УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА

Дунаєва Ольга Вікторівна

УДК 636.52/.58.082.453:591.1

ПІДВИЩЕННЯ ЖИТТЄЗДАТНОСТІ

КРІОКОНСЕРВОВАНИХ СТАТЕВИХ КЛІТИН ПІВНІВ

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ХАРКІВ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії репродукції птиці Інституту птахівництва УААН

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, академік УААН Сахацький Микола Іванович,

Національний аграрний університет

Кабінету Міністрів України,

завідувач кафедри розведення

сільськогосподарських тварин

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор, академік УААН Осташко Федір Іванович, Інститут тваринництва УААН, головний науковий співробітник

кандидат біологічних наук, доцент, заслужений працівник освіти України Югай Костянтин Дмитрович, Харківська державна зооветеринарна академія Міністерства аграрної політики України, завідувач кафедри фізіології сільськогосподарських тварин

Провідна установа: Донецький національний університет Міністерства освіти і науки України, кафедра фізіології людини і тварин, м. Донецьк

Захист дисертації відбудеться 07.12.2005 року о _10__ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 65.356.02 при Інституті тваринництва УААН за адресою: 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту тваринництва УААН за адресою: 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі.

Автореферат розісланий 07.11.2005 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Проніна В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У теперішній час у селекційно – племінній роботі, при збереженні генофонду рідкісних порід курей використовують декілька технологій низькотемпературної консервації сперми півнів, які забезпечують одержання заплідненості яєць на рівні 60-90% (Артеменко О.Б.,2002; Hammerstedt R.H. & al.,1992; Lake P.E.,1981; Schramm G.P.,1999; Sexton T.J.,1980). Але всі відомі технології мають суттєвий недолік, який полягає у низькому виході функціонально повноцінних сперміїв. Зазвичай, лише 30-50% сперміїв від їх загальної кількості зберігають здатність до запліднення після низькотемпературної консервації. Тому при використанні деконсервованої сперми півнів для одержання задовільних результатів за заплідненістю яєць потрібно вводити у статеві шляхи курей у 10-15 разів більше сперміїв, а також частіше (два рази на тиждень замість одного у 5-7 діб) проводити осіменіння (Каримов К.К.,1979; Курбатов и др.,1988; Lake P.E.,1986; Sexton T.J.,1981).

Удосконалення відомих технологій низькотемпературної консервації у напрямку підвищення виходу функціонально повноцінних клітин дає цілу низьку переваг. Головною з них, є можливість суттєвого збільшення кількості нащадків від видатних у селекційно – генетичному аспекті півнів, а також більш раціонального використання спермосховищ, зниженні витрат праці на проведення осіменіння.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Основні положення дисертації розроблені в лабораторії репродукції птиці Інституту птахівництва УААН при виконанні планових досліджень на 2001 – 2005 роки за темою: “Розробити нові та вдосконалити існуючи методи створення та збереження трансгенної птиці” (номер державної реєстрації 0104U004292).

Мета і завдання досліджень. Мета роботи полягала у підвищенні життєздатності кріоконсервованих сперміїв півнів шляхом удосконалення технології низькотемпературної консервації.

Для досягнення цієї мети необхідно було провести більш глибокі дослідження цитофізіологічних процесів, що відбуваються у спермі поза межами організму і при її технологічній обробці для тривалого зберігання. У зв’язку з цим на виконання були поставлені такі завдання:

1. Вивчити вплив дії кріопротекторів диметилформаміду, етиленгліколю, 1,2-пропандіолу, 2,3-бутандіолу, 2-метоксіетанолу, а також їх композицій при низькотемпературній консервації сперми півнів на перебіг цитофізіологічних процесів у сперміях.

2. Удосконалити технологічні засоби підготовки сперми півнів до заморожування.

3. Розробити нове кріозахисне середовище.

4. Розробити ефективний метод оцінки якості сперми півнів, який би дозволяв контролювати фізіологічний стан статевих клітин на різних етапах кріоконсервації.

5. На підставі нових даних удосконалити технологію кріоконсервації сперми півнів.

Об'єкт дослідження. Процес морфо-фізіологічних змін у сперміях півнів під впливом кріозахисних середовищ, кріопротекторів та їх композицій, температури та ступеня розведення сперми середовищем, а також температури введення в неї кріопротектору.

Предмет дослідження. Спермії півнів, методи оцінки функціональної повноцінності сперміїв, запліднююча здатність сперми півнів, кріопротектори, захисні середовища, режими підготовки сперми до заморожування.

Методи дослідження. Використано фізіологічні, морфологічні, фізико-хімічні, біологічні, зоотехнічні та математико-статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Наукова новизна й наукове значення для розвитку напрямку фізіології репродукції птиці, полягає у поглибленні уявлень про цитофізіологічні процеси, які відбуваються у спермі півнів поза межами організму в процесі кріоконсервації.

Вивчена кріозахисна й пошкоджуюча дія на спермії півнів найбільш відомих кріопротекторів та їх композицій. З 27 композицій хімічних сполук, вивчених вперше у якості кріопротекторів при заморожуванні сперми півнів, обрана одна, найбільш ефективна. Встановлено, що ця нова кріопротекторна суміш, яка складається з диметилформаміду, 1,2-пропандіолу і етиленгліколю при однаковому співвідношенні компонентів (1:1:1), є найменш токсичною по відношенню до сперми півнів, особливо у зоні плюсових температур, і найбільші кріозахисні властивості проявляє у 8%-ій кінцевій концентрації.

Вперше встановлена специфічність цитофізіологічного впливу кріопротекторів та їх композицій на окремі органели сперміїв, зокрема: диметилформамід спричиняє пошкоджуючу дію в основному на акросоми, 1,2-пропандіол, 2,3-бутандіол – на мембрани голівок сперміїв, етиленгліколь і 2-метоксіетанол – на рушійний апарат.

Удосконалені технологічні прийоми підготовки сперми півнів до низькотемпературної консервації.

Розроблене нове кріозахисне середовище, яке дозволяє підвищити збереженість сперміїв півнів, особливо у діапазоні плюсових температур.

Розроблено метод визначення життєздатності сперміїв півнів до і після заморожування за станом акросом і голівок шляхом їх диференційного забарвлення сумішшю барвників родаміна С і малахітового зеленого.

Наукова новизна розробленого технічного рішення захищена патентом України на корисну модель: № 8277 "Спосіб визначення морфо - функціонального стану сперміїв при кріоконсервуванні сперми півнів".

Практичне значення одержаних результатів. Комплексне застосування розроблених нових технічних рішень, зокрема нової кріопротекторної суміші в оптимальній кінцевій концентрації, нового захисного середовища та удосконалених технологічних прийомів підготовки сперми до заморожування, забезпечує збереженість життєздатності у 64,5% сперміїв півнів після їх кріоконсервації. Це дозволяє більш раціонально використовувати сперму цінних у племінному відношенні півнів, у порівнянні з розробленими раніше методами низькотемпературної консервації. Так, найбільш результативні з відомих методів забезпечують збереженість життєздатності лише у 30-50% сперміїв після їх кріоконсервації.

Розроблений метод визначення життєздатності сперміїв за станом їх акросом, голівок і рушійного апарату може бути використаний як об'єктивно лабораторний експрес-метод оцінки півнів за якістю сперми, для оцінки кріоконсервованої сперми при її збереженні, транспортуванні або купівлі, при розробці або удосконаленні технологій кріоконсервації.

Особистий внесок здобувача. Вся теоретична і практична робота виконана дисертантом особисто, в тому числі вивчення джерел науково-технічної та патентної інформації, формулювання цілей та завдань, проведення експериментів, їх обговорення, формулювання висновків, підготовка дисертації. Із спільних публікацій дисертант використав для оформлення роботи лише особисто виконану частину.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на щорічній робочій нараді “Консервація генетичних ресурсів”, Пущіно, 2000; на Всеукраїнській науковій конференції “Успіхи та перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини”, Харків, 2001; на III та IV Українських конференціях по птахівництву з міжнародною участю, Алушта, 2001, 2003.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 робіт у фахових наукових виданнях, у тому числі одержано 1 патент на корисну модель.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена російською мовою на 137 сторінках друкованого тексту. Робота складається із вступу, розділу огляду літератури, розділу опису матеріалів і методів досліджень, розділу власних досліджень, який складається з 5-ти підрозділів, розділу обговорення результатів досліджень, висновків, практичних рекомендацій і списку використаної літератури, що включає 281 джерело. Робота ілюстрована 22 таблицями, 3 фотографіями та 10 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження виконані в лабораторії репродукції птиці Інституту птахівництва Української академії аграрних наук. Використовували сперму півнів порід род-айленд, білий леггорн, юрловська голосиста. Їх годівлю проводили за раціонами, розробленими відділом фізіології, біохімії та годівлі птиці Інституту птахівництва УААН згідно із загальноприйнятими нормами. Утримували півнів у кліткових батареях.

Сперму одержували методом масажу абдомінальної області, для досліджень використовували розділені суміші еякулятів декількох півнів. Враховували об'єм еякуляту (мл), концентрацію сперміїв (млрд/мл), рухливість (в балах за десятибальною шкалою), живучість сперміїв (умовні одиниці) визначали за загальноприйнятою методикою (Курбатов А.Д., 1987). Рухливість сперміїв оцінювали під мікроскопом (х450) в термостолику при 37С. Визначення кількості сперміїв з цілими і ушкодженими мембранами голівок (у відсотках) здійснювали за допомогою флуориметра згідно відомого метода (Терещенко А.В., 1988), з використанням флуорохрому етідіум броміду (2,7-дiамiно-10-етил-9-фенiлфенантрiдiум бромiд). Оцінку якості сперми півнів за кількістю цілих та ушкоджених мембран голівок та акросом (у відсотках) визначали за допомогою експрес-методу (Сахацкий Н.И., Терещенко А.В., Артеменко А.Б., 1987) з використанням суміші флуорохромів етідіум броміду та тіазинового червоного. Морфо-функціональна цілісність сперміїв (у відсотках) визначалась за допомогою розробленого нами методу з використанням суміші барвників родаміна С і малахітового зеленого.

При вивченні захисної дії та токсичності кріопротекторів на статеві клітини півнів сперму розбавляли середовищем з кріопротектором у співвідношенні 1:1, у якості контролю використовували кріопротектор диметилформамід (ДМФ). У якості кріопротекторів вивчались етиленгліколь (ЕГ), 1,2-пропандіол (1,2-ПД), 2,3-бутандіол (2,3-БД) та 2-метоксиетанол (МЕ) та їх 27 композицій з диметилформамідом у різних об’ємних співвідношеннях та кінцевих концентраціях (4, 8 та 10%) у розчині. Всього досліджено 32 варіанти кріопротекторів та їх композицій. Усі кріопротектори марки “х.ч.” чи “ч.д.а.” додатково очищували (Протива М.,1966). Чистоту речовин перевіряли хроматографічним методом на газорідинному хроматографі “ЛХМ-8”.

При оптимізації температурних умов підготовки сперми півнів до заморожування вивчали вплив температури розбавлення сперми та введення в неї кріопротектора. У якості кріопротектора досліджували суміші кріопротекторів: ДМФ+1,2-ПД+ЕГ (1:1:1,8%), ДМФ+1,2-ПД (2:1,8%), ДМФ+ЕГ (1:1,8%) та контроль - ДМФА (7%). Експерименти проводились за принципом ізотермічності у двох напрямках: 1) кріопротектори вводили у складі середовища при температурах 5-10; 15-20; 25-30 та 35-40°С, нативну сперму доводили до тієї ж самої температури - одноразове розбавлення; 2) нативну сперму доводили до відповідної температури та розбавляли середовищем, яке мало таку ж саму температуру у діапазонах 5-10; 15-20; 25-30 та 35-40°С, потім охолоджували до 4°С та розбавляли вдруге середовищем, яке містить певний кріопротектор при температурі 4°С – дворазове розбавлення.

Дослідження по оптимізації складу захисного середовища проводили за принципом ізоосмотичності, відоме середовище ІП (Артеменко О.Б., 2002) використовували у якості контролю. При вивченні впливу на спермії півнів різних компонентів захисних середовищ, було складено та проаналізовано 20 експериментальних середовищ, вивчено вплив 1,9 та 2,8 % концентрації глутамата натрію на збереженість сперміїв півнів. Підготовку сперми до заморожування, саме заморожування та відтавання проводили за технологією, розробленою в Інституті птахівництва УААН (Артеменко О.Б., 2002), у якості кріопротектора застосовували ДМФ (7%).

Усі компоненти середовищ, які вивчались, були марки “х.ч.” чи “ч.д.а.”. Осмотичність кріозахисних середовищ вимірювали на осмометрі ОМК-1Ц-01.

Для визначення запліднюючої здатності сперміїв застосовували штучне осіменіння курей (Курбатов А.Д., 1987), яке проводили за режимом: два дні підряд, надалі - один раз у 3-4 дні. Заплідненість яєць визначали при розтині.

Статистичну обробку результатів досліджень проводили методом Фiшера-Стьюдента (Плохинский Н.А., 1969).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

При проведенні досліджень по відбору менш цитотоксичних кріозахисних сполук, визначенні їх оптимальної концентрації, співвідношення, температури та моменту введення, встановлено, що з вивчених 5 кріопротекторів та їх 27 композицій у різних співвідношеннях, більш перспективною за впливом на рухливість та морфологічну цілісність сперміїв є суміш кріопротекторів диметилформаміду, етиленгліколю та 1,2-пропандіолу у співвідношенні 1:1:1.

Встановлено, що суміші двох та трьох кріопротекторів диметилформаміду з етиленгліколем та 1,2-пропандіолом вірогідно менше пошкоджують спермії на етапі еквілібрації у порівнянні з використанням кожного з них окремо. При цьому до 70-75% клітин залишаються морфологічно цілими, деякі результати цих експериментів надані у табл.1.

Крім того, спермії мали більш високу рухливість та живучість у присутності вивчених сумішей, у тому числі при 10% кінцевій концентрації (ДМФ+ЕГ+1,2-ПД (1:1:1) - 170±6%), у порівнянні з контролем (ДМФ - 75±7%).

Таблиця 1

Дія концентрації кріопротекторів та їх сумішей на життєздатність сперміїв півнів

Група | Кріопротектори та їх суміші | Спів

відношен

ня | Концентрація, % | Кількість морфологічно цілих клітин, %, п = 12 | Рухливість, бали,

п = 9

до заморо

жування | після заморожу

вання-відтавання | до заморо

жування | після заморожу

вання-відтавання

1 | ДМФ | - | 8 | 56,4±2,8а | 46,4±2,3c | 7,0±0,5 | 5,0±0,6b

2 | ЕГ | - | 8 | 58,8±2,9 | 47,6±2,0c | 7,0±0,6 | 5,0±0,5b

3 | 1,2-ПД | - | 8 | 53,7±2,3 | 35,0±2,6c | 8,0±0,7 | 4,0±0,5

4 | ДМФ+1,2-ПД | 1:1 | 8 | 78,8±1,9c | 47,3±2,2b | 8,0±0,7 | 6,0±0,7c

5 | ДМФ+1,2-ПД | 2:1 | 8 | 71,4±1,5c | 42,2±1,5c | 8,0±0,6 | 6,0±0,6c

6 | ДМФ+ЕГ | 1:2 | 8 | 68,7±1,1c | 47,6±1,9b | 8,0±0,7 | 4,0±0,5

7 | ДМФ+ЕГ+1,2-ПД | 1:1:1 | 8 | 71,7±1,7c | 50,4±3,5c | 8,0±0,5 | 6,0±0,5c

8 | ДМФ+ЕГ+2,3-БД | 1:1:1 | 8 | 64,4±2,2 | 45,6±1,9c | 6,0±0,5b | 4,0±0,5

9 | ДМФ | - | 10 | 54,8±1,2 | 27,0±0,5c | 6,0±0,5 | 5,0±0,5b

10 | ЕГ | - | 10 | 62,8±1,1 | 27,8±0,9c | 6,0±0,7 | 3,0±0,5a

11 | 1,2-ПД | - | 10 | 54,2±1,0 | 31,9±1,9c | 6,0±0,8b | 6,0±0,7c

12 | ДМФ+1,2-ПД | 1:1 | 10 | 67,0±1,7 | 45,3±0,9c | 8,0±0,6 | 5,0±0,5b

13 | ДМФ+1,2-ПД | 2:1 | 10 | 62,3±1,3 | 46,8±1,1b | 7,0±0,5 | 4,0±0,5

14 | ДМФ+ЕГ | 1:2 | 10 | 63,1±1,4 | 48,2±1,5b | 7,0±0,7 | 5,0±0,5b

15 | ДМФ+ЕГ+1,2-ПД | 1:1:1 | 10 | 69,7±2,2c | 58,3±1,2a | 7,0±0,6 | 6,0±0,7c

16 | ДМФ+ЕГ+2,3-БД | 1:1:1 | 10 | 51,7±2,1 | 44,6±1,1b | 6,0±0,5b | 5,0±0,5b

Прим.: а:b, а:c; c:d, при p ? 0,05.

Вивчено вплив кріопротекторів та їх сумішей на різні органели сперміїв півнів. Відмічено, що при використанні диметилформаміду основними морфо –функціональними пошкодженнями у сперміїв були круглі акросоми (70%), залами хвостової частини (20%), етиленгліколю - залами шийки (40%) та хвоста (40%). Набряк голівок, порушення цілісності їх мембран у значній мірі (60-70%) спостерігаються при використанні 2,3-бутандіолу й 1,2-пропандіолу. Потовщення у межах хвоста, залами та закручування хвостів (70%) здебільшого спостерігаються при використанні 2-метоксиетанолу. Використання сумішей кріопротекторів дозволило знизити рівень пошкоджень кожного з кріопротекторів на 20-30%, у порівнянні з групами, де був використаний окремо взятий кріопротектор. Це підтверджує перспективність використання та подальшого вивчення сумішей кріопротекторів у процесі кріоконсервації сперми птиць та півнів зокрема.

З метою оптимізації умов підготовки сперми до заморожування проведені дослідження по визначенню впливу температури розбавлення сперми середовищем та введення у неї кріопротектора на різні органели сперміїв, а також на загальну морфологічну цілісність рухливість і живучість (табл.2).

Таблиця 2

Дія температури розбавлення на життєздатність сперміїв півнів

Група | Температура розбавлення, °С | Показник живучості при 4°С,
ум.од., п = 3 | Кількість сперміїв з

морфологічно

цілою структу-

рою тіла,%, п =12 | цілими мембранами голівок,%, п = 9

Захисне середовище містить кріопротектор ДМФ у кінцевій концентрації 7%

1 | 35-40 | 148,0±7a | 57,0±3,0a | 47,8±1,3a

2 | 25-30 | 137,1±6a | 66,0±2,6a | 52,2±2,1a

3 | 15-20 | 173,5±4 | 53,0±1,5a | 67,6±1,8

4 | 5-10 | 232,5±5b | 51,0±2,2a | 53,2±2,3a

Захисне середовище містить кріопротектор ДМФА+ЕГ+1,2-ПД (1:1:1), 8%

5 | 35-40 | 150,1±7 | 85,0±1,8b | 65,8±3,1

6 | 25-30 | 143,8±6 | 84,0±3,2b | 75,9±1,9

7 | 5-10 | 242,0±5b | 82,0±2,1b | 82,3±2,2b

Прим.: а:b, при p ? 0,05.

За показниками загальної морфологічної цілісності та збереженістю мембран голівок сперміїв одноразове розбавлення у всіх інтервалах температур ефективніше при використанні суміші трьох кріопротекторів. Обґрунтована необхідність використання одноразового розбавлення при низьких температурах, а саме від 5 до 10 °С. Дворазове розбавлення, коли кріопротектор додається при 4°С, слід використовувати при температурах: 15-20, 25-30°С. Відмічено, що показники загальної морфологічної цілісності сперміїв при дворазовому розбавленні на 15-30% вище, ніж при одноразовому розбавленні у всіх інтервалах температур (табл.3).

Визначено, що як при одноразовому, так і при дворазовому розбавленні в інтервалі температур від 5 до 10°С, основними пошкодженнями є закручування та залами хвостів сперміїв. З підвищенням температури розбавлення від 15 до 30°С в основному пошкоджуються голівки сперміїв. При одноразовому розбавленні при температурах 35-40°С в основному пошкоджується рушійний апарат сперміїв. При використанні ДМФ у якості кріопротектора при дворазовому розбавленні спостерігається великий процент пошкодження акросом сперміїв, які приймають круглу форму. Це відмічається у всіх інтервалах температур, процент акросомальних пошкоджень збільшується з підвищенням температури.

Таблиця 3

Залежність життєздатності сперміїв півнів від температури розбавлення сперми з введенням у неї кріопротектора при 4°С

Гру-па | Температура розбавлення, °С | Показник живучості при 4°С, ум.од., п = 3 | Кількість сперміїв з

морфологічно

цілою структу-

рою тіла,%,

п = 9 | цілими мембранами голівок,%, п = 9

Кріопротектор – ДМФ, 7%

1 | 35-40 | 151,7±7b | 85,0±1,8 | 88,0±3,1b

2 | 25-30 | 231,1±7a | 92,0±1,5b | 85,7±2,7

3 | 15-20 | 237,2±5a | 93,0±2,1b | 73,7±2,9a

4 | 5-10 | 221,4±6 | 81,0±2,1a | 85,7±2,6

Кріопротектор – ДМФ+ЕГ (1:1),8%

5 | 35-40 | 216,3±6 | 76,0±1,5a | 76,7±1,8

6 | 25-30 | 268,7±4 | 98,0±1,7b | 77,8±2,2b

7 | 15-20 | 273,7±5 | 92,0±1,8 | 63,2±2,4a

8 | 5-10 | 247,3±5 | 84,0±1,7a | 83,3±2,5b

Кріопротектор – ДМФ+1,2-ПД (2:1),8%

9 | 35-40 | 170,4±7a | 80,0±2,0 | 77,8±2,0

10 | 25-30 | 248,1±7b | 87,0±1,8 | 85,7±3,2

11 | 15-20 | 250,5±6b | 89,0±1,8 | 82,3±1,9

12 | 5-10 | 223,5±5b | 80,0±2,1 | 77,8±2,1

Кріопротектор – ДМФ+ЕГ+1,2-ПД (1:1:1),8%

13 | 35-40 | 86,6±5a | 76,0±2,2a | 61,4±2,1b

14 | 25-30 | 180,8±7b | 91,0±1,9b | 73,7±1,8

15 | 15-20 | 237,3±6b | 91,0±2,0 | 74,1±2,0

16 | 05-10 | 224,9±6b | 90,0±1,8 | 81,8±3,0b

Прим.: а:b, при p ? 0,05.

Проведені дослідження підтвердили та обґрунтували застосування дворазового розбавлення сперми при 20-25°С та введенні кріопротектора при температурі 4°С.

Внаслідок проведених нами досліджень по вивченню впливу солей натрію на спермії півнів було визначено, що найкраща збереженість сперміїв спостерігається у розчинах сульфату, ацетату та глутамату натрію. Дані живучості сперміїв півнів у солях натрію надані на рисунку.

Рисунок. Вплив солей натрію різних кислот на живучість сперміїв півнів.

У процесі роботи розроблено і вивчено вплив 20 експериментальних середовищ у порівнянні зі стандартним середовищем ІП на цитофізіологічні процеси, які відбуваються у спермі півнів при її розбавленні.

Вивчено вплив різних хімічних речовин, які входять до складу середовищ та їх співвідношення на органели сперміїв. Внаслідок проведених досліджень, встановлено, що присутність у середовищі сульфату натрію призводить до збільшення пошкоджень акросом сперміїв, у порівнянні з глутаматом натрію, але позитивно впливає на морфо-функціональну збереженість хвостів. Знаходження у середовищі сульфату цинку сприяє збільшенню кількості сперміїв з неушкодженими акросомами, але негативно впливає на цілісність хвостів. Присутність у середовищі сульфату магнію сприяє збереженню акросом і цілісності мембран голівок, ацетату натрію викликає порушення морфо-функціональної цілісності хвостів, ацетату магнію негативно впливає на мембрани голівок, оксиду ванадію (V) сприяє зменшенню кількості пошкоджених мембран голівок сперміїв, але викликає пошкодження акросом сперміїв півнів. Власне іони Mn2+ позитивно впливають на збереженість акросом та рухливість сперміїв, а Mg2+ лише на їх рухливість. При введенні до складу середовища полівінілпірролідону та протамін сульфату зменшується кількість клітин з пошкодженими мембранами голівок.

На підставі одержаних результатів розроблено середовище “Д”, такого складу (г/100мл Н2O): глутамат натрію – 1,90, фруктоза – 0,50, інозит – 0,25, ацетат магнію – 0,07, ацетат калію – 0,50, полівінілпірролідон (М.м. 12000) – 0,20, протамін сульфат – 0,028, V2O5 – 0,07, MnSO4 – 0,07. Осмотичність 365мОсмоль; рН 6,7.

Вивчено вплив глутамату натрію на збереженість сперміїв півнів у двох концентраціях, які найчастіше використовуються у поживних середовищах - 1,9 та 2,8%. Визначено, що найкраща збереженість сперміїв спостерігається при розбавленні сперми середовищем ІП-1(48,33±6,75), та середовищем “Д” (42,33±4,02), які містять глутамат натрію у концентрації 1,9%, у порівнянні з середовищем ІП (26,50±5,54).

На заключному етапі ми вивчали вплив кращих експериментальних кріозахисних середовищ, ступеня розбавлення сперми, кріопротекторів та їх сумішей на запліднюючу здатність сперміїв, які підтвердили перспективність їх використання для підвищення збереженості сперміїв у процесі кріоконсервації. Це дозволило вірогідно підвищити життєздатність сперміїв півнів до 64,5%, у порівнянні з контролем (табл.4).

Таблиця 4

Морфо - функціональна збереженість сперміїв півнів в залежності від середовища, ступеня розбавлення та кріопротектора

Група |

Сере

дови

ще |

Ступінь разбавлення | Кріо протектори та їх суміші | Показник живучості при 4°С, ум.од. | Цілісність мембран голівок**, % | Загальна морфологічна цілісність**, %

до заморо

жуван

ня* | після заморожування-відтавання** | до заморожуван

ня | після заморожування-відтавання | до заморожуван

ня | після заморожування-відтавання

1 | ІП |

1:1:1 | ДМФ | 247,9

±92,5 | 75,4

±5,5a | 68,6

±12,1 | 54,1

±6,6 | 93,5

±0,7 | 50,0

±4,1a

2 | ІП-1 | 1:1:1 | ДМФ | 199,8

±6,8 | 102,1

±26,7 | 83,3

±6,8 | 64,2

±9,9 | 76,0

±17,0 | 57,0

±7,1

3 | ІП-1 | 1:1:1 | ДМФ+ЕГ+1,2ПД | 156,0

±72,2 | 138,4

±5,7b | 82,1

±2,9 | 45,2

±14,0 | 80,0

±14,1 | 43,5

±14,9

4 | Д | 1:1:1 | ДМФ+ЕГ+1,2-ПД | 197,6

±81,5 | 133,8

±11,6b | 75,8

±2,3 | 44,7

±10,5 | 78,5

±12,0 | 64,5

±0,7b

5 | ІП | 1:1:2 | ДМФ | 267,8

±52,3 | 136,2

±15,2b | 68,7

±6,7 | 51,0

±5,5 | 81,0

±15,6 | 64,5

±0,7b

Прим.: * - п=3; ** - п=9, а:b при p ? 0,05.

Встановлено, що дворазове розбавлення сперми середовищем у співвідношенні 1:1:2 дозволяє не тільки підвищити збереженість сперміїв після заморожування-відтавання, у порівнянні з дворазовим розбавленням у співвідношенні 1:1:1, але і збільшити кількість спермодоз, що має велике значення при нестачі нативного матеріалу нечисленних та зникаючих порід курей.

При визначенні цитофізіолгічного стану й запліднюючої здатності сперми півнів особливо важливим є об’єктивна оцінка її якості. Згідно одержаних результатів ні рухливість, ні живучість, ні визначення цілісності мембран голівок не дають об’єктивної інформації про фізіологічний стан і запліднюючу здатність статевих клітин півнів.

Розроблений нами метод оцінки якості нативної та кріоконсервованої сперми півнів згідно одержаних даних більш корелює з заплідненістю яєць, ніж інші існуючи методи. Для здійснення розробленого нами метода на предметне скло наносили 3µl сперми півнів, яка була розбавлена захисним середовищем для сперми півнів у співвідношенні 1:1, додавали 12µl барвника (робочий розчин складається з суміші родаміну С – 0,05% та малахітового зеленого – 0,08%, який приготовлений на аналогічному захисному середовищі для сперми півнів), витримували протягом 1 хвилини мазок та висушували. Оцінку цілісності сперміїв проводили під мікроскопом при збільшенні 90Ч15 ? масляною імерсією. Підраховували 100 сперміїв і фіксували процентне співвідношення цілих і пошкоджених, а також відмічали пошкодження, які найчастіше зустрічаються.

При цьому забарвленні акросоми мали малиново-червоний колір, голівки синьо-зелений, середня частина та хвости теж малиново-червоний колір. Ця методика дозволяє визначити практично всі морфологічні пошкодження сперміїв, які впливають на їх запліднюючу здатність: порушення форми акросоми, її злам; здуття голівки, безформові, гігантські та карликові форми голівок, вигнуті та здуті у середній частині; залами хвоста, спіральне або петлеподібне закручування хвоста, відсутність його, присутність цитоплазматичної краплини і таке інше. При цьому цей метод достатньо простий у використанні, не потребує спеціального обладнання, дозволяє робити зразки в умовах птахоферм, дозволяє накопичувати та архівувати зразки.

Таким чином, нами вперше вивчено вплив 27 композицій кріопротекторів на морфо-функціональну цілісність статевих клітин півнів та їх кріозахисна активність у процесі кріоконсервації. Визначені перспективні речовини та їх суміші для використання їх у якості кріопротекторів при заморожуванні сперми півнів. Розроблено і вивчено вплив 20 експериментальних середовищ на збереженість морфо – функціональної цілісності різних органел статевих клітин півнів. Визначена та обґрунтована оптимальна температура та ступінь розбавлення сперми й введення у неї кріопротектора. На підставі одержаних результатів удосконалена технологія кріоконсервування сперми півнів, яка дозволяє збільшити кількість життєздатних сперміїв до 64,5% після кріоконсервації.

ВИСНОВКИ

1. Внаслідок проведених досліджень по вивченню цитофізіологічних процесів, які відбуваються у спермі півнів при використанні нового захисного середовища, нової кріопротекторної суміші, удосконалених прийомів підготовки статевих клітин до заморожування, суттєво підвищена результативність технології низькотемпературної консервації сперми півнів. Комплексне застосування розроблених нами технічних рішень забезпечує одержання у розмороженій спермі не менш 64,5% життєздатних сперміїв, що на 14,5 – 30,0% більше, ніж досягається в інших відомих технологіях кріоконсервації сперми півнів.

2. Розроблено нове захисне середовище “Д”, наступного складу (г/100мл Н2O): глутамат натрію – 1,90, фруктоза – 0,50, інозит – 0,25, ацетат магнію – 0,07, ацетат калію – 0,50, полівінілпірролідон (М.м. 12000) – 0,20, протамін сульфат – 0,028, оксид ванадію (V) – 0,07, сульфат марганцю – 0,07. Осмотичність 365 мОсмоль; рН 6,7. Це середовище забезпечує високу життєздатність сперми півнів до заморожування, а також має високу кріозахисну активність при додаванні до неї кріопротектора в оптимальній концентрації.

3. Встановлено, що найбільшу кріопротекторну дію має розроблена нами кріопротекторна суміш, яка складається з диметилформаміду, 1,2-пропандіолу та етиленгліколю у співвідношенні 1:1:1, та має 8%-ву кінцеву концентрацію.

4. При розробці нової кріопротекторної суміші встановлено, що диметилформамід викликає в основному пошкодження акросом сперміїв півнів, 1,2-пропандіол та 2,3 бутандіол – мембран голівок сперміїв, етиленгліколь – шийок і хвостів сперміїв, 2-метоксіетанол – морфо-функціональні ушкодження хвостів.

5. Удосконалено технологію кріоконсервації сперми півнів. Визначено, що для одержання більш високих результатів збереженості клітин щойно одержану сперму півнів необхідно охолоджувати протягом 15-20 хв. до 20-25 ?С, потім розбавляти у співвідношенні 1:1 середовищем “Д” і охолоджувати до 4?С протягом 30-40 хвилин. Після цього сперму необхідно ще раз розбавити у співвідношенні 1:1 середовищем “Д”, яке містить розроблену нами суміш кріопротекторів у 24% концентрації, що забезпечує їх 8%-ву кінцеву концентрацію в розбавленій спермі. Заморожування сперми проводять у пластикових пайєтах за режимом, розробленим в Інституті птахівництва.

6. Розроблено метод оцінки якості сперми, який дозволяє оцінити морфо-функціональний стан сперміїв півнів шляхом їх диференційного забарвлення сумішшю барвників родаміну С та малахітового зеленого на всіх етапах процесу кріоконсервації.

7. Встановлено, що дворазове розбавлення сперми захисним середовищем у співвідношенні 1:1:2 дозволяє підвищити збереженість сперміїв після заморожування-відтавання до 10 - 14%, у порівнянні з дворазовим розбавленням у співвідношенні 1:1:1, що дає можливість збільшити кількість спермодоз.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Для одержання розмороженої сперми півнів, у якій кількість життєздатних сперміїв складає не менш 64,5%, її заморожування рекомендується проводити з використанням розроблених нами захисного середовища та прийомів підготовки до низькотемпературної консервації. Для цього щойно одержану сперму півнів з активністю сперміїв не нижче 9 балів необхідно охолоджувати протягом 15-20 хв до 20-25°C. Потім поступово розбавляти у співвідношенні 1:1 захисним середовищем “Д”. Після цього сперму необхідно охолоджувати протягом 30-40 хв до 4°C та ще раз розбавити середовищем “Д”, яке містить суміш кріопротекторів диметилформаміду з етиленгліколем та 1,2-пропандіолом у співвідношенні 1:1:1 з їх загальною кінцевою концентрацією у розчині 8%. Потім розфасувати сперму у пластикові пайєти ємністю 0,25 мл та заморожувати за режимом, розробленим в Інституті птахівництва. Для відтавання сперми пайєти слід помістити на водяну баню з температурою +40°C.

2. Для визначення життєздатності сперміїв півнів рекомендується використовувати розроблений нами метод оцінки морфо-функціонального стану сперміїв з використанням у якості барвника суміші родаміну С та малахітового зеленого.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Линник Т.П., Бизикина О.В. Криоконсервирование спермы петухов. I. Цитотоксичность диолов и амидов // Пробл. Криобиологии. – 2001. - №2. – С. 72 – 79. (Здобувачем особисто проведено експерименти, вивчено цитотоксичність амідів і діолів, проаналізовано одержані результати.)

2. Линник Т.П., Бизикина О.В. Цитотоксичность и криопротекторная активность диолов, амидов и их смесей при криоконсервировании спермы петухов // Пробл. Криобиологии. – 2001. - №3. – С. 50. (Здобувачем особисто проведено експерименти, досліджена кріозахисна активність сумішей кріопротекторів на базі амідів і діолів, проведено статистичний аналіз одержаних результатів.)

3. Линник Т.П., Бизикина О.В. Криоконсервирование спермы петухов. II. Криозащитная активность диолов и амидов // Пробл. Криобиологии. – 2001. - №4. – С. 43-51.(Здобувачем особисто проведено експерименти, досліджено вплив структури амідів і діолів на цитофізіологічний стан сперміїв, проведено статистичний аналіз і узагальнено результати.)

4. Бізікіна О.В., Артеменко О.Б., Ліннік Т.П. Використання різних класів кріопротекторів при кріоконсервуванні спермии півнів // Птахівництво: Міжвід. темат. наук. зб. (Матеріали III Української конференції по птахівництву з міжнародною участю, 15 – 19 вересня, 2001р., м.Алушта, АР Крим). – Харків, 2001. - Вип.51. – С14-18. (Здобувачем особисто проведено досліження по вивченю впливу сумішей кріопроекторів амідів і діолів на життєздатність сперміїв півнів, проведено аналіз одержаних результатів.)

5. Бизикина О.В., Линник Т.П. Криоконсервирование спермы петухов. III. Цитотоксичность и криопротекторная активность смеси N,N- диметилформамида с диолами // Пробл. Криобиологии. – 2002. - №1. – С. 39-44.(Здобувачем особисто досліджено вплив сумішей аміду та діолів на їх кріозахисну активність, проведено статистичний аналіз і проаналізовано результати.)

6. Дунаєва О.В., Артеменко О.Б., Бичко С.В., Терещенко О.В. Збереженість сперміїв півнів у залежності від сольового складу розчинника // Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини: Зб. наук. пр./ ХДЗА. – 2002. – Вип.10(34). – С.118-120. (Здобувачем особисто проведено експерименти по вивченню впливу солей натрію на рухомість, морфо-функціональну цілісність сперміїв півнів, проведено аналіз одержаних результатів.)

7. Артеменко А.Б., Терещенко А.В., Дунаева О.В. Влияние частоты осеменения кур заморожено-оттаянной спермой на оплодотворённость яиц // Птахівництво: Міжвід. темат. наук. зб. (Матеріали IV Української конференції по птахівництву з міжнародною участю, 15 – 19 вересня, 2003р., м.Алушта, АР Крим). – Харків, 2003. - Вип.53. – С.372 – 375.( Здобувачем особисто проведено експерименти.)

8. Пат. 8277 Україна, МКИ 7 A61D19/02. Спосіб визначення морфо-функціонального стану сперміїв при кріоконсервуванні сперми півнів: Пат. 8277 Україна, МКИ 7 A61D19/02. Дунаєва О.В., Дунаєв Ю.К., Стегній Б.Т. (Україна) - № u 2005 02274; Заявл. 14.03.2005; Опубл. 15.07.2005, Бюл. № 7 - 3 c. (Розроблений особисто здобувачем.)

АНОТАЦІЇ

Дунаєва О.В. Підвищення життєздатності кріоконсервованих статевих клітин півнів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 – фізіологія людини і тварин. – Інститут тваринництва УААН, Харків, 2005.

У роботі проведено порівняльні дослідження кріозахисної й цитотоксичної дії на фізіологічні процеси у сперміях півнів вивчених вперше 27 композицій кріопротекторів. Запропоновано використання суміші трьох кріопротекторів диметилформаміду, 1,2-пропандіолу і етиленгліколю у співвідношенні компонентів 1:1:1.

Встановлена специфічність впливу кріопротекторів на окремі органели сперміїв. Удосконалені технологічні засоби підготовки сперми півнів до низькотемпературної консервації. Експериментально обґрунтовано вплив температури розбавлення сперми та введення у неї кріопротектора на життєздатність сперміїв півнів. Розроблено склад нового кріозахисного середовища, який дозволяє підвищити збереженість сперміїв півнів, особливо у діапазоні плюсових температур. Розроблено спосіб визначення морфо-функціонального стану сперміїв при кріоконсервації сперми півнів шляхом їх диференційного забарвлення сумішшю барвників родаміна С і малахітового зеленого.

Комплексне застосування розроблених нових технічних рішень забезпечує збереженість життєздатності у 64,5% сперміїв півнів після їх кріоконсервації.

Ключові слова: спермії, оцінка якості сперми, кріоконсервація, кріопротектори, захисне середовище, півень.

Дунаева О.В. Повышение жизнеспособности криоконсервированных половых клеток петухов. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 – физиология человека и животных. – Институт животноводства УААН, Харьков, 2005.

Исследования выполнены в направлении изучения цитофизиологических процессов, которые происходят в сперме вне организма и при её технологической обработке для длительного хранения.

Проведены сравнительные исследования криозащитного и цитотоксического действия на цитофизиологические процессы в спермиях петухов изученных впервые 27 композиций криопротекторов. Предложено использование смеси трёх криопротеторов диметилформамида, 1,2-пропандиола и этиленгликоля при одинаковом соотношении компонентов (1:1:1), в конечной концентрации 8%.

Установлена специфичность влияния криопротекторов на отдельные органеллы спермиев, а именно: диметилформамид вызывает в основном повреждения акросом спемиев петухов, 1,2-пропандиол и 2,3 бутандиол – мембран головок спермиев, этиленгликоль – шеек и хвостов спермиев, применение 2-метоксиэтанола приводит к снижению подвижности, вследствие морфо-функционального повреждения хвостов. Применение смесей криопротекторов снижает уровень отдельных повреждений на 20-30%.

Усовершенствованы технологические приёмы подготовки спермы петухов к низкотемпературной консервации. Экспериментально обосновано применение двухмоментного разбавления спермы при 20-25°С и введении в неё криопротектора при температуре 4°С. Разработана новая криозащитная среда “Д”, которая позволяет повысить сохранность спермиев, особенно в зоне плюсових температур. Её состав (г/100 мл Н2O): глутамат натрия – 1,90, фруктоза – 0,50, инозит – 0,25, ацетат магния – 0,07, ацетат калия – 0,50, поливинилпирролидон (М.м. 12000) – 0,20, протаминсульфат – 0,028, V2O5 – 0,07, MnSO4 – 0,07.

Установлено, что двухмоментное разбавление спермы средой в соотношении 1:1:2 повышает сохранность спермиев петухов после замораживания-оттаивания на 10-14%, в сравнении с двухмоментным разбавлением в соотношении 1:1:1.

Разработан метод определения жизнеспособности сперматозоидов петухов до и после замораживания-оттаивания по состоянию акросом и головок путём их дифференцированного окрашивания смесью родамина С и малахитового зелёного.

Усовершенствован метод низкотемпературной консервации спермы петухов. Комплексное применение разработанных новых технологических решений, в частности нового криопротектора в оптимальной конечной концентрации, новой защитной среды и усовершенствованных технологических приёмов подготовки спермы к замораживанию, обеспечивает сохранность жизнеспособности у 64,5% спермиев петухов после их замораживания-оттаивания, что на 14,5 - 30,0% больше, чем достигается в других известных технологиях низкотемпературной консервации спермы петухов.

Ключевые слова: спермии, оценка качества спермы, криоконсервирование, криопротекторы, защитная среда, петух.

Dynaeva O.B. Rise of cryoconservative cocks sex cells viability. - Manuscript.

Dissertation on completion of the scientific degree of the candidate of biology sciences on the speciality 03.00.13 – human and animal physiology - Institute of Animal Science of UAAS, Kharkiv, 2005.

The investigation gave the comparative facts of cryoprotective and cytotoxic effect on processes of physiology cock semen studied firstly 27 compositions of cryoprotectants. It is of propose to use the mixture of three cryoprotectants of dimethylformamide, 1,2-propanediol, ethileneglicol when the same proportion of components is used (1:1:1).

The specifity of influence of cryoprotectants on the separate organelles of cock semen were improved.

Technological methods of cock sperm preparation to low temperature conservation have been perfected. The influence of temperature of sperm dilution and bringing into it the cryoprotectant on cock sperm viability was experimentally grounded. Composition of new cryoprotective medium, which enables to raise safety of cock sperm have been developed. Method of determination of morphofunctional state of sperm at cock sperm cryoconservation by differentiating colourings by the mixture of rodamine C and malachite – green have been developed.

Complex use of the new worked out technological solutions provides safe keeping of viability of 64,5% of cocks sperm after their cryoconservation.

Key words: semen, estimation of sperm quality, cryoconservation, cryoprotectants, protective medium, cock.

Відповідальний за випуск Осташко Ф.І.

Підписано до друку 03.11.2005 р. Формат 60?90/16.

Папір офсет. Спосіб друку – різографія.

Умовних друк. арк. 0,9. Тираж 100 прим.

Замовлення №128-03

Надруковано у друкарні ПП “С.А. Євлентьев”

61176, м.Харків, вул. Велозаводська, 38

Тел.: 759-89-82