НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА
ЯНЧІЙ Оксана Романівна
УДК 577.164.11:577.112
ПОРІВНЯЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ТІАМІНЗВ'ЯЗУЮЧИХ БІЛКІВ МОЗКУ, ПЕЧІНКИ ТА НИРОК ЩУРІВ
03.00.04 – Біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2004
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.
Науковий керівник – доктор біологічних наук, член-кор. НАН України
ДОНЧЕНКО Георгій Вікторович,
завідувач відділу біохімії коферментів
Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
ВИНОГРАДОВА Руфіна Петрівна,
Інститут біохімії НАН України;
доктор біологічних наук, професор
КІБІРЄВ Володимир Костянтинович,
завідувач відділу хімії білка
Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.
Провідна установа – Київський національний університет
імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії.
Захист відбудеться “20” вересня 2004 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії
ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).
Автореферат розісланий “19” серпня 2004 р.
Учений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. На сьогоднішній день експериментально доведено, що ефективне функціонування вітамінів в організмі неможливе без участі специфічних вітамінзв'язуючих білків. Наявність подібних білків показана для більшості вітамінів, зокрема, ретинолу, ?-токоферолу, холекальциферолу, піридоксину, фолієвої кислоти, кобаламіну, біотину, рибофлавіну, нікотинаміду, тіаміну та ін. [Халмурадов та ін., 1982]. Вітамінзв'язуючі білки необхідні на всьому шляху метаболізму вітамінів – від процесів всмоктування в шлунково-кишковому тракті до проявлення їх коферментних та некоферментних функцій. Сюди слід віднести білки, які транспортують вітаміни та коферменти, білки-ферменти, в результаті взаємодії з котрими проявляється коферментна дія вітамінів, а також мембранні і внутрішньоклітинні білки, що беруть участь в реалізації некоферментних функцій вітамінів та їхніх природних метаболітів в організмі людини і тварин [Донченко та ін., 1992]. Дослідження подібних білків є важливим та перспективним напрямком в сучасній біохімії вітамінів, оскільки вивчення структури, властивостей та функцій цих білків є одним з методологічних підходів до з'ясування молекулярних механізмів дії та біологічної ролі вітамінів у внутрішньоклітинному метаболізмі.
В аспекті розшифрування молекулярних процесів, що лежать в основі некоферментних функцій вітаміну В1 (тіаміну), велике значення має дослідження властивостей тіамінзв'язуючих білків ссавців (ТЗБ). Проте до цього часу відомості щодо структури і функціональної активності цих білків надзвичайно обмежені та фрагментарні. У відділі біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України вперше ізольовано та частково досліджено властивості тіамінзв'язуючого білка мозку щурів [Постоєнко, 1987]. Звичайно, виникає питання, чи є подібні білки в інших тканинах, і якщо так, то яку роль вони відіграють в реалізації коферментних і некоферментних функцій тіаміну в організмі?
На сьогоднішній день, завдяки успіхам генетичних досліджень, достовірно з'ясовано, що саме вроджені дефекти у синтезі одного із білків, які зв'язують тіамін, а саме, тіамінтранспортуючого білка, є первинною причиною тіамінзалежної мегалобластичної анемії [Neufeld, 2001]. Це тільки одне із захворювань, пов'язаних з порушенням обміну тіаміну. Не виключено, що можуть відбуватися порушення функції тіамінтранспортуючого білка і не генетичного характеру. Все це настійно диктує необхідність дослідження структурних та функціональних властивостей тіамінзв'язуючих білків.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тему дисертаційної роботи було затверджено на засіданні вченої ради Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, протокол №1 від 17.01.1997 р. Дисертаційна робота безпосередньо зв'язана з плановими дослідженнями відділу біохімії коферментів за бюджетними темами: "Дослідження механізмів реалізації біологічної дії вітамінів, коферментів та їх специфічних білків-акцепторів в регуляції метаболізму спеціалізованих клітин" (1997-2001), № ДР 0197U004372, шифр 2.2.1.4; "Дослідження молекулярних механізмів взаємодії вітамінів, коферментів та їх білків-акцепторів в регуляції внутрішньоклітинного метаболізму в нормі та патології" (2002-2006), № ДР 0102U000628, шифр 2.2.1.4; та темою Державного фонду фундаментальних досліджень Міністерства освіти і науки НАН України "З'ясування функціональної ролі специфічних білків-акцепторів вітамінів в клітинному метаболізмі" (2001-2003), Ф7/441-2001.
Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було виділити, ідентифікувати та охарактеризувати властивості специфічних тіамінзв'язуючих білків мозку, печінки та нирок щурів. Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:
1) виділити гомогенні препарати тіамінзв'язуючих білків з мозку, печінки та нирок щурів;
2) визначити молекулярну масу, субодиничний та амінокислотний склад цих білків;
3) дослідити кінетичні параметри реакції взаємодії [14С]тіаміну з тіамінзв'язуючими білками печінки, нирок та мозку щурів;
4) з'ясувати, чи властиві тіамінзв'язуючим білкам печінки та нирок ферментативні властивості, які характерні для тіамінзв'язуючого білка мозку;
5) встановити субклітинну локалізацію тіамінзв'язуючих білків в досліджуваних тканинах щурів.
Об'єкт дослідження. Тіамінзв'язуючі білки, які виділені з печінки, нирок та мозку щурів.
Предмет дослідження. Фізико-хімічні властивості та біологічна роль тіамінзв'язуючих білків печінки, нирок і мозку щурів.
Методи дослідження. У роботі застосовані методи білкової хімії, електрофоретичний та амінокислотний аналіз. Ферментативну активність визначали спектрофотометрично. Зв'язування білків з тіаміном досліджували радіолігандним методом. Для обчислення отриманих результатів застосовували методи статистичного аналізу.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виділені та охарактеризовані тіамінзв'язуючі білки з печінки та нирок щурів. Проведено подальше дослідження виявленого раніше тіамінзв'язуючого білка мозку щурів та порівняння його властивостей і функцій з вперше виділеними білками печінки та нирок.
З'ясовано, що всі досліджувані тіамінзв'язуючі білки однакові за молекулярною масою, яка дорівнює близько 100 кДа, містять у своєму складі дві субодиниці – більшу, з молекулярною масою 63 кДа і меншу – 35 кДа. Показано, що тіамінзв'язуючі білки мозку, печінки та нирок подібні за амінокислотним складом.
Встановлено, що тіамінзв'язуючі білки специфічно взаємодіють з тіаміном, мають дві тіамінзв'язуючі ділянки з більш високою та низькою спорідненістю до тіаміну.
Доведена участь білків в обміні тіамінфосфатів. Вони з різною швидкістю гідролізують фосфорні ефіри тіаміну (тіамінмоно-, тіамінди- та тіамінтрифосфат), а найбільш активно – тіамінтрифосфат. Показано, що тіамінзв'язуючі білки не гідролізують нуклеозидтрифосфати (ATP, GTP, CTP) та не мають тіамінкіназної активності.
З'ясовано, що тіамінзв'язуючі білки печінки та нирок локалізовані переважно у плазматичній мембрані клітин, а мозку – у синаптичних везикулах та плазматичних мембранах синаптосом.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати поглиблюють уявлення про білки, які специфічно зв'язують вітаміни, зокрема тіамінзв'язуючі білки. Нові дані щодо універсального розповсюдження в плазматичній мембрані клітин високомолекулярного біфункціонального тіамінзв'язуючого білка підводять методологічну базу до розуміння молекулярних механізмів реалізації некоферментних функцій вітаміну В1 у клітинах різних тканин.
Метод отримання гомогенних препаратів тіамінзв'язуючих білків є основою для подальшого дослідження первинної структури цього білка з метою ідентифікації його на генетичному рівні та дає перспективу розробки імунохімічної тест-системи для моніторингу стану ТЗБ в тканинах при різних патологіях, зокрема спадкових, пов'язаних з дефектами синтезу тіамінзв'язуючих білків.
Окремі положення роботи ввійшли до курсу лекцій з біохімії вітамінів, що читаються на кафедрі біотехнології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та на кафедрі біології природничого факультету Національного університету "Києво-Могилянська академія".
Особистий внесок здобувача. Вся експериментальна частина роботи, підбір та опрацювання літератури виконані безпосередньо автором. Аналіз отриманих даних та їхнє обговорення проведено спільно з науковим керівником член-кор. НАН України Донченком Г.В. та д.б.н. Пархоменко Ю.М. Друковані роботи підготовлено за безпосередньої участі автора.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на конкурсі молодих вчених (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2000 р.), міжнародній науковій конференції “Биологически активные соединения в регуляции метаболического гомеостаза” (Гродно, 2000 р.), 5й конференції молодих вчених “Биология – наука 21го века” (Пущино, 2001 р.), VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002 р.). Результати окремих етапів роботи доповідались і обговорювались на засіданнях відділу біохімії коферментів та науковому семінарі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 3 статті в періодичних наукових спеціалізованих виданнях України, що включено в перелік, затверджений ВАК України, та 5 тез доповідей.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури (2 розділи), експериментальної частини (4 розділи), узагальнення, висновків та списку використаних літературних джерел (200 найменувань). Робота викладена на 134 сторінках друкованого тексту та містить 34 рисунки і 9 таблиць.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В огляді літератури висвітлені сучасні дані щодо властивостей, функціонального значення тіаміну і його похідних, а також механізмів транспорту тіаміну. Детально представлено інформацію про структуру, властивості та роль тіамінзв'язуючих білків мікроорганізмів, рослин і тварин.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Для експериментальних досліджень використано щурів лінії Вiстаp, масою 150–200 г. Тварин утримували на звичайному pацiонi віварію. Всі процедури з тваринами проводили згідно з міжнародними правилами проведення робіт з експериментальними тваринами.
Методи виділення і очищення тіамінзв'язуючих білків. В дослідах використовували мозок, печінку та нирки щурів, які гомогенізували в 5 мМ трис-НCl буфері, pH 7,4, що містив 0,25 М сахарозу, після чого центрифугували при 1000 g протягом 10 хв. Супернатант центрифугували 90 хв. при 100000 g, отриманий осад обробляли охолодженим до -10С ацетоном. Ацетоновий порошок екстрагували в 10 мМ трис-НСl буфері, pH 7,4 і наносили на колонку з афінним сорбентом. Білки, що зв'язувались з сорбентом, елюювали, використовуючи сходинковий сольовий градієнт: 1 М NaCl, 2 М та 4 М сечовину [Постоєнко, 1987]. Від солей білки звільняли гель-фiльтpацiєю на колонці з сефадексом G-25 та діалізом, після чого лiофiлiзували. Додаткову очистку проводили на колонці з сефадексом G-150. Всі операції здійснювали при температурі 0–4С з обов'язковим додаванням в буфер інгібітору протеаз – фенілметилсульфонілфториду.
Синтез афінного сорбенту. Афінний сорбент, тіамін-N-4-азобензоїл--амінокапроїлгідразидосефарозу 4В, синтезовано в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України за методом Кляшицького [1980]. Для синтезу сорбенту використовували гідразид N-4-амінобензоїл--амінокапронової кислоти, який приєднували до BrCN-активованої сефарози 4В в оцтовій кислоті. Гідразид N-4-амінобензоїл--амінокапронової кислоти одержаний шляхом взаємодії метилового ефіру N-4-нітробензоїл--амінокапронової кислоти з гідразингідратом.
Метод вивчення зв'язування [14С]тіаміну з тіамінзв'язуючими білками. Взаємодію тіаміну з ТЗБ досліджували радіолігандним методом [Cuatrecasas, 1972]. Визначення тіамінзв'язуючої здатності (ТЗЗ) проводили з використанням [тіазол-214C]тіаміну в 0,05 М бікарбонатному буфері Кребс-Рінгера, рН 7,4. Ліганд, що не зв'язався, відділяли фільтрацією на мембранних фільтрах Whatman GF/C з діаметром пор 0,45 мкм, після введення в інкубаційне середовище 0,1% -глобуліну G та 25% полiетиленглiколя. Радіоактивність вимірювали на рідинному сцинтиляційному лічильнику SL-20 "Intertechnique" (Франція). Специфічне зв'язування визначали за різницею між загальним зв'язуванням (інкубація лише з міченим тіаміном) і неспецифічним (в присутності 100-кpатного надлишку неміченого тіаміну). ТЗЗ виражали кількістю нмоль тіаміну, зв'язаного 1 мг білка.
Визначення молекулярної маси тіамінзв'язуючих білків. Молекулярну масу ТЗБ визначали двома методами – гель-фільтрацією на колонці з сефадексом G-150 та електрофорезом в ПААГ. В першому випадку для побудови калібрувального графіка залежності логарифму молекулярної маси від об'єму виходу стандартних білків були використані білки-маркери: гліцеральдегідфосфатдегідрогеназа м'язів кролика (144 кДа), гексокіназа дріжджів (100 кДа), альбумін сироватки людини (68 кДа), овальбумін (45 кДа), соєвий інгібітор трипсину (20 кДа), цитохром с (13 кДа). Електрофорез в 10% ПААГ з DS-Nа проводили за методом Laemmli [1970]. Як маркери використовували суміш білків ("Sigma", USA) з молекулярною масою міозин – 205 кДа, -галактозидаза – 116 кДа, фосфорилаза В – 97,4 кДа, альбумін сироватки бика – 66 кДа, овальбумін – 45 кДа, карбоангідраза – 29 кДа. Для розрахунку молекулярної маси ТЗБ будували калібрувальні графіки залежності логарифму молекулярної маси білків-маркерів від їх електрофоретичної рухливості.
Амінокислотний аналіз тіамінзв'язуючих білків. Амінокислотний склад гідролізатів ТЗБ визначали в лабораторії хроматографії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України на автоматичному амінокислотному аналізаторі Т 339 "Mikrotechna" (Чехія).
Методи визначення ферментативних активностей. Тіамінтрифосфатазну активність визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 630 нм за накопиченням Pi після інкубації тіамінтрифосфату (ТТФ) з тіамінзв'язуючим білком [Chan, 1986]. Інкубаційна суміш містила: 50 мМ тpис-НСl буфер (рН 7,4), 5 мМ МgCl2, 0,15 мМ ТТФ, кількість ТЗБ в пробі 10-50 мкг. Ферментативну активність виражали в нмолях Pi за 1 хв. у перерахунку на 1 мг білка.
При дослідженні впливу рН середовища на ТТФ-азну активність білків використовували 50 мМ трис-малеат-NaOH буфер, (рН 5,2-8,6) і 50 мМ трис-НСl буфер (рН 7,4 та 9,0).
ТТФ-азну активність визначали також за концентрацією утвореного в реакції тіаміндифосфату [Чернікевич, 1990]. Інкубаційна суміш містила: 50 мМ трис-НCl буфер, pН 7,4, 10 мМ МgCl2, 10-4 М ТТФ. Кількість тіаміндифосфату визначали ферментативним методом. Для цього відбирали аліквоти, які інкубували з апопіруватдекарбоксилазою 30 хв. при 25?С, далі вносили 0,2 М піровинограднокислий натрій та алкогольдегідрогеназу. Реакцію запускали 0,5 М NADH і вимірювали зміни оптичної густини розчину у перші три хвилини при довжині хвилі 340 нм. Кількість тіаміндифосфату розраховували за калібрувальним графіком, який будували, використовуючи певні концентрації хроматографічно чистого тіаміндифосфату.
Тіаміндифосфатазну, тіамінмонофосфатазну та нуклеотидтрифосфатазні активності визначали за накопиченням неорганічного фосфору [Chan, 1986].
Синтез тіамінтрифосфату. Тіамінтрифосфат синтезували, нагріваючи суміш тіамінгідрохлориду з фосфорним ангідридом в ортофосфорній кислоті [Penttinen, 1979]. Очистку ТТФ проводили на катіонообмінній колонці Dоwex 50-W Х.8, в Н+ формі [Пархоменко, 1982] та на сефадексі G-10.
Електрофорез на ацетат-целюлозі. Електрофорез фосфорних ефірів тіаміну на ацетат-целюлозі проводили в електрофоретичній камері з 0,025 М лимоннокислим буфером рН 3,8 дві години при 500 V [Пархоменко, 1979]. Хроматограми висушували і проявляли окислюючою сумішшю, що складалася з 5 частин 10% NaOH, 5 частин 55% етанолу, 1 частини 2,5% К3Fe(CN)6. В цих умовах всі ефіри перетворюються в тіохром. Флюоресценцію визначали в ультрафіолетовому спектрі.
Методи виділення субклітинних структур. Ядра та мітохондрії виділяли методом диференційного центрифугування [Widnell, Tata, 1964; Johnson, Lardy, 1967], мікросомальні фракції методом [Schenkman, Cinti, 1978], синаптосоми – [Abita, 1977], плазматичні мембрани та мембрани ендоплазматичного ретикулуму – [Давидова, 1968]. Контроль чистоти субклітинних фракцій здійснювали за активністю маркерних ферментів та електронною мікроскопією.
Кількісне визначення білка. Концентрацію білка визначали за методом Bradford [1976], Lowry [1951] та спектрофотометрично при 280 нм.
Математична обробка даних експериментів. Математичну обробку та аналіз отриманих результатів проводили використовуючи комп'ютерні програми Origin 5.1, Sigma Plot V 1.0 та Excel 2000 з урахуванням критерію Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
ВИДІЛЕННЯ, ОЧИСТКА ТА ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ТІАМІНЗВ'ЯЗУЮЧИХ БІЛКІВ РІЗНИХ ОРГАНІВ ЩУРІВ
Для з'ясування наявності тіамінзв'язуючих білків в печінці та нирках щурів ми визначали розподіл специфічної тіамінзв'язуючої здатності в субклітинних фракціях, виділених з цих тканин.
В субклітинних структурах обох органів виявлено значну тіамінзв'язуючу здатність (рис. 1). Найвища ТЗЗ зафіксована для мікросомальної фракції, значно нижча – для мітохондріальної, та слабо виражена – для ядерної і цитоплазматичної фракцій.
Таким чином, експериментальні дані засвідчують, що в умовах in vitro саме мікросомальні фракції найбільш активно зв'язують [14С]тіамін, що вказує на присутність та ймовірну локалізацію в цих клітинних структурах тіамінзв'язуючих білків. Тому наступне завдання нашої роботи полягало у виділенні та очищенні цих білків.
Для виділення тіамінзв'язуючих білків з тканин печінки, нирок та мозку щурів застосовано афінну хроматографію. З білкових екстрактів кожного органу отримано по чотири основних білкових фракцій. На рис. 2, А як приклад показано профіль елюції з афінної колонки білкових екстрактів з печінки щурів. Перший пік – це баластні білки,
Рис. 1. Специфічне зв'язування [14С]тіаміну
з субклітинними фракціями, одержаними з
печінки (a) та нирок (b) щурів (М±m, n=5):
1 – гомогенат;
2 – ядра;
3 – мітохондрії;
4 – мікросомальна фракція;
5 – цитозоль.
які зв'язуються з афінним сорбентом внаслідок неспецифічної взаємодії, оскільки в цій білковій фракції не виявлено ТЗЗ, і десорбуються вихідним буфером. Тіамінзв'язуюча здатність всіх трьох досліджуваних органів властива лише другому білковому піку (2), який елюювали 1 М NaCl, тому подальші дослідження проводили з цією білковою фракцією. Методом електрофорезу в ПААГ з DS–Na у цій фракції виявлені низькомолекулярні домішки, для видалення котрих був застосований додатковий етап очистки – гель-фільтрація на сефадексі G–150 (рис. 2, Б). Від солей білки звільняли хроматографією на сефадексі G–25 та діалізом, після чого їх ліофілізували.
Рис. 2. А – профіль елюції білкового екстракту з печінки щурів з афінного сорбенту.
Умови елюції: 1– 10 мМ трис-НСl буфер, рН 7,4; 2 – 1 М NaCl; 3 – 2 М сечовина; 4 – 4 М сечовина.
-- профіль елюції білка, - - - тіамінзв'язуюча здатність білка.
Б – профіль елюції тіамінзв'язуючого білка печінки щурів з колонки Sephadex G–150.
Завдяки використаним методичним підходам ми отримали препарати тіамінзв'язуючих білків мозку, печінки та нирок щурів з тіамінзв'язуючою здатністю: 3,3 нмоль/мг білка, 2,5 нмоль/мг білка, 3,6 нмоль/мг білка, ступенем очистки – 702, 658, 679 разів, відповідно (табл. 1,2,3).
Вихід білків, розрахований за загальною тіамінзв'язуючою здатністю, становив 46,8% для ТЗБ мозку, 39,5% для ТЗБ печінки та 45,5% для ТЗБ нирок.
Таблиця 1
Очистка тіамінзв'язуючого білка мозку щурів
Етапи очистки | Загальний
білок, мг | Тіамінзв'язуюча здатність | Вихід, % | Ступінь очистки
загальна, нмоль | питома, нмоль/мг білка
Вихідний екстракт | 1500 | 7,05 | 0,0047 | 100 | 1
Обробка ацетоном | 260 | 6,2 | 0,024 | 87,9 | 5,1
Афінна хроматографія | 2,0 | 5,2 | 2,600 | 73,8 | 553
Cефадекс G-150 | 1,0 | 3,3 | 3,300 | 46,8 | 702
Таблиця 2
Очистка тіамінзв'язуючого білка печінки щурів
Етапи очистки | Загальний
білок, мг | Тіамінзв'язуюча здатність | Вихід, % | Ступінь очистки
загальна, нмоль | питома, нмоль/мг білка
Вихідний екстракт | 2000 | 7,6 | 0,0038 | 100 | 1
Обробка ацетоном | 350 | 5,9 | 0,017 | 77,6 | 4,5
Афінна хроматографія | 2,1 | 4,4 | 2,100 | 57,9 | 553
Cефадекс G-150 | 1,2 | 3,0 | 2,500 | 39,5 | 658
Таблиця 3
Очистка тіамінзв'язуючого білка нирок щурів
Етапи очистки | Загальний
білок, мг | Тіамінзв'язуюча здатність | Вихід, % | Ступінь очистки
загальна, нмоль | питома, нмоль/мг білка
Вихідний екстракт | 1650 | 8,8 | 0,0053 | 100 | 1
Обробка ацетоном | 290 | 7,5 | 0,026 | 85,2 | 4,9
Афінна хроматографія | 2,2 | 6,2 | 2,800 | 70,5 | 528
Cефадекс G-150 | 1,1 | 4,0 | 3,600 | 45,5 | 679
Слід зазначити, що аналогічні білкові препарати мікроорганізмів мали вищу тіамінзв'язуючу здатність (від 10,3 до 25,9 нмоль/мг білка), проте вихід білків та ступінь їх очистки був менший, хоча автори застосовували по 5-6 трудоємких етапів очистки [Халмуpадов, 1982]. Вищу тіамінзв'язуючу здатність у порівнянні з досліджуваними нами білками виявляв і ТЗБ, виділений з еритроцитів щурів – 13,7 нмоль/мг білка [Воскобоєв, 1987]. Ймовірно, всі ці відмінності обумовлені різницею у функціях даних білків.
Молекулярна маса ТЗБ мозку, печінки та нирок, визначена гель-фільтрацією на колонці з сефадексом G–150, була однаковою і дорівнювала ~100 кДа.
Згідно з даними електрофорезу, який проводили в 10% ПААГ в присутності DS–Na (рис. 3), досліджувані білки складаються з двох субодиниць. Молекулярну масу білків
Рис. 3. Електрофореграми тіамінзв'язуючих білків в 10% ПААГ в присутності DS-Na:
А,2, Б,1,В,2 – тіамінзв'язуючі білки мозку, печінки, нирок щурів;
А,1, Б,2, В,1 – білки-маркери.
розраховували за калібрувальними графіками, побудованими з використанням експериментальних значень відносної рухливості білкових зон білків-маркерів та досліджуваних ТЗБ. Розрахована таким чином молекулярна маса тіамінзв'язуючих білків мозку, печінки та нирок дорівнювала 98 кДа. Білки містять у своєму складі дві різні за молекулярною масою субодиниці – більшу 63 кДа та меншу – 35 кДа.
Досліджувані білки подібні за амінокислотним складом (табл. 4). ТЗБ печінки містить 836 амінокислотних залишки, ТЗБ нирок – 834. Результати амінокислотного аналізу підтверджують кислу природу білків – в їхньому складі виявлено значну кількість моноамінодикарбонових кислот: для ТЗБ печінки, нирок та мозку – 25,9% (табл. 5). Карбоксильні групи цих амінокислот відіграють ключову роль при взаємодії білка з тіаміном. Відомо, що позитивно заряджений четвертинний атом азоту тіазолієвого кільця тіаміну взаємодіє з негативно зарядженими групами (карбоксильні
Таблиця 4 Таблиця 5
Амінокислотний склад тіамінзв'язуючих Порівняльна характеристика тіамінзв'язуючих білків печінки, нирок та мозку щурів білків за групами амінокислот (%)
Амінокислота | Кількість амінокислотних залишків на 1 моль ТЗБ | Амінокислоти | ТЗБ печінки | ТЗБ нирок | ТЗБ мозку*
ТЗБ печінки | ТЗБ нирок | ТЗБ мозку* |
Гідрофобні |
35,1 |
34,7 |
37,9
Ліз | 50 | 50 | 50 |
Полярні |
28,1 |
28,4 |
25,2
Гіс | 10 | 10 | 10
Арг | 31 | 31 | 33 |
Негативно заряджені |
25,9 |
25,9 |
25,9
Асп | 100 | 101 | 103
Тре | 45 | 45 | 41 | Позитивно заряджені |
10,9 |
10,9 |
11,0
Сер | 78 | 80 | 66
Глу | 116 | 115 | 117 |
* Дані Постоєнка В.О.
Про | 45 | 44 | 45
Глі |
86 | 86 | 86
Ала | 78 | 79 | 80
Ѕ ?ис | 7 | 7 | 7
Вал | 35 | 36 | 34
Мет | 8 | 7 | 25
Іле | 24 | 23 | 21
Лей | 64 | 63 | 65
Тир | 19 | 19 | 21
Фен | 29 | 27 | 34
Три | 11 | 11 | 12
Всього | 836 | 834 | 850
залишки глутамінової та аспарагінової кислот) ТЗБ [Kozik, 1996]. Тіамінзв'язуючі білки досліджуваних органів містять значну кількість гідрофобних амінокислот, що властиво білкам мембранного походження. Нами був розрахований полярний індекс (сума аспарагінової, глутамінової кислот, лізину, аргініну та половина кількості гліцину, треоніну, серину, тирозину, гістидину), який дорівнював для ТЗБ печінки 49,8%, ТЗБ нирок – 50,0%, а для ТЗБ мозку подібний індекс становив 48,9% [Постоєнко, 1990]. Отже, виділені білки мають досить значну гідрофобну і полярну ділянки. Загальна кількість позитивно заряджених амінокислот у білках, виділених з різних органів щурів, практично однакова.
Узагальнюючи отримані нами дані, можна стверджувати, що тіамінзв'язуючі білки печінки та нирок дуже схожі за амінокислотним складом. Порівнюючи їх з ТЗБ мозку, зазначимо, що вони також подібні. Проте, слід зауважити, що у ТЗБ мозку менша кількість серину та вищий вміст метіоніну.
БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ ТІАМІНЗВ'ЯЗУЮЧИХ БІЛКІВ РІЗНИХ ОРГАНІВ ЩУРІВ
Однією з найважливіших особливостей тіамінзв'язуючих білків є характер їх зв'язування з тіаміном. Нами встановлено (рис. 4, А), що за фізіологічних умов процес комплексоутворення тіаміну з ТЗБ всіх досліджуваних органів носить насичуючий характер в діапазоні використаних концентрацій тіаміну 0,05–50 мкМ. На рис. 4, А як приклад наведено залежність зв'язування [14С]тіаміну з ТЗБ печінки. Криві насичення, представлені в координатах Скетчарда (графік залежності відношення концентрації зв'язаного та вільного лігандів від концентрації ліганд-рецепторних комплексів), для всіх досліджуваних ТЗБ мають нелінійний вигляд і свідчать про наявність на білках двох типів ділянок зв'язування з більшою та меншою спорідненістю до тіаміну. На рис. 4, Б як приклад представлено графік Скетчарда для ТЗБ печінки. За допомогою подібних графіків, використавши метод графічної апроксимації, ми розрахували константи дисоціації (Кd1) для тіамінзв'язуючих білків різних органів, які становили: для ТЗБ печінки 0,63±0,16 мкМ, нирок – 0,45±0,11 мкМ та мозку – 0,30±0,17 мкМ. Кd2, що
Рис. 4. А – залежність зв'язування [14C]тіаміну з тіамінзв'язуючим білком печінки щурів від концентрації [14C]тіаміну.
Б – визначення рівноважних параметрів зв'язування [14С]тіаміну з тіамінзв'язуючим білком печінки щурів:
1 – нелінійний графік Скетчарда;
2 – компонента адсорбції тіаміну на центрах високої спорідненості.
характеризує центри зв'язування з меншою спорідненістю до ліганду, визначали методом [Костерін та ін., 1980]. Для ТЗБ печінки Кd2 дорівнювала 8,6±1,8 мкМ, нирок – 7,5±1,5 мкМ та мозку – 8,1±2,6 мкМ.
Таким чином, проведені дослідження та їх аналіз вказують на те, що процес взаємодії [14С]тіаміну з ТЗБ печінки, нирок та мозку має подібні характеристики: носить насичуючий характер в діапазоні досліджуваних концентрацій тіаміну; наявність на білках двох центрів зв'язування – з більшою та меншою спорідненістю до тіаміну; близькі значення констант дисоціації. Для ТЗБ мікроорганізмів зафіксовано дещо вищу спорідненість до тіаміну: для білка з E.coli Кd дорівнювала 0,02–0,05 мкМ [Leach, 1979], з Saccharomyces сerevisiae 0,029 мкМ та 0,17 мкМ [Nishimura, 1989]. Для ТЗБ, виділеного з білка курячого яйця, Кd становила 0,31 мкМ, з жовтка – 0,41 мкМ [Subramanian, 1996]. Ці значення близькі до відповідних величин виділених нами білків. Константи дисоціації ТЗБ рослинного походження дорівнювали: для білка з рисових висівок 0,44 мкМ, насіння гречки 0,73–1,1 мкМ, насіння сезаму 0,11–0,13 мкМ [Kozik, 1996]. Можливо, що ці відмінності спричинені функціональними особливостями даних білків.
Виходячи з того, що в організмі тіамін міститься не лише у вільній формі, а переважно у вигляді його фосфорних ефірів, методом інгібіторного аналізу ми визначали здатність тіамінфосфатів конкурувати з [14С]тіаміном за зв'язування на досліджуваних тіамінзв'язуючих білках. Показано, що тіамінмонофосфат, та, частково, тіамінтрифосфат, конкурували з тіаміном за зв'язування на ТЗБ.
В попередніх дослідженнях, виконаних у відділі біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, показано, що ТЗБ мозку щурів має ферментативні властивості – він гідролізує фосфорні ефіри тіаміну, найбільш активно ТТФ [Пархоменко, 1988]. Проведено дослідження кінетичних параметрів реакції гідролізу ТТФ тіамінзв'язуючим білком, виділеним з мозку [Протасова, Пархоменко, 1991]. У зв'язку з цим, було доцільним з'ясувати, чи характерні подібні властивості і для ТЗБ, виділених з інших органів, а саме з нирок та печінки щурів. Дослідження проводились за аналогічних умов, для порівняння нами був виділений також ТЗБ з мозку. Експериментально доведено (табл. 6), що ТЗБ печінки та нирок, аналогічно білку мозку, з різною інтенсивністю дефосфорилювали тіамінмонофосфат, тіаміндифосфат та тіамінтрифосфат, а найбільш виражено – ТТФ. Тіамінтрифосфатазна активність в різних органах зростала в ряду: нирки < мозок < печінка.
Зазначимо, що ферментативна активність досліджуваних ТЗБ строго специфічна до фосфорних ефірів тіаміну, оскільки жоден з білків не гідролізував нуклеотиди – ATP, GTP, CTP. Виявлена властивість відрізняє ТЗБ від специфічних ферментів – ТТФ-аз (КФ 3.6.1.28), які крім ТТФ гідролізували нуклеотиди і не гідролізували тіаміндифосфат та тіамінмонофосфат [Hashitani, Cooper, 1972]. Для виділених ТЗБ не характерна тіамінкіназна активність. Це свідчить про те, що вони не беруть участі у процесах фосфорилювання тіаміну і його похідних.
Детальне дослідження реакції гідролізу тіамінтрифосфату тіамінзв'язуючими
Таблиця 6
Субстратна специфічність тіамінзв'язуючих білків, ізольованих із мозку, печінки та
нирок щурів (нмоль Pi(хв·мг білка)-1, М±m, n=4-6)
Субстрат | ТЗБ мозку | ТЗБ печінки | ТЗБ нирок
Тіамінтрифосфат, pH 7,4 |
12,4 1,1 | 20,2 2,0 | 11,1 0,4
Тіаміндифосфат, pH 9,0 |
7,5 2,2 | 10,5 1,6 | 7,1 1,8
Тіамінмонофосфат, pH 7,4 | 2,6 0,5 | 2,4 0,5 | 5,4 1,0
АТP, pH 7,4 | 0,0 | 0,0 | 0,0
GТP, pH 7,4 | 0,0 | 0,0 | 0,0
CТP, pH 7,4 |
0,0 | 0,0 | 0,0
білками різних органів дало можливість з'ясувати, що найбільш активно реакція відбувається при фізіологічному значенні рН (7,4). Це також відрізняє білки від ТТФ-аз, а саме – цитозольної, з рН-оптимумом 9,0 [Макарчиков, 2000] та мембранозв'язаної, з рН-оптимумом 6,5 [Barchi, Braun, 1972].
З'ясовано, що для реакції гідролізу тіамінтрифосфату тіамінзв'язуючими білками необхідні іони Mg2+. Величини уявної константи Міхаеліса для Мg2+, визначені методом Лайнуївера-Берка, дорівнювали: для ТЗБ мозку – 2,0±0,3 мМ, для ТЗБ печінки – 2,7±0,6 мМ, для ТЗБ нирок – 2,2±0,5 мМ.
Отже, нами вперше показано, що тіамінзв'язуючі білки печінки та нирок, аналогічно ТЗБ мозку, є біфункціональними – вони специфічно взаємодіють з тіаміном і здатні гідролізувати його фосфорні ефіри. Досліджувані нами ТЗБ відрізняються від специфічних ферментів, котрі гідролізують тіамінфосфати, хоча мають деякі спільні властивості. Не можна стверджувати, що виділені ТЗБ ідентичні між собою за описаними властивостями. Безперечно, вони дуже подібні, але існують і певні відмінності у їх активності, які ми пояснюємо метаболічною спеціалізацією та функціональною активністю тканин, з яких вони виділені. Виявлені ферментативні властивості ТЗБ вказують на те, що вони беруть безпосередню участь у процесах, пов'язаних з перетворенням тіаміну та його похідних в організмі. Особливу увагу слід звернути на ТТФ-азну активність білків, оскільки ТТФ вивчений найменш досконало з фосфорних ефірів тіаміну і в літературі постійно з'являються дані, які дозволяють по-новому оцінити його фізіологічну роль. Так, на сьогоднішній день доведено, що тіамінтрифосфат є активатором макси-Cl?каналів, які присутні в плазматичних мембранах різних типів клітин [Bettendorff, 1994]. Згідно з останніми даними ТТФ може брати участь у фосфорилюванні білків, пов'язаних з ацетилхоліновим рецептором, виступаючи як донор фосфату [Bettendorff, 2000]. Ймовірно, виявлена нами ТТФ-азна активність тіамінзв'язуючих білків може бути певним чином причетною до тих функцій, які виконує ТТФ в клітині. Проте це питання потребує подальшого дослідження.
ВНУТРІШНЬОКЛІТИННА ЛОКАЛІЗАЦІЯ ТІАМІНЗВ'ЯЗУЮЧИХ БІЛКІВ
Для розуміння процесів, які відбуваються за участю тіамінзв'язуючих білків, необхідно було встановити їх внутрішньоклітинну локалізацію. Використавши виявлені нами властивості білків, а саме тіамінзв'язуючу здатність та тіамінтрифосфатазну активність, ми з'ясували їхнє розподілення в субклітинних фракціях мозку, печінки та нирок щурів, що могло бути доказом локалізації ТЗБ в певних досліджуваних структурах.
Так, експериментально показано, що у фракціях синаптичних везикул і плазматичних мембран мозку щурів зафіксовано найбільш високу тіамінзв'язуючу здатність (рис. 5, А). В цих же структурах спостерігалась значна тіамінтрифосфатазна активність (рис. 5, Б). Одержані дані дозволяють зробити висновок про те, що в мозку тіамінзв'язуючий білок локалізується переважно в синаптичних везикулах і плазматичних мембранах синаптосом.
Рис. 5. А – специфічне зв'язування [14С]тіаміну з субклітинними фракціями, одержаними з мозку щурів (М±m, n=5).
Б – тіамінтрифосфатазна активність у субклітинних фракціях, одержаних з мозку щурів (М±m, n=5).
Позначення: 1 – синаптосоми, після осмотичного шоку; 2 – мієлін + гладкий ендоплазматичний ретикулум; 3 – плазматичні мембрани синаптосом; 4 – синаптичні везикули; 5 – мітохондрії синаптосом.
Детальне дослідження субклітинної локалізації тіамінзв'язуючих білків печінки та нирок проводили аналогічним шляхом, визначаючи розподіл в клітинах ТЗЗ і ТТФ-азної активності, останню визначали за кількістю утвореного в процесі реакції тіаміндифосфату. Згідно з отриманими результатами (рис. 6) найвища тіамінтрифосфатазна активність для обох органів зафіксована у мікросомальній
Рис. 6. Тіамінтрифосфатазна активність в субклітинних фракціях, одержаних з печінки (a) та нирок (b) щурів (М±m, n=5):
1 – гомогенат;
2 – ядра;
3 – мітохондрії;
4 – мікросомальна фракція;
5 – цитозоль.
фракції. Оскільки мікросомальна фракція домінує і за здатністю зв'язувати тіамін (рис. 1), ймовірно, місцем локалізації ТЗБ печінки та нирок є мембранні структури, котрі осаджуються у складі мікросомальної фракції. Відомо, що в цій фракції осаджуються мембрани ендоплазматичного ретикулуму та везикульовані фрагменти плазматичних мембран. Ми припустили, що саме фрагменти плазматичних мембран і є джерелом ТЗЗ та ТТФ-азної активності в обох досліджуваних випадках, а плазматичні мембрани – місцем локалізації ТЗБ в клітинах печінки та нирок щурів. Це базувалось на тому, що в нервовій тканині тіамінзв'язуючий білок локалізований в мембранних структурах. Для перевірки цього припущення нами були виділені в чистому вигляді плазматичні мембрани з печінки та нирок щурів, а також мембрани ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрії для порівняльного дослідження їхньої тіамінзв'язуючої здатності.
Згідно з отриманими результатами (рис. 7) найбільш висока тіамінзв'язуюча здатність зафіксована саме для фракції плазматичних мембран, значно нижча характерна для мембран ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій.
Рис. 7. Специфічне зв'язування [14С]тіаміну з субклітинними фракціями, одержаними з печінки (a) та нирок (b) щурів (М±m, n=5):
1 – вихідний екстракт;
2 – мітохондрії;
3 – плазматичні мембрани;
4 – мембрани ендоплазматичного ретикулуму.
Отже, місцем найбільш ймовірної локалізації тіамінзв'язуючих білків в тканинах печінки та нирок щурів є саме плазматичні мембрани клітин.
Результати проведених досліджень та їх аналіз вказують на те, що білки-акцептори тіаміну присутні не лише в нервовій тканині, як вважалось раніше, а й в інших тканинах організму, зокрема, печінці та нирках щурів. Більше того, тіамінзв'язуючі білки печінки, нирок та мозку досить близькі за своїми характеристиками: молекулярною масою, субодиничним та амінокислотним складом. Всі вони специфічно взаємодіють з тіаміном та з різною інтенсивністю гідролізують його фосфорні ефіри, і ці функції є універсальними для всіх досліджуваних тканин.
ВИСНОВКИ
1. Для з'ясування молекулярних процесів, які лежать в основі некоферментних функцій тіаміну, суттєве значення мають дослідження тіамінзв'язуючих білків ссавців. На сьогоднішній день є достеменні відомості лише про тіамінзв'язуючий білок мозку щурів, а питання про наявність подібних білків в інших тканинах та їхню можливу роль залишалось відкритим. Нами вперше виділено та охарактеризовано тіамінзв'язуючі білки печінки та нирок щурів. Встановлено, що вони специфічно взаємодіють з тіаміном та беруть участь в обміні його біологічно активних похідних, і ці функції є універсальними для всіх досліджуваних тканин організму.
1.
2. Встановлено, що тіамінзв'язуючі білки печінки та нирок аналогічно білку мозку мають молекулярну масу близько 100 кДа. Всі досліджувані тіамінзв'язуючі білки містять у своєму складі дві різні субодиниці з молекулярною масою 63 кДа та 35 кДа.
3. Показано, що тіамінзв'язуючі білки з різних тканин близькі за амінокислотним складом. Для них зафіксовано високий вміст моноамінодикарбонових амінокислот, характерних для більшості тіамінзв'язуючих білків, та гідрофобних амінокислот, які властиві білкам мембранного походження.
4. Тіамінзв'язуючі білки мають високу спорідненість до тіаміну та дві ділянки зв'язування ліганду з Кd1 0,63±0,16 і Кd2 8,6±1,8 мкМ для тіамінзв'язуючого білка печінки, нирок – Кd1 0,45±0,11 і Кd2 7,5±1,5 мкМ та мозку – Кd1 0,30±0,17 і Кd2 8,1±2,6 мкМ.
5. Доведено, що тіамінзв'язуючі білки мозку, печінки та нирок за своєю природою є біфункціональними: вони здатні як специфічно взаємодіяти з тіаміном, так і гідролізувати його фосфорні ефіри, особливо тіамінтрифосфат. Реакція гідролізу тіамінтрифосфату залежить від наявності іонів Mg2+ та оптимальна при рН 7,4.
6. В мозку тіамінзв'язуючий білок локалізований переважно в синаптичних везикулах та плазматичній мембрані синаптосом, а в тканинах печінки та нирок – в плазматичній мембрані клітин.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Янчій О.Р., Пархоменко Ю.М., Донченко Г.В. Характеристика тіамінзв'язуючих білків мозку, печінки та нирок щурів // Укр. біохім. журн. – 2001. – Т.73, №3. – С. 107–111 (здобувачем проведено експериментальні дослідження, аналіз одержаних результатів, їх математичну обробку, підготовлено статтю до друку).
2. Пархоменко Ю.М., Протасова З.С., Янчий О.Р., Хосла К., Донченко Г.В. // Локализация тиаминсвязывающего белка в синаптосомах из головного мозга крыс // Нейрофизиология. – 2001. – Т.33, №3. – C. 161–165 (здобувач приймав участь у проведенні експериментів та виконував математичну обробку отриманих даних).
3. Янчий О.Р., Пархоменко Ю.М., Донченко Г.В. Внутриклеточная локализация тиаминсвязывающих белков печени и почек крыс // Укр. біохім. журн. – 2003. – Т.75, №6. – С. 111–114 (здобувачем проведено експериментальні дослідження, аналіз та інтерпретацію одержаних даних, їх математичну обробку, підготовлено матеріали статті до друку).
4. Yanchiy O.R., Parkhomenko Yu.M., Donchenko G.V. // Acethylcholine interaction with rat brain thiamine binding protein // Fifth IBRO world congress of neuroscience. – Jerusalem, Israel, 1999. – P.170.
5. Янчій О.Р., Пархоменко Ю.М., Донченко Г.В. Властивості тіамінзв'язуючих білків мозку, печінки та нирок щурів // Укр. біохім. журн. – 2000. – Т.72, №6. – С. 122–123.
6. Янчий О.Р., Пархоменко Ю.М., Донченко Г.В. Биологическая активность тиаминсвязывающих белков мозга, печени и почек крыс // Материалы Междунар. научн. конф. "Биологически активные соединения в регуляции метаболического гомеостаза". – Гродно: НАН Беларуси, 2000. – Т.2. – С.321–323.
7. Янчий О.Р., Пархоменко Ю.М., Донченко Г.В. Специфические тиаминсвязывающие белки из различных органов крыс // 5ая пущинская конференция молодых ученых “Биология – наука 21го века”. – Пущино, 2001. – С.70–71.
8. Янчій О.Р. Дослідження тіамінтрифосфатазної активності тіамінзв'язувальних білків мозку, печінки та нирок щурів // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т.74, №4а (додаток 1). – С. 94.
АНОТАЦІЯ
Янчій О.Р. Порівняльна характеристика тіамінзв'язуючих білків мозку, печінки та нирок щурів. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2004.
Дисертація присвячена виділенню, очищенню та порівняльній характеристиці специфічних тіамінзв'язуючих білків мозку, печінки та нирок щурів.
В результаті проведених досліджень вперше виділено тіамінзв'язуючі білки (ТЗБ) з тканин печінки та нирок щурів. Здійснено
