УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНих НАУК

ІНСТИтУТ експериментальної і КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

УДК 619:615.9:632.95:636.085

КУЦАН ОЛЕКСАНДР ТИХОНОВИЧ

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ

ТА РОЗРОБКА ТОКСИКО-ГІГІЄНІЧНИХ РЕГЛАМЕНТІВ

ПІРЕТРОЇДНИХ ПЕСТИЦИДІВ І ЇХ КОМБІНАЦІЙ

З ФОСФОРОРГАНІЧНИМИ СПОЛУКАМИ

В КОРМАХ ДЛЯ ТВАРИН

16.00.04 – ветеринарна фармакологія та токсикологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора ветеринарних наук

Харків - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини (ІЕКВМ) Української академії аграрних наук.

Науковий консультант – доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН

Малинін Олег Олексійович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, заступник директора з наукової роботи.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Малик Остап Григорович, Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок, головний науковий співробітник лабораторії фармакології та токсикології;

доктор ветеринарних наук, професор Гуфрій Дмитро Федорович, Львівська національна академія ветеринарної медицини імені С.З. Ґжицького, завідувач кафедри фармакології та токсикології;

доктор ветеринарних наук, професор Якубчак Ольга Миколаївна, Національний аграрний університет Кабінету Міністрів України, завідувач кафедри ветеринарно-санітарної експертизи і гігієни переробки продуктів тваринництва.

Провідна установа – Білоцерківський державний аграрний університет Міністерства аграрної політики України, кафедра внутрішніх хвороб і клінічної діагностики, м. Біла Церква.

Захист відбудеться "25" жовтня 2005 року о 930 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “21” вересня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор Бабкін А.Ф.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пестициди як глобальні забруднювачі навколишнього середовища продовжують залишатись у центрі уваги спеціалістів різного профілю, включаючи токсикологів, гігієністів і екологів. Хімізація сільськогосподарського виробництва, впровадження в аграрні технології хімічних засобів захисту рослин – гарантія високої продуктивності сільського господарства (Трахтенберг И.М., 2000; Проданчук Н.Г., Спыну Е.И., 2000; Каган Ю.С., 1981; Малинин О.А., Хмельницкий Г.А., Куцан А.Т., 2002).

Характерною особливістю сільськогосподарського виробництва є тенденція до широкого використання хімічних засобів захисту рослин. Асортимент хімічних сполук, що використовують у рільництві, тваринництві і побуті постійно зростає. В Україні (станом на 2001 рік) використовувалось 268 найменувань пестицидів, а їх тоннаж у формі препаратів досягав 36 тисяч тонн і застосовувались вони на 40 млн. га сільськогосподарських угідь. Багато згаданих вище речовин використовується і в тваринництві при лікуванні тварин від ектопаразитів. Сьогодні без пестицидів не обходиться практично ні одне господарство до якої б форми власності воно не належало (Проданчук Н.Г., Спыну Е.И., 2000; Проданчук М.Г., Великий В.І., Кучак Ю.А., 2000).

Через високу біологічну активність, широке розповсюдження, цілеспрямоване застосування в різних галузях господарства та побуті пестициди створюють вірогідним забруднення практично всіх об’єктів навколишнього середовища. У зв’язку з цим потрібні дослідження токсикодинаміки пестицидів, кількісних критеріїв шкідливості та гігієнічної регламентації. Після використання пестицидів необхідно забезпечити належну систему профілактичних заходів щодо можливих інтоксикацій тварин і людей. Обов’язковою умовою використання пестицидів є забезпечення безпеки, своєчасна токсикологічна оцінка, встановлення нешкідливих параметрів їх вмісту в об’єктах навколишнього середовища, включаючи корми для сільськогосподарських тварин (Шуляк В.Г., 1998; Гуфрій Д.Ф., Гунчак В.М., Коцюмбас І.Я., Канюка О.І., Скорохід В.Й., Масюк Д.М., 2004).

Проблема охорони навколишнього середовища пов’язана з питанням розробки та впровадженням системи моніторингу за наявністю токсичних сполук у кормах і продуктах тваринного походження. У тваринництві одним із основних показників рівня безпеки є максимально допустимі рівні (МДР) залишкових кількостей пестицидів у кормах. МДР повинні гарантувати не тільки виникнення хронічних отруєнь, забруднення залишками пестицидів навколишнього середовища та продуктів тваринного походження, а й відсутність можливої канцерогенної, мутагенної та ембріотоксичної дії (Проданчук Н.Г., Спыну Е.И., 2000; Горжеєв В.М., 2002; Якубчак О.М., Хоменко В.І., Мельничук С.Д., Ткачук С.А., 2003).

Однак, цілий спектр проблем санітарно-токсикологічної оцінки пестицидів залишається ще не вирішеним. Це перед усім стосується своєчасної токсикологічної і ветеринарно-санітарної оцінки пестицидів, особливо комбінованих токсикантів та речовин збагачених різноманітними активними ізомерами. Насамперед повстає питання постійного доопрацювання методичного рівня досліджень, щодо обґрунтування ГДК, МДР, методик визначення токсичних речовин у продуктах рослинного та тваринного походження, особливо групових, специфічних методик, які дають можливість визначати в пробі наявність цілої групи хімічних речовин. Вимоги щодо чутливості і специфічності методик, які використовуються, постійно зростають і тому багато з них вже не задовольняють працівників науки та практики. Перш за все, складні питання виникають після виявлення прихованої токсичної дії за багаторазового впливу малої кількості отрути.

Отже, перед токсикологією у ветеринарній медицині насамперед стоїть глобальне завдання щодо всебічної оцінки реальної і потенційної небезпеки пестицидів за показниками їх токсичності для тварин, вивчення особливостей накопичення залишкової кількості цих токсикантів у кормах і продукції тваринного походження, розробки заходів профілактики, які б дали можливість захистити людство від шкідливого впливу хімічних ксенобіотиків, що створені самою ж людиною. Властиво це становить актуальність проведення досліджень і має велике теоретичне і практичне значення для ветеринарної медицини, зокрема токсикології.

Зв’язок роботи з науковими програмами. Представлена дисертаційна робота є окремим розділом державних тем Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини Української академії аграрних наук – Завдання 10: „Провести дослідження по створенню нових хіміко-фармацевтичних лікарських засобів, антибіотиків, фітопрепаратів і профілактики токсикозів”, номер державної реєстрації 0197 U 000763 (1996-2000рр.) і Завдання 11: „Розробити методи визначення і засоби профілактики впливу негативних факторів зовнішнього середовища на організм сільськогосподарських тварин з метою одержання екологічно безпечних продуктів тваринництва”, номер державної реєстрації 0101 U 001617 (2001-2005 рр.).

Мета і задачі досліджень. Метою досліджень було теоретично обґрунтувати та експериментально розробити максимально допустимі рівні піретроїдів і їх комбінацій з фосфорорганічними сполуками в кормах для сільськогосподарських тварин, з’ясувати окремі питання токсикологічної і ветеринарно-санітарної оцінки цих пестицидів, розробити методики їх визначення в кормах і об’єктах тваринного походження, впровадити в практику ветеринарної медицини санітарно-гігієнічні нормативи і рекомендації щодо профілактики забруднень продукції тваринництва залишковими кількостями пестицидів та забезпечити відсутність їх шкідливого впливу на людей і сільськогосподарських тварин.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі і розробити:

- уніфіковану методику визначення групи піретроїдів (циперметрин, лямбда-цигалотрин, дельтаметрин і інші) в кормах та об’єктах тваринного походження способом газорідинної хроматографії;

- методику визначення піретроїду ф’юрі (зетациперметрин) в об’єктах тваринного походження способом газорідинної хроматографії;

- методику визначення комбінованого пестициду нурелу-Д (хлорпірифос+циперметрин) в об’єктах тваринного походження способом газорідинної хроматографії;

- експериментально визначити валідаційні характеристики всіх розроблених методик згідно з вимогами стандарту „ISO 17025” і європейської „інструкції ЕС 657/2002”;

- встановити основні закономірності токсикокінетики і строки виділення активних інгредієнтів піретроїду ф’юрі та комбінованого пестициду нурелу-Д з організму тварин;

- вивчити ступінь токсичності, окремі питання токсикодинаміки за розвитку гострих і хронічних експериментальних отруєнь тварин піретроїдом ф’юрі і комбінованим пестицидом нурелом-Д;

- теоретично і експериментально обґрунтувати МДР піретроїду ф’юрі і комбінованого пестициду нурелу-Д у кормах для сільськогосподарських тварин.

Об’єкт дослідження: проблема забруднення об’єктів тваринного походження пестицидами, гострі та хронічні пестицидні токсикози, МДР піретроїдів та їх комбінацій з фосфорорганічними сполуками у кормах для тварин.

Предмет дослідження: експериментально-теоретичне обґрунтування та розробка методик визначення пестицидів у кормах і об’єктах тваринного походження, вплив різних доз піретроїдів та їх комбінацій з фосфорорганічними сполуками на організм тварин, токсикокінетика і токсикодинаміка піретроїду ф’юрі і нурелу-Д в організмі тварин, розробка параметрів токсико-гігієнічного регламентування пестицидів у кормах для тварин.

Методи досліджень: для досягнення мети і вирішення поставлених задач були використані хіміко-аналітичні методи ідентифікації токсичних речовин (тонкошарова і газорідинна хроматографії), клінічні, токсикологічні, фармакологічні, біохімічні дослідження крові й органів та статистично-математичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше теоретично обґрунтовано та вирішено методичні питання визначення пестицидів в об’єктах тваринного походження, яке дозволило їх використати при розробці методик. Аргументовано покращені методичні прийоми екстракції і очищення проб від коекстрактивних речовин, які дали можливість розробити саме нові методики визначення як окремих піретроїдних пестицидів, так і їх комбінацій з фосфорорганічними сполуками в кормах і об’єктах тваринного походження. Новизна та актуальність цих розробок підтверджена наступними патентами:

· „Спосіб визначення хлорорганічних пестицидів і піретроїдів у біологічних об’єктах” (патент України 66709 А G 01N33/02, № 2003109160 від 10.10.2003 р.);

· „Спосіб визначення зетациперметрину в біологічних об’єктах” (патент України 66568 А G 01N33/02, №2003077014 від 25.07.2003 р.);

· „Спосіб визначення нурелу-Д в біологічних об’єктах” (патент України 57249 А G 01N33/02, №2002054266 від 24.05.2002 р.).

Одержані нові дані про вплив піретроїдів та їх комбінацій з фосфорорганічними сполуками на вуглеводно-енергетичний обмін в організмі курей. Виявлені інтегральні показники характеру дії як гострого, так і хронічного отруєння тварин препаратами у відносно малих дозах, які можуть реально траплятись у кормах при забрудненні їх у процесі сільськогосподарського виробництва. В комплексній оцінці шкідливого впливу пестицидів, як хімічних контамінантів, визначена важлива роль деяких біохімічних показників, особливо швидкості ферментативних реакцій тканин внутрішніх органів.

Проведені усесторонні комплексні експериментально-токсикологічні дослідження на лабораторних і сільськогосподарських тваринах, що дало змогу глибоко розкрити питання патогенезу, розподілу, накопичення, метаболізму і виведення піретроїдів та їх комбінацій з фосфорорганічними сполуками з організму тварин. Проведені всебічні дослідження дали змогу вперше в Україні обґрунтувати токсикологічну і ветеринарно-санітарну оцінку піретроїдного пестициду ф’юрі і комбінованого пестициду нурелу-Д та розробити їх МДР у кормах для сільськогосподарських тварин, що має теоретичне, науково-прикладне та соціальне значення.

Практичне значення одержаних результатів. Практична цінність роботи визначається розробленими методиками визначення пестицидів у біологічних об’єктах. Розроблені методики пройшли апробацію та затверджені як методичні вказівки для проведення токсикологічних досліджень у хіміко-токсикологічних відділах лабораторій ветеринарної медицини України та інших установах що здійснюють визначення залишкових кількостей пестицидів у кормах і об’єктах тваринного походження.

На підставі виконаних експериментів встановлена токсикологічна характеристика піретроїду ф’юрі та комбінованого пестициду нурелу-Д, дана ветеринарно-санітарна оцінка кормів і продуктів тваринництва, які одержують при використанні цих пестицидів. За результатами проведених досліджень обґрунтовані і впроваджені у практику нормативно-правові документи – максимально допустимі рівні (МДР) піретроїду ф’юрі і комбінованого пестициду нурелу-Д у кормах.

Матеріали досліджень увійшли до:

· навчального посібника „Ветеринарная токсикология” (2002), рекомендованого Міністерством освіти і науки України для студентів вищих навчальних закладів, протокол № 966 від 16.06.2002 року.

За матеріалами досліджень розроблені наступні методичні рекомендації:

· „Методичні вказівки щодо одночасного групового визначення хлорорганічних пестицидів і піретроїдів в кормах і тканинах тваринного походження (м’ясо, внутрішні органи, молоко, жир, яйця) способом газової та тонкошарової хроматографії”. Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України, протокол № 15-14/188 від 05.05.2003 року;

· „Методичні вказівки щодо визначення зетациперметрину (ф’юрі) в тканинах тваринного походження (м’ясо, внутрішні органи, молоко, жир, яйця) способом газорідинної хроматографії”. Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України, наказ № 86 від 18.11.2003 року;

· „Методичні вказівки щодо визначення нурелу-Д в тканинах тваринного походження (м’ясо, внутрішні органи, молоко, жир, яйця) за допомогою газової хроматографії”. Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України, протокол №15-14/298 від 07.06.2002 року;

· „Методичні вказівки щодо діагностики, профілактики і лікування тварин при отруєнні комбінованим піретроїдним пестицидом (нурел-Д)”. Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України, наказ № 59 від 25.05.2004 року;

· „Максимально допустимі рівні (МДР) комбінованого піретроїдного пестициду нурелу-Д в кормах для сільськогосподарських тварин”. Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України, наказ № 90 від 27.07.2004 року;

· „Максимально допустимі рівні піретроїду ф’юрі (зетациперметрин) в кормах для сільськогосподарських тварин”. Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України, наказ № 33 від 19 квітня 2005 року;

· „Методичні вказівки щодо діагностики, профілактики і лікуванню тварин при отруєнні піретроїдом ф’юрі (зетациперметрин)”. Розглянуті і ухвалені на засіданні методичної комісії ІЕКВМ УААН (протокол №1 від 16.03.2005р.) та направлені для розгляду в Державний департамент ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно виконав, проаналізував та узагальнив увесь обсяг експериментальних досліджень, включаючи формулювання мети, основних етапів досліджень, пошук та аналіз літератури, організацію дослідів і проведення всіх видів досліджень, включаючи інтерпретацію одержаних результатів та викладення висновків.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на щорічних наукових звітах і засіданнях Вченої ради Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини і отримали схвалення (м. Харків) у 1999-2004 рр.; Науково-технічної ради при Державному департаменті ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України протягом 2000-2004 рр. Розробки і методичні вказівки розглядались і пропонувались до впровадження на щорічних Всеукраїнських семінарах із завідувачами хіміко-токсикологічних відділів обласних державних лабораторій ветеринарної медицини у 2002 р. (м. Дніпропетровськ), 2003 р. (м. Миколаїв), 2004 р. (м. Київ). За результатами досліджень виголошені доповіді, які отримали загальне схвалення на: Міжнародній науковій конференції „ІЕКВМ – 80 років на передовому рубежі ветеринарної науки” (м. Харків, 2002); Міжнародній науково-практичній конференції з ветеринарної фармакології та токсикології, присвяченій 100-річчю з дня народження С.В. Баженова (м. Київ, 2002); Міжнародній конференції по науково-прикладним проблемам паразитоценології (м. Луганськ, 2003); Міжнародній науково-практичній конференції „Актуальні проблеми ветеринарної медицини в умовах сучасного ведення тваринництва” (м. Феодосія, 2003); Міжнародній науково-практичній конференції „Ветеринарна медицина–2004. Сучасні аспекти розробки, маркетингу і виробництва ветеринарних препаратів” (м. Феодосія, 2004); Міжнародній науковій конференції „Актуальні проблеми та інновації в тваринництві, ветеринарній медицині і харчових технологіях”, присвяченій 220-річчю академії (м. Львів, 2004); Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів „Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики” (м. Львів, 2004); Міжнародній науково-практичній конференції „Ветеринарна медицина – 2005: Сучасний стан та актуальні проблеми забезпечення ветеринарного благополуччя тваринництва”, присвяченій 90-річчю від дня народження академіка І.М. Гладенка та 100-річчю від дня народження М.Д. Кльосова, 30 травня – 4 червня 2005 р. (м. Ялта.–АР Крим); Міжнародній науково-практичній конференції „Стан, проблеми та перспективи сучасної аграрної науки і практики”, присвяченої 105-річчю від дня народження С.З. Гжицького, 9 – 10 червня 2005 року (м. Львів); і Міжнародній науково-практичній конференції „Біологічні основи продуктивності та здоров’я тварин”, 23 – 24 червня 2005 року (м. Львів) та на 2 обласних семінарах-нарадах спеціалістів ветеринарної медицини.

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи опубліковані у 28 наукових працях, з яких 24 статті (19 одноосібно) у фахових виданнях, що входять до переліку затвердженого ВАК України; 1 навчальний посібник, 3 патенти.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота включає вступ, огляд літератури, вибір напрямів досліджень, матеріали та методи виконання роботи, розділів результатів власних досліджень, узагальнення результатів досліджень та їх аналіз, висновки та пропозиції виробництву, список використаних джерел і додатки. Основний зміст роботи викладена на 296 сторінках комп’ютерного тексту, ілюстрована 84 таблицями що становить 72 сторінки та 10 рисунками що становить 7 сторінок. Список використаних джерел включає 621 найменування, у тому числі 317 авторів із далекого зарубіжжя.

ВИБІР НАПРЯМІВ досліджень, Матеріали

ТА методи ВИКОНАННЯ РОБОТИ

Робота виконувалася протягом 1998 – 2005 років у лабораторії токсикологічного моніторингу (раніше лабораторія фармакології та токсикології) Центру токсикологічних досліджень, ветсанекспертизи, сертифікації кормів та продуктів тваринництва Інституту експериментальної та клінічної ветеринарної медицини УААН за загальною схемою, представленою на рис.1.

Методологічною основою вибору напрямку роботи слугували матеріали літератури щодо розвитку патології різного генезу в організмі тварин і людей під впливом піретроїдів та їх комбінацій з фосфорорганічними сполуками. Дослідження були спрямовані на розробку чутливих і високоякісних методик визначення пестицидів у біологічних об’єктах, вивчення особливостей їх токсикокінетики та токсикодинаміки в організмі лабораторних та сільськогосподарських тварин, впливу на окремі ферментні системи тварин в експерименті.

За цих умов були визначені наступні напрямки роботи та загальна схема експериментальних досліджень:

- комплексна оцінка розроблених методик визначення залишкових кількостей піретроїдів та їх комбінацій з фосфорорганічними сполуками в тканинах тваринного походження;

- токсикокінетика і виділення препаратів з організму тварин при експериментальних гострих і хронічних інтоксикаціях;

- окремі питання токсикодинаміки за розвитку токсикозів згаданих вище пестицидів ;

- розробка системи токсико-гігієнічного регламентування залишкових кількостей пестицидів у кормах для сільськогосподарських тварин.

Дослідна частина роботи виконувалася у віварії та експериментальній базі інституту. Для експериментів використовували піретроїд ф’юрі (зетациперметрин) у формі 10% водної емульсії (в.е.) та комбінований пестицид нурел-Д (хлорпірифос+циперметрин) у формі 55% концентрату в

емульсії (к.е.). У дослідах використано 166 білих щурів і 210 курей. При цьому проведено 5515 токсикологічних досліджень, із них 1783 при розробці методик та 1260 біохімічних досліджень крові та органів.

У гострих дослідах пестициди вводили тваринам перорально, за допомогою зонду, у формі олійних розчинів, водно-олійних емульсій і водних суспензій. У хронічних дослідах пестицидивводили через зонд або задавали з кормом. Дозування здійснювали за діючою речовиною на кілограм маси тварини або в хронічних експериментах на кілограм корму. Контрольні тварини пестицидів не отримували або їм уводили відповідну кількість рослинної олії з емульгатором.

Вміст діючих речовин пестицидів (що вивчались) та їх метаболітів визначали в ґрунті і вегетативних частинах рослин із використанням розроблених методик. Утримання і годівлю піддослідних щурів та курей здійснювали у відповідності до загальноприйнятих нормативів (Западнюк И.П., и др., 1974; Калашников А.П. и др., 1985).

Розробляючи методики групового визначення піретроїдних та хлорорганічних пестицидів, ф’юрі і комбінованого пестициду нурелу-Д, відомі кількості стандартних активних інгредієнтів пестицидів уносили в проби біологічної матриці і після тригодинної витримки проводили екстракцію речовин, очищення екстрактів та ідентифікацію пестицидів хроматографічними методами. Цифровий матеріал підлягав метрологічній обробці. Ці методики використовували також у гострих і хронічних експериментах при вивченні токсикокінетики пестицидів. Для усіх розроблених методик була проведена валідація згідно з вимогами „Стандарту ІSO 17025” і „Європейської інструкції щодо застосування аналітичних методів та інтерпретації результатів ЕС 657/2002”.

Токсикологічні експерименти на тваринах виконували відповідно до методичних рекомендацій „Токсикологічний контроль нових засобів захисту тварин” (Косенко М.В., Малик О.Г., Коцюмбас І.Я. і інші, 1997), а при встановленні величин максимально допустимих рівнів залишкових кількостей пестицидів у кормах для сільськогосподарських тварин враховували методичні рекомендації, затверджені ВАСГНІЛ (Таланов Г.А., Аббасов Т.Г., Малинин О.А., и др., 1983) та інші.

Визначення середньосмертельної дози пестицидів ф’юрі і нурелу-Д проводили методом пробіт-аналізу Miller і Tainter (1944) в модифікації В.Б. Прозоровського (1962).

У крові визначали: кількість еритроцитів на КФК-2 за допомогою калібрувальних графіків (Дервиз Г.В., Воробьёв А.И., 1959; Заболоцкий В.Т., Поляков В. Ф., 1965); концентрацію гемоглобіну гемоглобінціанідним методом (Кондрахин И.П., 1985); глюкози в реакції з о-толуїдиновим реактивом (Самохін В.Т. і ін., 1981); піровиноградної кислоти в крові – в реакції з саліциловим альдегідом (Шамрай Е.В., 1967); молочної кислоти – за методом Баркера і Саммерсона; холестерину – за методом Ілька, 1962.

Дослідження активності ферментів у плазмі крові включали: активність АСТ (К.Ф. 2.6.1.1.) і АЛТ (К.Ф. 2.6.1.2.) за методом Reitman і Frankel в модифікації А.М. Ошеровича і Б.І. Мільнера; активність лужної фосфатази (К.Ф. 3.1.3.1.) – за допомогою відповідних наборів науково-виробничого підприємства „Філісіт Діагностика” (Україна); активність псевдохолінестерази (К.Ф. 3.1.1.8) – за допомогою відповідних наборів „Біо-ЛА-Тест®” науково-виробничої фірми “Lachema” (Чехія); активність фруктозодифосфатальдолази (К.Ф. 3.1.3.11) – за Кулганеком і Клашком; активність загальної лактатдегідрогенази (К.Ф. 1.1.2.3) – за Севелом і Товареком; неспецифічні естерази (К.Ф. 3.1.1.1, 3.1.1.2, 3.1.1.7) – за швидкістю перетворення 1-нафтилацетату (Малинін О.О., 1977).

Глікоген у тканинах печінки визначали за Кахну (Асатиани В.С., 1957), використовуючи кольорову реакцію з антроновим реактивом.

В окремих органах і тканинах курей (головний мозок, печінка, нирки, серце, червоні м’язи і тонка кишка) визначали активність лужної фосфатази (К.Ф. 3.1.3.1.), фруктозодифосфатальдолази (К.Ф. 3.1.3.11) і загальної лактатдегідрогенази (К.Ф. 1.1.2.3) та гомогенатах печінки і серця визначали активність АСТ (К.Ф. 2.6.1.1.) і АЛТ (К.Ф. 2.6.1.2.) за вказаними вище методами. Для цього головний мозок, печінку, нирки, серце, червоні м’язи і тонку кишку відбирали після розтину тварин для отримання гомогенатів. Тканини швидко вилучали, охолоджували протягом 3 хв., продавлювали крізь прес, гомогенізували (скло-тефлон) у відповідному середовищі, яке містить для АСТ – 0,25М сахарозу, приготовлену на 0,05 М трис-HCl буфері (рН 7,4); для АЛТ – 50 мМ трис-HCl буфер (рН 7,4); для фруктозодифосфатальдолази – 5мМ триетаноламіновий буфер (ЕДТА) (рН 7,4); для загальної лактатдегідрогенази – 0,1М розчин трис-HCl буфер, який містить ЕДТА (0,001М), і для лужної фосфатази – 100мМ трис-HCl буфер з рН 7,4; центрифугували протягом 1 хв. при 800 об./хв. та фільтрували і зберігали при t 00 С до використання у дослідженні. Співвідношення наважки тканини та об’єму середовища гомогенізації складало 1:50.

У роботі використовували реактиви фірм: “Lachema” (Чехія), “Reanal” (Угорщина); “Merk” (Німеччина), “Sigma” (США) і реактиви вітчизняного виробництва кваліфікації ЧДА, ХЧ і ОСЧ.

Паралельно з біохімічними проводили токсикокінетичні дослідження пестицидів в організмі тварин. При цьому органи і тканини (головний мозок, серце, легені, кров, печінка, нирки, червоні та білі м’язи, вміст м’язового шлунку і товсту кишку, жир) відбирали після розтину тварин. Дослідження проб на вміст діючих компонентів ф’юрі та нурелу-Д проводили методом газорідинної хроматографії згідно з розробленими нами методиками.

Результати клініко-біохімічних та токсикологічних досліджень наведені у відповідності з Міжнародною системою одиниць, рекомендованою для використання в клінічній лабораторній практиці, і статистично оброблені на персональному комп’ютері з використанням пакету програм Microsoft Excel for Windows 2000.

результати досліджень

Експериментально-теоретичне обґрунтування і розробка хроматографічних методик визначення піретроїдів та їх комбінацій з фосфорорганічними сполуками в об’єктах тваринного походження, а також гармонізація їх згідно з вимогами „Стандарту ІSO 17025” і „Європейської інструкції щодо застосування аналітичних методів та інтерпретації результатів ЕС 657/2002”

Методика групового визначення хлорорганічних пестицидів і піретроїдів.

Кількісні методи визначення залишкових кількостей піретроїдів, хлорорганічних пестицидів та активних інгредієнтів піретроїду ф’юрі і комбінованого пестициду нурелу-Д в об’єктах тваринного походження розроблені за схемою, яка представлена на рисунку 2.

На першому етапі ми визначали оптимальний екстрагент, який забезпечує максимальне екстрагування пестициду, що досліджувався із матриці за мінімальної кількості коекстрактивних речовин. Для цього використовували різноманітні органічні розчинники: ацетон, етанол, бензол, гексан і їх суміші. Наступні етапи включали фільтрацію, ультрафільтрацію, центрифугування та інші методи звільнення екстрактів від домішок. Реекстракцію проводили, як правило, з використовуванням гексану. Для додаткового очищення реекстрактів використовували хроматографію на колонках. На заключній стадії відпрацювували оптимальні режими ідентифікації пестицидів засобом хроматографії. Валідацію методик проводили згідно з вимогами GLP, стандарту „ISO 17025” і „Європейської інструкції щодо застосування аналітичних методів та інтерпретації результатів ЕС 657/2002”.

Складність розробки групових уніфікованих методик визначається різноманітними фізико-хімічними властивостями пестицидів та об’єктів дослідження. Накопичений досвід та проведені дослідження дали змогу визначити два екстрагенти: етанол та ацетон. В останніх розчинні більшість хлорорганічних і піретроїдних пестицидів. Однак, за цих умов в екстракт потрапляє велика кількість коекстрактивних речовин. Властиво це викликає необхідність розробки системи очищення екстрактів. На першому етапі ми використали метод осаджування коекстрактивних речовин із суміші полярного розчинника з водою. Найбільш позитивні результати були отримані після використання ацетон-водного екстракту та ацетату свинцю. Реекстракцію пестицидів після цього проводили неполярними органічними розчинниками (частіше гексаном) із додатково розведених водою екстрактів. На заключному етапі для додаткового очищення екстрактів ми використовували хроматографію на колонці. Очищений гексановий екстракт у подальшому використовували для ідентифікації пестицидів методом газорідинної або тонкошарової хроматографії.

Метрологічні характеристики методу та валідаційні параметри розробленої методики одночасного групового визначення хлорорганічних пестицидів і піретроїдів у кормах і тканинах тваринного походження (м’ясо, внутрішні органи, молоко, жир, яйця) способом газорідинної та тонкошарової хроматографії проведені на базі матриці – м’язова тканина, згідно з вимогами GLP і європейських стандартів після внесення у проби 10 мкг хлорорганічних пестицидів (J-ГХЦГ, ДДТ, ДДД, ДДЕ, дилор, кельтан) і піретроїдів (амбуш, децис, цимбуш, карате, фастак). За цих умов точність і правильність при поверненні добавки аналіту до матриці була у межах 70,3 – 91,6, відносне стандартне відхилення склало 6,0 – 11,7. Крім того відносне стандартне відхилення виявлено за проведення та відтворення контролю в лабораторії і воно склало 3,02 – 4,90, яке вказує на те, що фактори, які досліджувались, не чинять впливу на результати дослідження і методика не вимагає додаткових заходів корекції. Метод був також лінійним і оптимальна стабільність аналізу у матриці, що вивчалась, зберігалась упродовж 20 діб за умови використання посуди із темного скла і t +40С. Межа детектування становила 0,5 нг для хлорорганічних пестицидів і 1,0 нг для піретроїдів.

Отже, розроблена методика досліджень групового визначення хлорорганічних пестицидів і піретроїдів в об’єктах тваринного походження відповідає вимогам міжнародних стандартів.

Новизна цієї розробки захищена Патентом України 66709 А G 01N33/02, №2003109160. На базі цієї розробки підготовлені „Методичні вказівки щодо одночасного групового визначення хлорорганічних пестицидів і піретроїдів у кормах і тканинах тваринного походження (м’ясо, внутрішні органи, молоко, жир, яйця) способом газової та тонкошарової хроматографії”, які апробовані та затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України, протокол № 15-14/188 від 05.05.2003 року.

Методика визначення зетациперметрину (ф’юрі). Встановлено, що кращим екстрагентом для зетациперметрину з біологічної матриці є ацетон. Але при аналізі об’єктів тваринного походження (м’ясо, внутрішній жир, яйце, молоко) ацетон екстрагує і велику кількість ендогенних сполук (ліпіди, пігменти, каротиноїди тощо), які заважають ідентифікації пестициду.

Для звільнення екстрактів від жирових компонентів при визначенні зетациперметрину ми використовували спосіб виморожування їх. Після охолодження екстракту протягом години при t (– 10 – 200С) вдавалось позбутись 80–85 відсотків ліпідних компонентів. Додаткове очищення екстрактів від коекстрактивних речовин проводили методом хроматографії з використанням розподільних колонок (колонка з оксидом алюмінію II ступеня активності). Для цього використовували суміш розчинів гексану з бензолом. Аналіз результатів досліджень цих сумішей показав, що оптимальним співвідношенням для елюювання зетациперметрину є – бензол : гексан – (6:4) в кількості 10 см3.

Якісну ідентифікацію та кількісне визначення зетациперметрину проводили за часом утримання методом газорідинної хроматографії з використанням дектектора для захоплення електронів за встановленими нами параметрами.

Після розробки методики нами проведені експериментальні дослідження щодо її валідації на базі дослідження біологічної матриці (м’язова тканина), в яку штучно вносили зетациперме-трин.

Після проведення контролю точності та правильності повернення добавки аналіту до матриці, процент повернення пестициду склав 77,3%, відносне стандартне відхилення – 6,0. І таким чином, методика є точною і правильною. Відносне стандартне відхилення за проведення контролю та відтворення всередині лабораторії склало 3,56, яке вказує на те, що фактори, які враховувались, не чинять впливу на результати дослідження і методика не вимагає відповідно додаткової корекції. Метод є також лінійним. Оптимальна стабільність аналіту в матриці, що вивчалась, зберігалась упродовж 14 діб за умови використання посуди із темного скла та t +40С. Межа детектування складала 0,5 нг.

Отже, новизна розробленої методики визначення зетациперметрину для дослідження об’єктів тваринного походження захищена Патентом України 66568 А G 01N33/02, №2003077014. Методика затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України (Наказ № 86 від 18.11.2003р.) і рекомендована для використання у практиці.

Методика визначення комбінованого пестициду нурелу-Д. Використання сумішей пестицидів вимагає відповідного контролю за залишковими кількостями обох компонентів пестициду. Саме тому, нами були проведені дослідження щодо розробки методу одночасного визначення хлорпірифосу і циперметрину в біологічній матриці з використанням приладу газорідинної хроматографії. Проведеними дослідженнями встановлено, що найбільш ефективним екстрагентом для обох пестицидів є ацетон, який забезпечує найбільшу екстракцію хлорпірифосу і циперметрину із субстанції що досліджувались. Однак, ацетон за проведення аналізу об’єктів тваринного походження екстрагує багато ендогенних сполук, які заважають подальшій ідентифікації препарату. В цьому випадку для зручності роботи створили загальну схему виділення хлорпірифосу і циперметрину із складної біологічної матриці. Первинне звільнення проб від жирових компонентів проводили за методом виморожування.

Для додаткового очищення проб від коекстрактивних речовин і розробки сепаративного елюювання хлорпірифосу і циперметрину використовували хроматографію з розподільними колонками. Колонка з силікагелем АСК не забезпечувала роздільного виходу хлорпірифосу і циперметрину. Саме тому, подальші дослідження проводили з оксидом алюмінію. Неоднакова кількість фосфорорганічного пестициду (хлорпірифосу) і піретроїду (циперметрину) в пробах, що досліджувались викликала потребу проведення сепаративного елювання препаратів із колонки. Для цього хлорпірифос вимивали сумішшю гексан : бензол (14:1) в кількості 10 см3, а циперметрин – гексан : бензол (7:3) в кількості 10 см3, які були визначені експериментальним шляхом.

Для ідентифікації і встановлення валідаційних параметрів розробленої нами методики одночасного визначення активних компонентів нурелу-Д у біологічній матриці (м’ясо, внутрішні органи, молоко, жир, яйця) використовували спосіб газорідинної хроматографії.

Після проведення контролю точності та правильності щодо повернення добавки аналіту внесеного до матриці, процент повернення був у межах 74,9 – 81,6, а відносне стандартне відхилення склало 5,97 – 7,25. Тобто методика є точною і правильною. Відносне стандартне відхилення за проведення контролю і відтворення всередині лабораторії склало 3,43 – 3,93, що вказує на те, що фактори, які досліджувались, згідно з валідацією не чинять впливу на результати дослідження і методика не вимагає заходів корекції. Метод є також лінійним і оптимальна стабільність аналізу в матриці, що вивчалась, зберігається протягом 10 діб за умови використання посуди із темного скла та t +40С. Межа детектування складає 0,05 нг для хлорпірифосу і 0,5 нг для циперметрину.

Отже, розроблена методика має прийнятні характеристики для валідації і може використовуватись в хіміко-токсикологічних лабораторіях для дослідження більшості об’єктів рослинного та тваринного походження. Новизна методики захищена Патентом України 57249 А G 01N33/02, №2002054266. Методика затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України, протокол №15-14/298 від 07.06.2002 року та рекомендована у виробництво.

Параметри токсичності піретроїдів і їх комбінацій з фосфорорганічними сполуками

Гостра токсичність ф’юрі для білих щурів. Параметри токсичності ф’юрі (10% в.е.) визначали на білих щурах, масою 180-210 г. Пестицид щурам задавали у формі водної суспензії в шлунок за допомогою зонда в дозах 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 і 5,5 мг/кг маси тіла. Спостереження за піддослідними тваринами проводили протягом 14 діб.

Через одну годину після введення ф’юрі в шлунок у щурів усіх дослідних груп встановили відмову від корму і легке пригнічення. Більшість тварин лежали, лише деякі повільно пересувались.

Щури, які отримали ф’юрі в дозах 3,0, 3,5, 4,0 мг/кг маси тіла на другу добу після введення дослідного препарату починали прийом корму та води. У щурів, які одержали вище згаданий пестицид у дозах 4,5, 5,0 і 5,5 мг/кг маси тіла, встановили порушення координації руху, а згодом параліч передніх і задніх кінцівок. Покрив шерсті щурів був скуйовдженим, видимі слизові оболонки синюшними. Спостерігались також сильне потовиділення та салівація.

Через одну добу у щурів, яким ввели ф’юрі в дозах 4,5 і 5,0 мг/кг маси тіла і що залишилися живими, спостерігали параліч кінцівок та збільшення черевної порожнини. Шерстний покрив забруднений, особливо біля анального отвору. Крім того, у щурів установлено утруднене дихання, хрипи. Після введення дослідного пестициду в смертельних дозах щури загинули в перші дві доби.

Патологоанатомічні зміни у щурів, які загинули, характеризувались вираженими застійними явищами в легенях, печінці та селезінці.

Параметри токсичності визначали шляхом розрахунків прямої графіку щодо пробіт-аналізу. ЛД50 ф’юрі (10% в.е.) для білих щурів за цими розрахунками склала 4,93 мг/кг маси тіла. Величина помилки ЛД50, яку вираховували за методом Міллера і Тейнтера, склала - 0,62 мг/кг.

Отже, згідно з гігієнічною класифікацією за Л.І. Медведьом ф’юрі відносимо до високотоксичних сполук.

Гостра токсичність комбінованого пестициду нурелу-Д. Нурел-Д (55% к.е.) задавали щурам у формі олійних розчинів у шлунок за допомогою зонда. Щурам піддослідних груп вводили нурел-Д в дозах 20, 40, 60, 80, 100 і 120 мг/кг маси тіла. Об’єм розчину, що вводився, визначали індивідуально для кожної тварини у відповідності до маси тіла. Спостереження за піддослідними тваринами показали, що через одну годину після введення нурелу-Д у шлунок дослідні щури відмовлялись від корму і настало легке пригнічення.

Встановлено, що через 3 години після введення щурам нурелу-Д у дозі 20 і 40 мг/кг тварини починали споживати корм і воду. А у щурів, які одержали нурел-Д у дозах 60, 80, 100 і 120 мг/кг маси тіла, розпочиналось посмикування м’язів на передній частині тіла, а згодом настав параліч передніх і задніх кінцівок. У подальші терміни дослідження клінічні ознаки інтоксикації у щурів цих груп зникли.

Через одну добу в щурів, які одержали нурел-Д у дозах 60, 80 і 100 мг/кг маси тіла і залишились живими, спостерігали параліч кінцівок. Покрив шерсті був забруднений, особливо біля анального отвору. Крім того, було утруднене дихання та спостерігали хрипи. Лише деякі тварини споживали корм. Після введення згаданого вище пестициду в дозі більше 120 мг/кг маси тіла паралічі наступали через декілька хвилин згодом. У смертельних дозах щури загинули в основному в перші дві доби після введення дослідного пестициду.

Патологоанатомічні зміни у щурів, які загинули, характеризувались вираженими застійними явищами в легенях, печінці та селезінці.

Параметри токсичності визначали шляхом розрахунку прямої графіку для пробіт-аналізу. ЛД50 за результатами цих розрахунків склало 74,7 мг/кг маси тіла. Величина помилки ЛД50, яку вираховували за методом Міллера і Тейнтера, склала 17,08 мг/кг.

Отже, згідно з гігієнічною класифікацією за Л.І. Медведьом цей комбінований пестицид відносимо до високотоксичних сполук.

Токсикокінетика піретроїдів і їх комбінацій з фосфорорганічними сполуками в органах і тканинах тварин, терміни виведення їх із організму

Токсикокінетика ф’юрі в організмі білих щурів.

Вивчення токсикокінетики ф’юрі та виведення його з калом і сечею, проводили на щурах, за одноразового перорального введення препарату в дозі 2,5 мг/кг маси тіла (? ЛД50).

Після введення дослідного пестициду щурам настали клінічні ознаки токсикозу. Через 4 і 8 годин, а також через 1, 3 і 7 діб після введення інсектициду проводили евтаназію тварин за легкого ефірного наркозу і відбір проб органів і тканин для дослідження. Зетациперметрин за цих умов визначено в усіх пробах, що досліджувались протягом трьох діб (табл. 1).

Таблиця 1

Розподіл зетациперметрину в організмі щурів за одноразового перорального введення ф’юрі в дозі 2,5 мг/кг маси тіла

Органи і тканини | Концентрація зетациперметрину (мг/кг) через

4 години | 8 годин | 1 добу | 3 доби | 7 діб

Мозок головний | 0,024±0,009 | 0,020±0,006 | 0,021±0,004 | 0,031±0,016 | < м.в.

Серце | 0,045±0,011 | 0,027±0,015 | 0,028±0,014 | 0,041±0,016 | < м.в.

Легені | 0,031±0,006 | 0,010±0,005 | 0,024±0,006 | 0,012±0,003 | < м.в.

Кров | 0,025±0,004 | 0,018±0,009 | 0,044±0,008 | 0,014±0,003 | < м.в.

Печінка | 0,014±0,008 | 0,004±0,002 | 0,005±0,003 | 0,004±0,002 | < м.в.

Нирки | 0,028±0,014 | 0,014±0,007 | 0,027±0,006 | 0,010±0,006 | < м.в.

М’язи | 0,020±0,003 | 0,014±0,009 | 0,008±0,004 | 0,005±0,002 | < м.в.

Внутрішній жир | 0,041±0,015 | 0,038±0,009 | 0,038±0,013 | 0,008±0,002 | < м.в.

Вміст шлунка | 1,504±0,831 | 0,627±0,010 | 0,487±0,368 | 0,002±0,001 | < м.в.

Вміст товстої кишки | 2,369±0,572 | 0,999±0,353 | 0,196±0,102 | 0,001±0,005 | < м.в.

Примітки: < м.в. – нижче величин межі визначення 0,002 мг/кг для зетациперметрину;

Зетациперметрин виявляли в усіх органах і тканинах уже через 4 години після введення пестициду, що вказує на його активну резорбцію в організмі. Найбільшу кількість його встановлено в умісті товстої кишки – 2,369±0,572 мг/кг та шлунку – 1,504±0,831 мг/кг. У серці, легенях, нирках і головному мозку згаданий вище пестицид визначався в менших кількостях. У подальшому концентрація зетациперметрину в тканинах знижувалась. Однак, через 3 доби зетациперметрин продовжували виявляти в серці (0,041±0,016 мг/кг) і головному мозку (0,031±0,016 мг/кг) та в менших кількостях в інших тканинах.

Окрім вивчення характеру розподілу зетациперметрину в органах і тканинах нами вивчалась динаміка виділення згаданого вище пестициду із організму тварин з сечею і калом. У добовому об’ємі сечі і калу, від кожної тварини