТ серії ІПО для імунофенотипування лімфоцитів оволоділи наукові працівники та лікарі-лаборанти імунологічних лабораторій з 18 наукових та практичних закладів України, Російської Федерації, Білорусії, Латвії, Литви, Естонії та Грузії.

Особистий внесок здобувача. Дисертанту належить ідея отримання панелі МКАТ серії ІПО до антигенів диференціювання В-клітин людини. Вона безпосередньо приймала участь в отриманні гібридом, що секретують МКАТ серії ІПО, а також у вивченні специфічності цих МКАТ. Нею самостійно проведені біохімічні, імунохімічні та функціональні дослідження антигенів, що розпізнаються МКАТ серії ІПО. Самостійно аналізувала весь отриманий матеріал, формулювала всі положення та висновки роботи. Готувала до друку більшість наукових робіт, в яких відображені результати дисертації.

Апробація роботи. Матеріали роботи були представлені та обговорені на Всесоюзних конференціях “Современные методы создания медицинских диагностикумов” (Москва, 1988, 1990), “Актуальные вопросы диагностики заболеваний системы крови” (Сухумі, 1988), “Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований” (Москва, 1989), Республіканській конференції “Механізми канцеро- -і лейкозогенезу" (Київ, 1990), Робочих конференціях країн-членів РЕВ по проблемі “Імунологія пухлин” (Москва, 1987; Рига, 1990), Міжнародних конференціях “Tumor Markers” (Київ, 1990), “Oncodevelopmental Biology and Medicine” (Москва, 1990), “FASEB” (Анахейм, США, 1992); “V International Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens” (Бостон, США, 1993); “ 9th International Congress of Immunology” (Сан-Франціско, США, 1995); “VI International Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens” (Кобе, Японія. 1996), Conferences of Howard Hughes Medical Institute (Прага, 1996, Варшава, 1997 та Будапешт, 1998), “13th European Immunology Meeting”(Aмстердам, 1997), “8th European Congress on Biotechnology” (Будапешт, 1997), “17th International Cancer Congress” (Ріо де Жанейро, Бразілія, 1998).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладений у 60 публікаціях, в тому числі в 4 авторських свідоцтвах, 1 монографії та 35 журнальних статтях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури (три підрозділи), шести розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків і списку цитованої літератури. Дисертація викладена на 287 сторінках машинопису та містить 27 таблиць і 54 рисунка. Список використаних джерел включає 291 найменування, з них 27 - на українській та російській мовах, 264 - на англійській мові.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Гібридоми, що секретують моноклональні антитіла ІПО-3 (IgG1), ІПО-4 (IgM), ІПО-10 (IgG3) та ІПО-24 (IgG2b), були отримані в результаті соматичної гібридизації спленоцитів мишей лінії BALB/c з клітинами мишиної мієломи P3-X63.Ag8.653 та у випадку МКАТ ІПО-24 — 653А сублінії, що була люб’язно надана др. В.Б. Климовичем (Росія). Було використано три варіанти довгострокової імунізації з використанням В-лімфобластоїдної лінії клітин RPMI-1788 (МКАТ ІПО-3 та ІПО-4), В-клітинної лінії Daudi (МКАТ ІПО-10) та клітин селезінки хворого на ВКЛ (МКАТ ІПО-24). Через чотири доби по закінченню імунізації проводили гібридизацію клітин селезінки з клітинами мієломи за допомогою 50% поліетиленгліколю з м.м. 2000 Д за методом Davidson R. та Gerald P. [1978]. Після селекції клітинних гібридів у ГАТ і ГТ середовищах проводили скринінг продукції специфічних антитіл, використовуючи метод імунофлуоресценції у непрямому варіанті на моношарі живих клітин. Після клонування, реклонування і культивування in vitro були відібрані клони гібридом, які активно продукують антитіла до поверхневих антигенів клітин ліній RPMI-1788, Daudi, чи селезінки хворого на ВКЛ. Гібридоми, що секретують МКАТ ІПО-3 та ІПО-10, були отримані та охарактеризовані у співробітництві з к.м.н. О.П. Вєтровою, а гібридоми, що секретують МКАТ ІПО-4 та ІПО-24 — у співробітництві з к.м.н. О.П. Вєтровою, к.б.н. Л.Н. Шлапацькою та к.б.н. А.Г. Бердовою. Всі гібрідоми захищені авторськими свідоцтвами: N 1389284 (ІПО-3), N 1420020 (ІПО-10), N 1684338 (ІПО-4) та N 1705343 (ІПО-24).

В роботі була використана велика панель МКАТ та сироваток, що були отримані від колег, Американської колекції культур клітин (АТСС), IV, V та VI Міжнародних робочих досліджень антигенів диференціювання лейкоцитів та фірми DAKO (Данія). Ця панель включала МКАТ до СD1, СD2, СD3, СD5, СD38, HLA-DR (проф. А.Ю. Баришніков, Росія); СD4, СD7, СD8, СD21 (др. А.В. Філатов, Росія); L та H ланцюгів Ig (др. В.Б. Климович, Росія); СD10, СD19, СD21, СD22, СD23, СD25, СD30, СD37, СD45, (DAKO, Данія), а також МКАТ HD37 анти-СD19 (др. T. Pezzutto, Німеччина), 1F5 анти-СD20, G19-4 анти-СD3 (др. J. Ledbetter, США), MOPC21, W6/32 анти-HLA-I класу та НВ10 анти- HLA-DR (ATCC); G28-1 анти-СD37, G28-5 анти-СD40, G28-10 анти-СD39, G28-8 анти-Bgp95, LB-2 анти-СD54, ВВ-1 анти-СD80, LB-1, 2С3 анти-IgM (др. E.A. Clark, США), BLAST2 та МНМ6 анти-CD23, AD-2 анти-СD73, LN1 анти-СD75, 424/4A11 і 424/3D9 анти-СВ77, B5, HС2, BLAST1, L22, та інші (IV, V та VI Міжнародні робочі дослідження антигенів диференціювання лейкоцитів). Гетероантисироватки та МКАТ до компонентів сигнальних каскадів були придбані у біотехнологічних компаній: Santa Cruz Biotechnology, UBI, Transduction Laboratories та Jackson (США).

Дослідження проводили на 28 лініях клітин людини, що включали лінії клітин В-лімфоцитарного походження: RPMI-1788, PHS, T5-1, 6.16, DB, CESS, MP-1, Raji, Ramos, Daudi, EB-3, Namalwa, REH, Nalm-6, RPMI-8226 та HCLL-7876; Т-клітинні лінії: CEM, MOLT-4, CCRF-HSB2, MT-4, HUT, H9, HPB-ALL, Jurkat, а також клітинні лінії нелімфоїдного походження: К-562, U-937, A-431, Mewo. Ці клітинні лінії були люб’язно надані колекцією клітинних ліній Інституту Цитології АН Росії, АТСС, проф. О.В. Рохліним, проф. Г.І. Абелєвим, проф. А.Ю. Баришніковим і проф. E.A. Clark. Клітини культивували у середовищі RPMI-1640 з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки та стандартних додатків.

В роботі також були використані мононуклеарні клітини периферійної крові, мигдаликів, селезінки, тимусу, лімфатичних вузлів, кісткового мозоку 156 практично здорових осіб та 170 хворих на лейкози та лімфоми, що включали хронічний лімфолейкоз (46), гострий лімфобластний лейкоз (27), гострий мієлобластний лейкоз (11), волосатоклітинний лейкоз (8), негоджкінські злоякісні лімфоми (34), лімфогранулематоз (36) та мієломну хворобу (8). Хворі знаходились на лікуванні у гематологічних відділеннях 25-ї клінічної лікарні, Київської обласної лікарні та 14-ї дитячої спеціалізованої лікарні м.Києва. Діагнози лейкозів та лімфом були поставлені на основі стандартних морфологічних, клінічних та цитохімічних критеріїв у співробітництві з д.м.н. Л.М. Скляренко та к.б.н. В.А. Надгорною при консультації д.м.н., проф. Д.Ф. Глузмана. Імуногістологічні та ультраструктурні дослідження кріостатних зрізів лімфатичних вузлів проведені разом з к.б.н. О.В. Юрченко. Морфологічний, цитохімічний та ультраструктурний аналіз клітин проводили за стандартними методиками (Глузман Д.Ф. и др., 1982; Пинчук В.Г. и др., 1990).

Мононуклеарні клітини виділяли з крові та кровотворних органів в градієнті щільності фіколл-верографін (d=1,077 г/см3), чи використовуючи Lymphoprep (Pharmacia, Швеція). Т- і В-клітини розділяли після реакції розеткоутворювання з еритроцитами барана (Clark E.A., Shu G., 1986), а Е--клітини розділяли на фракції різної щільності у градієнті 60%, 55%, 50% та 45% перколлу (Pharmacia, Швеція) (Clark E.A. et al., 1989).

Очищення МКАТ, кон’югація з флуоресцеїн ізотіоціанатом (ФІТЦ), біотином (Н-hydroxysuccinimidobiotin) та СNBr-активованою сефарозою 4В проводилися за стандартними методиками (Clark E.A. et al., 1986). Поверхневі та цитоплазматичні АГ клітин виявляли за допомогою слідуючих імуноцитохімічних методів: 1) Непрямий імунофлуоресцентний метод з використанням МКАТ та F(ab’)2 фрагментів вторинних антитіл проти мишачих Ig, мічених ФІТЦ (TAGO, США). 2) Непрямий імунофлуоресцентний метод з використанням біотинільованих МКАТ та стрептавідину, кон’югованого з ФІТЦ, або з фікоеритрином (ФЕ). 3) Прямий імунофлуоресцентний метод з використанням МКАТ, кон’югованих з ФІТЦ, або з ФЕ. 4) Непрямий імуноферментний метод з використанням МКАТ та вторинних антитіл, мічених пероксидазою хрону (DAKO, Данія). 5) Непрямий імуноферментний метод з використанням біотинільованих МКАТ та стрептавідину, кон’югованого з пероксидазою хрону (Sigma, США). 6) ПАП-метод (пероксидаза-анти-пероксидаза) з використанням МКАТ, вторинних кролячих антитіл проти Ig мишей та комплексу МКАТ проти пероксидази з пероксидазою хрону (др. В.Б. Климович, Росія).

Флуоресцентний аналіз проводили на моношарі живих чи фіксованих клітин, що прикріплювали до предметних скелець, оброблених розчином полі-L-лізину (Sigma, США), і оцінювали реакцію за допомогою імунофлуоресцентного мікроскопа. Також одно- та двокольоровий аналіз проводили на проточному цитофлуориметрі FACScan (Becton Dickinson, США), використовуючи показник ПФІ (пік флуоресцентної інтенсивності), що складає відношення лінійних флуоресцентних інтенсивностей препарату, що вивчається, і контролю (Clark E.A. et al., 1989).

Функціональні тести включали: оцінку проліферативної активності клітин, зміни рівня внутриклітинного Са2+ [Са2+]і, індукцію та модуляцію запрограмованої смерті клітин (апоптозу). Клітини культивували у квадриплікатах з додаванням одного чи більше стимуляторів: антитіл проти IgM, IL-4, РМА, різних мітогенів та МКАТ. Після культивування від 30 хвилин до 7 діб клітини збирали, виявляли на них поверхневі АГ, оцінювали рівень апоптозних клітин, або культивували 18 годин з 0,5 мкСі [3H]-тимідину на лунку. Радіоактивно мічені клітини збирали на фільтри та вимірювали радіоактивність у сцинтиляційному лічильнику (Becton Dickinson, США). Для вимірювання рівня внутриклітинного [Са2+]і клітини були насичені ацетоксіметиловим ефіром Indo-1 (Molecular Probes, США). Зміни рівня [Са2+]і вимірювали за допомогою проточної цитофлуориметрії на FACSstar аналізаторі (Becton Dickinson, США). Для оцінки рівня апоптозних клітин в популяції ми використовували чотири методи фарбування клітин: 1) аннексін V, кон’югований з ФІТЦ (Clonteck, США); 2) Hoechst 33342 (Sigma, США); 3) Propidium Iodide (Sigma, США); 4) стандартні морфологічні та цитохімічні методики.

В роботі були використані слідуючі біохімічні методи: реакція імунопреципітації, метаболічне та хімічне мічення поверхневих антигенів клітин, електрофорез у поліакріламідному гелі з додецилсульфатом Na (ДДС), Western блоттінг, кіназна реакція in vitro, фосфоамінокислотний аналіз, виділення субклітинних фракцій шляхом азотної кавітації та ультрацентрифугування (Leprince C. et al., 1992; Sidorenko S.P., Clark E.A., 1993; Sidorenko S.P. et al., 1995). Мічення поверхневих антигенів включало: радіойодування поверхневих АГ клітин Na125І, біотиніляцію поверхні клітин, а також метаболічне мічення з використанням 32Р-ортофосфату Na, 35S-треонiну, 35S-метiонiну, 3Н-маннози та 3Н-фукози. В деяких експериментах імунопреципітовані білки були деглікозильовані за допомогою ферменту Endo F деглікозидази (Boehringer Mannheim, Німеччина) та десіалізовані при обробці нейрамінідазою (Sidorenko S.P., Clark E.A., 1993). Статистичну обробку отриманих результатів дослідження проводили із розрахуванням середньої величини, похибки середньої величини, значення відмінностей між окремими вибірками. Результати вважали достовірними при коефіцієнті вирогідності р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Експресія, біохімічні властивості та функції антигенів, що виявляються

МКАТ ІПО-3, ІПО-4, ІПО-10 та ІПО-24

З метою пошуків нових поверхневих антигенів клітин була створена панель моноклональних антитіл, що включає МКАТ ІПО-3, ІПО-4, ІПО-10 та ІПО-24. Специфiчнiсть цих МКАТ вивчали на клiтинних лiнiях рiзного походження та мононуклеарах периферійної кровi, мигдаликів, тимусу та кiсткового мозку.

Гiбридому, що секретує МКАТ IПО-3 (IgG1), було сконструйовано у 1983 роцi після iмунiзації клiтинами лiнiї RPMI-1788. МКАТ IПО-3 реагували з В-лiмфобластоїдними клiтинними лiнiями, В-клiтинними лiнiями Raji, EB-3, Namalwa, Daudi, а також НCLL-7876, що походить з ВКЛ. Більшість Т-клiтинних лiнiй були негативними, і тільки на поверхні клітинної лінії HPB-ALL ІПО-3 антиген можна виявити за допомогою проточної цитофлуориметрії. Цей АГ не був виявлений на поверхнi В-клiтинних лiнiй Ramos, RPMI-8226, Nalm-6, REH. Негативними також були нелiмфоїднi клiтиннi лiнiї (табл. 1).

Таблиця 1

Взаємодiя МКАТ серії ІПО з лiнiями клiтин

Клiтиннi лiнiї | Антиген-позитивні клітини (%)

походження | назва | ІПО-3 | ІПО-4 | ІПО-10 | ІПО-24

В-лiмфо- | RPMI-1788 | 51,2+7,2 | 41,2+3,6 | 0 | 50,0+7,5

бластоїднi | МР-1 | 87,4+3,2 | 89,5+7,4 | 90,5+5,6 | 37,5+4,2

T5-1 | 82,5+6,5 | 57,7+6,1 | 98,0+0,5 | 19,6+1,5

DB | 48,3+4,1 | 17,5+1,2 | 61,0+4,3 | 27,0+4,3

CESS | 80,1+3,3 | 24,0+3,1 | 74,5+6,5 | 21,0+1,5

6.16 | 69,0+5,7 | 38,6+4,4 | 91,3+2,7 | 17,5+2,6

PHS | 48,8+2,7 | 35,0+2,7 | 20,0+3,3 | -

Пре-В | Nalm-6 | 0 | 0 | - | 0

REH | 0 | 0 | - | 0

ВКЛ | HCLL-7876 | 80,5+6,6 | 31,1+0,7 | 14,5+2,5 | 17,0+4,3

Лiмфома | Raji | 34,0+2,3 | 59,0+3,9 | 86,0+7,4 | 55,1+6,6

Беркiтта | Ramos | 0 | 40,0+2,5 | 0 | 87,0+5,7

EB-3 | 15,7+1,9 | 10,0+0,3 | 31,0+2,6 | 0

Namalwa | 24,0+0,5 | 45,0+2,0 | 82,0+5,7 | 78,5+4,0

Daudi | 32,5+1,5 | 1,5+0,5 | 95,0+1,3 | 80,0+7,1

Miєлома | RPMI-8226 | 0 | 0 | 50,0+2,5 | 0

Т-клiтиннi | CEM | 0 | 10,0+2,1 | 0 | 0

лiнiї | Jurkat | 0 | 61,0+8,3 | 0 | 0

CCRF-HSB2 | 0 | 10,0+2,0 | 0 | 0

MT-4 | 0 | 14,5+0,5 | 0 | 0

HPB-ALL | 28,0+7,5 | 11,5+1,0 | 0 | 0

HUT-78 | 0 | 0 | 0 | 0

MOLT-4 | 0 | 0 | 0 | 0

Нелiмфоїднi | К-562 | 0 | 0 | 0 | 0

лiнiї | HL-60 | 0 | 0 | 0 | 0

U937 | 0 | 0 | 0 | 0

А-431 | 0 | 0 | 0 | 0

MEWO | 0 | 0 | 0 | 0

Бiля 8% мононуклеарiв мигдаликів несли цей АГ, причому це були В-клiтини, так як вони експресували CD19 та CD20 і не несли CD3 i CD2. На IПО-3+ клiтинах був також виявлений CD23. Рiвень експресiї IПО-3 АГ на В-клiтинах мигдаликів залежав вiд щільності клiтин у градiєнтi перколу: для найлегших клiтини (iнтерфаза 50/55 та 45/50) характерна висока щільність IПО-3 АГ. Цей антиген не був експресований на CD19+ чи CD20+ В-клiтинах периферiйнiї кровi, але був виявлений в низькiй щільності на CD3+ Т-клiтинах кровi, якi також несли CD4 чи CD8. Бiля половини IПО-3+ Т-клiтин кровi мали CD25 АГ i були CD45RO+, але CD45RA-. Цi результати показують, що IПО-3 АГ експресований на активованих Т-клiтинах i на Т-клiтинах пам’ятi.

Бiльша половина тимоцитiв була IПО-3+, причому IПО-3+ клiтини були CD45RO+, але CD45RA-. Вони також експресували CD4 разом з CD8, але мали вiдносно низьку щільність CD3. IПО-3 антиген не був виявлений на Е+CD16+ клiтинах (NK клiтини), чи на нестимульованих чи активованих -iнтерфероном моноцитах, але дендритичні клітини, виділені з периферійної крові, несли цей антиген. IПО-3 антиген не був виявлений на клiтинах ембрiональної печiнки, гранулоцитах, еритроцитах, мiєло-карiоцитах та стромальних фiбробластах кiсткового мозку. На крiостатних зрiзах лiмфaтичних вузлiв та мигдаликів МКАТ IПО-3 фарбувало тiльки зародковi центри В-клiтинних фолiкулiв та ендотелiальнi клiтини.

Пiсля стимуляцiї лiмфоцитiв периферiйної кровi за допомогою мiтогенiв ФГА, СоnА, PWM рiвень позитивних клiтин зростав від 4.5% до 12,6 - 23,5%. Слiдуючим етапом стало вивчення експресiї IПО-3 АГ на iзольованих популяцiях Т- i В-клiтин, що були активованi через специфiчнi рецептори. МКАТ до CD40, CD20, чи Bgp95, або анти-IgM разом з анти-CD40, були найбiльш ефективними в пiдвищеннi експресiї IПО-3 антигену. У той же час самi анти-IgM МКАТ, IL-4 чи РМА були менш ефективними, а стимуляція -iнтерфероном не викликала підвищення рівня експресії ІПО-3 антигену. Активацiя Т-клiтин через ТКР за допомогою анти-СD3 МКАТ, чи анти-СD3 в комбiнацiї з анти-CD28, пiдвищувала експресiю IПО-3 антигену. У той же час РМА та анти-CD28 самi не змiнювали його експресiю. Отже, як на Т-, так i на В-лiмфоцитах експресiя IПО-3 АГ пiдвищується пiсля активацiї, але кiнетика такого пiдвищення рiзна. На В-клiтинах рiвень IПО-3 АГ пiдвищувався на протязi 6 годин пiсля активацiї, досягаючи максимуму через 24 години. У той же час, на Т-клiтинах експресiя IПО-3 АГ досягала максимуму лише на 3 добу пiсля активацiї.

МКАТ IПО-3 iмунопреципiтували з радiойодованих, або біотинільованих клiтинних лiнiй Т5-1, 6.16, CESS та HCLL-7876 антиген з м.м. 75-95 кД. У нередукуючих умовах IПО-3 антиген мiгрував на 5 кД нижче, що є свiдоцтвом того, що цей антиген є одноланцюговою молекулою з внутриланцюговими дисульфiдними зв’язками. Деградацiя IПО-3 iмунопреципiтатiв за допомогою деглікозідази Еndo F, пiсля якої м.м. бiлкового ядра IПО-3 становила 42 кД, вказує на наявність N-зв’язаних олiгоцукрових бокових ланцюгів. Iнкубацiя з нейрамiнiдазою приводила до зниження м.м. IПО-3 АГ приблизно на 10 кД, що свiдчить про присутнiсть термiнальних залишкiв сiалової кислоти на цукрових ланцюгах.

Для з’ясування можливостi асоцiацiї IПО-3 АГ з кiназними активностями, ми провели кiназну реакцiю in vitro на IПО-3 iмунопреципiтатах з лiзатiв клiтинних лiнiй Т5-1, CESS та Jurkat. Як в NP-40, так i в дигiтонiнових лiзатах IПО-3 антиген був асоцiйований як серин/треонiн, так i з тирозин кiназними активностями. Фосфоамiнокислотний аналiз білкового ядра ІПО-3 АГ виявив фосфорилювання по тирозину. Епiтоп, що розпiзнають МКАТ IПО-3, був чутливий до обробки трипсином, але нечутливим до нейрамiнiдази. Iнкубацiя клiтин з тунiкамiцином - iнгiбiтором N-глiкозилювання, зменшувала рiвень експресiї IПО-3 АГ бiльш нiж на 50%.

В рамках VI Мiжнародного робочого дослiдження антигенiв диференцiювання лейкоцитiв, що проходило у 1994-1996 роках, нами було показано, що МКАТ ІПО-3 та А12 виявляють один і той же АГ. Для цього була проведена трансфекція клітин лінії COS комплементарною ДНК (pSURslam1), що кодує SLAM (signalling lymphocyte activation molecule). МКАТ А12 та pSURslam1 кДНК були люб’язно надані Dr. G.Aversa (США). Тільки МКАТ ІПО-3 та А12 специфічно реагували з трансфектантами. Конкурентне пригнічування зв’язування антитiл IПО-3 з використанням МКАТ A12 показало, що ці антитіла розпізнають різні епітопи одного АГ. Виходячи з цього, на VI Мiжнародній конференції по антигенам диференцiювання лейкоцитiв (Японія, 1996), АГ, який розпізнають МКАТ ІПО-3, отримав міжнародну номенклатуру CDw150 (Mason D.Y. et al., 1997; Zola H. et al., 1997).

Факти, що IПО-3 антиген (CDw150) асоцiйований з протеїн кiназними активностями, та його експресiя пiдвищується пiсля активацiї, є показниками активної ролi цього АГ у процесах В-клiтинної активацiї. З метою вивчення такої можливостi, ми iнкубували клiтини з МКАТ IПО-3 в присутностi потенцiйних костимуляторiв. Зв’язування CDw150 антитiлами не викликало пролiферацiї та не змiнювало пролiферативної вiдповiді щільних В-клiтин мигдаликів на анти-IgM, анти-IgM+IL-4, чи анти-CD20. У той же час МКАТ IПО-3 у концентрацiях вiд 1,0 до 5,0 г/мл суттєво пiдвищувало В-клiтинну вiдповiдь на IL-4, анти-СD40, IL4+анти-СD40, чи РМА. Додавання МКАТ IПО-3 у культури Т-клiтин в комбiнацiях з анти-СD3, анти-СD2, анти-СD4, анти-СD28 та РМА не впливало на пролiферативну вiдповiдь Т-клiтин периферiйної кровi, за виключенням дворазової iнгiбiцiї стимуляцiї за допомогою субоптимальних концентрацiй анти-СD3, або анти-СD3+анти-СD28.

Оскiльки сигнал через CDw150 був костимуляторний з IL-4 та анти-СD40, якi передають сигнали прогресiї, ми висунули гіпотезу, що цей сигнал може бути сигналом компетенцiї для В-клiтин. Пiдвищення рiвня внутриклiтинного вiльного Са2+ є найпершою вiдповiддю В-клiтин на компетентнi сигнали через IgM та СD19 (Clark E.A., Lane P., 1991). Сигнал через CDw150 приводив до підвищення [Са2+]і в 30-50% В-клiтин мигдаликів, що знаходились в стані спокою. Проте, число вiдповiдаючих клiтин було меншим, ніж при стимуляцiї через IgM, і цi клiтини реагували на 40 секунд пiзнiше. При аналiзi розподiлення В-клiтин по фазах клiтинного циклу пiсля зв’язування CDw150 (забарвлення акридиновим оранжевим) спостерiгалась така ж картина, як i при стимуляцiї через IgM - B-клiтини входили в G1 фазу клiтинного циклу. Таким чином, сигнал, що передається у В-клiтини через CDw150, є сигналом компетенцiї. МКАТ IПО-3 не викликають пролiферацiї В-клiтин, але мають костимуляторний ефект разом з сигналами пролiферацiї: анти-CD40, IL-4 та РМА.

Гiбридому, що секретує МКАТ IПО-4 (IgM), було сконструйовано у 1983 р. після iмунiзації клiтинами лiнiї RPMI-1788. МКАТ IПО-4 реагує з клітинними лініями як Т- так і В-клiтинного походження (табл.1). Цей АГ не був виявлений на деяких В-клiтинних лiнiях: Daudi, RPMI-8226, Nalm-6, REH; Т-клiтинних лiнiях HUT-78, MOLT-4, а також нелiмфоїдних клiтинних лiнiях.

Hизька щільність цього АГ була виявлена на 5-10% Т-, В-, NK клiтин та моноцитiв. Двокольоровий аналiз показав, що МКАТ IПО-4 реагують переважно з CD2+CD3+CD45RA-CD45RO+ Т-клiтинами, які представленi активованими лімфоцитами, чи клiтинами пам’ятi. Не було переважної експресiї IПО-4 АГ на CD4+ або CD8+ клiтинах. Двокольорове фарбування клiтин периферiйної кровi та мигдаликів показало присутнiсть IПО-4 антигена на CD19+CD20+ B-лiмфоцитах. IПО-4 АГ не був виявлений на клiтинах ембрiональної печiнки, гранулоцитах периферiйної кровi, мiєлокарiоцитах та стромальних фiбробластах кiсткового мозку. На крiостатних зрiзах лiмфaтичних вузлiв та мигдаликів МКАТ IПО-4 фарбувало переважно зародковi центри В-клiтинних фолiкулiв та ендотелiальнi клiтини.

Пiсля стимуляцiї лiмфоцитiв периферiйної кровi за допомогою мiтогенiв ФГА, СоnА, PWM рiвень позитивних клiтин зростав з 1,5-7,5% до 11,7-21,7%. Рiвень експресiї IПО-4 АГ пiсля активацiї пiдвищується як на Т-, так i на В-клiтинах, причому пiдвищується не тiльки число позитивних клiтин, але також щільність антигена на клiтинних мембранах. Експресiя IПО-4 АГ на Т-клiтинах зростала пiсля стимуляцiї Con A, активацiї через CD3 разом з CD28, чи за допомогою РМА. Стимуляцiя через IgM, або СD20 не давала пiдвищення рiвня IПО-4 АГ, але активацiя через CD40 вже через 24 години приводила до зростання пiку флуоресцентної iнтенсивностi з 2,82 до 5,27. Комбiнацiї анти-СD40 МКАТ разом з анти-IgM чи IL-4, а також РМА були навiть бiльш ефективними.

Пiсля метаболiчного мiчення з використанням 3Н-манози та 3Н-фукози МКАТ IПО-4 iмунопреципiтували у редукуючих умовах глікопротеїд з м.м. 42-46 кД.

З метою вивчення функцiй АГ, який розпiзнають МКАТ IПО-4, цi антитiла були випробовані у пролiферативному тестi. Щільні В-клiтини мигдаликів культивували у середовищi з 10% ЕТС чи з додаванням МКАТ IПО-4 у комбiнацiї з рiзними В-клiтинними стимуляторами: МКАТ до IgM, CD20, CD40 та IL-4 чи РМА. Додавання МКАТ IПО-4 у культури В-лiмфоцитiв разом з анти-IgM, анти-CD20, анти-CD40, анти-CD40+РМА або IL-4 практично не змiнювало пролiферативної активності В-клiтин. У той же час МКАТ IПО-4 вдвiчi пригнічували пролiферацiю В-клiтин, стимульованих анти-CD40+IL-4 або РМА. Oскiльки МКАТ IПО-4 пригнічували пролiферативну активнiсть В-клiтин при стимуляцiї, що веде до диференцiювання, постало питання, чи викликане таке пригнічування зниженням пролiферативної активностi, чи можуть МКАТ IПО-4 впливати на життєздатнiсть В-клiтин? Клiтини лiнiї Ramos можуть служити за модель для вивчення апоптозу (Valentine M.A., Licciardi K.A., 1992). Додавання МКАТ IПО-4 в культуральне середовище викликало смерть у 10,2+2,7% клiтин, а контрольнi культури мали 4,76+1,3% мертвих клiтин. МКАТ IПО-4 у комбінацiї з антитiлами проти IgM приводили до зростання вiдсотку мертвих клiтин до 24,8+4,3%. Таким же високим був рiвень мертвих клiтин при комбiнацiї анти-IgM+СD40+IПО-4. При оцiнцi процесу апоптозу за числом клiтин з фрагментованою ДНК, виявлено зростання апоптозу після інкубації з МКАТ ІПО-4 у 2,5 рази, а в комбiнацiї з анти-IgM - бiльш як у 5 разiв, нiж в контрольних культурах, що становить майже половину клiтин в культурах. Культивування клітин інших ліній, наприклад, Jurkat, Namalwa, Raji, MP-1, CESS, RPMI-1788, в присутності МКАТ ІПО-4 (0,5-10 мкг/мл) також викликало апоптоз в 30-96% клітин.

Результати бiохiмiчних дослiджень, вивчення експресiї та функцiональних властивостей вказують, що МКАТ IПО-4 виявляють Fas/Apo-1 антиген, який медiює апоптоз - запрограмовану смерть клiтин. МКАТ IПО-4 було включено до V Мiжнародного робочого дослiдження антигенiв диференцiювання лейкоцитiв. Аналiз в рiзних лабораторiях показав, що МКАТ IПО-4 разом з трьома iншими МКАТ АРО-1, Fas та 7С11 розпiзнають АРО-1/Fas антиген, який отримав номенклатуру CD95 (Robertson M., Ritz J., 1994).

Гiбридому, що секретує МКАТ IПО-10 (IgG3), було сконструйовано у 1984 роцi після iмунiзації клiтинами лiнiї Daudi. МКАТ IПО-10 реагують з поверхневим АГ на клiтинах лiнiй Daudi, Namalwa, Raji, EB-3 i не взаємодіють з клiтинами лiнiї Ramos (табл.1). Висока щільність цього АГ була виявлена на більшості В-лімфобластоїдних ліній, проте, тiльки 20,0%+3,3 клiтин PHS несли цей АГ, а клiтини лiнiї RPMI-1788 були негативними. IПО-10 антиген був вiдсутнiй на поверхневих мембранах клiтин лiнiй Т-лiмфоцитарного та нелімфоїдного походження. Цей АГ експресований на 11,5-29,4% мононуклеарiв периферiйної кровi, 45-55% клітин мигдаликів та лiмфатичних вузлiв, а також на мiєлокарiоцитах та лiмфоцитоподiбних клiтинах ембрiональної печiнки. Гранулоцити, тимоцити, еритроцити та стромальнi фiбробласти кiсткового мозку були негативними.

Конкурентне пригнічення зв‘язування антитіл показало, що взаємодія МКАТ ІПО-10 з антигеном не блокується МКАТ проти CD19, CD20, CD21, CD24, CD72, CD74, CD78, HLA-DQ, HLA-DP, але частково може бути заблокована МКАТ проти мономорфної детермінанти HLA-DR (HB10). Це дозволило зробити висновок, що МКАТ ІПО-10 розпізнають антигенну детермінанту, що належить до HLA-DR. Оскільки МКАТ ІПО-10 не реагували з клітинами Ramos та RPMI-1788, на яких експресовані мономорфні детермінанти HLA-DR, МКАТ ІПО-10 очевидно розпізнають поліморфну детермінанту HLA-DR. Важливо, що інкубація з МКАТ до CDw78, що розпізнають епітопи HLA-DR і HLA-DQ (Funderud et al., 1997), призводила до підвищення рівня експресії АГ, що його розпізнають МКАТ ІПО-10.

В крiостатних зрiзах мигдаликів та лiмфатичних вузлiв МКАT IПО-10 фарбувало В-клiтиннi фолiкули та поодинокi клiтини у мiжфолiкулярнiй зонi. Це антитiло реагувало як з клiтинами мантiї, так i з зародковими центрами лiмфоїдних фолiкулiв. IПО-10 антиген був також виявлений у цитоплазмi гiстiоцитiв та макрофагiв.

Слідуючим етапом встановлення специфічності МКАТ ІПО-10 було вивчення експресії АГ, що визначається МКАТ ІПО-10, на клітинах бласттрансформованих культур. Через 24 години в культурах клітин, стимульованих LPS, не було відмічено суттєвих змін в кількості клітин, що реагують з МКАТ ІПО-10. На другий день культивування їх число зменшилось вдвоє порівняно з початковим рівнем (19,8+2,4% та 9,1+1,3% відповідно). В подальшому було відмічено різке підвищення експресії антигена, що виявляється МКАТ ІПО-10. На 4-ту добу стимуляції число ІПО-10+ клітин зростало до 23,5+2,1%. Паралельно була вивчена динаміка експресії АГ, що визначається МКАТ ІКО-1 (проф. А.Ю. Баришников, Росія) і направлені до мономорфної детермінанти HLA-DR. В культурах лімфоцитів до додавання PWM ІПО-10+ клітини становили 15,1+1,8%,а ІКО-1+ клітини - 14,9+2,7%. Пік експресії антигенів, що визначаються цими антитілами, спостерігали на 7-й день культивування. Він досягав 27,3+3,2% для АГ, що виявляється МКАТ ІПО-10, та 26,7+2,7% для HLA-DR, але динаміка експресії цих антигенів на 2-6 добу була різною. Число ІКО-1+ клітин поступово зростало, а ІПО-10+ клітин - різко падало на другу добу, часом досягаючи нуля, а починаючи з 4 доби зростало і на 7 добу досягало максимума. ConA та ФГА не впливали на відносну кількість клітин, що реагують з МКАТ ІПО-10.

Для бiохiмiчного аналiзу АГ, що реагує з МКАТ IПО-10, поверхневi антигени клiтин лiнiй Т5-1 та Raji були мiченi 125I, і після солюбілізації клiтин МКАТ IПО-10 преципiтували димер м.м. 33/28 кД. Метаболiчне мiчення 35S-метiонiном та 35S-цистеїном також виявило подібну біохімічну структуру IПО-10 АГ. Оскiльки зв’язування МКАТ IПО-10 з клiтинами було тільки частково блоковане МКАТ до мономорфної детермiнанти HLA-DR, зроблено висновок, що 33 кД полоса вiдповiдає -ланцюгу, а 28 кД - -ланцюгу HLA-DR, але МКАТ ІПО-10 виявляють поліморфну детермінанту HLA-DR.

Гiбридому, яка секретує МКАТ IПО-24 (IgG2b), було сконструйовано у 1986 роцi після iмунiзації клiтинами селезiнки хворого на волосатоклітинний лейкоз. Це антитiло реагувало з АГ на поверхнi більшості клiтинних лiнiй, що мають В-лiмфоцитарне походження. Проте, ІПО-24 антиген не був виявлений на поверхнi пре-В-клiтинних лiнiй Nalm-6, REH, а також мієломної лінії клітин RPMI-8226. Негативними були нелiмфоїднi і Т-клiтиннi лiнiї (табл. 1).

МКАТ ІПО-24 реагувало з 8,0-14,0% мононуклеарiв периферiйної кровi та 28,0-65,0% клiтин лiмфатичних вузлiв та мигдаликів. Двокольорове фарбування клiтин периферiйної кровi та мигдаликів показало присутнiсть IПО-24 АГ практично на всіх CD19+CD20+ B-лiмфоцитах, але дуже низька щільність цього АГ була знайдена також на 2,5-7,5% CD3+ Т-лiмфоцитах. В крiостатних зрiзах мигдаликів МКАТ IПО-24 виявляло лiмфоцити мантiйної зони та зародкових центрiв лiмфоїдних фолiкулiв, причому найбiльш виражена реакцiя вiдзначалася у мантiйнiй зонi. Т-клiтиннi зони залишались нефарбованими. Макрофаги та дентритичнi клiтини також були негативними. Антиген, що виявляють МКАТ IПО-24, присутнiй не тiльки на поверхнi лiмфоцитiв, але також i в цитоплазмi клiтин. Проте, він не був виявлений на клiтинах ембрiональної печiнки, гранулоцитах периферiйної кровi, мiєлокарiоцитах та стромальних фiбробластах кiсткового мозку.

Конкурентне пригнічування зв’язування антитiл виявило, що МКАТ IПО-24 розпiзнають антиген CD37: зв’язування антитiл IПО-24 було повнiстю блоковане вiдомими анти-CD37 МКАТ (G28-1), у той же час МКАТ до CD19, CD20, CD21, CD22, CD72, CD76 та HLA-DR не пригнічували взамодiю МКАТ IПО-24 з антигеном.

Аналіз властивостей МКАТ IПО-24 в рамках V та VI Мiжнародних робочих дослiджень антигенiв диференціювання лейкоцитiв пiдтвердив, що МКАТ IПО-24 разом з 6 iншими МКАТ розпiзнають СD37 антиген (Schlossman S.F. et al., 1995; Kishimoto T. et al., 1997).

Оскільки CD37 виявлений на зрiлих В-клiтинах i рiвень цього антигена знижений на В-лiмфобластоїдних лiнiях, ми поставили собi за мету дослiдити, як змiнюється рiвень експресiї цього АГ пiсля активацiї В-лiмфоцитiв. При тих типах стимуляцiї, де домiнують процеси пролiферацiї (анти-IgM, анти-CD40), змiни рiвня експресiї CD37 на протязi трьох дiб були несуттєвими. Активацiя, що веде до диференцiювання (анти-IgM+анти-CD40, анти-IgM+IL-4, анти-CD20 та РМА), приводила до рiзкого зниження числа позитивних клiтин та рiвня експресiї CD37 АГ. Це вказує, що В-лiмфоцити гублять цей АГ з поверхнi