Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України

Риженко Сергій Анатолійович

УДК 613.16:612:576.8.095:504.504

ГІГІЄНІЧНА ОЦІНКА АЕРОКОКІВ У МІКРОБІОЦЕНОЗАХ ОРГАНІЗМУ ЛЮДИНИ В УМОВАХ АНТРОПОГЕННОГО ЗАБРУДНЕННЯ НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА

14.02.01 – гігієна

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Дніпропетровській державній медичній академії МОЗ України

Науковий консультант: | доктор медичних наук, професор Кременчуцький Геннадій Миколайович, Дніпропетровська державна медична академія, завідувач кафедри

Офіційні опоненти: | доктор медичних наук, професор Волощенко Олег Гнатович,

Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України, завідувач лабораторії

доктор медичних наук, професор Салата Ольга В'ячеславівна, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, професор кафедри

доктор медичних наук, професор Пазиніч Володимир Михайлович, Запорізький державний медичний університет, завідувач кафедри

Провідна установа | Харківський державний медичний університет МОЗ України, кафедра загальної гігієни та екології

Захист відбудеться "25"березня 2005 року о "10.00" годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.604.01 Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України за адресою: м. Київ - 94, вул. Попудренка, 50.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України (м. Київ, вул. Попудренка, 50).

Автореферат розіслано " 23 " лютого 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Селезньов Б.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Погіршення еколого-гігієнічних умов життя людини призводить до зниження резистентності та імунологічної реактивності, що і визначає стан її здоров'я. Паралельно виявляються зміни і у мікробіоценозах (Кира Е.Ф. и соавт., 1994; Миронов А.Ю. и соавт., 2001; Ногаллер A.M. и соавт.,1984). Багатьма дослідниками установлено важливу роль нормальної мікрофлори організму у підтримці його фізіологічного стану, забезпеченні гомеостазу і життєдіяльності, що особливо набуває значення за умов проживання в антропогенно забрудненому середовищі (Бондаренко В.М. и соавт.,1998; Грачева Н.М. и соавт.,1999; Шендеров Б.А., 1998; Nyange P.M. et al., 1999).

А.А.Воробьев і Е.А. Лыкова (1999) підкреслюють, що порушення, зокрема у складі кишкової мікрофлори, настають задовго до клінічних симптомів і тому можуть служити провісниками патологічного процесу. Звідси виникає необхідність у розробці критеріїв оцінки популяцій мікробіоценозів у різних вікових, професійних і інших груп населення з урахуванням регіональних екологічних умов (Веккер И.Р. и соавт., 2001; Онищенко Г.Г., 2001; Сердюк А.М. и соавт., 1997).

Вивчення взаємодії мікробіоценозів і макроорганізму, взаємозв'язку бактеріального спектру мікрофлори і шкідливих факторів довкілля особливо актуальні сьогодні, коли на нормальну мікрофлору людини негативно впливають еколого-гігієнічні умови життя, харчування та інші зовнішні фактори (Бондаренко В.М., 2003; Бабин В.Н. и соавт.,1994), серед яких на особливу увагу заслуговують важкі метали (ВМ). Останні за своєю поширеністю, стійкістю у навколишньому середовищі і можливістю одночасної дії на організм людини з повітрям, питною водою та харчовими продуктами розглядаються як пріоритетні сполуки довкілля і потребують комплексної гігієнічної оцінки при вирішенні питань небезпеки для людини впливу антропогенних чинників та визначенні резистентності організму до їх дії (Білецька Е.М., 1999; Ревич Б.А., 1992; Трахтенберг И.М. и соавт., 1994).

Зважаючи на несприятливі еколого-гігієнічні умови життєдіяльності населення, які склалися останнім часом, відбувається пошук ефективних і доступних засобів підвищення адаптаційних можливостей організму і формування загальної підвищеної стійкості його до шкідливих факторів. Звідси зростаючий інтерес медичної громадськості до захисної ролі мікробіоценозів організму людини та засобів корекції і профілактики дисбіозу мікробіоценозів як одного із шляхів досягнення зазначеної мети (Поспелова В.В. и соавт., 1991; Селькова Е.П. и соавт., 1998; Лобзин Ю.В. и соавт.,2000; Онищенко Г.Г. и соавт., 2002).

У природних популяціях між співчленами асоціацій мікроорганізмів відбувається, як відомо, інтенсивний обмін генетичною інформацією (Danese P.N. et al., 2000; Watnіck P., Kolter R., 2000). У цьому аспекті патологічні зміни, що виявляються в мікробіоценозах, постають як наслідок порушень каскадних реакцій і інформаційних процесів. Важливу роль у цих взаєминах відіграють фізико-хімічні і біохімічні фактори і механізми (Бабин В.Н. и соавт., 1994), що реалізуються на метаболічному, регуляторному, внутрішньоклітинному і молекулярно-генетичному рівнях. Звідси важливість впливу на ці рівні ксенобіотиків, у т.ч. ВМ навколишнього середовища.

Незважаючи на встановлення регуляторної функції активних форм кисню, у т.ч. перекису водню, на міжпопуляційному рівні у мікробіоценозах (Олескин А.В. и соавт., 1998, 2000), стан цих процесів вивчено недостатньо.

Таким чином, уточнення біологічної ролі аерококів, що продукують перекис водню, їх гігієнічного значення у мікробіоценозах організму людини дозволить обґрунтувати реабілітаційне та профілактичне застосування пробіотиків, зокрема виготовлених на основі A.для осіб, що знаходяться в умовах антропогенного забруднення довкілля.

Зв’язок із науковими програмами, планами, темами. Дисертація є частиною планової наукової програми кафедри загальної гігієни Дніпропетровської державної медичної академії “Медичне обґрунтування та впровадження харчових пектинних препаратів для профілактики, адаптації та реабілітації здоров’я дітей промислового регіону” (№ держреєстрації 02V001318); частиною планової наукової програми кафедри мікробіології, вірусології та імунології Дніпропетровської державної медичної академії “Біотехнологія отримання асоційованого препарату із A.іrіdans і B.subtіllіs, які входять у склад А-бактерину і Субаліну, та дослідження його біологічних властивостей іn vіtro і іn vіvo” (№ держреєстрації 0100V003058).

Мета роботи - установити гігієнічне значення аерококів у мікробіоценозах організму людини, їх біологічну роль за умов антропогенного забруднення навколишнього середовища та дати наукове обґрунтування реабілітаційного та профілактичного застосування пробіотиків.

У відповідності до поставленої мети дослідження були спрямовані на вирішення наступних завдань:

1. Провести комплексну гігієнічну оцінку стану антропогенного забруднення довкілля та визначити реальне техногенне навантаження на мешканців індустріального міста ВМ.

2. Визначити внесок окремих об‘єктів навколишнього середовища у формування загального добового навантаження пріоритетних сполук (ВМ) на населення.

3. Здійснити біомоніторингові спостереження за вмістом ВМ у людей критичних груп, що проживають на території міст із різним ступенем забруднення.

4. Визначити кількісні та якісні показники присутності аерококів, що продукують перекис водню, у мікробіоценозах макроорганізму.

5. Визначити зв’язок змін у системі “мікробіоценози - макроорганізм” з умовами антропогенного забруднення довкілля.

6. Вивчити біологічні властивості аерококів, що продукують перекис водню, і їх зміни при взаємодії з ВМ.

7. Дослідити взаємодію аерококів із патогенною мікрофлорою, їх токсинами і ВМ у мікробіоценозах різних екологічних ніш організму людини.

8. Установити вплив аерококів на імунну систему та інші показники гомеостазу.

9. Розробити критерії оцінки ступеня дисбіозу кишечника людини на підставі кількісного визначення вмісту в ньому аерококів.

10. Обґрунтувати доцільність застосування пробіотиків, на прикладі А-бактерину, для корекції дисбіозів із урахуванням еколого-гігієнічних умов проживання населення.

Об’єкт дослідження - критеріальна значущість аерококів у мікробіоценозах макроорганізму у нормі та за умов антропогенного забруднення навколишнього середовища.

Предмет дослідження:

- забруднення довкілля;

- ВМ у навколишньому середовищі (атмосферне повітря, питна вода, харчові продукти);

- біосубстрати людини (кров, волосся, сеча);

- мікробіоценози;

- A.vіrіdans, що продукує перекис водню.

Методи досліджень: гігієнічні – для оцінки техногенного навантаження на населення ВМ; фізико-хімічні – (атомно-адсорбційна спектрофотометрія) для ідентифікації ВМ в об’єктах довкілля та біосубстратах організму людини; мікробіологічні – для визначення співчленів мікробіоценозів макроорганізму, у т.ч. A.; імунологічні – для визначення кількісної характеристики показників імунітету під впливом ВМ та A.viridans; біохімічні – для визначення характеру впливу аерококів на метаболічні реакції; математико-статистичні – для оцінки вірогідності виявлених ефектів і визначення зв’язку між станом мікробіоценозів та антропогенним забрудненням довкілля.

Наукова новизна роботи полягає у розробці теоретичних, методичних та практичних питань оцінки техногенного навантаження на населення сучасних міст на основі показників біомоніторингових спостережень за екологічно небезпечними чинниками та змін у системі “мікробіоценози-макроорганізм”.

У результаті виконання запланованих досліджень вперше в нашій країні та країнах СНД:

· дано комплексну гігієнічну оцінку стану навколишнього середовища та визначено реальне техногенне навантаження на мешканців індустріального міста ВМ на основі визначення змін у системі “мікробіоценози-макроорганізм”;

· показано високу чутливість та інформативність біомоніторингових спостережень, які засвідчили, що, незважаючи на низькі концентрації ВМ в об‘єктах довкілля, в організмі людей відбувається їх накопичення на рівнях, значно вищих за фізіологічні норми;

· одержано нові дані щодо ролі мікробіоценозів та їх співчленів у життєдіяльності організму людини у нормі та за умов антропогенного забруднення довкілля, а також взаємозв'язку мікробіоценозів різних мікроекологічних ніш організму людини;

· обґрунтовано гігієнічне значення та показано біологічну роль аерококів, що продукують перекис водню, у системах „мікробіоценози – макроорганізм” і „фактори довкілля – мікробіоценози”; висвітлено роль перекису водню як фактора стійкості мікробіоценозів до впливу ксенобіотиків;

· запропоновано новий метод оцінки у людини донозологічних змін за умов антропогенного забруднення довкілля за вмістом аерококів у мікробіоценозах, зокрема ротовій порожнині;

· установлено зв‘язок і показано пряму залежність стану мікробіоценозів ротової порожнини і кишечника людини (за вмістом у них аерококів) від ступеня антропогенного забруднення довкілля важкими металами.

Теоретична значущість роботи полягає у встановленні закономірностей формування стану мікробіоценозів організму (на прикладі аерококів ротової порожнини і кишечника) за умов антропогенного забруднення довкілля та корекції дисбіозів пробіотиками, а також визначенні характеру надходження, накопичення та елімінації антропогенних чинників у біосубстратах людини.

Практична значущість роботи полягає у:

· розробці методичних підходів до визначення небезпеки антропогенного забруднення довкілля з використанням біологічних систем – мікробіоценозів організму людини;

· рекомендації використання A.vіrіdans як індикатора забруднення водойм за умов додаткових досліджень їх властивості з високою частотою виділятися з водойм із благополучною санітарно-гігієнічною характеристикою;

· установленні змін у мікробіоценозах ротової порожнини та кишечника за умов антропогенного забруднення довкілля, що дає підставу рекомендувати лікарям включати у план обстеження хворих на екологозалежні захворювання дослідження на дисбіоз із урахуванням вмісту аерококів, а при виявленні порушень _проводити коригувальну терапію пробіотиками, у т.ч. А-бактерином;

· рекомендації застосовування на популяційному та індивідуальному рівнях пробіотиків для профілактики і корекції дисбіозів мікробіоценозів та порушень імунної системи в умовах антропогенного забруднення довкілля;

· розробці та впровадженні схеми виробництва пробіотика А-бактерину (на основі A.viridans) на Дніпропетровському фармацевтичному підприємстві;

· впровадженні у практику роботи Центральної бактеріологічної лабораторії м. Дніпропетровська, бактеріологічних лабораторій, санітарно-гігієнічних відділів Дніпропетровської обласної і міської санітарно-епідеміологічних станцій прискореного та економічного методу мікробіологічної оцінки стану мікробіоценозу кишечника за індикаторним мікроорганізмом — A.viridans.

Основні положення дисертаційної роботи використовуються у лекційних, семінарських та практичних заняттях кафедр загальної гігієни, мікробіології, вірусології та імунології Дніпропетровської медичної академії і кафедри екології Національного гірничого університету.

За результатами проведеного дослідження видано монографію “Роль микроэкологии организма человека и принципы ее коррекции”, яка використовується як учбово-методичний посібник, розроблено методичні рекомендації із виконання дипломної роботи магістра НГУ за спеціальністю “Екологія, охорона навколишнього середовища”.

Особистий внесок здобувача: самостійно провів пошук і аналіз літературних даних; сформулював мету, задачі, визначив напрямки досліджень, їх обсяги та методи; провів науковий аналіз та узагальнення результатів досліджень, наукове обґрунтування застосування пробіотика А-бактерину; організував та безпосередньо виконував дослідження, викладені у розділах дисертації; особисто провів гігієнічну оцінку вмісту ВМ у навколишньому середовищі та організмі жителів міст, в яких проводилися дослідження; визначав чутливість досліджуваних штамів мікроорганізмів до антибіотиків і пробіотиків, вплив A.vіrіdans на імунологічні реакції макроорганізму, ліпідний і білковий обмін, провів мікробіологічні дослідження та статистичну обробку матеріалу, сформулював висновки і практичні рекомендації з дисертаційної роботи. Матеріали досліджень, проведених разом із співробітниками кафедр загальної гігієни та мікробіології Дніпропетровської медичної академії, становлять не більше 15% обсягу роботи.

Апробація роботи. Наукові положення виконаного дослідження оприлюднені та обговорені на:

- міжнародних наукових конференціях: “Стратегія і тактика боротьби з інфекційними захворюваннями” - Харків, 2001; “Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования” - Москва, 2002; ІХ Міжнародній конференції “Новые информационные технологии в клинической нейрофизиологии, неврологии и хирургии” - Гурзуф, 2001; ХІ Міжнародній конференції “Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии, экологии” - Гурзуф, 2003; “Актуальні питання боротьби з інфекційними хворобами” - Харків, 2003; “Пробіотики - ХХІ сторіччя. Біологія. Медицина. Практика” - Тернопіль, 2004; ХІІ Международной конференции “Новые информационные технологии” - Гурзуф, 2004;

- науково-практичних конференціях: “До 100-річчя санепідслужби Дніпропетровської області” - Дніпропетровськ, 2001; “Розвиток санітарної мікробіології в Україні” - Чернівці, 2002; “Україна наукова” - Київ, 2002;

- XIV з’їзді гігієністів України - Дніпропетровськ, 2004.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 36 друкованих праць (три монографії – з яких 1 одноосібна), 24 статті у фахових наукових журналах (5 одноосібних), 9 публікацій у збірниках наукових праць і тез конференцій), отримано 1 деклараційний патент.

Структура і об’єм дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, 7 розділів власних досліджень, обговорення результатів дослідження, висновків та списку використаних джерел.

Робота викладена на 353 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 89 рисунками та 90 таблицями. Бібліографія містить 406 літературних джерел (з яких 241 джерел із країн СНД та 165 - зарубіжних).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали, методи та обсяги досліджень

Відповідно до мети і задач дослідження проводилися за розробленою програмою у 4 етапи.

Перший етап – гігієнічна оцінка вмісту ВМ у навколишньому середовищі і біосубстратах організму жителів міст із різним рівнем техногенного навантаження цими сполуками.

Другий етап _дослідження змін мікробного пейзажу різних мікробіоценозів організму людини під впливом антропогенного забруднення довкілля, індикаторним показником якого були ВМ, ідентифікація і вивчення біологічних властивостей виділених A.іrіdans.

Третій етап _вивчення впливу аерококів на показники гомеостазу і тканини макроорганізму, перебіг інфекційного процесу і стан мікробіоценозів, установлення механізмів взаємовідношення і взаємодії аерококів з умовнопатогенною і патогенною мікрофлорою, їхніми токсинами і ксенобіотиками.

Четвертий етап _визначення біологічних властивостей аерококів при взаємодії з біотичними та абіотичними факторами навколишнього середовища.

Санітарно-гігієнічні дослідження були спрямовані на вивчення вмісту в об‘єктах довкілля ВМ – свинцю, кадмію, нікелю, марганцю, хрому, цинку і міді. В атмосферному повітрі обсяг досліджених проб склав 7167, у воді - 1189 проб, у харчових продуктах - 4039 проб.

Досліджено матеріал від 1435 людей: вміст мікробіоценозу ротової порожнини, кишечника, піхви, цервікального каналу і шкіри промежини; паличкоядерні лейкоцити, ферменти, ліпіди, білки і мононуклеари крові. У 990 тварин (безпородні і лінійні миші, кролі) досліджено мікробний пейзаж вмісту кишечника, обсіменіння внутрішніх органів, 220 гістологічних препаратів шлунково-кишкового тракту, клітини периферичної крові. Вивчено морфологічні і біохімічні властивості 162 штамів умовнопатогенних і патогенних мікроорганізмів і 32 штами A.vіrіdans.

Об'єктами і матеріалами дослідження у роботі були: 32 штами A.іrіdans (референтний № , виділені з ротової порожнини № № , 205 і 29 резидентних культур з різних мікробіоценозів організму людини); тест-мікроби патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів; токсин стафілококів і ендотоксин сальмонел; вміст нестерильних порожнин організму людини і тварин; змиви зі шкіри; ультратонкі зрізи випробуваних мікроорганізмів, тканин і органів тварин; клітини і сироватка крові людини і тварин; безпородні білі миші, миші лінії СВА і кролі; хімічно чистий перекис водню (0,001% розчин).

Дослідження із залученням добровольців проводили відповідно до Декларації Всесвітньої медичної асоціації 1964 р. зі змінами від 1975, 1983 і 1989 рр. із дотриманням усіх вимог біоетики. Роботу з лабораторними тваринами проводили згідно з “Руководством по содержанию лабораторных животных в питомниках и экспериментально-биологических клиниках (вивариях)” (1993).

Виділення чистих культур мікроорганізмів та ідентифікацію їх щодо виду і роду проводили за допомогою загальноприйнятих культуральних, біохімічних і серологічних тестів (Меньшиков В.В., 1987; Приказ МЗ СССР № , 1985).

Стан кишкового біоценозу хворих на дисбактеріоз кишечника визначали за методикою Р.В.Епштейн-Литвака і Ф.Л. Вильшанськой (1977). Аерококи виділяли за методом М.Л. Горбуновой (1970) на елективному середовищі (Кременчуцький Г.Н., 1989), ідентифікацію культур аерококів проводили згідно з J.B. Evans (1986).

Чутливість тест-мікроорганізмів до A. vіrіdans і пробіотиків визначали методом відстроченого антагонізму. Вивчення чутливості до антибіотиків мікроорганізмів проводили за методом дифузії в агар із використанням дисків (Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков. Утв. МЗ СССР № , 1983).

Мутагенну обробку аерококів за допомогою етілениміну і нітрозометилсечовини виконували за методом, запропонованим Г.Н.Кременчуцким (1989), адгезивні властивості їх у різних мікробіоценозах організму людини і тварин - розгорнутим пробірним методом (Брилис В.И. и соавт., 1986).

Оцінку стану системи імунітету проводили за кількістю Т- і В-лімфоцитів, а також субпопуляцій Т- лімфоцитів у периферичній крові (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 1990).

Для виявлення у кишечнику штучно введених аерококів використовували метод непрямої імунної флюоресценції за Кунсом (модифікація Барышникова А.Ю., 1997) з переглядом у люмінесцентному мікроскопі марки МЛ-3 мазків-відбитків і зрізів. Кількість аерококів у перерахуванні на 1 мм2 слизової оболонки розраховували за формулою Виноградова-Брида.

Фагоцитарну функцію поліморфно-ядерних лейкоцитів (ПЯЛ) вивчали за методом В.М. Бермана і Е.М. Славськой (1958).

Функціональний стан перитоніальних макрофагів визначали за їх фагоцитарною активністю (ФА), фагоцитарним числом (ФЧ) та показником завершеності фагоцитозу (ПЗФ), бактерицидні властивості - за допомогою тесту з нітросинім тетразолієм (НСТ-тест) за методикою К.А. Войткевич (1977) і Б.С. Нагоева (1983)

Вплив аерококів на імуногенез досліджували за допомогою реакції непрямої гемаглютинації за Бойденом (Бюргер М.О., 1982), вплив A.vіrіdans на систему комплементу сироватки крові - шляхом дослідження рівня активності системи комплементу по 50% гемолізу за методикою Е.В.Гембицкого (1987).

Вплив A.vіrіdans на летальні властивості токсину стафілокока, вірулентні властивості S.typhіmurіum, антитоксичний ефект A.vіrіdans і перебіг експериментальної сальмонельозної інфекції оцінювали за числом тварин, що вижили у досліді, у порівнянні з контрольною групою.

Вміст молочної кислоти визначали за методом Баркера - Саммерсона (1941), ступінь окиснення молочної кислоти аерококами – за показниками поглинання кисню (О2) за 1 хв. на 1 мг білка і відновлення 2,6-дихлорфеноліндофенолу. Поглинання кисню при окисненні ферментним комплексом молочної кислоти визначали за допомогою платинового електрода закритого типу. Реєстрацію споживання кисню проводили на полярографі Р-7 (Чехія).

Кількісне визначення рівня загальних ліпідів, ліпідних фракцій і їхнього співвідношення, ліпопротеїдів у сироватці крові проводили відповідно до рекомендацій Г.В. Тананова (1983) і В.В. Меньшикова (1987). Перекис водню визначали йодометричним методом, білок - біуретовою реакцією і реакцією зв'язування білка з барвником - кумасі синім (Р.Скоупс, 1985).

Активність трансаміназ АлАТ, АсАТ і лактатдегідрогенази (ЛДГ) визначали за допомогою наборів Біо-Ла-Тест чеської фірми “Лахема”, ізоферменти ЛДГ- кількісним електрофоретичним методом (Юрков Ю.А., Алатырцев В.В., 1966), каталазну активність (каталазне число) - за методом А.Н. Баха і С.Р. Зубковой (1937).

Стан хворих на сальмонельоз у процесі застосування A.vіrіdans оцінювали у динаміці за рівнем лейкоцитарного індексу інтоксикації (ЛІІ) і гематологічного показника інтоксикації (ГПІ) (Васильев B.C., Комар В.И., 1983; Сухоруков В.П., Захарищева Т.П., 1982). Ультратонкі зрізи готували на улътрамікротомі фірми ЛКВ за методом Г. Гайера (1974), Б. Уикли (1975) і C.F.Cullіng et al. (1973). Дослідження проводили за методом E.S. Reunolds (1963) на електронному мікроскопі ЕМВ-100БР із збільшенням у 5000-50000.

Матеріали досліджень обробляли із використанням методів варіаційної статистики (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1973; Лапач С.Н. и соавт., 2000; Гланц С., 1998) з розрахунком відносних показників і середніх рівнів (M), дисперсії (2), середнього квадратичного відхилення (), помилки середніх і відносних величин (m).

Вірогідність розходжень середніх значень показників і відповідних дисперсій оцінювали за параметричними критеріями Фішера (F) і Стьюдента (t) і непараметричними Вілкоксона-Манна-Уїтні (U); при порівнянні частотних характеристик використовували критерій Пірсона 2, для множинного порівняння декількох груп спостереження - методи одно - і двофакторного дисперсійного аналізу з оцінкою сили впливу (2) окремих регульованих факторів на результативну ознаку, непараметричні критерії Крускала-Уолліса і Фрідмана. Для оцінки зв'язків між різними факторами застосовували методи кореляційного аналізу з розрахунком коефіцієнтів рангової кореляції Спірмена і лінійної кореляції Пірсона (r).

Обробку результатів дослідження проводили за допомогою статистичного пакета “Біостат” (Практика, 1998) і редактора електронних таблиць Microsoft Excel-2000 для ПК.

Гігієнічна характеристика вмісту важких металів в об'єктах навколишнього середовища промислового та непромислового міст Дніпропетровської області. Узагальнено результати досліджень ВМ у повітрі житлової зони трьох промислово забруднених адміністративних районів м. Дніпропетровська (Ленінський, Індустріальний, Жовтневий) і менш забрудненого міста порівняння -  Новомосковська.

Рис. . Порівняльна характеристика середньодобового вмісту важких металів в атмосферному повітрі міст спостереження

Як видно із рис. 1, у приземному шарі атмосфери сельбищної зони м. Дніпропетровська середньодобової концентрації ВМ (свинець, кадмій, марганець, хром, нікель та мідь) у більшості випадків не перевищують відповідних ГДК, однак максимальні величини для свинцю і міді вищі за гігієнічні нормативи у 1,1 і 9,2 рази відповідно. Комплексна гігієнічна оцінка свідчить про те, що середньомісячні концентрації цих ВМ у повітряному середовищі міста значно коливаються, але середньорічні величини досить стабільні і практично не перевищують ГДК, хоча значно вищі за фонові (за винятком міді, вміст якої постійно вище допустимого). В окремі роки мало місце перевищення вмісту свинцю і кадмію в 1,5_,7 рази. Вміст усіх ідентифікованих ВМ в атмосферному повітрі міста порівняння (м. Новомосковськ) значно і статистично достовірно (p<0.01) нижчий, ніж у м. Дніпропетровську, а за величиною коефіцієнта комбінованого впливу ВМ на населення у 13,2 рази нижчий, ніж у промисловому місті (відповідно 0,068 та 0,9 ум. од.).

Аналіз вмісту ВМ у водопровідній воді проведено на підставі даних систематичного санітарного контролю питної води м. Дніпропетровська і м. Новомосковська за 1998-2003 рр. Оцінювали концентрації свинцю, кадмію, марганцю, хрому, нікелю і міді за середньомісячними і середньорічними їх значеннями за 1998-2003 рр.

Рис. . Порівняльна характеристика середньорічного вмісту важких металів у питній воді міст спостереження

Як видно із рис. 2, у питній воді м. Дніпропетровська і міста порівняння Новомосковська визначаються свинець, кадмій, марганець, хром, нікель, мідь, середньорічні концентрації яких у цілому не перевищують відповідних ГДК і не мають істотних і достовірних розбіжностей між собою.

Результати комплексних гігієнічних досліджень вмісту пріоритетних металів-ксенобіотиків – свинцю і кадмію, а також облігатних металів-мікроелементів - міді і цинку в основних групах харчової сировини та харчових продуктів у м. Дніпропетровську та м. Новомосковську свідчать, що Pb, Cd, Cu і Zn визначаються в усіх основних продуктах як рослинного, так і тваринного походження. Їх концентрації за середніми величинами коливаються від 0,004 до 8,5 мг/кг. У цілому ці значення для переважної більшості груп продуктів не перевищують існуючих граничних рівнів.

Порівняльний аналіз вмісту ВМ у продуктах і сировині місцевого походження у промисловому місті стосовно контрольного представлено на рис. 3 та 4.

Рис. 3. Вміст свинцю в основних групах продуктів харчування досліджуваних міст

- м. Дніпропетровськ

- м. Новомосковськ (місто порівняння)

Рис.4. Вміст кадмію в основних групах продуктів харчування досліджуваних міст

- м. Дніпропетровськ

- м. Новомосковськ (місто порівняння)

Результати, як видно із наведених даних, статистично достовірно відрізняються у містах спостереження (p<0,05). Так, вміст свинцю у рибі, рослинних продуктах і харчових жирах у м. Дніпропетровську відповідно вище у середньому на 17; 83,3; 114 мкг/кг, ніж у м. Новомосковську. Середні концентрації кадмію у таких продуктах як м'ясо, овочі і фрукти перевищують аналогічні у контрольному місті на 37,5 і 7,5 мкг/кг, а у рибі, навпаки, нижчі на 100 мкг/кг. Що стосується мікроелементів, то в обох містах розходження середніх величин за вмістом цинку були незначними, а за вмістом міді – по м. Новомосковську вони у 1,3-1,8 рази перевищували відповідні дані по м. Дніпропетровську.

Результати розрахунку сумарного добового надходження (СДН) ВМ при комплексному надходженні з їжею, водою і повітрям в організм жителів промислових міст Дніпропетровської області показали, що цей показник формується як токсикантами, так і есенційними металами. Отримані дані СДН металів оцінювалися для Pb, Cd, Cu і Zn і зіставлялися з допустимою величиною ФАО/ВООЗ щодо харчових добавок (1994) і фізіологічною потребою у мікроелементах.

Визначено, що СДН Pb у Дніпропетровську становить у середньому 0,23 мг (при максимальному 0,72 мг), що майже відповідає допустимому - 0,26 мг (ФАО/ВООЗ) і такому, яке спостерігається в інших регіонах України, Росії і Польщі (0,18-0,29 мг). Питома вага харчового шляху надходження Pb у порівнянні з водним і аерогенним переважає і становить 95,6%.

Кадмій надходить в організм жителів м. Дніпропетровська в середньому у кількості 26,9 мкг на добу, але виявлені максимальні рівні (до 248 мкг) за відносним значенням перевищують ДДН (70 мкг) більш ніж у 3 рази. Основним шляхом надходження цього металу, як і свинцю, є харчові продукти - 97,4% від СДН.

Таким чином, комплексне надходження ВМ в організм населення досліджуваних міст із повітрям, водою і їжею формується як абіотичними, так і життєво необхідними металами. Головною особливістю є систематичність надходження пріоритетних контамінантів навколишнього середовища - Pb і Cd у сполученні з недостатністю надходження есенційних мікроелементів – міді та особливо цинку, кількість якого у 2,5-5 разів нижче від фізіологічної потреби і у 4 рази менше, ніж у мешканців міста порівняння.

Біомоніторинг ВМ (Pb, Cd, Mn, Cr, Cu, Zn) в інформативних біосубстратах вагітних жінок (129 осіб), які постійно проживають у досліджуваних містах Дніпропетровської області, показав, що ці сполуки визначалися у всіх обстежених як у крові, так і в сечі.

На рис. видно, що вміст свинцю у крові вагітних жінок промислового міста за середніми значеннями складає 0,5 мкг/мл, міста порівняння – 0,18 мкг/мл. Кадмій у крові жінок промислового і непромислового міст визначається у середньому на рівнях 0,098 і 0,028 мкг/мл відповідно, що незначно перевищує фізіологічні величини (0,02-0,3 мкг/мл). Що стосується марганцю і хрому, то їх середня концентрація у крові вагітних обох міст знаходиться у межах норми, але у жінок промислового міста в 1,6-2,1 рази вища.

Рис. . Порівняльна характеристика середніх концентрацій вмісту важких металів у крові вагітних жінок міст спостереження

Рис. . Порівняльна характеристика середніх концентрацій вмісту важких металів у сечі вагітних жінок міст спостереження

Як свідчать дані рис. , у сечі обстежених вагітних жінок промислового міста свинець і кадмій знаходяться у концентраціях, значно вищих за фізіологічну норму і аналогічні дані по місту порівняння. Що стосується хрому, то у жінок досліджуваних міст виявлено рівноцінно підвищений його вміст у порівнянні з нормою.

В організмі дошкільників промислового міста виявлені Pb і Cd, кількість яких у 1,5-4 рази вище нормативів і аналогічних показників контрольного міста, що аргументує їхнє техногенне походження. Цинк, мідь і залізо в сечі й волоссі значно нижче норми, це пов'язано з недостатністю їх у їжі, а також може бути пояснено біологічним антагонізмом з Pb і Cd.

Таким чином, незважаючи на низькі концентрації ВМ у життєзабезпечуючих середовищах - воді, повітрі, продуктах харчування, їх постійне надходження в організм формує, через здатність до кумуляції, значне внутрішнє забруднення організму такими пріоритетними ксенобіотиками як свинець і кадмій і одночасно супроводжується розвитком порушень мікроелементного обміну – цинкдефіцитних станів. У вагітних подібний несприятливий збіг обставин, з огляду на тропність Pb і Cd до генеративної сфери і значущість Zn для нормального перебігу вагітності, може потенціювати розвиток ускладнень репродуктивної функції.

Підвищений вміст ВМ у навколишньому середовищі і організмі людини призводить до змін показників гомеостазу, і у першу чергу зниження імунітету і резистентності організму. Загальновідома роль нормальної мікрофлори у підтримці гомеостазу макроорганізму, виконанні функції захисного бар'єра щодо патогенів, у т.ч. шкідливих факторів навколишнього середовища.

Особливої уваги заслуговують мікроорганізми, що продукують перекис водню і мають свої особливості при взаємодії із ксенобіотиками. Одним із видів аерококів, що продукують Н2О2, є A.vіrіdans, який і став об'єктом наступних досліджень у системах "мікробіоценоз - макроорганізм" і " фактори навколишнього середовища – мікробіоценоз".

Біологічні властивості аерококів у мікробіоценозах людини і тварин. Оцінка якісного і кількісного складу мікрофлори ротової порожнини проводилася у 135 клінічно здорових осіб у віці 19-45 років. У ротовій рідині обстежених більш ніж у 70% випадків виявлено мікроорганізми роду Streptococcus, Staphylococcus, Corіnebacterіum, Lactobacіllus і Aerococcus. При цьому частота виявлення і концентрації у ротовій рідині стрептококів і стафілококів були достовірно (p<0,01) вищими, ніж інших мікроорганізмів. Установлено також достовірно високі (p<0,05) концентрації A.vіrіdans (3,2±0,1 lg КУО/мл) у порівнянні із вмістом S.sanguіs (2,8±0,2 lg КУО/мл).

Із виділених із ротової рідини штамів аерококів методом випадкової вибірки відібрано культури A.vіrіdans під номерами 11 і 205 для досліджень. Результати вивчення антагоністичних властивостей цих штамів виявили чутливість до них патогенних і умовно патогенних тест-мікробів. Особливо чутливими за діаметром пригнічення росту виявилися тест-культури S.aureus № (22,4 і 21,2 мм) і S.epіdermіdіs (20,7 і 18,9 мм).

Ступінь чутливості випробуваних мікроорганізмів розрізнявся як між видами, так і усередині одного виду, і ймовірно пов'язаний із ступенем активності антиоксидантних ферментів мікроорганізмів.

На рис. представлено результати оцінки стану мікробіоценозу у дітей віком 3-6 років трьох груп – дослідної (відвідують дитячі установи), контрольної (не організовані діти) м. Дніпропетровська та дослідної міста порівняння. Як видно з цих матеріалів, у дітей дослідної і контрольної груп, що проживають в екологічно забрудненому місті, вміст A.vіrіdans у ротовій рідині не мав достовірних відмінностей (р>0,05), тоді як у дітей екологічно чистого міста цей показник був на 1,6±0,3 lg КУО/мл вищим (р<0,05).

Рис. 7. Порівняльна характеристика вмісту індикаторного мікроорганізму A.viridans у ротовій рідині дітей, що мешкають у різних екологічних умовах

Отримані результати дослідження дозволяють продовжити подальше вивчення індикаторних аерококів, які вказують на наявність впливу шкідливих факторів навколишнього середовища і відбивають стан імунного гомеостазу і реактивності організму дитини та дають можливість прогнозу переднозологічних порушень у здоров'ї.

Що стосується механізмів дії, то дослідним шляхом було установлено виражену здатність культур A.vіrіdans № і № окиснювати D і L ізомери лактату за різних концентрацій, сприяючи їх розщепленню до кінцевих метаболітів. При цьому ступінь окиснення істотно (p<0,001) залежав від концентрації лактату, що підтвердилось результатами однофакторного дисперсійного аналізу.

В експерименті на мишах було виявлено що аерококи, які продукують перекис водню, є в усіх відділах травного тракту тварин. У найбільшій кількості вони визначалися у товстому кишечнику: 7,57±0,6 lg КУО/г у вмісті кишечника і 6,43±0,8 lg КУО/г - у гомогенаті. Частота їх виявлення склала відповідно 75,0% і 76,9% випадків.

Таким чином, отримані результати підтверджують дані щодо високого вмісту аерококів у мікробіоценозі кишечника і наявності у них здатності до антагоністичної дії у відношенні патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів.

Проведено вивчення стану мікробіоценозу кишечнику та показників неспецифічної резистентності у 368 чоловік (табл.1).

Таблиця 1

Рівень неспецифічної резистентності здорових і хворих людей
до кишкових інфекцій

Обстежені

групи людей | Кількість

спостережень | Показники фагоцитозу (М±m)

ФА

(%) | ФЧ

(абс. число) | ПЗФ

(%)

Хворі на гострі кишкові інфекції

(1-ша група) | 100 | 21,2±1,5

p2 p3 p4 | 1,1±0,2

p2 p3 p4 | 38,2±8,4

Хворі з декомпен-сованим дисбіозом

(2-ша група) | 30 | 14,0±3,1

p1 p3 p4 | 2,3±0,24

p1 p4 | 32,9±4,8

p4

Клінічно здорові люди з компенсова-ним дисбіозом

(3-тя група) | 126 | 47,0±3,6

p1 p2 p4 | 2,3±0,11

p1 p4 | 39,7±2,1

Здорові люди

(4-та група) | 112 | 58,0±2,3

p1 p2 p3 | 4,9±0,7

p1 p2 p3 | 62,7±13,7

p2

Залежність фагоцитарної функції від стану кишкового мікробіоценозу (показники дисперсійного аналізу) | F=42,7; p<0,001

2= 0,27 | F=14,4; p<0,001

2= 0,11 | F=1,8;

p>0,05

2= 0,01

Примітка: p1, p2, p3, p4 <0,05 між показниками у відповідних групах.

Отримані результати підтверджують залежність показників фагоцитарної функції від стану мікробіоценозу кишечника: для фагоцитарної активності (ФА) сила впливу 2=0,27, для фагоцитарного числа (ФЧ) - 2=0,11.

Отже, очевидно, що високий рівень вмісту аерококів у фекаліях (106-108 КУО/г випорожнень) свідчить про нормобіоз і досить високий рівень резистентності організму. Це дозволяє запропонувати новий підхід до оцінки дисбіозу кишечника з використанням індикаторного мікроорганізму - A.vіrіdans (табл.2).

Запропонований метод у порівнянні з існуючими є більш результативним, простим у виконанні, доступним практично для всіх мікробіологічних лабораторій, та економічним, оскільки не вимагає складних і дорогих живильних середовищ.

При дослідженні адгезивних властивостей двох штамів A.vіrіdans (№ і № ) на культурі епітеліоцитів тонкого і товстого кишечника білих мишей і кролів методом електронної мікроскопії було показано, що у

Таблиця 2

Оцінка дисбіозу кишечника за рівнями вмісту A.vіrіdans
як індикаторного співчлена мікробіоценозу

Стан біоценозу кишечника | Концентрація аерококів
у КУО/г випорожнень

Нормобіоз | 106 - 108

Компенсований дисбіоз (1-й ступінь) | 104 – 105

Декомпенсований дисбіоз
(2-3-й ступені) | < 104 чи 0

результаті взаємодії аерококів (жива добова культура) з ізольованими епітеліоцитами кроля і білих мишей аерококи виявляють виражені адгезивні властивості, легко прикріплюються до епітеліоцитів, адгезуються на різних фрагментах зруйнованих клітин, розмножуються і утворюють мікроколонії.

Установлено, що аерококи, введені перорально, здатні адгезуватися і колонізувати слизову оболонку кишечника, де провідна роль належить рецепторним взаємодіям мікроба і клітин хазяїна. Кореляційний аналіз між перекис-продукуючою активністю і ступенем адгезії аерококів у одного музейного штаму і 29 резидентних штамів аерококів, виділених з родових шляхів вагітних і породіль, показав зворотний кореляційний зв'язок у досліджуваних клітин (коефіцієнт кореляції r= -0,46; р<0,001).

Проведеними дослідженнями встановлено, що A.vіrіdans, які продукують перекис водню, у мікробіоценозах організму людини виявляються у порівняно великих кількостях (105 -108 КУО/мл). Відзначено виражену антагоністичну активність A.vіrіdans у відношенні патогенних і умовно-патогенних тест-мікробів і їх лактатоксидної активності. Підтверджено залежність реактивності організму від стану кишкового мікробіоценозу і виявлено закономірне зниження рівня A.vіrіdans у фекаліях при дисбіотичних явищах, на підставі чого пропонується новий підхід до діагностики дисбіозу кишечника з використанням індикаторного мікроорганізму - A.vіrіdans.

Вивчення адгезивних властивостей показало, що аерококи, виділені з різних екологічних ніш організму людини, характеризуються переважно середнім і високим ступенем адгезії, а провідна роль належить рецепторним взаємодіям мікроба і клітин хазяїна. Статистично підтверджено зворотний кореляційний зв'язок у досліджуваних аерококів (коефіцієнт кореляції r=-0,46; р<0,001) між перекис-продукуючою активністю і ступенем адгезії.

Вплив A.vіrіdans на мікроорганізми і їхні токсини. Дослідження впливу аерококів на кількість стафілококів у носоглотці підтвердили, що іn vіvo аерококи виявляють досить виражений антагоністичний вплив на стафілококи. Вивчення антагоністичної дії A.vіrіdans (штам № ) на S.aureus при багаторазових контактах в умовах спільного культивування в рідких живильних середовищах дозволило констатувати, що з кожним наступним пересіванням кількість стафілококів, що вижили в культуральній рідині у присутності А.vіrіdans, зменшувалася (рис.8).

Рис. . Динаміка (логарифмічна шкала) зниження кількості стафілококів (штам № ) при багаторазових контактах (послідовні генерації) з A.vіrіdans № 

Значущої зміни динаміки кількості в МПБ стафілококів, вирощених у відсутності аерококів, не установлено. Підвищення при цьому питомої ваги штамів S.aureus, що не продукують плазмокоагулазу, зі збільшенням числа контактів з А.vіrіdans указує на зміну біологічних властивостей стафілокока. У всякому разі, навіть з урахуванням тільки одного критерію патогенності стафілококів - продукції плазмокоагулази - варто зазначити, що аерококи деякою мірою сприяють нейтралізації цієї фенотипової ознаки і, відповідно, знижують прояв патогенності стафілококової популяції.

На підставі результатів попереднього досліду можна припустити, що у відповідь на вплив перекису водню у аерококів активізується один з основних механізмів антиоксидантного захисту стафілококів - продукція ферменту каталази. Це було підтверджено у наших подальших дослідженнях - у культурах стафілококів при спільному культивуванні з аерококами знижувалась каталазна активність із кожною наступною генерацією. Ця закономірність характерна для обох досліджуваних штамів S.aureus (№ і № ). При статистичній обробці даних вірогідність розходжень значень каталазної активності S.aureus між дослідом і контролем підтвердилася після шостої генерації (p<0,001).

У наступній серії дослідів вивчали вплив аерококів на токсиноутворюючу здатність стафілококів і прояв факторів їх вірулентності. Здатність до токсиноутворення, силу токсину і фактори вірулентності визначали за наявністю і проявом лейкотоксичної, летальної, некротичної і гемолітичної активності.

Було показано, що A.vіrіdans № , які продукують Н2О2, проявляють не тільки бактеріостатичну і бактерицидну дію на стафілокок, але і змінюють його властивості аж до втрати вірулентності. Висловлено припущення, що аерококи у момент формування клітиною стафілококу токсину порушують синтез чи перешкоджають утворенню його фракції.

Проведено вивчення впливу штучно введених A.vіrіdans № на мікробіоценоз кишечника в експерименті на звичайних і лінійних білих мишах. Як тест-мікроб використано Еscherіchіa colі - представника нормальної мікрофлори, що міститься у відносно постійній кількості у кишечнику білих мишей. Установлено, що кількість ешерихій як за сумою, так і за окремими різновидами, знижується зі збільшенням кількості днів спостереження. Достовірне зниження (2=86,4; р<0,001) відбулося для Lac+ варіантів у залежності від серії дослідження на 7,7% і 9,8%, для Lac- - відповідно на 14,9% і 9,5% (рис. 9).

Рис. 9. Динаміка кількості ешерихій (lg КУО/г випорожнень) у серії експериментів у звичайних білих мишей

Lac+ - lg кількості лактозопозитивних ешерихій

Lac- - lg кількості лактозонегативних ешерихій

Звертає на себе увагу та обставина, що зниження загальної кількості кишкових паличок в обох серіях досліджень відбувається в основному за рахунок Lac+ варіантів (р<0,01).

Виявлено прямі кореляційні зв'язки середнього ступеня виразності (p<0,05) між кількістю аерококів, що