ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

МЕЛЬНИК Віталій Миколайович

УДК 575.22: 582.923.1 + 576.5

ВАРІАБЕЛЬНІСТЬ рДНК ДЕЯКИХ ВИДІВ РОДУ GENTIANA

У ПРИРОДІ ТА В КУЛЬТУРІ IN VITRO

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України

Науковий керівник: член-кор. НАН України, доктор біологічних наук, професор

Кунах Віктор Анатолійович

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу генетики клітинних популяцій

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Кучук Микола Вікторович

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України,

заступник завідувача відділу генетичної інженерії;

кандидат біологічних наук

Коваленко Павло Григорович

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

старший науковий співробітник відділу молекулярної генетики.

Провідна установа: Інститут фізіології рослин і генетики НАН України

Захист дисертації відбудеться “ 24 ” лютого 2005 р. о _14_ год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148.

Автореферат розіслано “ 17 ” січня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.А. Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Метод культури in vitro широко використовується для вирішення багатьох фундаментальних питань клітинної біології, фізіології і генетики рослин, а також для одержання цінних вторинних метаболітів, нового вихідного матеріалу для селекції та як один із способів збереження генофонду зникаючих видів. Значні успіхи досягнуті у вивченні спадкового апарату культур клітин і тканин рослин. Зокрема, показано, що лише деякі культури можуть стабільно підтримувати вихідний генотип, тоді як інші зазнають швидких змін геному в умовах in vitro. Численні дані стосовно генетичних змін в культурі in vitro дають підставу вважати, що збереження клітинами генетичної стабільності може розглядатися лише як виключення.

Експериментальними роботами останніх років встановлено, що геномні реорганізації, що спостерігаються в сформованих штамах, часто мають каналізований (невипадковий) характер. Невипадковість виявлених перебудов проявляється у подібності змінених послідовностей ДНК геномів культивованих клітин та інтактних рослин, що належать до різних видів або сортів (Linacero et al., 2000; Кунах, 2003; Андрєєв та ін., 2004). Проте, особливості і механізми генетичних перебудов на молекулярному рівні на сьогодні вивчені недостатньо. Останнім часом з цією метою дедалі частіше використовують молекулярно-генетичні маркери. Одними з таких маркерів є гени, які кодують рибосомні РНК. Особливості будови генів рРНК – багатокопійність, кластерна організація, висока консервативність кодуючих ділянок і варіабельність спейсерних послідовностей, а також наявність механізмів, що забезпечують узгоджену еволюцію повторів рДНК всередині кластера, роблять їх зручною моделлю для з’ясування питань екології, популяційної генетики, селекції і систематики.

Актуальність вибору видів роду Gentiana L. як об’єктів дослідження визначається тим, що багато тирличів є джерелом цінної лікарської сировини, але одночасно знаходяться під загрозою зникнення і підлягають охороні.

До видів, природні ресурси яких з кожним роком зменшуються, відноситься офіцинальний вид Gentiana lutea L., знищення більшості популяцій якого призвело до інтенсивного використання у народній медицині інших видів роду Gentiana (G.acaulis L., G.punctataG.аsсlepiadea L.). Ці види здатні накопичувати, хоча і у менших кількостях, але аналогічні до G.lutea біологічно активні речовини (БАР): секоiридоїднi глiкозиди, алкалоїди, ксантони, флавоноїди тощо. Відомо, що екстракти з кореневищ і коренів G.lutea поліпшують функціональну діяльність травних органів, а також здійснюють нормалізуючий вплив на метаболічні функції печінки.

Одним із основних способів забезпечення фармацевтичної промисловості рослинною сировиною є створення промислових плантацій. Однак, для видів роду Gentiana, і для G.lutea зокрема, такий підхід в силу фізіологічних особливостей (складність пророщування насіння, пізній вступ у фазу цвітіння) економічно невигідний. Окрім того, відомо, що БАР синтезуються в основному у підземній частині, а для отримання кореневища масою 100-200 г необхідно вирощувати рослини до 10-12 років. Одним із шляхів вирішення наведеної вище проблеми є отримання культур клітин і тканин даних видів. Біомаса культивованих клітин рослин ще з кінця 70-х років використовується в якості альтернативного джерела економічно важливих продуктів. Однак, низка труднощів і запитань стримують широкомасштабне застосування культури in vitro. Одна з основних, найчастіше досліджуваних, але до цього часу невирішених проблем – нестабільність геному популяцій культивованих клітин рослин.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Робота виконувалась у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за бюджетною темою 2.2.4.5. “Дослідження структурно-функціональної мінливості геному в процесах диференціювання і дедиференціювання клітин вищих рослин в інтактному організмі та при культивуванні in vitro”, № держ. реєстрацiї 0101U000007. Частина досліджень проводилась за часткової фінансової підтримки наукової програми НАН України “Фізіолого-біохімічні та молекулярно-генетичні основи функціонування живих систем і розробка принципів керування ними”.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчити особливості геномної мінливості в культурах тканин тирличів та провести порівняльний аналіз геномних перебудов in vitro з міжпопуляційною, а також міжвидовою мінливістю серед інтактних рослин – представників деяких видів роду Gentiana.

Конкретними завданнями даного дослідження були:

1. Отримати культуру тканин видів G.lutea, G.punctata, G.asclepiadea, G.acaulis та розробити оптимальні умови для їх проліферації.

2. Провести рестрикційний аналіз ДНК культивованих тканин та інтактних рослин різних видів роду Gentiana.

3. Дослідити методом блот-гібридизації міжвидову варіабельність рибосомної ДНК тирличів за локалізацією сайтів впізнавання для деяких ендонуклеаз рестрикції.

4. Виявити перебудови 18S-25S рДНК в культурах тканин in vitro шляхом порівняння з інтактними рослинами.

5. Дослідити варіабельність повторів 5S рибосомної ДНК тирличів у культивованих тканинах та інтактних рослинах.

Об’єктом дослідження була варіабельність ДНК і, зокрема, ядерної рДНК культивованих тканин G.acaulis, G.punctata, G.lutea та інтактних рослин – представників роду Gentiana.

Предмет дослідження складали ДНК культур тканин in vitro та інтактних рослин деяких видів роду Gentiana.

Методи дослідження: методи роботи з культурами рослинних тканин та клітинна селекція in vitro, виділення ДНК та її гідроліз ендонуклеазами рестрикції, електрофорез ДНК в агарозному гелі, блот-гібридизація.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показано наявність індивідуальної та міжпопуляційної варіабельності рДНК для виду G.lutea, а також міжвидового поліморфізму ДНК, і рДНК зокрема, для чотирьох досліджуваних видів роду Gentiana L. (G.asclepiadea, G.lutea, G.punctata, G.acaulis). Вперше здійснено картування 18S-25S рибосомної ДНК тирличів за локалізацією сайтів впізнавання для деяких ендонуклеаз рестрикції. Встановлено, що виявлені відмінності повторів рДНК тирличів за довжиною зумовлені варіабельністю в ділянці нетранскрибованого міжгенного спейсера, тоді як транскрибовані частини рДНК є консервативними в усіх видів.

Вперше показано, що геноми клітин видів роду Gentiana L. (G.lutea, G.punctata, G.acaulis) при культивуванні в умовах in vitro зазнають змін на молекулярному рівні.

Встановлено існування паралелізму між перебудовами ДНК в клітинах культури тканин in vitro та міжпопуляційними відмінностями, які виникли в процесі еволюції – фрагменти ДНК культивованих тканин G.lutea, перебудовані порівняно з геномом рослини вихідної популяції, нагадують такі у рослини іншої популяції того самого виду роду Gentiana. Тобто, зміни рДНК G.lutea в умовах ізольованого росту клітин на штучних живильних середовищах не виходять за рамки внутрівидової мінливості. Виявлена закономірність геномних перебудов у процесі адаптації клітин до умов росту in vitro в певній мірі дає можливість прогнозувати ці зміни в культурі in vitro.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень вказують на можливість застосування одержаних культур тканин in vitro видів G.lutea, G.punctata, G.acaulis, а також підібраних умов культивування (зокрема низького вмісту в живильному середовищі екзогенних фітогормонів) для збереження генофонду цих цінних зникаючих видів.

Вивчення геномної мінливості тирличів за допомогою методу блот-гібридизації показало, що поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів рДНК може бути використаний для ідентифікації видів роду Gentiana L., а також при паспортизації їх клітинних штамів та ліній, що має суттєве практичне значення в ботанічних та біотехнологічних дослідженнях.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є завершеним науковим дослідженням Мельника В.М. Наведені в рукописі результати отримано здобувачем особисто або за безпосередньої участі при виконанні експериментів. Роботу з одержання та підтримання культур тканин проведено у співробітництві з працівниками лабораторії екології та біотехнології Тернопільського національного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка під керівництвом к.б.н. Страшнюк Н.М. Результати з молекулярно-біологічного аналізу ДНК отримані разом з к.б.н. Андрєєвим І.О., к.б.н. Спірідоновою К.В.

Автор особисто відібрав і критично проаналізував великий обсяг сучасної вітчизняної та зарубіжної літератури за темою проведеного наукового дослідження. Дисертантом розроблено програму вирішення поставлених завдань, інтерпретовано отримані результати. Аналіз та обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником – д.б.н., професором, членом-кореспондентом НАН України Кунахом В.А., а також з к.б.н. Андрєєвим І.О., к.б.н. Спірідоновою К.В. та к.б.н. Страшнюк Н.М., з якими автор має спільні публікації.

Автор висловлює щиру подяку за допомогу і моральну підтримку під час виконання роботи всім співробітникам відділу генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України та лабораторії екології та біотехнології Тернопільського національного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка, а також працівникам Інституту екології Карпат НАН України, які сприяли експедиційній роботі в Карпатах.

Апробація роботи. Результати роботи були представлені на 14-и конференціях та симпозіумах: Науково-практичній конференції “Збереження флористичного різноманіття Карпатського регіону” (Синевир, Україна, 1998); II Міжнародному симпозіумі “Plant Biotechnology” (Київ, Україна, 1998); I Всеукраїнській науковій конференції “Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах” (Тернопіль, Україна, 1998); 11 Міжнародній науковій конференції “Вивчення онтогенезу рослин природних та культурних флор у ботанічних закладах та дендропарках Євразії” (Біла Церква, Україна, 1999); Конференції з молекулярної біології і генетики для студентів, аспірантів та молодих вчених (Київ, Україна, 2001); II Міжнародній науково-практичній конференції “Сельскохозяйственная биотехнология” (Горки, Білорусія, 2001); Міжнародному симпозіумі “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources” (Ялта, Україна, 2002); XXXII щорічній нараді Європейської Спільноти з нових методів в сільськогосподарських дослідженнях та Міжнародної Спілки радіоекологів (Варшава, Польща, 2002); VIII конференції молодих вчених “Сучасні напрямки у фізіології та генетиці рослин” (Київ, Україна, 2002); IV Міжнародній конференції “Геном растений” (Одеса, Україна, 2003); XXXІII щорічній нараді Європейської Спільноти з нових методів в сільськогосподарських дослідженнях (Вітербо, Італія, 2003); VIII Міжнародній конференції “The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology” (Саратов, Росія, 2003); Конференції з молекулярної біології і генетики для студентів, аспірантів та молодих вчених (Київ, Україна, 2003); Україно–Британській нараді з біотехнології рослин “Biotechnology approaches to engineering plant growth” (Ялта, Україна, 2004), а також доповідалися на наукових семінарах відділу генетики клітинних популяцій ІМБіГ НАНУ.

Публікації. Результати досліджень наведено у вигляді 6 статей, опублікованих у фахових наукових журналах, а також 14 тез доповідей у збірниках матеріалів міжнародних і всеукраїнських конференцій та симпозіумів з питань екології, біотехнології рослин, молекулярної біології та генетики.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із списку умовних скорочень, вступної частини, огляду літератури, матеріалів і методів, результатів досліджень та їх обговорення, заключення, висновків і списку літератури, що містить 169 посилань. Робота викладена на 116 сторінках, включає 2 таблиці та 19 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури представлено сучасні уявлення про рід Gentiana L. Зокрема про систематичне положення, еволюцію, морфофізіологічну характеристику досліджуваних видів, культивування деяких видів роду в умовах ізольованого росту на штучних живильних середовищах. Особлива увага приділена причинам, механізмам та особливостям змін геному рослин у культурі in vitro. Детально висвітлені дані стосовно будови, функцій, варіабельності рДНК в цілому та окремих її частин.

Матеріали та методи досліджень. У роботі використовували рослини різних видів роду Gentiana L.: тирлич жовтий G.lutea, тирлич крапчастий G.punctata, тирлич безстебловий G.acaulis, тирлич ваточниковидний G.asclepiadea. В експериментах з одержання калюсних культур вихідним матеріалом слугувало насіння цих видів, зібране в Українських Карпатах, яке стерилізували у розчині Н2О2 і висаджували на середовище Мурасіге-Скуга (МС) (Murashige, Skooog, 1962). З метою індукції калюсоутворення використовували отримані з насіння асептичні 1,5-2 місячні рослини, кореневі, стеблові та листкові експланти яких висаджували на середовища MС, MС/2 та B5 (Gamborg, Eveleigh, 1968), доповнені комбінаціями різних концентрацій 6-бензиламінопурину (БАП), 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти (2,4-Д) та нафтилоцтової кислоти (НОК). Культури вирощували в темряві при +25оС–+26,5оС, субкультивування проводили через кожні 4 тижні.

Матеріалом для виділення ДНК були листки і кореневища 4-5-річних рослин, а також культивовані in vitro впродовж різного часу калюсні тканини G.lutea, G.punctata, G.acaulis, які характеризувались найкращим ростом з-поміж інших, одержаних нами. В нашій роботі за основу було взято метод виділення ДНК S.O.Rogers i A.J.Bendich (Rogers, Bendich, 1985), модифікований Спірідоновою К.В. (Спірідонова, 2000). Реакцію гідролізу ДНК ферментами рестрикції проводили в об’ємі 30мкл згідно рекомендацій фірм-виробників (“Fermentas”, Литва; “Сибэнзим”, Росія). Розділення фрагментів ДНК проводили в 1% агарозі в 1 трис-ацетатному (ТАЕ) або 0,5 трис-боратному (ТВЕ) буферах (Маниатис и др., 1984). Електрофорез проводили при напрузі 2,5 В/см протягом 16–20 год. ДНК візуалізували бромистим етидієм і фотографували в ультрафіолетовому світлі на плівку Микрат-300 (“Тасма”, Росія). Для побудови денситограм одержані негативи сканували і обробляли за допомогою програми Scion Image (NIH, USA). В ролі маркерів молекулярних мас використовували ДНК фага , гідролізовану рестриктазами HindIII і PstI.

У ролі зондів для блот-гібридизації були використані наступні послідовності ДНК: 1) повний 18S-25S повтор рДНК гороху (плазмідна конструкція pHA1 (вставка по HindIII)), (Jorgensen et al., 1987) довжиною 8,8 т.п.н.; 2) повний повтор 18S-25S рДНК пшениці (клон pТА71) (Gerlach, Bedbrook, 1979) довжиною 9 т.п.н. та його фрагменти: EcoRI-BamHI фрагмент розміром 4,55 т.п.н., що містить нетранскрибований міжгенний спейсер (НТС); BamHI-фрагмент довжиною 3,6 т.п.н., що містить транскрибовану ділянку рДНК (включає 18S, ВТС 1, 5,8S, ВТС 2, 25S); 3) клонований BamHI фрагмент гена 5S рРНК жита, який містить частину кодуючої ділянки та нетранскрибований спейсер (Gerlach, Dyer, 1980).

Реакцію мічення проводили методом розсіяної затравки, використовуючи (-32P)-dCTP (цитозин-трифосфат). Блот-гібридизацію проводили згідно стандартної процедури, рекомендованої фірмою Amersham (Amersham, 1985). Для отримання радіоавтографів мембрану експонували з рентгенівською плівкою РП-1С (МПТВП “Оніко”, Україна). Експозицію проводили при –20°C.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Введення в культуру in vitro та особливості росту на штучних живильних середовищах культивованих клітин різних видів Gentiana. Першим етапом роботи був підбір умов in vitro для одержання та культивування калюсів чотирьох видів тирличів. На досліджуваних середовищах різного складу (B5, МС та МС/2, доповнених комбінаціями різних концентрацій ауксинів і цитокінінів) усі типи експлантів (стеблові, кореневі, листкові) формували калюс. Проте, інтенсивність калюсогенезу в значнiй мiрi залежала від типу експланта та складу живильного середовища. Так, на середовищі B5 калюсоутворення було незначне, або висаджені експланти некротували уже через 1-1,5 тижні. Тестування середовищ МС і МС/2, показало, що процеси дедиференціації у досліджуваних видів не залежать від концентрації макро- і мікросолей і обидва середовища індукують калюсоутворення. Доповнення цих середовищ різними комбінаціями фітогормонів БАП+НОК та БАП+2,4-Д показало, що обидві комбінації ауксинів і цитокінінів стимулюють процеси калюсогенезу у досліджуваних видів. Однак, на відміну від комбінації БАП з 2,4-Д, введення у середовища як МС, так і МС/2, комбінації БАП+НОК було менш сприятливим для калюсоутворення. Отриманий калюс наростав повільно, і через один пасаж спостерігався його некроз. Доповнення обох типів середовищ комбінацією БАП+2,4-Д стимулювало формування калюсу блідо-жовтого забарвлення, пухкої консистенції, що швидко наростав.

Результати досліджень показали, що оптимальний склад (зокрема концентрації фітогормонів) живильного середовища для культивування іn vitro залежить від виду, умов зростання рослин кожної з популяцій досліджуваних видів, типу вихідного експланта. Процес калюсоутворення на кореневих і стеблових експлантах найкраще відбувається на середовищі МС/2, доповненому 0,1 мг/л БАП і 0,5 мг/л 2,4-Д. Вид G. аsclepiadea характеризується калюсогенною активністю усіх типів експлантів, однак здатність до субкультивування у нього мінімальна – через 5-6 пасажів спостерігається некроз калюсу.

Дослідження геномних перебудов у культурах тканин G.lutea і G.punctata методом рестрикційного аналізу. В даному дослідженні ми виходили з припущення, що зміни послідовностей ДНК, які спостерігаються при введенні рослинних клітин в культуру, можуть бути обумовлені щонайменше двома чинниками. З одного боку, модифікації геному можуть бути пов’язані з процесами дедиференціації-редиференціації клітин, що відбуваються на перших етапах культивування. З іншого боку, їх спричиняють різноманітні мутації, індуковані стресовими умовами in vitro, які зачіпають насамперед найбільш варіабельні ділянки геному. Тому при дослідженні геномів культивованих клітин було проведено паралельний аналіз міжвидової варіабельності рестрикційних фрагментів ДНК, а також можливих їх відмінностей у диференційованих тканинах різних органів інтактних рослин.

Отримані результати показали, що набори фрагментів ДНК інтактних рослин G.lutea, G.punctata, G.acaulis і G.asclepiadea, одержані у результаті електрофоретичного розділення HindIII, BamHI, EcoRI i TaqI-продуктів гідролізу, характеризуються видовою специфічністю. Окрім видоспецифічних фрагментів на електрофоретичних профілях виявлені фрагменти, що були спільними для усіх чотирьох видів. Серед групи досліджуваних видів вирізняється G.acaulis, який за електрофоретичними профілями продуктів гідролізу найменше схожий на решту видів. Найбільш спорідненим з G.lutea є вид G.punctata, менше спільних з ним рестрикційних фрагментів у G.asclepiadea.

Порівняння електрофоретичних профілів ДНК листка інтактної рослини та калюсної культури G.punctata показало, що за набором HindIII-фрагментів розміром ~4 т.п.н. калюс більше схожий на інтактну рослину не вихідного, а іншого виду – G.lutea. Зокрема, у цієї культури замість одного мажорного фрагмента ДНК довжиною 4 т.п.н. (як у рослини цього виду), наявні два фрагменти приблизно такої ж довжини, як у G.lutea.

Серед BamHI-продуктів гідролізу ДНК на електрофоретичних профілях лише калюсних культур G.lutea i G.punctata, окрім специфічного для інтактних рослин цих видів набору фрагментів, з’являються низькомолекулярні фрагменти (~100-200 п.н.). Їх не виявлено у продуктах гідролізу ДНК інтактних рослин усіх досліджуваних нами видів.

Порівняння ДНК калюсів G.lutea і G.punctata з ДНК листка і кореневища цих рослин, гідролізованих EcoRI, дозволило виявити варіабельні фрагменти на електрофоретичних профілях культур in vitro (поряд із збереженням загального, характерного для інтактних рослин, розподілу фрагментів). Цікаво, що за деякими фрагментами (або їх відсутністю) профілі калюсів нагадують листки (G.lutea – 7,9 т.п.н.), за іншими ж – кореневище (G.lutea – 11,2 т.п.н., G.punctata – 4,3 т.п.н.).

Одержані за допомогою методу рестрикційного аналізу дані свідчать про те, що рослини роду Gentiana L. характеризуються видоспецифічними наборами рестрикційних фрагментів ДНК. Геноми калюсних культур видів G.lutea і G.punctata на молекулярному рівні характеризуються значною генетичною стабільністю. Однак, поряд з цим нами були виявлені ділянки ДНК, що в умовах in vitro зазнають перебудов. Очевидно, при вирощуванні клітин вивчених рослин в умовах in vitro в ДНК відбуваються мутації, які призводять до зміни локалізації сайтів упізнавання деяких ендонуклеаз рестрикції.

Картування 18S-25S рДНК деяких видів роду Gentiana. Робота з вивчення особливостей мінливості рДНК тирличів нами була розпочата з картування сайтів пізнавання для HindIII, BamHI, EcoRI рестриктаз в ядерних генах 18S-25S рРНК чотирьох представників роду Gentiana L. На основі результатів блот-гібридизації були побудовані карти 18S-25S рДНК G.acaulis, G.lutea, G.punctata, G.asclepiadea (рис.1).

Рис. 1. Міжвидова варіабельність повтору 18S-25S рДНК за довжиною та локалізацією додаткового HindIII сайта у тирличів. В – BamHI сайт; Е – EcoRI сайт; Н – HindIII сайт;

* – частково метильований HindIII сайт.

Загалом, результати картування показали значну консервативність кодуючих ділянок 18S-25S генів рРНК у досліджуваних видів. Поряд з цим виявлено міжвидові відмінності 18S-25S рДНК за розміром, які зумовлені варіабельністю ділянки нетранскрибованого спейсера (НТС), а також за локалізацією в НТС сайта HindIII ендонуклеази рестрикції.

Найменша довжина повтору 18S-25S рДНК характерна для G.asclepiadea. Розмір повної повторюваної одиниці 18S-25S рДНК у цього виду складає 10,5 т.п.н. У G.acaulis довжина повтору 18S-25S рДНК становить 11,0 т.п.н. Кількість послідовностей 18S-25S рДНК у геномі G.acaulis відносно сумарної ДНК значно менша порівняно з іншими видами. Довжина повної повторюваної одиниці 18S-25S рДНК G.punctata становить 11,8 т.п.н. У G.lutea виявлено повтори 18S-25S рибосомної ДНК розміром приблизно 13,0; 13,7 і 14,5 т.п.н., що свідчить про внутрігеномний поліморфізм повторів за довжиною. Виходячи з того, що гетерогенність повторів 18S-25S рДНК G.lutea обумовлена відмінностями їх розмірів на дискретну величину (700-800 п.н.), можна припустити, що в даному випадку молекулярною основою виявленої гетерогенності є різниця в числі субповторів, які формують окремі ділянки НТС.

Щодо HindIII-сайта, розташованого в ділянці НТС, виявлено, що в G.acaulis він розташований на відстані ~1 т.п.н. від початку ділянки, яка кодує 18S рРНК, і розщеплюється майже у всіх повторів рибосомної ДНК. У G.asclepiadea цей сайт піддається гідролізу лише в частині повторів і розташований по відношенню до 18S рДНК так само, як і в G.acaulis. У G.punctata і G.lutea HindIII-сайт в НТС гідролізується лише у мінорній частці повторів, при цьому сайт порівняно з двома попередніми видами знаходиться ближче до кінця гена 25S рРНК.

При аналізі отриманих нами результатів з-поміж досліджуваних видів Gentiana вирізняється G.lutea. Даний вид характеризується морфологічними ознаками рослини, властивими для предкових видів тирличів. На цій підставі деякі автори вважають доцільним виділення його в межах роду в окрему секцію (Драпайло, 1995). Однак, не дивлячись на значну консервативність морфологічних ознак, найбільша довжина повтору 18S-25S рДНК наводить на думку про більш пізнє формування геному G.lutea порівняно з молодшими в еволюційному плані G.asclepiadea та G.acaulis. На те, що геном цього виду знаходиться ще у процесі формування, вказує і властива лише для G.lutea гетерогенність повторів 18S-25S рибосомної ДНК за довжиною. Найближчим до G.lutea за довжиною НТС і локалізацією в ньому HindIII-сайту є G.punctata, який подібний до цього виду також за морфологічними та анатомічними ознаками і спектром рестрикційних фрагментів ДНК.

Порівняльний аналіз рестрикційних карт генів 18S-25S рРНК тирличів та інших рослин (Gerlach, Bedbrook, 1979; Jorgensen et al., 1987) (рис.2) показав подібність локалізації сайтів пізнавання для HindIII, BamHI i EcoRI ендонуклеаз у транскрибованій частині 18S-25S рДНК. Причому більша спорідненість спостерігається з дводольними рослинами, до класу яких належать і тирличі. Така подібність зумовлена високою консервативністю кодуючих ділянок генів 18S-25S рРНК.

Рис. 2. Порівняльний аналіз локалізації сайтів впізнавання для HindIII (Н), BamHI (В) i EcoRI (Е) ендонуклеаз рестрикції в транскрибованій частині повтору 18S-25S рибосомної ДНК різних рослин. Карти рДНК пшениці, гарбуза, гороху наведені за (Jorgensen et al., 1987). * – частково метильований BamHI сайт.

Результати наших досліджень узгоджуються з літературними даними, що різні ділянки повтору 18S-25S рДНК істотно відрізняються за швидкістю молекулярної еволюції. У представників роду Gentiana, подібно до інших рослин, найбільш швидко еволюціонує НТС, з мінливістю якого пов’язана варіабельність повторів рибосомної ДНК.

Таким чином, у результататі проведених досліджень з’ясовано деякі особливості структурної організації 18S-25S рДНК у тирличів. Зокрема показано, що гени 18S-25S рРНК видів роду Gentiana характеризуються міжвидовими відмінностями за розміром повтору та локалізацією сайтів деяких рестриктаз. Встановлено, що ці відмінності зумовлені варіабельністю нетранскрибованих спейсерних ділянок, в той час як транскрибовані ділянки повторів 18S-25S рДНК різних видів виявилися подібними за розташуванням сайтів рестрикції та довжиною. Виявлено подібність видів роду Gentiana L. до інших рослин за локалізацією рестрикційних сайтів у транскрибованій ділянці 18S-25S рДНК, при цьому більша спорідненість спостерігається з дводольними рослинами, до класу яких належать і тирличі.

Мінливість 18S-25S рДНК у культурі in vitro. Щоб наблизитись до розуміння характеру геномних перебудов, які спостерігаються при культивуванні в умовах in vitro, було проведено дослідження генів 18S-25S рРНК культивованих тканин G.acaulis, G.lutea і G.punctata та їх порівняння з 18S-25S рДНК інтактних рослин видів роду Gentiana

Отримані результати свідчать про відсутність в калюсних культурах G.punctata і G.acaulis якісних змін наборів HindIII, BamHI, EcoRI i TaqI рестрикційних фрагментів 18S-25S рДНК порівняно з інтактними рослинами. Як видно з наведених на рис.3 даних, на гібридизаційних профілях калюсних культур G.punctata і G.acaulis наявні фрагменти 18S-25S рДНК, ідентичні за довжиною таким у геномах рослин вихідних видів. Поряд з цим, у геномі тривало культивованих in vitro клітин G.lutea знайдено суттєві структурні перебудови генів 18S-25S рРНК.

Рис. . Порівняльний аналіз HindIII-продуктів гідролізу 18S-25S рДНК інтакт-них рослин та калюсних культур:

А – G.acaulis;

Б – G.punctata;

В – G.lutea;

1 – інтактна рослина (листок);

2 – калюсна культура.

Стрілкою на рис. 3, 4 позначено фрагмент 18S-25S рДНК, який з’являється в калюсі G.lutea.

Так, з використанням HindIII-ендонуклеази рестрикції виявлено, що культивування in vitro приводить до появи окрім наявних в інтактної рослини G.lutea послідовностей 18S-25S рДНК, додаткового, меншого за розміром, класу повторів довжиною ~ 12 т.п.н. (рис.3 В, дор.2). Крім того, як видно з рисунка, у калюсі G.lutea мінорна частина повторів 18S-25S рДНК подібно до інтактної рослини (рис.3 В, дор.1) містить у собі додатковий HindIII-сайт рестрикції і піддається гідролізу з утворенням двох різних за довжиною фрагментів.

При дослідженні калюсних культур G.lutea, G.punctata і G.acaulis були виявлені зміни у копійності 18S-25S рДНК, зокрема зменшення кількості повторів рибосомної ДНК порівняно з геномами інтактних рослин (рис. , ). Порівняння інтенсивності гібридизаційного сигналу фрагментів 18S-25S рДНК культур in vitro різних пасажів (G.acaulis – 6 і 19 пасаж (рис.4 А, дор.3, 2 відповідно), G.lutea – 23 і 50 пасаж (рис.4 В, дор.2, 3 відповідно)) показало, що в процесі культивування кількість повторів 18S-25S рибосомної ДНК продовжує зменшуватися. Тобто спостерігається прямо пропорційна залежність між копійністю 18S-25S рДНК і кількістю пасажів.

Рис. 4. Порівняльний аналіз BamHI-продуктів гідролізу 18S-25S рДНК інтактних рослин та калюсних культур:

А – G.acaulis (1 – листок, 2 – калюс, 19-й пасаж, 3 – калюс, 6-й пасаж);

Б – G.punctata (1 – листок, 2 – калюс, 6-й пасаж);

В – G.lutea (1 – листок, 2 – калюс, 23-й пасаж, 3 – калюс, 50-й пасаж).

Аналіз отриманих результатів виявив наступні особливості геномних перебудов в культивованих клітинах. Послідовність 18S-25S рДНК характеризується міжвидовою варіабельністю за копійністю – найменшою кількістю 18S-25S рДНК характеризується вид G.acaulis. Поряд з цим, в культурах in vitro також відбувається зменшення кількості копій 18S-25S рДНК, що, очевидно, може свідчити про елімінацію частини повторів з рибосомного кластера, або про зменшення числа локусів 18S-25S рДНК в межах геному. З іншого боку, в калюсі G.lutea перебудовам піддаються саме ті ділянки геному, для яких властива міжвидова варіабельність. В той же час, консервативні серед досліджуваних видів фрагменти рДНК залишаються незмінними і в культивованих клітинах. Ці дані свідчать про невипадковий характер змін рДНК в геномах культивованих клітин видів роду Gentiana, а саме подібність до змін, які відбувалися в природі в процесі видоутворення.

Внутрівидова (міжпопуляційна, індивідуальна, сомаклональна) варіабельність 18S-25S рДНК у G.lutea. При дослідженні геномної ДНК отриманих калюсних культур лише в одного з видів, а саме G. lutea, були виявлені відмінності рДНК між інтактною рослиною та культивованими тканинами. Поряд з цим, вивчення генів 18S-25S рРНК деяких видів роду Gentiana L. показало, що дана послідовність характеризується міжвидовою варіабельністю. Серед досліджуваних видів вирізнявся G.lutea, в якого 18S-25S рДНК була представлена не одним мажорним класом послідовностей, як у решти видів, а виявлялася у складі декількох варіантів повторів, різних за довжиною.

З огляду на це, наші подальші дослідження було спрямовано на виявлення внутрівидової варіабельності 18S-25S рДНК G.lutea (співставляли геноми інтактних рослин з трьох різних географічно віддалених популяцій: пожижевської, трояської, рогнеської) та порівняння з нею змін, знайдених у культурі тканин in vitro в даного виду.

Результати гідролізу ДНК досліджуваних об’єктів HindIII-рестриктазою з подальшою гібридизацією з повним повтором 18S-25S рДНК пшениці, подані на рис.5, демонструють варіабельність повторів 18S-25S рДНК за довжиною та наявністю додаткового сайта в геномах як серед рослин різних популяцій, так і в калюсних тканин. Міжпопуляційна варіабельність 18S-25S рДНК проявляється в тому, що крім спільних фрагментів довжиною 13,0-14,5 т.п.н., що відповідають повному повтору 18S-25S рибосомної ДНК, на гібридизаційних профілях були виявлені специфічні для кожного з об’єктів фрагменти: 5,0 і 9,0 т.п.н. – для рослини пожижевської популяції (рис.5 А, дор.1), 6,5 т.п.н. – для рослини рогнеської популяції (рис.5 А, дор.2), 12,0 т.п.н. – для рослини трояської популяції (рис.5 А, дор.3). Фрагменти розміром 5,0 і 9,0 т.п.н. (рис.5 Б, дор.1) та 6,5 т.п.н. (рис.5 А, дор.2) утворюються внаслідок гідролізу додаткового HindIII сайту, розташованого в нетранскрибованому міжгенному спейсері. На HindIII гібридизаційному профілі рослини з трояської популяції (рис.5 А, дор.3) присутній фрагмент ~12,0 т.п.н., що є повним повтором 18S-25S рибосомної ДНК, який був виявлений нами лише у рослин даної популяції. Цей варіант повтору міг утворитися в результаті делеції ділянки 18S-25S рДНК розміром 1-2,5 т.п.н.

Рис. 5. Варіабельність повторів 18S-25S рДНК G.lutea в геномах інтактних рослин та калюсних культур.

Блот-гібридизація ДНК інтактних рослин та калюсних культур G.lutea, гідролізованих HindIII ендонуклеазою рестрикції, з повним повтором 18S-25S рДНК пшениці.

А – варіабельність 18S-25S рДНК серед інтактних рослин з пожижевської (1); рогнеської (2); та трояської (3) популяцій.

Б – перебудови в культурі тканин in vitro:

1 – рослина пожижевської популяції;

2 – калюс, 23-й пасаж.

Стрілками на рис. , 6 позначено подібні за довжиною фрагменти 18S-25S рДНК, які змінюються в калюсі і одночасно є варіабельними у рослин різних популяцій.

Між калюсною тканиною, яка походить від рослини з пожижевської популяції, та інтактною рослиною з тієї ж популяції G.lutea, виявляються відмінності за набором HindIII фрагментів повтору рДНК (рис.5 Б). Зокрема в калюсі виявляється клас повторів розміром 12 т.п.н. Поряд з цим, в клітинах in vitro виявляються два мінорні фрагменти довжиною 9,3 та 4,5 т.п.н., відмінні за розміром від таких в інтактній рослині.

Наведені на рис.6 результати EcoRI-гідролізу 18S-25S рДНК демонструють наявність у всіх об’єктів консервативного фрагмента розміром 3,8 т.п.н. та групи фрагментів у діапазоні 8-10,5 т.п.н. Останні є варіабельними за довжиною та копійністю у рослин з різних популяцій (рис.6 А). Поряд з цим, виявляються відмінності за наявністю та кількісним співвідношенням фрагментів цієї групи між культивованими клітинами та інтактною рослиною (рис.6 Б).

Рис. 6. Варіабельність повторів 18S-25S рДНК G.lutea: варіабельні та консервати-вні EcoRI фрагменти.

А – варіабельність 18S-25S рДНК серед інтактних рослин з пожижевської (1); рогнеської (2); та трояської (3) популяцій.

Б – перебудови в культурі тканин in vitro: рослина пожижевської популяції (1); калюс, 23-й пасаж (2) та 50-й пасаж (3).

Лабільні фрагменти 18S-25S рДНК, що спостерігаються на EcoRI (рис.6) рестрикційних профілях досліджуваних об’єктів, містять ділянку НТС. Їх сукупність характеризує наявний в конкретному геномі набір варіантів повторів, відмінних за розміром. Таким чином, в індивідуальних геномах рослин і культивованих тканин G.lutea 18S-25S рДНК представлена набором різних за довжиною повторів, відмінності між якими зумовлені варіаціями послідовності НТС. Відмінності за складом групи лабільних EcoRI фрагментів, які спостерігаються між рослинами різних популяцій, свідчать про те, що співвідношення повторів різного розміру не є стабільним показником, а може варіювати в значній мірі в межах виду.

Після визначення розмірів повних повторів 18S-25S рДНК за результатами наведеного рестрикційного аналізу, було встановлено, що в геномах рослин G.lutea з трьох популяцій в різній кількості наявні повтори розміром 13,0; 13,7 та 14,5 т.п.н. Серед досліджуваних об’єктів виділяється рослина з трояської популяції, в геномі якої на додачу до згаданих вище знайдено повтор розміром 12,0 т.п.н., і, в той же час, не виявлено повторів з додатковим HindIII-сайтом.

На основі порівняння спектрів фрагментів 18S-25S рДНК калюсних тканин G.lutea, які походять від рослин з пожижевської популяції, і рослини з тієї ж популяції встановлено відмінності, які свідчать про зміни у наборі варіантів повторів, що відбулися в культурі in vitro. З одного боку, в калюсному геномі при наявності деяких з варіантів 18S-25S рДНК, характерних для інтактної рослини, не детектуються повтори розміром 14,5 т.п.н., з іншого, – в калюсі спостерігається варіант повтору довжиною 12 т.п.н. Ще одна відмінність порівнюваних геномів виявляється у розмірі фрагментів 18S-25S рДНК, які утворюються при розщепленні додаткового HindIII-сайта, розташованого в НТС. Виявлені відмінності спостерігаються в геномах калюсних тканин 23-го та 50-го пасажів, що може свідчити про те, що ці зміни відбуваються на більш ранніх етапах культивування (до 23-го пасажу) і зберігаються у стабільній калюсній культурі. При аналізі отриманих результатів звертає на себе увагу те, що виявлений у калюсних тканинах G.lutea додатковий варіант повторів 18S-25S рибосомної ДНК (12 т.п.н.) подібний до такого в геномі рослини з іншої (трояської) популяції.

Встановлена варіабельність 18S-25S рДНК G.lutea як у культурі тканин in vitro, так і в природі (індивідуальна гетерогенність і міжпопуляційна мінливість) зумовлена перебудовами в ділянці НТС, зокрема, очевидно, кількістю субповторів, що формують окремі його ділянки.

Отримані результати свідчать, що послідовність 18S-25S рДНК в геномах представників G.lutea представлена різними варіантами повторів, відмінними за розміром, а також за наявністю додаткового HindIII-сайта в НТС, при цьому в геномі окремої рослини зазвичай спостерігається кілька з цих варіантів. Аналіз геномів рослин з різних популяцій виявив внутрівидову мінливість за кількісним співвідношенням та наявністю окремих варіантів повторів 18S-25S рДНК. При аналізі перебудов 18S-25S рДНК, знайдених в культурі тканин G.lutea, привертає увагу той факт, що повтори розміром 12 т.п.н., які відрізняють геном калюсних тканин від геному рослини вихідної популяції, наявні також в інтактних рослинах іншої (трояської) популяції. Таким чином, зміни в наборі варіантів повторів 18S-25S рДНК, які спостерігаються в калюсних тканинах, не виходять за межі внутрівидової мінливості. З цього висновку витікає ряд важливих наслідків, що мають як фундаментальне, так і прикладне значення.

По-перше, в калюсі G.lutea перебудовам піддаються ті ділянки 18S-25S рДНК, для яких властива міжвидова (рис.1) та міжпопуляційна (рис.5-6, А) варіабельність. Виявлена особливість – невипадковість геномних змін в процесі адаптації клітин до умов росту in vitro в певній мірі дає можливість прогнозувати ці зміни в культурі in vitro. По-друге, отримані дані свідчать, що послідовність 18S-25S рДНК в геномі G.lutea, незважаючи на значну внутрівидову варіабельність, обумовлену мінливістю нетранскрибованого міжгенного спейсера, є консервативною структурою. По-третє, результати проведених досліджень вказують на можливість застосування культури in vitro G.lutea, а також використаних умов культивування (зокрема низького вмісту в живильному середовищі екзогенних фітогормонів) для збереження генофонду цього цінного зникаючого виду.

Отже, виявлено такі особливості 18S-25S рДНК G.lutea: 1) індивідуальна гетерогенність – в одному геномі існує кілька варіантів повторів, відмінних за розміром, копійністю, а також наявністю додаткового HindIII-сайта; 2) міжпопуляційна варіабельність – обумовлена відмінностями 18S-25S рДНК за розміром, копійністю, а також за наявністю та розташуванням додаткового HindIII-сайта; 3) зміни в культурі in vitro – в калюсних тканинах спостерігаються зміни в наборі варіантів повторів 18S-25S рДНК порівняно з інтактною рослиною вихідної популяції; 4) порівняння перебудов 18S-25S рДНК калюсних тканин із міжпопуляційною мінливістю свідчить про їх невипадковий характер, а саме про подібність змін в природі та в культурі тканин in vitro.

Ген 5S рРНК. Гібридизація ДНК інтактних рослин і калюсних культур видів роду Gentiana L., гідролізованих BamHI рестриктазою, з геном 5S рРНК виявила в усіх об’єктах набір регулярно розташованих фрагментів у діапазоні довжин від 0,5 до 4,0 т.п.н. (рис.7).

Рис. 7. Варіабельність генів 5S рРНК в різних органах інтактних рослин та в культивованих клітинах представників роду Gentiana L.

Блот-гібридизація ДНК культивованих клітин та інтактних рослин роду Gentiana L., гідролізованих BamHI рестриктазою, з Р32dCTP-міченою 5S рДНК (пшениці):

1, 2 – листок та кореневище (відповідно) G.asclepiadea; 3 – листок G.acaulis; 4, 5 – калюс 19-го та 6-го пасажів (відповідно) G.acaulis; 6, 7 – листок та кореневище (відповідно) G.lutea; 8, 9, 10 – калюс 50-го, 30-го та 23-го пасажів (відповідно) G.lutea; 11 – калюс 13-го пасажу G.punctata; 12, 13 – листок та