НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

БІЛАН ПАВЛО ВОЛОДИМИРОВИЧ

УДК 612.822:611.813.14

Механізми внутрішньоклітинної кальцієвої регуляції в екзокринних клітинах

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в відділі загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Науковий консультант: академік НАН України, доктор біологічних наук, професор

Костюк Платон Григорович,

директор Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: академік НАН України, доктор біологічних наук, професор

Кришталь Олег Олександрович,

зав. відділом фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

заст. директора з наукової роботи та зав. відділом біохімії м’язів Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

доктор біологічних наук,

Жолос Олександр Вікторович,

професор кафедри біофізики Київського Національного університету імені Тараса Шевченка.

Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О.Богомольця.

Захист дисертації відбудеться “ 22 листопада 2005 року о “ 14 ” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад. Богомольця, 4.

Автореферат розіслано “ 21 жовтня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ВСТУП

Актуальність проблеми.

Внутрішньоклітинний кальцій розглядається у сьогоденні як один з найбільш універсальних вторинних посередників, що бере участь у передачі сигналу від структур плазматичної мембрани до внутрішньоклітинних елементів, які забезпечують відгук клітини на зовнішній стимул . Зміни внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію запускають цитоплазматичні процеси, що лежать в основі клітинної збудливості, секреції, синаптичної передачі та скорочення.

Підвищення цитоплазматичного кальцію в секреторних клітинах є найважливішим кроком у процесі кальцій-залежного єкзоцитозу . Kasai й Augustine показали, що викликане агоністом підвищення кальцію починається в апікальній частині секреторних клітин й потім поширюється до базолатеральної частини . Нещодавно було показано, що протягом стимуляції низькими (фізіологічними) концентраціями агоністу, це підвищення концентрації вільного цитозольного кальцію ([Ca2+]i) є обмеженим тільки апікальною частиною клітини . Недавні експерименти продемонстрували, що короткі застосування високих доз ацетилхоліну (АХ) також викликали подібні обмежені спайки кальцію, які не в змозі вторгнутися в ядро. Така обмежена у просторі та часі форма передачі кальцієвих сигналів вигідна фізіологічно, оскільки вона допускає їх цільове виникнення і застосування, а також не призводить до потенційно шкідливих зростань концентрації вільного кальцію в інших частинах клітини.

Вважається загальносприйманим, що ендоплазматичний ретикулум є головною кальцій-регулюючою структурою у незбудливих клітинах . В той же час істотна частина апікальної області поляризованих ацинарних секреторних клітин (де й має місце головна частина всіх агоніст-залежних змін [Ca2+]i) зайнята органелами екзоцитозно-ендоцитозного напрямку (секреторні везикули, апарат Гольджі, ендосоми) і майже не містить ендоплазматичного ретикулуму. Вміст вільного кальцію й механізми його регулювання в цих органелах у значній мірі невідомі. Механізми контролю секреції рідини і ферментів з ацинарних секреторних клітинах, що викликається агоніст-залежними локальними цитозольними [Ca2+]i транзієнтами в секреторному полюсі були, таким чином, неясними. На момент початку дисертаційної роботи, органели, відповідальні за викид і відновлення кальцію протягом цього процесу, також були невідомі, як і невідомий був механізм перезавантаження запасів кальцію в апікальній частині екзокринних клітин. Регуляція концентрації кальцію в ацинарному люмені (біля апікальної мембрани) важлива для регулювання ендоцитозу і ймовірно важлива для перезавантаження запасів кальцію (особливо запасів, що беруть участь в обмежених апікальним полюсом змінах концентрації цитозольного кальцію), теж була невідома. Роль різних механізмів, які можуть брати участь у регулюванні концентрації кальцію у зовнішньоклітинному люмені усе ще залишається невстановленою. Інакше кажучи, є дві тісно зв'язані й важливі області досліджень: органели й механізми, що залучені в змінах цитозольної концентрації кальцію, та обіг кальцію в секреторній області цих клітин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана в рамках наукових програм відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України: „Розробка біофізичних методів та підходів для реєстрації вивільнення іонів кальцію з поодиноких клітин”, „Вивчення локалізації вивільнення іонів кальцію з поодиноких клітин”, „Моделювання дифузії кальцію в зовнішньоклітинному середовищі”, „Дослідження механізмів синаптичної передачі у центральній нервовій системі ссавців”.

Мета роботи.

Мета виконаної роботи полягала у дослідженні механізмів кальцієвої регуляції в екзокринних секреторних клітинах.

Задачі дослідження.

1. Провести дослідження різноманітних клітинних механізмів, що приймають участь у скоординованій регуляції іонів кальцію в екзокринних клітинах під час секреції ними ферментів травлення.

2. Розробити біофізичні методи та підходи, які дозволять реєструвати вивільнення іонів кальцію з окремих секреторних везикул та вимірювати кількість іонів кальцію, звільнених окремими ізольованими клітинами або кластерами секреторних клітин.

3. Розробити біофізичні методи та підходи для візуалізації місць вивільнення або захоплення іонів кальцію на поверхні ізольованих клітин або невеликих клітинних кластерів та математичну модель дифузії і буферування іонів кальцію у навколоклітинному середовищі після їх вивільнення з окремих клітин.

4. Оцінити можливості нових методів для оцінки малих кальцієвих вхідних потоків, викликаних вивільненням іонів кальцію з внутрішньоклітинних кальцієвих депо.

5. Дослідити, чи є окремі секреторні гранули кальцієвими внутрішньоклітинними депо у екзокринних клітинах.

6. Вивчити локалізацію вивільнення іонів кальцію з ацинарних клітин та визначити молекулярні системи, що можуть відповідати за це вивільнення.

7. Дослідити просторове розподілення кальцієвих насосів плазматичної мембрани в ацинарних клітинах підшлункової залози на рівні поодиноких клітин.

8. Знайти зв’язок між просторово-часовими змінами внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію та змінами виходу іонів кальцію з панкреатичних ацинарних клітин.

9. Оцінити на прикладі секреторних клітин слинних залоз вклад секреції, як можливого основного механізму, у процес виведення кальцію з екзокринних клітин.

Наукова новизна отриманих результатів.

У роботі вперше були розроблені нові біофізичні методи, які дозволяють кількісно реєструвати вивільнення іонів кальцію з окремих секреторних везикул, а також вимірювати кількість іонів кальцію, звільнених або захоплених окремими ізольованими клітинами або невеликими клітинними кластерами під час роботи різних кальцій-регулюючих систем плазматичної мембрани. Нами також були розроблені нові біофізичні методи візуалізації місць вивільнення іонів кальцію на поверхні поодиноких ізольованих клітин або їх невеликих кластерів. У роботі вперше проведено дослідження локалізації вивільнення іонів кальцію з панкреатичних ацинарних клітин і ацинарних клітин слинних залоз та визначені молекулярні системи, що відповідають за це вивільнення. Автором вперше показано, що окремі секреторні гранули є кальцієвими внутрішньоклітинними депо. Дана робота вперше характеризує як кількість, так і кінетику вивільнення кальцію шляхом екзоцитозу на рівні одиночної клітини та у порівнянні із вивільненням кальцію за допомогою мембранних кальцієвих насосів. Встановлено, що вивільнення кальцію у екзокринних клітинах може мати місце як шляхом екструзії, так і через екзоцитоз і, у деяких випадках, основна частина кальцію вивільняється за допомогою останнього механізму. Вперше показано зв’язок між просторово-часовими змінами внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію та змінами виходу іонів кальцію з панкреатичних ацинарних клітин. Розроблена математична модель дифузії іонів кальцію у навколоклітинному середовищі після їх вивільнення з окремих клітин.

Теоретичне та практичне значення роботи.

Результати, які отримані в роботі, мають як фундаментальне, так і практичне значення. Дослідження механізмів кальцієвої регуляції секреторних клітин істотно допомагають розумінню механізмів екзотитозу як у різноманітних секреторних, так і в нервових клітинах. Вони збагачують знання, що стосуються вивільнення іонів кальцію з окремих секреторних везикул та різних внутрішньоклітинних кальцієвих депо.

Нові розроблені методи дозволяють вимірювати як кальцієві потоки з поодиноких клітини (і навіть окремих секреторних гранул) так і просторове розподілення цих потоків. Методи дозволяють легко вимірювати просторові властивості кальцієвого потоку навіть настільки малого як 0.01-0.02 фентамоль/cек з просторовим розрізненням у декілька мікрометрів. Таким чином, ці новітні методи можуть бути застосовані для досліджень широкого спектру фізіологічних та патологічних явищ у різних типах клітин. Наприклад, використовуючи нові методи, ми змогли продемонструвати, що секреторний полюс секреторних клітин є головним місцем для кальцієвого витоку під час дії агоністів. Практичне значення отриманих результатів полягає в тому, що вони дозволяють зрозуміти, які саме механізми внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу відіграють головну роль у процесах секреції в тих чи інших клітинах, що пов’язано з кращим розумінням етіології таких тяжких захворювань, як гострий та хронічний панкреатити.

Отримані в роботі дані та їх інтерпретація можуть стати основою для розробки високоселективних фармакологічних підходів до лікування гострого та хронічного панкреатитів та різноманітних захворювань слинних залоз.

Особистий внесок здобувача.

Автор поставив задачі досліджень і розробив нові методики реєстрації вивільнення іонів кальцію з окремих секреторних везикул, а також вивільнення або захоплення іонів кальцію окремими ізольованими клітинами або кластерами секреторних клітин. Автор розробив нові методи візуалізації місць вивільнення іонів кальцію на поверхні клітин, а також самостійно виконував основну частину експериментів пов’язаних з дослідженнями процесів секреції у ацинарних клітинах підшлункової та слинних залоз, здійснював аналіз, статистичну обробку й узагальнення результатів.

Деякі експерименти були проведені разом з іншими співавторами опублікованих робіт, співробітниками Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України: академіком П.Г.Костюком, завідуючим відділом Фізіології Ліверпульського університету (Велика Британія) професором O.H. Петерсеном, завідуючим лабораторією кальцієвої сигналізації Національного інституту здоров’я (США) доктором Д.В. Патні, професором Ліверпульського університету О.В. Тепікіним, докторами цього ж Університету О.В.Герасименко, Ю.В. Герасименко, Д. Гарднер, доктором Д. Біордом та кандидатами біологічних наук О.Е. Сафтенку і В.В. Сницаревим.

Апробація результатів дисертації.

Усі матеріали дисертації докладено на семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, а також на міжнародних симпозіумах і з’їздах: щорічних конференціях Американського Товариства Нейронаук, США (Новий Орлеан, 1997; Лос Анжелес, 1998; Майями, 1999; Сан Дієго, 2001; Орландо, 2002; Новий Орлеан, 2003, Сан Дієго 2004); щорічних конференціях Американського Біофізичного Товариства, США (Балтимор 1999; Новий Орлеан, 2000;); Ювілейній школі IBRO (Ялта, Україна, 2004), а також на засіданнях сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, 2000, 2001, 2002, 2003 и 2004 років.

Публікації.

За результатами роботи опубліковано 24 стаття у провідних вітчизняних і закордонних журналах і 12 тез доповідей.

Структура й обсяг дисертації.

Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень, аналізу й узагальнення цих результатів, висновків та списку використаних літературних джерел із 380 найменувань. Робота викладена на 322 сторінках, містить 4 таблиці та проілюстрована 84 рисунками.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Ізоляція клітин, їх навантаження кальцієвими індикаторами та вимірювання трансмембранних кальцієвих потоків за допомогою конфокальної мікроскопії

Шматочки підшлункової залози миші обробляли чистою колагеназою для того, щоб отримати одиночні ацинарні клітини чи малі (по 2-10 клітин) кластери, як це вже було описано раніше . Для деяких експериментів, які безпосередньо описані у розділі “Результати”, клітини навантажували флуоресцентним індикатором – Fura Red (Molecular Probes, США) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, як це вже було попередньо описано щодо методики навантаження fura-2 . Суспензії ізольованих клітин, як навантажених Fura Red, так і не навантажених, або кластери клітин, поміщали у маленьку експериментальну камеру (приблизно 200 мікролітрів), яка в нормі містила безкальцієвий розчин із 1,5-5,0 мкM декстрану, зв’язаного із Ca2+-чутливим барвником. В більшості дослідів використовувався барвник Calcium Green-1, зв’язаний із декстраном (молекулярна вага 500.000, Molecular Probes, США). Концентрація вільного Ca2+ у зовнішньоклітинному розчині у таких умовах становила приблизно 0.2-0.4 мкM. Значна відмінність у спектрах емісії Calcium Green-1 декстрану та Fura Red дозволила нам спостерігати одночасно за змінами як внутрішньоклітинної так зовнішньоклітинної концентрацій Ca2+. Флуоресцентні сигнали від внутрішньоклітинного та зовнішньоклітинного барвників реєстрували, використовуючи конфокальний мікроскоп Noran Odyssey (Noran Instruments, США) із довжиною хвилі збудження 488 нм та довжиною хвиль емісії 530 і 650 нм для Calcium Green-1 декстрану і Fura Red відповідно. Одночасно із реєстрацією зображень, флуоресцентні сигнали отримували у кількох місцях, які нас цікавили. Ці місця, бокси, розміщували у різних зонах конфокальної площини та усереднені флуоресцентні сигнали від цих боксів записували як функцію часу.

Всі зображення аналізували та обробляли за допомогою програмного забезпечення 2D Intervision Analysis Software (Noran Instruments, США).

Аплікацію агоніста робили або шляхом додавання малої краплі висококонцентрованого маточного розчину агоніста, або шляхом іонтофорезу із мікроелектроду (у цьому випадку другий електрод поміщали у експериментальну камеру). Тривалість іонофорезу становила від 5 до 50 сек. Струми іонофоретичної ін’єкції становили від 10 до 100 нА.

Зовнішньоклітинний розчин містив (у мМ): NaCl 140, MgCl2 0.66-1.13, KCl 4.7, Hepes 10, глюкоза 10; pH 7.2 із NaOH.

Для експериментів із фотолабільними хелаторами кальцію (NP-ЕGТА) клітини навантажували шляхом їх інкубації із ацетоксіметильною формою цієї речовини (концентрація NP-ЕGТА у розчині 5 мкM) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Як зазначалося вище, в інкубаційний розчин додавали 1 мМ CaCl2. Після навантаження клітини двічі центрифугували та ресуспендували у безкальцієвому розчині. Спалахи ультрафіолету (УФ) (1-4 сек) для виділення кальцію із зв’язаних фотолабільних хелаторів робили, використовуючи УФ лазер конфокального мікроскопа. У цих експериментах реєстрація флуоресценції переривалася на кілька секунд (на час, необхідний для того, щоб відкрити та закрити шторку УФ лазеру) для того щоб не пошкодити фото помножувачі конфокального мікроскопу.

Індикатори Ca2+ та NP-ЕГТА поставлялися фірмою Molecular Probes (Eugene, США). Всі інші реактиви поставлялися фірмою Sigma (Dorset, Велика Британія). Експерименти проводили при кімнатній температурі.

Приготування секреторних гранул, їх навантаження кальцієвими індикаторами та вимірювання вивільнення з них за допомогою конфокальної мікроскопії

Миші забивалися шляхом цервікальної дислокації та ізольована підшлункова залоза із двохмісячних мишей промивалася холодним буфером А на льоду (10 мМ MOPS-Tris pH 6.8, 0.1 мМ МгSO4, 3 мМ АТФ, 250 мМ сахарози, 0.5 мг/мл інгібітору трипсину, 1 мг/мл альбуміну із бичачої сироватки). Потім підшлункову залозу обережно розсікали та гомогенізували у буфері А, використовуючи тефлонові або скляні гомогенізатори. Секреторні гранули отримували із гомогенізованої тканини, як це вже було описано (Rogers et al. 1987), але із певними модифікаціями. Ядра та клітинні залишки видаляли центрифугуванням при 1000 g протягом 10 хв.; супернатант центрифугували при 2500g протягом 10 хв. Отриманий білий осад ресуспендували у буфері B (135 мМ KC1, 10 мМ MOPS-Tris, pH 6.8, 0.1 мМ МгSO4, 3 мМ АТФ, 1 мг/мл альбуміну із бичачої сироватки, 0.1 мг/мл інгібітору трипсину). Для того, щоб пофарбувати фракцію секреторних гранул, їх інкубували із 1 мкМ Mag-fura Red AM протягом 7 хвилин при 20oC. Після фарбування Mag-fura Red проводили два послідовні етапи центрифугування у буфері B для того, щоб відмити залишки зовнішньоклітинної Mag-fura Red. Всі етапи намагалися виконувати якнайшвидше при температурі 0-4oC. Використовували ?-амілазу із діагностичного набору Sigma; загальний білок визначали за методом Лоурі при використанні альбуміну сироватки бика як стандарту.

Ми поміщали 10 мікролітрів препарату секреторних гранул у експериментальну камеру і добавляли до них калієві солі кальцієвих індикаторів fluo-3 або indo-1 для того щоб отримати 100 мікромолярну концентрацію цих флуоресцентних індикаторів і кальцієвих буферів для вимірів концентрації кальцію у позагранулярному середовищі. Вторинні кальцієві посередники IP3 та cADP рибоза добавлялися до гомогенату гранул для отримання їх фінальної концентрації на рівні 5-25 мкМ. СаCl2 та EGTA добавлялись до гомогенату наприкінці кожного експерименту для того, щоб відкалібрувати кальцієві відповіді у позагранулярному середовищі. Гранули напружені Mag-fura Red були використані як у експериментах з гранулярними суспензіями так і у експериментах з поодинокими гранулами. Для експериментів з поодинокими гранулами 10 мікролітрів препарату секреторних гранул розбавлялися до 100 мкл з використанням буферу В, що містив 100 мкМ EGTA і поміщали цей розчин у експериментальну камеру. IP3 та cADP рибоза були добавлені або ін’єковані іонофоретично у позагранулярне середовище у цьому наборі експериментів. Іономіцін (20 мкМ) або А23187 (20 мкМ) з 1 мМ EGTA та 10 мМ СаCl2 були використані для калібрування внутрішньо гранулярних змін концентрації кальцію наприкінці кожного експерименту. Всі виміри кальцію виконувались при кімнатній температурі з використанням конфокальної системи Noran Odyssey (Noran Instruments, США) об’єктивів x20 та x100 (Nikon, Японія). Режим сумації 128 окремих зображень був використаний у експериментах з поодинокими гранулами для підвищення співвідношення сигнал/шум.

Вимірювання вивільнення іонів кальцію із поодиноких клітин за допомогою методу крапельки.

Головна ідея методу крапельки – це утримання клітини у дуже маленькій за об’ємом крапельці зовнішньоклітинного розчину. Об’єм такої крапельки повинен бути настільки малим, щоб кількість кальцію вивільненого із ізольованої клітини була достатньою для того, щоб викликати такі за величиною зміни зовнішньоклітинної концентрації кальцію, які можна було б виміряти. Крапельку утворюють на поверхні силіконізованого покровного скла та покривають мінеральною олією для того, щоб запобігти швидкому випаровуванню. Клітину та зовнішньоклітинний розчин наповнюють індикаторами кальцію різних типів. Оптичні характеристики цих індикаторів підбирають таким чином, щоб надати можливість синхронних вимірів внутрішньоклітинної та зовнішньоклітинної концентрацій кальцію. Клітина у крапельці може при цьому стимулюватися агоністами, які прикладають через мікропипетки, вставлені у крапельку. Оцінка об’єму клітини та крапельки дозволяє експериментатору виміряти всі зміни загальної концентрації кальцію як у клітині так і у крапельці.

Вимірювання вивільнення іонів кальцію із поодиноких клітин за допомогою важких декстранів.

Експерименти по вимірюванню вивільнення Ca2+ за допомогою важких декстранів є технічно набагато простішими, ніж вимірювання вивільнення кальцію із використанням методу краплинки. Перевагою такого типу експериментів є те, що на рівні одиночної клітини реєструється не тільки загальна кількість виділення кальцію, але і її локальна інтенсивність.

Ми сповільнювали поширення кальцію із місця вивільнення за допомогою кальцієвого буфера із великою молекулярною вагою (Calcium Green-1, декстран, МW 500.000) який одночасно використовувався як кальцієвий індикатор. Це створило необхідні умови для локалізації місць вивільнення кальцію за допомогою конфокального мікроскопа.

Для експериментів готували зовнішньоклітинний розчин, який містив 30-100 мкМ кальцій-чутливого барвника, зв’язаного із декстраном. Для підвищення чутливості методики із використанням Calcium Green-1 декстрана, цей декстран був єдиним кальцієвим буфером у зовнішньоклітинному розчині.

Після цього ізольовані клітини відмивали у безкальцієвому розчині та ресуспендували у безкальцієвому розчині, який містив Calcium Green-1 декстран. 200 мкл клітинної суспензії наливали у експериментальну камеру і рзміщували камеру на столику конфокального мікроскопу. У разі довготривалого експерименту (більше, ніж 10 хв.), розчин вкривали мінеральною олією.

Для стимуляції клітин агоністами використовували локальну їх аплікацію. Наприклад, мікроелектрод заповнювали розчином із 10 – 20 мМ АХ. При цьому опір мікроелектрода становив 40 – 50 МОм при заповненні його 1М КСl. В експериментальну камеру вносили інший електрод (срібну дротину, вкриту AgCl). Прикладали постійний струм, що не дозволяв АХ виходити з мікроелектрода (5 – 10 нА). Розміщували кінчик електрода на відстані 50 – 100 мкм від групи клітин, які планували стимулювати. Для стимуляції клітин прикладали вхідний струм у зворотному напрямку (у наших експериментах – 10 – 100 нА).

Аналіз даних. Аналіз даних та зображень виконували з використанням аналітичних програмних продуктів: 2D Intervision Analysis Software, Noran Instruments, США; QuantiCell, Applied Imaging, UK; Tida HEKA Electronics, Germany; Origin 3.54, Microcal Software, США; Excel 2000, Microsoft, США). Як що не вказано іншого, результати представлені як середні значення ± середньоквадратична похибка при обсязі вибірки n. Вірогідність розходжень між значеннями визначали за критерієм t-Стьюдента. Різницю вважали достовірною при р < 0.05.

Результати Досліджень

Вивільнення Сa2+ із одиночних ізольованих панкреатичних зимогенних гранул, викликане інозитолом трифосфатом та циклічною АДФ-рибозою.

Існує важливий клас викликаних агоністом цитозольних Ca2+ сигналів, причиною яких є стимульоване медіаторами вивільнення Ca2+ із депо всередині клітини. Найбільш важливим посередником вивільнення Ca2+ є IP3 і, виходячи із того, що вивільнення Ca2+ із ЕР спричинюється IP3 , загальноприйнятою стала та точка зору, що агоністи викликають Ca2+ сигнали у цитозолі через опосередковане IP3 вивільнення Ca2+ із ЕР .

На високополяризованих панкреатичних ацинарних клітинах було показано, що низькі (фізіологічні) концентрації пептидного гормону CCK, або нейропередатчика АХ викликають локальні спайки [Ca2+] у цитозолі апікального секреторного полюса (область секреторних гранул) . Ці спайки можуть виникати як одиночні, або повторюватися, і у деяких випадках вони можуть передувати довготривалим Ca2+ сигналам, які поширюються по клітині . Локальні спайки [Ca2+] у секреторному полюсі виникають не завдяки локалізації рецепторів для CCK чи АХ у апікальній частині клітини, оскільки внутрішньоклітинна інфузія IP3 (чи неметаболізуючихся аналогів IP3) спричинює спайки [Ca2+], які повторюються та або обмежуються секреторним полюсом, або виникають у цій частині клітини, а потім поширюються по ній . Селективні мікроін’єкції IP3 у область секреторного полюса чи базальної частини клітини дозволяють встановити, що у секреторному полюсі існує механізм вивільнення Ca2+, чутливість якого до вторинних посередників є набагато вищою, ніж у базальній частині клітини . Також було показано, що фокальна аплікація АХ на базальну частину клітини може викликати підвищення цитозольного Ca2+ у секреторному полюсі на деякій відстані від місця генерації вторинного посередника . Це відбувається, найвірогідніше, завдяки швидкій дифузії дуже мобільного посередника (IP3) до області секреторного полюсу, яка є надзвичайно високочутливою до IP3 . Всі ці дані вказують на те, що у панкреатичних ацинарних клітинах полюс секреції відіграє свою специфічну роль у Ca2+ сигнальних процесах внаслідок своєї високої чутливості до IP3, що відбувається, найімовірніше, завдяки як відносно високій концентрації IP3 рецепторів у цій області та/чи тому, що IP3 рецептори секреторного полюсу мають особливо високу афінність до IP3 . Імунохімічними дослідженнями було показано, що IP3 рецептори типу 3 специфічно локалізовані у секреторному полюсі панкреатичних ацинарних клітин . Хочеться також відмітити, що локальні спайки [Ca2+]і у секреторному полюсі фізіологічно важливі, оскільки, як показали вимірювання ємності, вони є достатніми для того, щоб викликати секрецію (екзоцитоз) .

Добре відомо з результатів численних електронномікроскопічних досліджень, що у панкреатичних ацинарних клітинах в області секреторного полюсу знаходяться численні гранули зимогену (ЗГ), тоді як у базальній частині клітини знаходяться переважно ядро та ЕР . Той факт, що фізіологічно важливі цитозольні [Ca2+] сигнали виникають у області, яка переважно містить ЗГ, але не у частині, у якій домінує ЕР, спонукав нас досліджувати можливості ЗГ, про які відомо те, що вони мають високий вміст кальцію і можуть вивільняти частину цього кальцію у відповідь на стимуляцію IP3. Yoo та Albanesi описали експерименти, у яких IP3 викликав підвищення концентрації Ca2+ (час наростання до піку близько 1 хвилини) навколо популяції ізольованих адренальних хромафінних гранул, але це спостереження вважалося деякими дослідниками недостовірним .

У цьому розділі дисертаційної роботи ми описуємо результати експериментів у яких, використовуючи конфокальну мікроскопію та новітні методи описані в попередніх розділах, нам пощастило провести вимірювання концентрації вільного Ca2+ всередині одиночних секреторних гранул і в екстрагранулярному просторі дуже близько до поодиноких ізольованих ЗГ. Далі ми покажемо, що IP3 та інший можливий посередник вивільнення Ca2+ - циклічна АДФ рибоза (cADPr) спричинює помітне зниження концентрації Ca2+ всередині одиночної ЗГ. Використовуючи новітню методику високої роздільної здатності ми також продемонстрували, що локальна іонофоретична аплікація IP3 призводить до швидкого та крутого наростання концентрації Ca2+ (час наростання до піка близько 5 сек.) назовні ЗГ. Ми вважаємо, що ці результати прямо показують, що внаслідок дії вторинних посередників може відбуватися вивільнення кальцію із секреторних гранул яке має часову розгортку відповідну до генерації спайків цитозольної [Ca2+].

Приготування препарату ЗГ

Для того, щоб вивчати здатність IP3 та cADPr викликати вивільнення Ca2+ із ЗГ, нам було необхідно отримати їх високоочищену фракцію. Одночасно процедура ізоляції повинна була бути досить швидкою для того, щоб зберегти можливість гранул відповідати на дію посередників.

Ми отримували переважно одиночні гранули, які виглядають, як чорні сфери (ЗГ ефективно абсорбують світло при довжинах хвиль близько 500 нм). Більшість ЗГ добре забарвлюються флуоресцентним кальцієвим барвником mag-Fura Red. Після того, як були отримані зображення, до експериментальної камери додавали специфічний барвник для кислотних органел Lizo Tracker. Флуоресцентне зображення від тієї самої області записували через 5 хв. (збудження - 488 нм, емісія - 515 - 560 нм). Більшість ЗГ яскраво забарвлюються цим барвником, що свідчить про те, що інтрагранулярний простір, має кислі властивості. У деяких експериментах для досягнення цієї ж мети використовували замість Lizo Tracker акридиновий помаранчевий і отримували подібні результати.

Ми також перевіряли, чи не відбувається у наших експериментах забруднення препарату гранул компонентами ендоплазматичного ретикулуму. Одиночні гранули не виявляли ніякої помітної флуоресценції після фарбування ЕР за допомогою DiOC6(3), але вони яскраво флуоресцували при використанні Lizo Tracker. У паралельних експериментах, DiOC6(3) при подібних умовах яскраво забарвлював часточки панкреатичного гомогенату, який ми використовували для ізоляції секреторних везикул. У попередніх експериментах на ізольованому ядрі ми також змогли продемонструвати яскраве забарвлення ядерної оболонки (зовнішня ядерна мембрана має властивості ЕР), використовуючи такі ж самі концентрації флуоресцентного маркера ЕР . Таким чином, ми зробили висновок про те, що наш препарат зимогенних гранул практично вільний від забруднення ЕР. Цей висновок підкріплюється також тим, що Tg, специфічний інгібітор Ca2+-ATФаз в ЕР, був неспроможний викликати вивільнення Ca2+ із ЗГ (дивись нижче).

Таблиця 1. Розподілення ?-амілази та білку у субклітинних фракціях, ізольованих із підшлункової залози миші.

Фракції | Об’єм, мл | Білок | б-?мілаза | Збагачення (рази)

мг/мл | Вихід, % | Од/мл | Вихід, %

Гомогенат | 7 | 3,9 | 100 | 69,4 | 100 | 1

Гранули (ЗГ) | 1 | 1 | 3,6 | 208 | 10,7 | 3

Активність ?-амілази та загальної концентрації білків були виміряні у фракції ЗГ та в клітинному гомогенаті. Як це показано у таблиці 1, фракція ЗГ містила в 3 рази вищу концентрацію ?-амілази ніж гомогенат, відповідно до тих значень, які вже наводилися раніше .

Вивільнення Ca2+ в екстрагранулярне середовище

Для вимірювання змін концентрації вільного Ca2+ у середовищі навколо ізольованих секреторних гранул ми поміщали 10 мкл концентрату ЗГ, які містили 100 мкМ fluo-3 або indo-1 (взяті із 2 мМ маточних розчинів) у експериментальну камеру на столику конфокального мікроскопа (Норан, США) із об’єктивом зі збільшенням 20 (Найкон, Японія). Вимірювання із fluo-3 проводили при довжині хвилі збудження 488 нм та довжинах хвиль випромінювання 510 - 560 нм. Для indo-1 ми використовували довжину хвилі збудження 363 нм та реєстрували співвідношення емісії при 405 нм та 495 нм. Концентрація вільного кальцію у екстрагранулярному середовищі становила 160 + 7 нм. Для вивчення впливу IP3 ми використовували як нормальний D-міо-інозитол 1,4,5 трифосфат, так і неметаболізуючийся аналог D-міо-інозитола 1,4,5 трифосфата, 3-деокси-3- флуoро IP3 . Подібні результати були отримані для обох агентів і дані, таким чином, були об’єднані. Аплікація 5 мкМ IP3 (рис. 1А) спричинювала помітне зростання зовнішньогранулярної концентрації Ca2+ у 3 експериментах. IP3 у концентрації 25 мкМ викликав зростання екстрагранулярної концентрації вільного Ca2+ (рис. 1B) до 55 + 5 нм (n = 15). Це відповідає підвищенню загальної концентрації вільного кальцію у середовищі до величини приблизно 5 мкМ. І це одночасно відповідає спаданню до величини приблизно 0.5 мМ загальної концентрації кальцію у гранулах. Гепарин (0.2 мг/мл) знімав ефект IP3 (25 мкМ) у всіх 3 проведених експериментах такого типу.

Аплікація cADPr (1 мМ маточний розчин, розведений до фінальної концентрації 25 мкМ) викликала підвищення [Ca2+] у екстрагранулярному середовищі на 49 + 7 нм (n = 6) (рис. 1C). Це відповідає зростанню загальної концентрації кальцію у середовищі до 4.3 мкМ, що відповідає зниженню до 0.43 мМ загальної концентрації кальцію у гранулах. Подібні результати були отримані для indo-1, коли його використовували замість fluo-3 (IP3: n = 20, cADPr: n = 7). Як IP3 , так і cADPr могли бути забруднені кальцієм. Для того, щоб це перевірити, ми проводили контрольні експерименти та знайшли, що обидві

речовини - IP3 та cADPr (обидві по 25 мкМ), якщо їх додавати у подібне середовище без ЗГ, викликали зростання концентрації вільного кальцію менше, ніж на 5 нМ. Тапсігаргін (Tg) (10 мкМ), специфічний блокатор Ca2+ -АТФаз у ЕР не викликав ніяких помітних змін у флуоресценції fluo-3 (рис. 1D), але якщо після цього додавався IP3, то виникала така ж відповідь, як і раніше (n = 7).

Для того, щоб оцінити максимальну кількість вивільненого із зимогенних гранул кальцію, у експериментальну камеру вміщували по 10 мкл зразків гранул. До камери додавали indo-1 (200 мкМ) та 1 мМ EGTA. Вивільнення кальцію спричиняли додаванням 20 мкМ іономіцину або 0.5% Тритона X 100. Кількість кальцію, вивільненого із гранул, оцінювали при додаванні кальцію у різних кількостях як після додавання агентів, так і у контрольних експериментах. Загальна концентрація вивільненого кальцію у об’ємі гранул становила 13 + 3 мМ (n = 4)

Вимірювання змін інтрагранулярної концентрації вільного кальцію

Для того, щоб вивчити зміни концентрації вільного Ca2+ всередині гранул, ми проводили їх інкубацію із mag-Fura Red AM, використовуючи загальний підхід, який розробили Хофер та Мачен . Вимірювання проводили при довжині хвилі збудження 488 нм та довжині хвилі випромінювання близько 590 нм. Оцінена таким чином концентрація вільного Ca2+ всередині гранул (припускаючи, що Kd для mag-Fura Red для Ca2+ становить

17 мкМ) була 55 + 4 мкМ (n = 25). IP3 (25 мкМ) викликав 30 + 3% (n = 8) зниження концентрації вільного Ca2+ всередині гранул у порівнянні із його рівнем перед стимуляцією. Таким чином, інтрагранулярна концентрація Ca2+ стабілізувалася на новому рівні.

cADPr (25 мкМ) також спричинював зниження інтрагранулярної концентрації Ca2+ на 25 + 3% (n = 5) від його рівня перед аплікацією. Аплікація 10 мкМ Tg не змінювала концентрацію інтрагранулярного Ca2+, але знову ж, коли після цього додавали IP3, то спостерігалося його помітне зниження (n = 5).

Вимірювання концентрації вільного Ca2+ всередині одиночної ЗГ

Вимірювання на одиночних гранулах проводили на препаратах, навантажених mag-Fura Red (збудження 488 нм та випромінювання >590 нм). Області із гранулами вибиралися при використанні режиму прохідного світла конфокального мікроскопу. Для експериментів вибиралися ділянки, що мали зображення темних круглих частинок із діаметром приблизно 1 мкм. На рис. 2 A-C показані результати експерименту, у якому одночасне вимірювання флуоресценції проведене для шести ізольованих гранул у полі зору. Вибрані для вимірювання флуоресценції ділянки співпадали із яскравими часточками такого ж розміру, що і темні у прохідному світлі. Виміряна концентрація вільного Ca2+ всередині одиночних гранул становила 50 + 1 мкМ (n = 70). IP3 інжектували у середовище поблизу гранул, які були вибрані для експерименту, і це спричиняло зниження у них інтрагранулярної концентрації вільного Ca2+ на 25 + 3% (n = 30) (рис. 2A). Подібні ж відповіді отримували, використовуючи ін’єкцію cADPr (зниження на 30 + 5%, n = 24, рис. 2B). Додавання 10 мкМ Tg не викликало ніяких змін (n = 24, рис. 2С).

Вимірювання змін концентрації вільного Ca2+ у середовищі навколо одиночної секреторної гранули

Вимірювання вивільнення Ca2+ із одиночної ЗГ проводили, використовуючи Calcium Green-1 декстран (збудження - 488 нм, випромінювання - 510-560 нм). Поля із одиночними гранулами вибирали, використовуючи можливості конфокального мікроскопа для реєстрації у прохідному світлі (рис. 3). Цікаві ділянки вибирали так, щоб одна із них знаходилася поблизу секреторної гранули (контроль), а інша – на відстані 10-15 мкм від гранули. Аплікацію IP3 виконували, використовуючи іонофоретичну ін’єкцію (рис. 3). Записи інтенсивностей флуоресценції для випадку Calcium Green-1 декстрану (70kD) показані на рис. 3 D. Верхній запис демонструє сигнал, заміряний у боксі поблизу гранули (рис. 3 A,B,C), нижній запис відповідає боксу, розміщеному на відстані 15 мкМ від гранули (поза полем зору, зображеному на рис. 3 A,B,C). Ін’єкції IP3 викликали швидке вивільнення Ca2+ із одиночних ЗГ (n=3) та із маленьких кластерів гранул (n=6). Швидкоминаюче підвищення концентрації вільного Ca2+, яке можна було зареєструвати за допомогою боксу, розміщеного поблизу гранули, слабо реєструвалося вже на відстані кілька мікрон від гранули, і ніяких змін не можна було зареєструвати вдалині, на відстані у 10 мкм. Контрольна ін’єкція IP3 у те ж саме середовище, але без ЗГ не викликала ніяких змін у інтенсивності флуоресценції.

Зміни у концентрації вільного цитозольного Ca2+ в інтактних клітинах внаслідок дії ацетилхоліну або тапсігаргіну

У попередніх експериментах було багаторазово задокументовано, що AХ та CCK викликають зміни у концентрації цитозольного вільного кальцію ([Ca2+]i), які або обмежуються областю секреторних гранул, або виникають в цій області, а потім поширюються на інші частини клітини . Toeску та ін. показали, що на відміну від дії стимуляторів секреції, специфічний інгібітор ЕР Ca2+-АТФаз, Tg, головним чином викликає вивільнення Ca2+ із базолатеральних областей панкреатичних ацинарних клітин . Результатами своїх експериментів Toeску та ін. показали, що коротка попередня стимуляція AХ викликала помітне підвищення [Ca2+]і у області секреторних гранул, а після цього клітина могла відновити концентрацію [Ca2+]i у області секреторних гранул і повернутись до нормальних стану перед аплікацією Tg. Однак можна було заперечити, що той факт, що у таких експериментах Tg не викликав вивільнення Ca2+ із області секреторних гранул можна пояснити попереднім, викликаним АХ, вивільненням Ca2+ у цій області. Виходячи із точки зору наведених вище даних які вказують на те, що Tg не може вивільнювати Ca2+ із ізольованих ЗГ, нам було цікаво протестувати інтактні клітини, використовуючи конфокальний мікроскоп і з’ясувати, де все ж таки відбувається первинне вивільнення Ca2+, викликане Tg. Підвищення Ca2+, виклікане короткою іонофоретичною аплікацією AХ відбувалося дуже специфічно у гранулярній секреторній області. Як і у попередньо опублікованих даних, Tg викликав повільне зростання [Ca2+]i переважно у базолатеральній області.

Таким чином у даній частині дисертаційної роботи ми визначали, чи є ЗГ кальцієвими депо у секреторних клітинах і чи можуть вивільнювати Ca2+ із ЗГ такі посередники, як IP3 та циклічна АДФ-рибоза. У експериментах на одиночних ізольованих ЗГ із використанням конфокальної мікроскопії ми показали, що IP3 та cADPr викликають помітне спадання концентрації вільного інтрагранулярного Ca2+. Використовуючи новий метод, ми вимірювали зміни у концентрації Ca2+ поблизу ізольованих ЗГ та показали, що IP3 та cADPr викликають швидке вивільнення Ca2+ із гранул, чим можна пояснити явище викликаного агоністом підвищення цитозольного Ca2+ у секреторному полюсі ацинарних клітин.

Локалізація місць виділення Сa2+ в панкреатичних ацинарних клітинах

Еволюційним шляхом в клітинах утворилася складна система для підтримки низьких концентрацій Ca2+ шляхом видалення Ca2+ із цитоплазми після того, як він туди потрапив як шляхом вивільнення із внутрішньоклітинних депо, так і внаслідок потрапляння Ca2+ через канали плазматичної мембрани. Власне, Ca2+ може бути видалено із цитозолю різноманітними системами плазматичної мембрани . Однак, не дослідженою до цього часу проблемою є просторове розподілення вивільнення у позаклітинний простір на клітинному рівні. Як правило, оцінки просторового розподілу активності різних типів регуляторних систем плазматичної мембрани робляться на основі вивчення змін у [Ca2+]і. Однак, інтерпретація результатів таких вимірювань є неоднозначною внаслідок інтерференції із іншими кальцієвими регуляторними системами (такими, як буфери Ca2+, механізми захвату Ca2+) та неоднорідностями дифузії Ca2+ всередині клітин.

Розробивши теоретичне і практичне обґрунтування для застосування розроблених нами новітніх методів вимірів просторово-часових характеристик потоків іонів кальцію через плазматичну мембрану клітин, ми розпочали серії дослідів, націлених на дослідження місць виділення Ca2+ в панкреатичних ацинарних клітинах мишей.

Швидке зростання [Ca2+]i, спричинене аплікацією АХ, викликало зниження інтенсивності флуоресценції Fura Red, за яким слідувало зростання інтенсивності флуоресценції Calcium Green-1 декстрану, що означало вивільнення Ca2+ із клітин у оточуюче середовище. Стимуляція цього типу (за допомогою 10 мкМ АХ) завжди викликала зростання [Ca2+]i, яке починалося у секреторному полюсі, а