ІНСТИТУТ ЕНДОКРИНОЛОГІЇ ТА ОБМІНУ РЕЧОВИН

ім. В.П.Комісаренка АМН України

Салех Дж. М. Абу Жаяб

УДК: 577.175.62:616-089.843:615.361.014.41

КОРЕКЦІЯ АНДРОГЕННОЇ ФУНКЦІЇ

У ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ТВАРИН

ШЛЯХОМ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ НАТИВНИХ

І КРІОКОНСЕРВОВАНИХ ОРГАННИХ КУЛЬТУР сім’яників

14.01.14 – ендокринологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: | доктор біологічних наук, професор

Бондаренко Тетяна Петрівна

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини

НАН України, завідувач відділу кріобіохімії та фармакології нейрогуморальних систем, м. Харків

Офіційні опоненти: | доктор медичних наук, професор, член-кореспондент

НАН і АМН України

Резніков Олександр Григорович

Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, завідувач відділу ендокринології репродукції і адаптації, м. Київ

доктор медичних наук, професор

Бобирьова Людмила Єгорівна

Українська медична стоматологічна академія, завідувач кафедри ендокринології з лікувальною фізкультурою та спортивною медициною, м. Полтава

Провідна установа: | Івано-Франківська державна медична академія, кафедра ендокринології, м. Івано-Франківськ

Захист відбудеться 22.06.2004 року о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.558.01 з ендокринології в Інституті ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 69).

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 69).

Автореферат розіслано 20.05.2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Калинська Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сьогодні одним із підходів до вирішення проблем гормональної недостатності ендокринних залоз, що розвивається при тривалій гормональній терапії і супроводжується, як правило, розвитком гормоно-залежного стану пацієнтів, є трансплантація ендокринних тканин неонатальних поросят у вигляді органотипових культур [Егоров У.И., 1994, Турчин И.С., 2000]. Даний підхід дозволяє сформувати в організмі реципієнта у випадку з тканинами сім’яників функціонуюче депо стероїдних гормонів. Розвиток технології клітинного й органотипового культивування [Алієв М.А., 2000, Гаврилюк Б.К., 1983] ендокринного матеріалу і низькотемпературних технологій [Белоус А.М., 1986, Грищенко В.И., 1997, Morris G.J., 1998] сприяють створенню низькотемпературних запасів біологічного матеріалу різних тканин, що тривалий час зберігає свої морфофункціональні характеристики. Остання обставина дозволяє впритул підійти до вирішення питань, пов'язаних із розробкою нових підходів до розв’язання проблем компенсації гормонального статусу організму.

У нормальному стані існує гармонійний баланс між активністю ендокринних залоз, станом нервової системи і відповіддю тканин-мішеней [Старкова П.Т., 1991]. Будь-яке порушення в кожній з цих ланок швидко призводить до відхилення від норми. Надлишкова чи недостатня продукція гормонів спричинює різні захворювання, що супроводжуються глибокими біохімічними змінами в організмі [Шмидт Р., 1996]. Продукцію тестикулярних гормонів контролюють гонадотропіни [Sandrin M.S., 1995, Takamatsu I.I., 1999]. Порушення ендокринної функції сім’яників зводиться в більшості випадків до недостатності секреції андрогенів. Наприклад, гіпогонадизм – це зниження функції сім’яників, включаючи секрецію тестостерону. На сьогодні гормональна терапія здатна компенсувати недостатню секрецію практично будь-якої ендокринної залози. Однак вона не завжди дає очікуваний результат. В разі тривалої гормональної терапії відбувається розвиток вторинної недостатності (дистрофії) відповідної залози, чого не спостерігається при трансплантації органотипових культур. Окрім того, трансплантат органотипових культур підлягає регуляції з боку нейрогуморальної системи. Серед описаних способів лікування шляхом трансплантації ендокринних тканин тварин людині, добре відомий терапевтичний ефект нативної органотипової культури ендокринних тканин новонароджених поросят [Бондаренко Т.П., 2000, Кобяков С.К., 1999, Потиха О.П., 2000, Сичинава Р.М., 2000]. Проте широке впровадження в клініку даного методу обмежене через необхідність індивідуального вирощування культур для кожного пацієнта, а також ускладнюється проблемами, пов'язаними з доставкою даного матеріалу в клініку і повноцінним тестуванням його на стерильність [Голубєв Д.Б., 1976]. Дослідження з кріоконсервування органотипових культур ендокринних тканин, що з'явилися останнім часом [Бондаренко Т.П., 1999, Геращенко А.В., 2002, Самченко И.И., 2003], дозволяють говорити про принципову можливість впровадження в практику методу трансплантації кріоконсервованого ендокринного матеріалу. Але на сьогодні залишається відкритим питання про вплив процесів кріоконсервування на органотипові культури тканин сім’яників. Є лише роботи з проблеми кріоконсервування тканин ембріональних сім’яників людини [Керос В.А., 2001]. Невідомо також, чи буде кріоконсервований матеріал забезпечувати таку ж компенсаторну функцію в організмі реципієнта, як і нативний, у випадку його трансплантації. Залишається відкритим питання і про те, чи будуть кріопротектори, використані при формуванні середовищ для кріоконсервування, змінювати функціональні характеристики органотипових культур і чи будуть клітини органотипових культур підлягати принципам функціонування ендокринних тканин в організмі реципієнта, чи зміниться їх базальна та стимульована секреція.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в рамках науково-дослідних тем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України №73 “Біохімічні і фармакологічні аспекти кріоконсервування ендокринних тканин та еритроцитів” (шифр – 2.2.6.73, № 02-13-73) і теми №3 “Дослідження механізмів функціонування кріоконсервованих органних культур ендокринних тканин” (шифр - 2.2.6.03, № 0101U003478).

Метою роботи був порівняльний аналіз функціональних характеристик нативних і кріоконсервованих органотипових культур сім’яників статевозрілих щурів та новонароджених поросят за умов ало- і ксенотрансплантація орхіектомованим тваринам і тваринам з експериментальним гіпогонадизмом, викликаним введенням хлориду кадмія.

Для досягнення мети передбачалося вирішити наступні задачі.

1. Оцінити функціональні характеристики клітин в органотипових культурах сім’яників статевозрілих щурів і новонароджених поросят в залежності від термінів культивування з метою виявлення максимальної функціональної активності клітин.

2. Підібрати оптимальну концентрацію кріопротектора (димексид) і швидкість охолодження, що забезпечують максимальне збереження життєздатних клітин, та їх функціональні характеристики при кріоконсервуванні і тривалому зберіганні
(–196С).

3. Провести порівняльний аналіз функціональних характеристик нативних і кріоконсервованих органотипових культур сім’яників тварин на основі вивчення базальної і стимульованої секреції тестостерону та визначення кількості життєздатних клітин з використанням прижиттєвого фарбування трипановим синім.

4. Дослідити в порівняльному аспекті вплив ало- та ксенотрансплантації нативного і кріоконсервованого ендокринного матеріалу на гормональний статус організму орхіектомованих щурів і щурів з експериментальним гіпогонадизмом.

Об'єкт дослідження. Андрогенна функція нативних та кріоконсервованих органотипових культур сім’яників тварин.

Предмет дослідження. Корекція андрогенної функції шляхом трансплантації кріоконсервованих і нативних органотипових культур сім’яників статевозрілих щурів і новонароджених поросят.

Методи дослідження. У роботі використовувалися метод органотипового культивування тканин сім’яників щурів і новонароджених поросят, метод 2-етапного заморожування, колориметричні методи визначення білка та життєздатності клітин, радіоімунологічний метод визначення тестостерону в плазмі крові експериментальних тварин, клітинах органотипової культури і середовищі культивування при базальній та стимульованій секреції.

Наукова новизна отриманих результатів. Представлено порівняльний аналіз стану кріоконсервованих і нативних органотипових культур з сім’яників щурів і новонароджених поросят in vitro та in vivo при ало- і ксенотрансплантації орхіектомованим тваринам або тваринам з експериментальним гіпогонадизмом, спричиненим введенням хлориду кадмія. Показано, що кріоконсервування і тривале зберігання при –196С забезпечує збереження функціональних характеристик ендокринного матеріалу. Кріоконсервований матеріал при його трансплантації експериментальним тваринам сприяє достовірному підвищенню рівня тестостерону в плазмі крові. Кріоконсервований матеріал має функціональну активність.

Практичне значення отриманих результатів. Збереження морфо-функціональних характеристик при кріоконсервуванні органотипових культур сім’яників новонароджених поросят, а також їх велика функціональна активність в умовах рекультивування і трансплантації орхіектомованим тваринам та тваринам з експериментальним гіпогонадизмом свідчать про придатність кріоконсервованого матеріалу до використання в якості трансплантату для корекції гіпофункції сім’яників на рівні організму. Відсутність впливу тривалості збереження ендокринного матеріалу на його функціональні характеристики дозволяє зробити висновок про можливість створення запасів ендокринного матеріалу, що дозволить більш широко впроваджувати в клінічну практику трансплантаційний метод лікування гіпофункції сім’яників.

Особистий внесок здобувача. Винесені на захист положення і результати роботи отримані автором особисто. Роботи, опубліковані за темою дисертації у співавторстві з науковим керівником теми д.б.н. Бондаренко Т.П. та іншими співробітниками відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем, відображають результати спільного планування та проведення досліджень у відділі, обговорення і підготовки матеріалів до друку.

Автор самостійно провів дослідження, аналіз отриманих результатів і зробив висновки в роботі.

Апробація результатів дисертації. Матеріали досліджень представлені на конференціях молодих учених ІПКіК НАНУ разом з кафедрою UNESCO (Харків, 2001, 2002 рр.); на науково-практичній конференції, присвяченій 150-річчю з дня народження академіка В.Я.Данилевського “Патогенетичні аспекти фармакотерапії ендокринних захворювань” (Харків, 2002 р.); на конференції “Актуальні проблеми фундаментальної і прикладної біохімії” (Київ, 2002 р.).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 статей в спеціальних виданнях, 2 тези.

Обсяг і структура дисертації. Матеріали викладені на 129 сторінках, на 20 сторінках – перелік опублікованих праць. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень та їх обговорення, кінцевої частини, висновків і списку цитованої літератури з 186 джерел, з яких 99 – вітчизняних і 87 – закордонних. Робота має 26 рисунків і 7 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Дослідження виконані на органотипових культурах, які одержували з сім’яників білих безпородних щурів (100 шт) з віварію при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, і новонароджених поросят (100 шт), що доставляли з агрокомплексу “Слобожанський” (с. Гракове Чугуївського району Харківської області). Тваринами-реципієнтами для трансплантації нативних і кріоконсервованих органотипових культур ало- та ксеногенного походження були орхіектомовані самці білих безпородних щурів або щури з експериментальним токсичним гіпогонадизмом вагою 200-230 г (200 шт).

Для одержання сім’яників тварин забивали гільйотинуванням, із застосуванням ефірного наркозу. Екстирпацію ендокринних органів здійснювали з дотриманням суворих правил асептики й антисептики. Сім’яники відразу ж після видалення клали в охолоджений стерильний фізіологічний розчин, у якому подрібнювали тканини сім’яників на фрагменти розміром 0,5-1,0 мм3, відмивали від крові середовищем 199 і в цьому ж середовищі в стерильних флаконах із пробками залишали при 4С на 12-14 годин. Органотипове культивування здійснювали за методом [Потиха О.П., 1993]. Середовище культивування складалося із середовища 199, 10% ембріональної сироватки, бензилпеніциліну натрієвої солі (100 МО/мл) і канаміцину (75 мг/мл). Співвідношення між тканиною і середовищем за масою складало 1:6 [Беникова Е.А., Турчин И.С., 1991]. Культивування тривало протягом 5 діб при 32С. Заміну живильного середовища здійснювали в той самий час кожну добу. Після кожної доби культивування у зразках визначали кількість білка, рівень базальної секреції тестостерону. Для вивчення стимульованої секреції використовували інкубацію органотипової культури при 37С протягом 6 годин у живильному середовищі, яке складалося зі стимуляторів стероїдогенезу. Як стимулятори стероїдогенезу використовували 10% екстракт гіпофізу або дибутирил-цАМФ у кінцевій концентрації 1 мМ. Екстракт гіпофізу готували за методом, описаним у роботі Легач Е.И. [1998], і нормували на білок.

В органотипових культурах тканин сім’яників визначали рівень білка за методом Бредфорда, де розраховували показники рівня стероїдних гормонів як у клітинах, так і в культуральному середовищі. Рівень тестостерону визначали радіоімунологічним методом з використанням тест-наборів РІА Ст-тестостерон. В разі визначення рівня тестостерону в гомогенатах здійснювали екстракцію гормонів за методом Резнікова О.Г. [1980].

Життєздатність визначали колориметричним методом з використанням прижиттєвого фарбування трипановим синім [De Miguel M.P., 1996] у модифікації [Бондаренко Т.П., 2001].

Заморожування органної культури сім’яників новонароджених поросят проводили з кріопротектором димексидом (фармакопейна форма диметилсульфоксиду). Димексид (ДМ) готували на стерильному фізіологічному розчині і змішували при кімнатній температурі з органотиповими культурами у співвідношенні 1:1 до необхідної кінцевої концентрації ДМ. Заморожування здійснювали на програмному заморожувачі Cryoson у поліетиленових кріостійких ампулах об’ємом 2 мл. Використані швидкості заморожування і температурні зони охолодження докладно описані в розділі власних досліджень.

Після заморожування до кінцевої температури (–196С) матеріал зберігався в низькотемпературному банку протягом різних термінів. Максимальний термін зберігання складав 1 рік. Відігрівали матеріал на водяній бані з пристроєм, що перемішує, при 40С до появи рідкої фази.

Розморожений ендокринний матеріал відмивали від димексиду стерильним фізіологічним розчином шляхом 7-8-разової заміни кріоконсервуючого середовища на фізіологічний розчин. Після цього проводили рекультивування при 32С в живильному середовищі протягом двох діб.

Як реципієнти нативних чи кріоконсервованих органотипових культур використовувалися орхіектомовані самці білих безпородних щурів і самці щурів з експериментальним токсичним гіпогонадизмом.

Орхіектомію здійснювали за методикою Кабак Я.М. [1984].

Для одержання тварин з експериментальним токсичним гіпогонадизмом користувалися моделлю, розробленою Резніковим О.Г. із співавт., [1976], відповідно до якої одноразове введення щурам 0,055 мг хлориду кадмію на 100 г ваги тварини викликає розвиток гіпогонадизму, що зумовлено зміною стану елементів клітин, які беруть участь у синтезі тестостерону.

Через тиждень після орхіектомії або 3 тижні після введення хлориду кадмію тваринам здійснювали ксено- чи алотрансплантацію нативної або кріоконсервованої органотипової культури сім’яників. Доза трансплантації складала 325 мг/100 г і відповідала дозі, експериментально підібраній в роботі [Потиха О.П., 1993]. Трансплантацію проводили шляхом ін'єкції голкою Дюфо в підшкірно-жирову клітковину в ділянці холки. По закінченні термінів спостереження протягом 1 тижня – 3 місяців після трансплантації тварин забивали, а їхню плазму крові і сім’яники забирали на аналіз тестостерону.

Статистичну обробку результатів здійснювали за методом Стьюдента-Фішера з використанням пакету програм Excel.

Результати досліджень та їх обговорення Метою наших досліджень було вивчення можливості використання кріоконсервованого ендокринного матеріалу як трансплантаційного для корекції гіпофункції сім’яників у експериментальних тварин. Оскільки всі органотипові культури мають обмежений термін функціонування in vitro і певну динаміку стероїдогенезу та секреції, необхідно було визначити терміни культивування, що забезпечують максимум їх функціональної активності.

Як видно з даних, наведених на рис. 1, у нативній культурі сім’яників (НКС) щурів у першу добу культивування відзначається високий вміст тестостерону, що, очевидно, зумовлено його вивільненням із загиблих клітин через фрагментацію в результаті механічного подріб-нення тканини для культивування. У гомогенатах клітин тканини в той же термін спостерігається низький рівень тестостерону, що свідчить про пригнічення процесів синтезу в тканині, яка перебуває у періоді адаптації до нефізіологічних умов.

Таке поводження клітин у культурі відповідає “стадії спокою”. На другу добу спостерігається низький рівень вмісту тестостерону в живильному середовищі.

З третьої по п'яту добу для клітин культури була характерна тенденція до підвищення вмісту тестостерону в живильному середовищі і суттєве підвищення його рівня на п`яту добу. У той же період також спостерігається підвищення вмісту тестостерону у гомогенатах, при цьому можна спостерігати вирівнювання поза- і внутрішньоклітинних концентрацій тестостерону, що свідчить про те, що в цей період синтез і секреція тестостерону відбуваються de novo. Цей період культивування відповідає “стадії активного росту”. Після 5-ї доби культивування спостерігається тенденція до зниження концентрації тестостерону в живильному середовищі, яка зберігається аж до 10-ї доби. У цей же період відзначається збільшення градієнта концентрації між поза- і внутрішньоклітинними фракціями тестостерону за рахунок переважного зниження внутрішньоклітинної фракції, що свідчить про дегенеративні процеси, які починаються у тканині. Отримані нами результати щодо зміни секреції тестостерону в живильне середовище корелюють з роботами інших дослідників [Heggland S.J., 1995], у яких вивчалася динаміка зміни активності 3--гідроксилстероїд-дегідрогенази (головний фермент стероїдогенезу) в процесі культивування. Ці дані підтверджують, що терміни культивування з 2-ї по 5-у добу характеризуються синтезом тестостерону de novo.

При проведенні аналогічних експериментів з ендокринним матеріалом, отриманим з сім’яників новонароджених поросят, ми одержали аналогічні результати. Тобто, органотипові культури, одержувані з сім’яників 2 видів тварин, мали максимум секреції основного статевого гормону в ті самі терміни культивування. При цьому слід зазначити, що органотипові культури, одержувані з тканин неонатальних (добових) поросят до 5-ої доби виробляли і секретували в 1,25 рази більше тестостерону, ніж відповідні культури з тестисів статевозрілих щурів. Максимум секреторної активності в клітинах 5-добових культур, які одержували з тканин 2 видів тварин, став основою для проведення всіх наступних експериментів, у яких здійснювали підбір оптимальної концентрації димексиду, підбір умов кріоконсервування (швидкостей заморожування), тривалості низькотемпературного зберігання й апробації властивостей трансплантаційного нативного і кріоконсервованого матеріалу на експериментальних тваринах.

Вибір димексиду як кріопротектора був зумовлений тим, що тканина сім’яників має підвищену чутливість до дії ішемічних факторів [Грищенко В.И. и др., 1993], а стосовно димексиду добре відома його протиішемічна дія [Грищенко В.И. и др., 1993].

На рис. 2 представлені дані про вміст тестостерону в органотиповій культурі сім’яників новонароджених поросят, а також в інкубаційному середовищі в залежності від наявності в ньому різних концентрацій ДМ. Обробка з кріопротектором полягала в 45-хвилинній інкубації культури при кімнатній температурі і наступному видаленні димексиду шляхом 5-6-разової заміни середовища. Далі органотипову культуру поміщали на 6 годин у живильне середовище при 37С без стимулятора стероїдогенезу (базальна секреція) або за наявності дибутирил-цАМФ чи екстракту гіпофізу (стимульована секреція). З даних, наведених на рисунку, видно, що ДМ у використаних концентраціях не змінював базальну секрецію тестостерону клітинами нативної органної культури новонароджених поросят.

При цьому було виявлено, що клітини нативної культури відповідають на введення стимулятора стероїдогенезу дибутирил-цАМФ підвищенням рівня секреції тестостерону в середовищі при 5 і 10% концентраціях ДМ. Однак цей ефект цілком зникає при 15% концентрації, при якій клітини взагалі не відповідають на введення неспецифічного стимулятора дибутирил-цАМФ. Таке збільшення секреції тестостерону за наявності 5 і 10% концентрацій ДМ можна пояснити його відомою властивістю збільшувати проникність мембрани, внаслідок чого поліпшується надходження цАМФ у клітини Лейдига і відбувається активація синтезу гормону. З іншого боку, при 15% концентрації ДМ, можливо, уже виявляється його токсична дія, що виражається в інгібуванні секреції.

При аналізі кількості тестостерону в клітинах орга-нотипової культури з сім’яників новонароджених поросят, інкубованої із ДМ, ми одержали такі результати. Всі використані концентрації ДМ не змінюють рівень тестостерону в клітинах органотипової культури. Однак обробка клітин неспецифічним стимулятором стероїдогенезу дибутирил-цАМФ на тлі дії на клітини кріопротектора призводить до значного збільшення кількості гормону в клітинах. Підвищення вмісту тестостерону в клітинах культури мало концентраційно-залежний характер від наявності ДМ. Ми не виявили порушень процесів стероїдогенезу в клітинах під впливом 15% концентрації ДМ, що спостерігалося при вивченні секреції тестостерону в інкубаційне середовище (рис.2). Цей факт свідчить про справедливість припущення про токсичність ДМ у високих концентраціях для ендокринних клітин.

Таблиця 1. Вплив преінкубації з різними концентраціями димексиду на рівень секреції тестостерону і його кількість у клітинах культури з сім`яників щурів (n=10)

Умови

експерименту | Тестостерон у нмоль/л/мг білка

У клітинах | В інкубаційному середовищі

Інкубація

без димексиду (ДМ) | 74,13 ± 3,51 | 76,21 ± 3,84

Інкубація з 5% ДМ | 74,24 ± 3,71 | 76,43 ± 4,24

Інкубація з 10% ДМ | 83,33 ± 5,11 | 57,26 ± 3,92*

Інкубація з 15% ДМ | 98,46 ± 6,78* | 32,70 ± 2.59*

*- результати достовірні в порівнянні з результатами інкубації без кріопротектора (Р<0,05).

При аналізі впливу димексиду на органотипові культури, отримувані з тканин сім’яників щурів, ми одержали наступні результати (табл. 1). Для клітин даної культури у випадку 5% концентрації ДМ ми не спостерігали будь-яких змін рівня тестостерону як у клітинах, так і в інкубаційному середовищі. Однак підвищення концентрації кріопротектора супроводжувалося зниженням секреторної активності клітин, причому ці зміни були достовірні, і зниження тестостерону в інкубаційному середовищі в порівнянні з контрольними зразками (без ДМ) було на 25 і 58% відповідно для 10 і 15% концентрацій ДМ. При аналізі показників вмісту тестостерону в клітинах виявилося, що його концентрація зростала, а це означало, що процеси стероїдогенезу не порушувалися, а відбувалася зміна процесів секреції, як і у випадку клітин органотипової культури з сім’яників новонароджених поросят.

Клітини органотипової культури сім’яників щурів реагують на стимулятор стероїдогенезу без ДМ незначним підвищенням рівнів тестостерону як в інкубаційному середовищі (?11%), так і в клітинах (?11%). Кріопротектор у 5% концентрації підсилює дію стимулятора стероїдогенезу – кількість тестостерону зростає як в інкубаційному середовищі, так і в самих клітинах. Однак, якщо секреція середовища зростає приблизно на 12,5%, то кількість тестостерону в клітинах збільшується приблизно на 16%. При підвищенні в інкубаційному середовищі концентрації ДМ до 10% це відсоткове співвідношення порушується ще більше. Так, наприклад, кількість тестостерону в інкубаційному середовищі зростає в порівнянні з контролем приблизно на 13%, а в клітинах – приблизно на 17%. Досягнення 15% концентрації кріопротектора призводить до того, що секреція тестостерону залишається на рівні контролю, тобто відповідає рівню базальної секреції, але в клітинах рівень тестостерону досягає величини, яка перевищує контрольний рівень на 22%. Це означає, що, як і у випадку органотипових культур, одержуваних із тканин новонароджених поросят, ми спостерігаємо порушення процесів секреції на тлі збереження процесів стероїдогенезу. При цьому слід зазначити, що зміни в рівнях секреції не були зумовлені зміною числа життєздатних клітин.

У зв'язку з цим, ми вважали за доцільне проаналізувати поводження клітин органотипових культур двох видів тварин при дії на них специфічних модифікаторів стероїдогенезу – гормонів гіпофізу, до складу яких входять гонадотропіни (ФСГ, ЛГ). З цією метою ми використовували 10% екстракт гіпофізу (ЕГ). Проведення даних експериментів ми вважали дуже важливим, оскільки надалі органотипові культури ми збиралися використовувати як трансплантаційний матеріал, а на рівні організму стероїдогенез і секреція тестостерону контролюються саме гонадотропінами. Отримані результати представлені на рис. 3. З наведених даних видно, що клітини культури без ДМ реагують на введення 10 мкл/мл ЕГ збільшенням рівня секреції. Використання більш високої (50 мкл/мл) концентрації також призводить до збільшення рівня секреції, однак це збільшення нижче, ніж при 10 мкл/мл ЕГ. Це, очевидно, зумовлене тим, що всі біологічно активні сполуки виступають як активатори того чи іншого процесів тільки при їхній фізіологічній концентрації, а зростаючі концентрації діють як інгібітори. При введенні в середовище інкубації димексиду в 5% концентрації ми спостерігали припинення інгібуючої дії високої концентрації ЕГ, і цей ефект також зберігався для більш високих концентрацій кріопротектора (10 і 15%).

Ці дані свідчили на користь того, що у випадку трансплантації вказаного матеріалу клітини органотипової культури в організмі реципієнта будуть підкорятися регуляції з боку тропних гормонів гіпофізу.

Аналогічні експерименти були також проведені на клітинах органотипової культури з сім’яників статевозрілих щурів. Було встановлено, що клітини органотипових культур сім’яників статевозрілих щурів реагували аналогічно на стимуляцію екстрактом гіпофізу за наявності кріопротектора. Проте клітини культури сім’яників новонароджених поросят були більш чутливі до стимулятора стероїдогенезу в порівнянні з клітинами культури сім’яників статевозрілих щурів. Ці результати дозволили нам перейти до експериментів стосовно вивчення впливу дії кріоконсервування з димексидом на функціональні особливості органотипової культури сім’яників новонароджених поросят.

На першому етапі наших експериментів із кріоконсервування, ми використовували режим охолодження, що дає гарні результати для органотипової культури надниркових залоз. Відповідно до даного режиму, кріопротектор ДМ у концентрації 5% вводиться при 0С. Охолодження на першому етапі здійснюється зі швидкістю 1С/хв до – 80С, а потім ампули занурюються в рідкий азот (-196С), відігрівання відбувається при 37-40С до появи рідкої фази [Легач Е.И., 1998].

Рис. 4. Вміст тестостерону в нативній (1) і кріоконсервованій (2) культурах сім’яників поросят в залежності від термінів культивування і рекультивування (n=8) деконсервованого матеріалу.

* - розбіжності достовірні відносно 1-ї доби рекультивувания, P<0,05.

** - розбіжності достовірні відносно 6-ї доби культивувания, P<0,01.

На рис. 4 подано дані вимірів вмісту рівня тестостерону в процесі рекультивування, що з деякими допусками можна було б вважати моделлю функціонування культури в організмі реципієнта. Рекультивований розморожений матеріал порівнювали з культурами, які не заморожували, але за термінами культивування не відрізнялися. Першому дню рекультивування відпові-дали 6-добові нативні культури. Як видно з наведених даних, розморожений матеріал після видалення кріопротектора та вміщення в живильне середовище, характеризувався в першу добу наявністю деякого періоду спокою. Це пов'язане з розвитком репаративних процесів, які відбуваються в клітинах культури після впливу низьких температур. Проте із другої і до п'ятої доби рекультивування ми відзначали зростання секреторної здатності клітин, що свідчило про збільшення, насамперед, процесів біосинтезу гормонів. Для нативної культури аналогічних термінів культивування із шостої доби починався спад функціональної активності. Чим можна пояснити подібні розходження для нативного і кріоконсервованого матеріалу? ДМ має здатність активізувати різні біосинтетичні реакції. Можливо, під впливом ДМ відбувається активація ферментів, які беруть участь у перетворенні холестерину у стероїдні гормони, що, в свою чергу, і стало причиною збільшення швидкості секреції гормонів. Добре відомо також про вплив димексиду на ліпідну фазу плазматичних мембран. Дані, отримані про рекультивування деконсервованого матеріалу, свідчать на користь того, що процес кріоконсервування не призводить до втрати клітинами органотипових культур з сім’яників новонароджених поросят їх здатності секретувати і виробляти стероїдні гормони. Це підтверджується також даними про тривале зберігання органної культури сім’яників при -196С. Рівень тестостерону в зразках після відігрівання незалежно від термінів зберігання складав 72.15-71.98 нМ/мг білка.

Рис. 5. Кількість життєздатних клітин у культурі сім’яників новонароджених поросят (n=10).

* - розбіжності достовірні відносно контролю, P<0,05.

Однак у порівнянні з вихідним рівнем секреції (до заморожування) вона була трохи нижчою. Це зумовлене загибеллю частини клітин. На рис.5 представлено дані про визначення відсотка клітин, які вижили. Дійсно, частина клітин гине. І ця загибель спричинена дією низьких температур. Такі міркування правомочні, оскільки обробка клітин кріопротектором не супроводжувалася зміною числа клітин.

На наступному етапі наших досліджень були проведені експерименти щодо виміру вмісту холестерину в живильному середовищі при рекультивуванні кріоконсервованої органотипової культури сім’яників новонароджених поросят. Виявилося, що в процесі рекультивування клітини культури утилізують холестерин з живильного середовища, причому його утилізація збільшується в часі, що є свідченням активного функціонування клітин після кріоконсервування.

На сьогодні існують твердження про те, що для кожного типу тканини існує своя оптимальна програма заморожування і своя оптимальна концентрація кріопротектора. У зв'язку з цим, ми почали спробу розробки режиму охолодження, який би забезпечував збереження значної кількості клітин органотипових культур сім’яників новонароджених поросят.

Найбільш близькими до вирішення нашої проблеми є дані з кріоконсервування тканин ембріональних тестисів [Керос В.А., 2001].

Рис. 6. Кількість життєздатних клітин в органотиповій культурі з сім’яників новонароджених поросят після кріоконсервування за 2-етапною програмою з різними концентраціями димексиду (n=7).

Розбіжності достовірні відносно контролю до заморожування,
* - P<0,05.

Базуючись на цих дослідженнях, ми зупинили свій вибір на використанні на першому етапі швидкості охолодження 2С/хв до температури -40С і досліджували захисну дію різних концентрацій диметилсульфоксиду в діапазоні 5-10%. Результати суправітального фарбування клітин культур, кріоконсервованих згідно з даним способом, показали, що максимальну кількість життєздатних клітин культури після кріоконсервування ми відзначали у випадку використання 10% концентрації димексиду (рис. 6).

Застосування даного режиму заморожування забезпечує за наявності 10% концентрації ДМ більше збереження клітин культури, отримуваної із сім’яників новонароджених поросят. Такі ж результати отримані для культур із сім’яників щурів.

Рис.7. Вплив ксенотрансплантації органотипової культури з сім’яників новонароджених поросят на рівень тестостерону в плазмі крові щура у різний термін після орхіектомії (n=10).

* - розбіжності достовірні відносно групи орхіектомованих тварин, P<0,05.

Отримані дані дозволили нам зробити висновок про можливість використання кріоконсервованого матеріалу як трансплантаційного. Як експериментальні моделі ми використовували орхіектомованих тварин та тварин з експериментальним токсичним гіпогонадизмом. Аналіз кількості тестостерону в плазмі крові експериментальних тварин показав, що доцільно проводити трансплантацію на 7-му добу після орхіектомії і 21-у добу після введення хлориду кадмію (експериментальний токсичний гіпогонадизм). На рис. 7 представлено дані щодо ксенотрансплантації нативних і кріоконсервованих органотипових культур з сім’яників новонароджених поросят. Кріоконсервований матеріал виявляв більший позитивний ефект порівняно з нативним.

Ці дані узгоджуються з даними про те, що кріоконсервування з ДМ змінює функціональні характеристики клітин культур з сім’яників 2-х видів тварин, що виражається в збільшенні процесів секреції і стероїдогенезу гормонів. Кріоконсервований трансплантат у порівнянні з нативним забезпечував більш виражений ефект зростання рівня тестостерону в плазмі крові. Однак для обох випадків після 30-ї доби з моменту трансплантації намічається тенденція до зниження позитивного ефекту, хоча рівень тестостерону залишається вищим в плазмі крові реципієнтів кріоконсервованої культури в порівнянні з рівнем гормонів у реципієнтів нативних ксенографтів і орхіектомованих тварин без трансплантації.

Рис. 8. Рівень тестостерону в плазмі орхіектомованих тварин у різний термін після алотранс-плантації нативного і кріокон-серво-ваного ендокринного матеріалу (n=10).

* - розбіжності достовірні відносно групи орхіектомованих тварин, P<0,05.

У випадку алотрансплантації були отримані такі результати (рис. 8). Ми також спостерігали розвиток позитивного ефекту, викликаного трансплантацією ендокринного матеріалу, однак розбіжності між нативним і кріоконсервованим матеріалом були незначними, хоча і відзначалася деяка тенденція в перевазі використання кріоконсервованого матеріалу.

Слід зазначити, що на 15-у добу після трансплантації ксеногенного та алогенного матеріалу позитивний ефект був однаковим і виражався в підвищенні рівня тестостерону в плазмі орхіектомованих тварин. До 30-ї доби з моменту алотрансплантації розвивався позитивний ефект – рівень тестостерону був значно вищий, ніж на 15-ту добу. Значення рівня тестостерону були великими в порівнянні з андрогенною функцією орхіектомованих тварин із ксенотрансплантацією. (див. рис. 7)

На наступному етапі ми провели дослідження з вивчення впливу трансплантації на гормональний статус тварин з експериментальним гіпогонадизмом. Отримані результати представлені на рис. 9.

Рис. 9. Вплив ксенотрансплантації органотипової культури з сім’яників новонароджених поросят на рівень тестостерону в плазмі крові щура з експериментальним токсичним гіпогонадизмом (n=10).

* - розбіжності достовірні відносно групи тварин з експериментальним токсичним гіпогонадизмом, P<0,05.

Показано, що позитивний ефект після ксенотрансплантації починає виявлятися на 15-у добу як у випадку нативного, так і кріоконсервованого ендокринного матеріалу. До 30-ї доби з моменту трансплантації рівень тестостерону у випадку трансплантації нативного матеріалу досягав рівня контрольного у тварин, а у випадку кріоконсервованого – перевищував його. До 45-90-ї доби з моменту здійснення трансплантації рівень тестостерону знижувався, однак був вірогідно вищим (Р<0,05) від рівня тестостерону в плазмі крові експериментальних тварин без трансплантації. При аналізі маси сім’яників і рівня в них тестостерону ми одержали наступні результати (рис. 10). Отримані дані свідчать, що трансплантація органотипової культури сім’яників новона-роджених поросят позитивно впливає на андрогенну функцію організму реципієнта - підвищення рівня тестостерону в плазмі крові, (але й до деякої міри стимулює відновні процеси в сім’яниках тварин, ушкоджених введенням хлориду кадмію).

Узагальнюючи дані, можна зробити висновок про те, що трансплантація як нативної, так і кріоконсервованої органотипової культури з сім’яників новонароджених поросят і статевозрілих щурів орхіектомованим тваринам та тваринам з експериментальним токсичним гіпогонадизмом сприяє зростанню андрогенної функції в них. При цьому слід зазначити, що використання органотипових культур з неонатальних тканин є ефективнішим, оскільки забезпечує більш стабільний і пролонгований у часі позитивний ефект на ендокринний статус організму реципієнтів.

Рис. 10. Відносні маси сім’яників і рівень тестостерону в них залежно від термінів після трансплантації. За 100% вважали параметри контрольних тварин (n=10).

Розбіжності достовірні відносно показників до трансплантації,
* - P<0,05.

Ендокринний матеріал сприяє розвитку більш виражених реакцій в організмі реципієнта щодо стимулювання андрогенної функції власних залоз у тварин з експериментальним токсичним гіпогонадизмом. В орхіектомованих тварин трансплантація ендокринного матеріалу підвищує рівень тестостерону в плазмі крові. Отримані результати є досить обнадійливими з точки зору корекції гіпофункції сім’яників. А схожість тканин людини та свині, наявні експериментальні й клінічні результати щодо використання ендокринних тканин новонароджених поросят дозволяє зробити висновок про принципову можливість використання кріокон-сервованих органотипових культур не лише для корекції вторинної надниркової недостатньості, а і для лікування гіпофункції сім’яників у людини.

ВИСНОВКИ

1. Проведений порівняльний аналіз властивостей нативних і кріоконсервованих органотипових культур з сім’яників статевозрілих щурів і новонароджених поросят вказує на доцільність використання кріоконсервованого матеріалу як трансплантату, а створення його запасів у низькотемпературних банках сприятиме впровадженню метода ксенотрансплантації для корекції ендокринопатій.

2. Кріоконсервування органотипових культур з сім’яників тварин в присутності 10% димексиду при двоетапному заморожуванні зі швидкістю 2С/хв до –40С з подальшим зануренням у рідкий азот (–196С) забезпечує збереження 80-85% життєздатних клітин зі збереженням функціональних характеристик, визначених за рівнем базальної і стимульованої секреції тестостерону, вимірюваних радіоімунним методом. Терміни низькотемпературного зберігання не впливають на життєздатність і функціональні характеристики органотипових культур з сім’яників.

3. Кріоконсервований ендокринний матеріал має високу функціональну активність, що зумовлено впливом димексиду і факторами, які реалізуються при зниженні температури.

4. Ало- і ксенотрансплантація нативних і кріоконсервованих органотипових культур орхіектомованих тварин і тварин з експериментальним гіпогонадизмом сприяє підвищенню рівня тестостерону в плазмі крові реципієнтів.

5. Алотрансплантат в організмі орхіектомованих тварин забезпечує в період з 15-ї по 30-у добу після трансплантації більший порівняно з ксенотрансплантатом позитивний ефект, який різко знижується до 45-ї доби і поступово знижується до 90-ї доби. Ксенотрансплантат протягом усього терміну спостереження (90 діб) забезпечував стійкий позитивний ефект.

6. Позитивний ефект ало- і ксенотрансплантатів в організмі експериментальних тварин з токсичним гіпогонадизмом починає виявлятися на 15-у добу, до 30-ї доби концентрація тестостерону в плазмі крові досягає рівня контрольних тварин при трансплантації нативного матеріалу і перевищує такий у випадку використання кріоконсервованого ксенотрансплантату. На 45 добу спостерігається зниження позитивної функції, яке виходить на плато і залишається незмінним до закінчення термінів спостереження (90 діб).

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ:

1. Бондаренко Т.П., Салех Дж. М. Абу Жаяб. Криоконсервирование органной культуры семенников новорожденных поросят для создания банка трансплантационного материала // Проблеми медичної науки та освіти. – 2002. - №2.- С.60-64 (дисертантом особисто проведена вся експериментальна частина).

2. Салех Дж. М. Абу Жаяб, Луговой С.В., Губина Н.Ф. Влияние криоконсервирования на динамику базальной секреции тестостерона органной культурой семенников крыс // Проблемы криобиологии. - 2002. - №1.- С.50-54 (дисертантом проведено експерименти з культивування, рекультивування та кріоконсервування).

3. Салех Дж. М. Абу Жаяб, Бондаренко Т.П. Функциональные характеристики органной культуры семенников при криоконсервировании // Проблемы криобиологии. - 2002. - №3.- С.80-82 (дисертантом особисто проведено всю експериментальну частину).

4. Бондаренко Т.П., Алабедалькарим Н.М., Божок Г.А., Салех Дж. М. Абу Жаяб Вплив диметилсульфоксиду та кріоконсервування на функціональні характеристики органної культури сім’яників // Проблеми ендокринної патології.-2003.-№3.-с.57-62 (дисертантом особисто досліджено вплив диметилсульфоксиду на функціональні характеристики органної культури сім’яників).

5. Бондаренко Т.П., Салех Дж. М. Абу Жаяб, Божок Г.А., Алабедалькарим Н.М., Легач Е.И. Коррекция гормонального статуса у кастрированных и с экспериментальным гипогонадизмом крыс путем алло- и ксенотрансплантации органотипических культур // Проблеми екології та медицини.- 2003.-Т. 7.- № 1-2 с. 3-7 (дисертантом самостійно здійснено постанову експерименту, забір матеріалу, біохімічні дослідження, статистичну обробку даних та оформлення результатів у вигляді статті).

6. Салех Дж. М. Абу Жаяб, Луговой С.В., Губина Н.Ф. Влияние криоконсервирования на секрецию тестостерона органной культурой семенников крыс // Збірник тез. конференції: Патогенетичні аспекти фармакотерапії ендокринних захворювань. Харків.- 6-7 лютого. – 2002. – С.17-18.

7. Божок Г.А., Салех Дж. М. Абу Жаяб, Алабедалькарим Н.М. Вплив кріоконсервування на функціональний стан органної культури сім'яників новонароджених поросят // Тези конференції //Укр. біохім. журнал.-2002.-74, № 4.-с. 141-142.

АНОТАЦІЯ

Салех Дж. М. Абу Жаяб. Корекція андрогенної функції в експериментальних тварин шляхом трансплантації нативних та кріоконсервованих органних культур сім’яників. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.14 – ендокринологія, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, Київ, 2004.

У роботі проведено порівняльний аналіз функціональних характеристик нативних і кріоконсервованих органних культур сім’яників щурів та новонароджених поросят in vitro (культивування, рекультивування) та in vivo (ало- і ксенотрансплантація орхіектомованим щурам, а також щурам з експериментальним гіпогонадизмом ).

Встановлено, що використання димексиду як кріопротектора (10%) та швидкості охолодження 2С/хв до температури –40С з наступним зануренням у рідкий азот (–196 С) забезпечує довгострокове зберігання функціональних властивостей ендокринного матеріалу. Кріоконсервований матеріал має підвищену активність за даними щодо секреції тестостерону та утилізації холестерину. У роботі обговорено можливі механізми щодо підвищеної функціональної активності.

Ало- і ксенотрансплантація нативного та кріконсервованого ендокринного матеріалу орхіектомованим тваринам, а також тваринам з експериментальним гіпогонадизмом, має позитивний ефект. В роботі зроблено висновок про доцільність використання кріоконсервованих органних культур новонароджених поросят як трансплантанти.

Ключові слова: органна культура сім’яників, корекція андрогенної функції, ало- та ксенотрансплантація, гіпогонадизм, кріоконсервування.

АННОТАЦИЯ

Салех Дж. М. Абу Жаяб. Коррекция андрогенной функции у экспериментальных животных путем трансплантации нативных и криоконсервированных органных культур семенников. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук