КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Філінська Олена Мечиславівна

УДК 577.352.2+577.152.315

БІОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ МЕМБРАНОТРОПНОЇ АКТИВНОСТІ

ГЕТЕРОПОЛІЯДЕРНИХ СПОЛУК

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі цитофізіології НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Рибальченко Володимир Корнійович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

завідувач відділу цитофізіології НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Хижняк Світлана Володимирівна,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

провідний науковий співробітник лабораторії фізико-хімічної біології біологічного факультету

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Могилевич Сергій Євгенович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач відділу медико-біологічних досліджень

Провідна установа: Чернівецький національний університет

імені Юрія Федьковича МОН України, м. Чернівці

Захист відбудеться „14” червня 2006 року о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, проспект академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий „11” травня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останнім часом хімія комплексних сполук переживає період інтенсивного розвитку: синтез, дослідження взаємозалежності їх складу, будови, фізико-хімічних і біологічних властивостей та методи їх практичного застосування. Гетерополіядерні комплексні сполуки – комплекси, в молекулі яких міститься декілька атомів металів, які з’єднані з лігандами координаційними зв’язками. У досліджуваних нами гетерополіядерних сполуках центральними атомами металів виступають Cu (II) і Co (III), що оточені лігандом – діетаноламіном [Маханькова, 2002; Kokozay, Vassilyeva, 2002].

Чисельні природні лікарські препарати містять комплекси металів як фармакологічно активні компоненти. Наприклад, вітамін B12 містить координаційно зв’язаний іон кобальту [Kobayashi, Shimizu, 1999], молекула інсуліну – цинк [Леменовский, 1997], цисплатин – платину тощо [Zhang, Lippard, 2003]. Комплексні сполуки також займають важливе місце в розробці лікарських і діагностичних засобів. Встановлена здатність комплексних сполук проявляти функції біокаталізаторів та антиканцерогенні властивості [Thompson, Orvig, 2003]. Гетерополіядерні сполуки Cu (II) та Co (III) з діетаноламіном характеризуються антиканцерогенною, антифітовірусною, бактерицидною, фунгіцидною активностями та проявляють каталітичну активність в реакції розкладу пероксиду водню [Харіна та ін., 2003; Маханькова, 2002].

Плазматична мембрана (ПМ) є найпершою ланкою в сприйнятті клітиною всіх зовнішніх сигналів, їх проведенні і трансформації у клітинну відповідь. Тому при вивченні клітинних і молекулярних механізмів дії речовин різної природи значна увага приділяється саме особливостям їх взаємодії з плазматичною мембраною [Рибальченко та ін., 1990-2002; Островська, 2005; Lodish, 2000]. Одним з найбільш чутливих показників впливу біологічно активних речовин ендогенного і екзогенного походження на стан ПМ клітини є зміна активності мембранозв’язаних ферментів. В той же час, відомо, що афінність мембранозв`язаних АТФаз до хімічних агентів, до яких відносяться також гетерополіядерні комплексні сполуки, визначається тісними структурно-функціональними зв`язками між АТФазами та ліпідами плазматичної мембрани [Рыбальченко, Островская, 1998; Filomatori, Rega, 2003]. Все це свідчить, що ефекти гетерополіядерних сполук можуть бути опосередковані як через безпосередній зв’язок з молекулами мембранних АТФаз, так і шляхом модифікації ліпідного матриксу мембрани. Це і послужило нам підставою для вивчення біохімічних механізмів ефектів гетерополіядерних комплексних сполук як на мембранах різного ступеня організації – моно- та бімолекулярних ліпідних мембранах, фракціях ПМ гепатоцитів, так і на органному рівні – процесах жовчовиділення в печінці.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках науково-дослідної теми “Синтез та дослідження гетерометальних комплексів, що виявляють протипухлинну дію” (№ державної реєстрації 0102U000412) Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є вивчення біохімічних і фізико-хімічних властивостей гетерополіядерних сполук Cu (II) та Co (III) з діетаноламіном, дослідження їх ефектів на різних рівнях організації живого: молекулярному, мембранному, органному.

У відповідності до мети дослідження були поставлені такі задачі:

1. Дослідити взаємодію гетерополіядерних комплексних сполук з штучними мономолекулярними ліпідними мембранами.

2. З’ясувати характер впливу гетерополіядерних комплексних сполук та їх складових на бімолекулярні ліпідні мембрани.

3. Дослідити вплив гетерополіядерних комплексних сполук на екто-АТФазну, Мg2+,Са2+-АТФазну, Nа+,K+-АТФазну активності плазматичних мембран гепатоцитів щурів.

4. Дослідити жовчосекреторну функцію печінки in situ у щурів за умов впливу гетерополіядерних комплексних сполук.

Об’єкт дослідження. Біохімічні механізми реалізації ефектів гетерополіядерних комплексних сполук Cu (II) та Co (III) з діетаноламіном на молекулярному, мембранному і клітинно-органному рівнях.

Предмет дослідження. Мембранотропні ефекти гетерополіядерних комплексних сполук Cu (II) та Co (III) з діетаноламіном, зміни АТФазних активностей плазматичних мембран та жовчосекреторної функції печінки під впливом цих сполук.

Методи дослідження. У роботі використані методи дослідження поверхневої та мембранотропної активності гетерополіядерних комплексних сполук за зміною двовимірного тиску та граничного стрибка потенціалу ліпідних моношарів, визначення електричної провідності та ємності бімолекулярних ліпідних мембран, метод виділення плазматичних мембран гепатоцитів щурів в градієнті щільності сахарози, методи визначення ферментативної активності (екто-АТФазної, Мg2+,Са2+-АТФазної, Nа+,K+-АТФазної) плазматичних мембран гепатоцитів, метод дослідження жовчосекреторної функції печінки щурів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що гетерополіядерні комплексні сполуки Cu (II) та Co (III) з діетаноламіном, які мають різні аніонні замісники, взаємодіють з моно- та бімолекулярними ліпідними мембранами, змінюючи граничний стрибок потенціалу і двовимірний тиск ліпідних моношарів та електричну провідність і електричну ємність БЛМ в залежності від типу аніону. Гетерополіядерні комплексні сполуки з тіоціанатним та ацетатним аніонами (СNCS та CАс, відповідно) більш інтенсивно вбудовуються до ліпідного матриксу мембрани, підвищуючи його механічні та електричні характеристики. Гетерополіядерні комплексні сполуки з хлоридним, бромідним та йодидним аніонами (CCl, CBr, CI, відповідно) взаємодіють з полярними головками молекул ліпідів і не інкорпоруються всередину гідрофобної зони мембрани. Вперше встановлено і охарактеризовано впливи гетерополіядерних комплексних сполук на екто-АТФазну, Мg2+,Са2+-АТФазну і Na+,K+-АТФазну активності плазматичних мембран гепатоцитів щура. Показано, що всі мембраномодулюючі ефекти гетерополіядерних комплексних сполук Cu (II) та Co (III), включаючи зміни ферментативних властивостей біологічних мембран, залежать від типу аніонного замісника в цих сполуках. За мембранотропними властивостями та за модифікацією ферментативної активності ПМ гепатоцитів найбільшою активністю характеризуються СNCS та CАс-сполуки, а найменшою - CCl, CBr та CI-сполуки. Встановлено також, що CCl, CI, CАс-сполуки проявляють гальмівну дію на об’ємну швидкість секреції жовчі печінкою, СNCS-сполука викликає протилежний ефект.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати розширюють уявлення про молекулярні механізми, що лежать в основі сигнальної трансдукції біологічних мембран, є внеском в розуміння біохімічних механізмів ефектів біорегуляторів. Встановлені первинні механізми взаємодії гетерополіядерних комплексних сполук Cu (II) та Co (III) з плазматичною мембраною клітини і модифікації ними ліпідного матриксу мембрани та активності мембранозв’язаних ферментів можуть бути використані для пошуку та цілеспрямованого синтезу нових біорегуляторів з заданим спектром дії та підбору оптимальних комбінацій і ефективних концентрацій, для створення нових підходів у профілактиці низки патологічних станів, пов’язаних із забрудненням довкілля. Отримані результати впроваджені в навчальний процес біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка в спецкурси: „Цитологічні ефекти фармпрепаратів”, „Рецептори мембран”, „Фармакологія”, а також використані в навчальному посібнику „Фізіологія і біохімія травлення. Практикум” (2006).

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні експериментів, в аналізі та інтерпретації даних літератури і отриманих результатів, формулюванні висновків, оформленні дисертації. Загальне планування роботи та обговорення результатів проводилось за участю наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на: Міжнародній науковій конференції „Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи” (Львів, 2004); Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); II З’їзді токсикологів України (Київ, 2004); I Міжнародній конференції студентів та аспірантів „Молодь і поступ в біології” (Львів, 2005); VI Міжнародній науково-практичній конференції „Актуальні проблеми токсикології. Безпека життєдіяльності людини” (Київ, 2005); V Всеукраїнській науковій конференції студентів та аспірантів „Біологічні дослідження молодих вчених в Україні” (Київ, 2005); 2nd International conference “Neural-humoral and cellular regulatory mechanisms of digestion processes” (Kyiv, 2005).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 статтей у фахових наукових виданнях та 7 тез доповідей на конференціях та з’їздах.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 135 сторінках, складається з вступу, огляду літератури, розділу з описом матеріалів і методів досліджень, розділу власних досліджень, узагальнення, висновків і списку використаних джерел, що включає 255 найменувань. Робота ілюстрована 24 рисунками і 7 таблицями.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Гетерополіядерні комплексні сполуки Cu (II) та Co (III) з діетаноламіном синтезовані на хімічному факультеті Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Всі досліджувані сполуки мають однаковий центросиметричний катіон Cu2Co2(H2Дea)2(Дea)4+, але різні аніонні замісники: Cl-, Br-, I-, NCS-, CH3СОO-. Далі по тексту хлоридна, бромідна, йодидна, тіоціанатна та ацетатна сполуки позначаються: CCl, CBr, CI, СNCS, САс.

Дослідження взаємодії гетерополіядерних сполук з ліпідними моношаровими мембранами проводили на межі розподілу фаз „розчин електроліту – повітря” та „розчин електроліту – моношар ліпідів – повітря” [Гевод, 1990; Островська, 2005]. Двовимірний тиск (П) моношарових структур вимірювали за допомогою напівзануреної платинової пластинки за методом Вільгельмі, чутливість – 0,1 мН/м. Граничний стрибок потенціалу (ГСП), що виникає при формуванні поверхневих структур на поверхні субфази, вимірювали за методом динамічного конденсатора, чутливість – 2 мВ. Для відведення ГСП використовували хлор-срібний електрод (занурений у субфазу) і золоту пластинку діаметром 1 см, яка вібрувала у повітрі над поверхнею розподілу фаз з частотою 1450 Гц. За нульове значення приймали параметри вільної поверхні розподілу фаз „розчин електроліту–повітря”. Розчин гетерополіядерних сполук вносили в об’єм субфази за допомогою насосу Бернулі, що запобігає безпосередньому їх попаданню на поверхню розчину. Ліпідні моношари формували з азолектину (сумарна фракція фосфоліпідів із бобів сої) шляхом нанесення розчину ліпідів (1 мг/мл) у хлороформі на поверхню субфази (0,01 М KCl, 0,01 М трис-HCl, рН=7,4) у тефлоновій кюветі (130Ч200Ч5 мм) до досягнення стабільної величини двовимірного тиску.

Плоскі бімолекулярні ліпідні мембрани (БЛМ) формували з розчину фосфатидилхоліну в n-декані (23-25 мг/мл) на отворі ( 0,8 мм) у тефлоновій склянці, зануреній у 0,1 М розчин KCl [Омельченко, 1990]. Струм (I) крізь мембрану вимірювали в умовах фіксації потенціалу (U) за допомогою швидкодіючого операційного підсилювача (чутливість – 0,1 пА) і реєстрували двокоординатним самозаписувачем Н-307/1. Опір мембрани вираховували за формулою R=U/I, провідність – G=1/R. Ємність БЛМ вимірювали за методом нестаціонарних циклічних вольт-амперних характеристик і розраховували за рівнянням: C=Ic/2/?ц/Дф, де Ic – ємнісний струм, а ?ц/Дф – швидкість розгортки мембранного сигналу до 50 мВ.

Плазматичні мембрани (ПМ) клітин печінки щурів виділяли методом ультрацентрифугування в градієнті щільності сахарози [Song et al., 1969.]. Вміст білка в отриманій фракції визначали за методом Lowry et al. [1951]. Чистоту препарату визначали за порівнянням активності маркерних ферментів – 5?-нуклеотидази (ЕС 3.1.3.5) та глюкозо-6-фосфатази (ЕС 3.1.3.9) – у вихідному гомогенаті і в отриманих мембранних фракціях. Mg2+,Са2+-АТФазну активність (ЕС 3.6.1.38) ПМ гепатоцитів щурів визначали у середовищі, що містить: 50 мМ Трис-НСl, 70 мМ КСl, 30 мкМ ЕГТА, 0,3 мМ АТФ, рН 7,5, яку активували додаванням 10 мкМ CaCl2 [Lotersztain et al., 1981]. Середовище для визначення екто-АТФазної активності (ЕС 3.6.1.3) містило: 50 мМ Трис-НСl, 70 мкМ КСl, 3 мМ АТФ, рН 7,5. Активність ферменту стимулювали додаванням 300 мкМ СаСl2. Вміст ПМ в середовищі інкубації становив 20 мкг білка на 0,5 мл середовища інкубації. Nа+,K+-АТФазну активність (ЕС 3.6.1.37) ПМ гепатоцитів визначали за різницею між загальною АТФазною активністю і активністю в присутності уабаїну (1·10-4 М). Вміст мембранного препарату в реакційній суміші становив ~50 мкг білка на 0,5 мл середовища інкубації мМ: 100 NaCl, 20 KCl, 5 MgCl2, 0,5 ЕДТА, 5 · 10-7 М SDS, 50 Трис-НСl, 5 АТФ, рН 7,4. Кількість неорганічного фосфату, що виділився в процесі ферментативної реакції, визначали за методом Rathbun, Betlach [1969]. Активність мембранозв’язаних ферментів виражали у нмоль Рн/мг білка хв.

Для вивчення жовчосекреторної функції печінки in situ у щурів після лапаротомії канюлювали загальну жовчну протоку і через 20 хв реєстрували вихідний рівень жовчовиділення. Після цього у воротну вену впродовж наступних 20 хв інфузували 1 мл розчину гетерополіядерної комплексної сполуки у концентрації 5·10-6 М.

Експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами варіаційної статистики [Плохинский, 1978]. Математичну обробку експериментальних результатів проводили з використанням програм статистичного пакету аналізу даних Microsoft Excel. Для визначення вірогідних відмінностей між середніми величинами використовували критерій Стьюдента (t).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Мембранотропна активність гетерополіядерних комплексних сполук. При дослідженні взаємодії гетерополіядерних комплексних сполук Cu (II) та Co (III) з діетаноламіном з мономолекулярними ліпідними мембранами встановлено, що галогенідні гетерополіядерні сполуки (CCl, CBr, CI) не викликають значних змін двовимірного тиску та граничного стрибка потенціалу мономолекулярних ліпідних мембран. Найвищу мембранотропну активність проявляють тіоціанатна (СNCS) та ацетатна (САс) сполуки, збільшуючи поверхневий тиск до 6,5 мН/м.

При дослідженні дії гетерополіядерних комплексних сполук на БЛМ встановлено, що модифікація ліпідної мембрани хлоридною сполукою (СCl) в концентрації 10-10 - 10-5 М призводить до зростання електричної провідності та

ємності БЛМ максимально на 20% (p<0,05) порівняно з контролем. Бромідна сполука (СBr) призводить до лінійного зростання електричної провідності БЛМ до 10%, тоді як величина електричної ємності спадає на 15% (p<0,05). Йодидна сполука (СІ) знижує значення електричної провідності на 10% (p<0,05) при максимально діючих концентраціях, і не змінює величину електричної ємності БЛМ.

Отже, галогенідні сполуки істотно не змінюють електричних параметрів БЛМ, їх взаємодію з фосфатидилхоліновими мембранами можна описати як адсорбцію молекул речовин в зоні заряджених головок ліпідів. Це узгоджується з ефектами їх дії на моношарові ліпідні структури.

Тіоціанатна (CNCS) та ацетатна (CАс) сполуки викликають збільшення електричної провідності БЛМ, при цьому електрична ємність залишається практично незмінною. Так, CNCS-сполука при високих концентраціях істотно не змінює електричну провідність БЛМ (G0=30,91±2,47 нСм/см2). При концентрації речовини 10-5 М електрична провідність стрибкоподібно зростає в 1,7 рази, що становить 52,69±9,93 мкФ/см2 (р<0,01). CАс-сполука, взаємодіючи з БЛМ (G0=27,72±1,38 нСм/см2) при концентрації 10-9 М, підвищує електропровідність мембрани на 52% – 42,02±7,94 нСм/см2. При подальшому збільшенні концентрації CАс-сполуки значення електропровідності істотно не змінюються.

Слід відмітити, що за проведеними нами дослідженнями ряди активності гетерополіядерних сполук, встановлені як на моношарових, так і на бішарових ліпідних мембранах, співпадають: бромідна сполука (CBr) < йодидна сполука (CI) < хлоридна сполука (CCl) < тіоціанатна сполука (CNCS) < ацетатна сполука (CАс). Це свідчить, що характер взаємодії гетерополіядерних сполук з штучними ліпідними мембранами залежить від ліпофільних властивостей катіону Cu2Co2(H2Деа)2(Деа)42+, а інтенсивність взаємодії – визначається аніоном. Так, галогенідні сполуки (хлоридна – CCl, бромідна – CBr, йодидна – CI), взаємодіючи з ліпідним матриксом мембрани, лише адсорбуються на полярних головках ліпідів. В свою чергу, тіоціанатна (CNCS) та ацетатна (CАс) гетерополіядерні сполуки характеризуються більш вираженими мембранотропними властивостями. Враховуючи те, що всі речовини проявляють різноспрямований вплив на ліпідний матрикс мембрани, стверджувати, що тільки катіон є відповідальним за проникнення комплексу до бішару, немає підстав. Гетерополіядерні сполуки CNCS і CАс, на відміну від галогенідних сполук, містять в своєму складі тіоціанатний та ацетатний аніони. Тому можна припустити, що, або саме аніонні замісники надають гетерополіядерним комплексним сполукам нові біологічно активні властивості, або ж аніони самостійно, внаслідок дисоціації, проявляють специфічний вплив на електричні параметри мембрани. Все це стало підставою для дослідження впливу складових гетерополіядерних комплексних сполук на електричні властивості мембран.

Мембранотропна активність складових гетерополіядерних комплексних сполук. Основними складовими координаційних сполук є центральні атоми металів, які координаційними зв’язками з’єднані з лігандами. До складу досліджуваних нами гетерополіядерних комплексних сполук входять іони металів Cu(II) і Co(III), що оточені лігандом – діетаноламіном. Для дослідження впливу іонів металів на мембранні структури до розчину електроліту вносили CuCl2 і CoCl2 в діапазоні концентрації 10-9-10-4 М. Початкові параметри БЛМ за умов дії CuCl2: G0 = 21,03±1,45 нСм/см2 та С0 = 0,52±0,06 мкФ/см2. Результати отриманих дослідів показали, що при поступовому збільшенні концентрації іони міді підвищують електричну провідність мембран на 35%. Також спостерігається підвищення і електричної ємності БЛМ, ця величина максимально зростає на 25%, і має більш виражену параболічну залежність.

Іони кобальту викликають протилежні зміни (по відношенню до іонів міді) електричних характеристик БЛМ. Вихідні параметри БЛМ за умов дії CоCl2: G0 = 20,85±1,68 нСм/см2 та С0 = 0,49±0,07 мкФ/см2. При дії хлориду кобальту відбувається лінійне зниження електричної провідності та ємності мембрани. При максимально діючій концентрації (10-4 М) електропровідність зменшується на 32%. Зниження електричної ємності БЛМ є менш вираженим і досягає 15% при концентрації 10-4 М.

Виходячи з наведених даних, взаємодію досліджених іонів металів з БЛМ можна описати як адсорбцію іонів кобальту в зоні заряджених головок ліпідів, що супроводжується зменшенням електричної провідності і ємності БЛМ, і часткове проникнення у гідрофобний кор ліпідного матриксу мембрани іонів міді, про що свідчить зростання вказаних характеристик.

Діетаноламін при концентрації 10-9 М підвищує провідність мембрани на (початкові параметри: G0 = 21,4±2,1 нСм/см2 та C0 = 0,52±0,01 мкФ/см2) 15%, а при концентрації 10-4 М провідність БЛМ збільшується до 40%. Електрична ємність БЛМ залишається незмінною. Отже, молекула спирту, так само як і іони металів, проявляє більш виражені зміни електричної провідності БЛМ порівняно з гетерополіядерними комплексними сполуками. Тіоціанатний та ацетатний аніони при концентрації 10-4 М максимально підвищують електричну провідність та ємність БЛМ на 15% та 30%, відповідно. Причому, при наномолярній концентрації діючих речовин зміни електричних характеристик БЛМ не спостерігаються. Ці результати не ототожнюються з мембраномодулюючими властивостями тіоціанатної (СNCS) та ацетатної (САс) гетерополіядерних комплексних сполук. На відміну від тіоціанатного та ацетатного аніонів, СNCS- та САс-сполуки характеризуються більш вираженими мембранотропними властивостями: САс-сполука проявляє свій вплив на БЛМ починаючи з концентрації 10-10 М, збільшуючи електричну провідність на 40%. Тіоціанатна сполука призводить до зростання даного параметру при концентрації 10-5М майже в 2 рази.

Отже, досліджені нами складові гетерополіядерних комплексних сполук – іони міді та кобальту і діетаноламін – проявляють більш виражені мембраномодулюючі властивості БЛМ порівняно з самими сполуками. В свою чергу, вільні тіоціанатний та ацетатний аніони мають незначний вплив на електричні характеристики БЛМ, порівняно з сполуками, до складу яких вони входять. Враховуючи наведені результати, можна сказати, що при взаємодії гетерополіядерних комплексних сполук з мембранною структурою досліджені речовини не дисоціюють на окремі складові. Найбільш виражені ефекти проявляються у складі цілісного комплексу.

Вплив гетерополіядерних комплексних сполук на іон-транспортні АТФази ПМ гепатоцитів щурів. Встановлення мембранотропних властивостей гетерополіядерних сполук, з різним ступенем їх модифікації моно- та бімолекулярних ліпідних мембран, стало підставою для проведення подальших досліджень на біологічних мембранах. Плазматична мембрана є однією з основних мішеней для токсичних і лікарських препаратів, взаємодія яких з її ліпідними і білковими компонентами може впливати на структуру і функції мембран. Одним з найбільш чутливих показників впливу біологічно активних речовин ендогенного і екзогенного походження на стан ПМ клітини є зміна активності мембранозв’язаних ферментів. Враховуючи цей факт, що всі досліджувані нами гетерополіядерні комплексні сполуки характеризуються різним ступенем мембранотропності, для вивчення впливу речовин на активність мембранозв’язаних ферментів ми вибрали речовини з найбільш вираженою мембранотропністю – тіоціанатна сполука (СNCS) та з найменшою – хлоридна (CCl) та бромідна (CBr) сполуки.

У немодифікованих гетерополіядерними сполуками мембранах гепатоцитів середнє значення екто-АТФазної активності складає 99,19,7 нмоль Рн/хвмг білка. Хлоридна сполука (CCl) в концентрації 10-9-10-7 М практично не викликає достовірних змін екто-АТФазної активності ПМ гепатоцитів. При мікромолярних концентраціях досліджуваної речовини ферментативна активність знижується на 20%, максимальний ефект речовини спостерігається при концентрації 10-4 М – активність спадає на 70% (p<0,05). Бромідна сполука (CBr) характеризується більш вираженим впливом на екто-АТФазну активність ПМ порівняно з CCl-сполукою. Екто-АТФазна активність зменшується при наномолярній концентрації речовини на 35% (p<0,02), при мікромолярній концентрації на 65%, а при концентрації 10-4 М активність спадає на 88% (p<0,01). Тіоціанатна сполука (СNCS) пригнічує ферментативну активність лише при максимально діючих концентраціях речовини: 10-5 М на 33% (p<0,01), при 10-4 М на 75% (p<0,01).

Таким чином, гетерополіядерні CCl- та СNCS-сполуки в концентраціях 10-9-10-6 М не викликають достовірних змін екто-АТФазної активності. Проте, CBr-сполука пригнічує дію ферменту в даному діапазоні концентрацій. Різке зниження екто-АТФазної активності спостерігається при максимальній концентрації речовин – 10-4 М. Враховуючи той факт, що АТФ-гідролізуючий центр екто-АТФази локалізований на зовнішній поверхні мембрани [Рыбальченко и др., 1991; Joseph et al., 2003], можна припустити, що досліджувані речовини або безпосередньо взаємодіють із „зовнішнім” сайтом молекули ферменту і змінюють його конформацію, або ж опосередковано, через зміну стану ліпідного матриксу мембрани, діють на нуклеотидгідролізуючий сайт ферменту, наслідком чого є зменшення його чутливості до субстрату.

Mg2+,Ca2+-АТФаза та Na+,К+-АТФаза належать до АТФаз Р-типу, мають низку спільних особливостей: є іон-транспортуючими ферментами, мають багато гомологічних послідовностей в молекулі білка, характеризуються подібним кінетичним механізмом [Болдырев, 1990; Apell, 2003]. Виходячи з цього та враховуючи високу чутливість обох транспортних АТФаз до впливу біологічно активних речовин [Рыбальченко, Островская, 1998], доцільно було б дослідити характер змін їх ферментативної активності під впливом гетерополіядерних комплексних сполук.

Середнє значення Mg2+,Ca2+-АТФазної активності ПМ гепатоцитів у немодифікованих гетерополіядерними сполуками мембранах складає 21,903,35 нмоль Рн/хвмг білка. При дії хлоридної сполуки (CCl) на Mg2+,Ca2+-АТФазну активність ПМ спостерігається тенденція до зниження її ферментативної активності . Проте, при мінімальних концентраціях CCl-сполуки (10-9 і

10-8 М) АТФазна активність зростає на 40%. Бромідна сполука (CBr) в діапазоні концентрацій 10-9-10-6 М пригнічує Mg2+,Ca2+-АТФазну активність до 50%, яка при вищих концентраціях відновлюється до вихідного рівня. При дослідженні ефекту впливу тіоціанатної сполуки (СNCS) на Mg2+,Са2+-АТФазну активність ПМ встановлена параболічна залежність: при концентрації СNCS-сполуки 10-9 М ферментативна активність зростає в 1,5 рази і при її концентрації 10-5 М у 2,4 рази.

Середнє значення Na+,K+-АТФазної активності в немодифікованих гетерополіядерними сполуками мембранах складає 70,66,9 нмоль Рн/хвмг білка. Гетерополіядерна хлоридна сполука (CCl) в діапазоні концентрацій 10-9-10-4 М знижує Na+,K+-АТФазну активність ПМ (на 80% при концентрації сполуки 10-7 М). Тіоціанатна сполука (СNCS) викликає протилежний ефект – збільшує АТФазну активність ПМ, досягаючи максимального значення в 52% при концентрації сполуки 10-5 М. Таким чином, всі досліджені гетерополіядерні сполуки мають різноспрямовану дію на Mg2+,Са2+- та Na+,K+-АТФазну активність ПМ гепатоцитів: хлоридна (CCl) та бромідна (CBr) сполуки пригнічують активність мембранозв’язаних ферментів, а тіоціанатна сполука (СNCS) активує ферменти.

Різноспрямовані зміни АТФазних активностей плазматичних мембран гепатоцитів за умов впливу гетерополіядерних сполук можна пояснити, виходячи з мембранотропних властивостей досліджених речовин. Хлоридна сполука (CCl) і бромідна сполука (CBr) неактивно взаємодіють з ліпідним матриксом мембрани. Вони здатні адсорбуватися лише на поверхні мембрани в області полярних головок ліпідів за рахунок електростатичних взаємодій, про що свідчать незначні зміни механічних та електричних параметрів штучних мембран. Отже, адсорбуючись на поверхні ліпідного шару, хлоридна та бромідна сполуки можуть безпосередньо взаємодіяти з позамембранними петлевими доменами молекули АТФази, змінювати їх конформацію, і тим самим зменшувати афінність ферменту до активуючої дії іонів Са2+, що в результаті призводить до зниження активності мембранозв’язаного ферменту.

Тіоціанатна сполука (СNCS) характеризується більш вираженими мембранотропними властивостями порівняно до вищезазначених речовин. При мінімально діючих концентраціях тіоціанатний комплекс, так як і CCl- та СBr-сполуки, адсорбується на поверхні мембрани, і може взаємодіяти лише з поверхневими доменами молекули ферменту і модулювати його активність. Починаючи з мікромолярних концентрацій, СNCS-сполука більш активно інкорпорує до ліпідного матриксу мембрани, модифікуючи внутрішньомембранні домени ферменту. При проникненні в гідрофобну зону плазматичної мембрани клітин, сполуки можуть не лише безпосередньо модифікувати структуру мембранних ферментів, але і впливати на їх активність шляхом зміни фізико-хімічних властивостей самого ліпідного матриксу мембрани. Адже, відомо, що ліпіди відіграють значну роль у регулюванні активності мембранозв’язаних ферментів [Рыбальченко, Коганов, 1988; Tillman, Cascio, 2003].

Отже, за результатами експериментальних досліджень можна вважати, що зміна активності мембранозв’язаних ферментів відбувається за двома біохімічними механізмами: перший – шляхом безпосередньої дії на молекулу ферменту і, як наслідок, зміни його конформації. Саме така дія притаманна галогенідним сполукам – CCl та СBr. Другий механізм: взаємодіючи з мембраною, речовини змінюють фізико-хімічні властивості ліпідного матриксу і, як наслідок, функціональну активність мембранозв’язаних ферментів. Такий вид взаємодії притаманний тіоціанатній сполуці (СNCS), яка характеризується більш вираженими мембранотропними властивостями, порівняно з хлоридною та бромідною сполуками.

Жовчосекреторна функція печінки при дії гетерополіядерних комплексних сполук. Зміна одного з фізіологічних параметрів, який характеризує стан процесів утворення жовчі гепатоцитами (первинної жовчі), є об’ємна швидкість секреції жовчі (мкл/кг·хв) як тест для оцінки фізіологічної активності речовин, здатних впливати на клітинний метаболізм, в тому числі на процеси іонного мембранного транспорту. Аналіз цих змін може бути використаний для з’ясування механізмів дії гетерополіядерних комплексних сполук як на жовчосекреторну функцію печінки, так і на функцію інших органів.

При дослідженні впливу хлоридної (CCl) та йодидної (СІ) сполук на об’ємну швидкість секреції жовчі встановлено, що в контрольних дослідах вихідний рівень даного параметру дорівнював 1451,0±74,2 мкл/кг·хв. При інфузії CCl- та СІ-сполук інтенсивність секреції жовчі пригнічується. Хлоридна сполука знижує даний показник на 10 % (80-та хвилина), йодидна сполука в зазначеному часі пригнічує секрецію жовчі на 17% (р0,05). Ацетатна сполука (САс) призводить до падіння об’ємної швидкості секреції жовчі, що на 80-ій хвилині складає більше 20% (р0,01). Інтенсивність секреції жовчі в період інфузії тіоціанатною сполукою (СNCS) збільшується майже на 15% (р0,01) з наступним (в часі) уповільненням ефекту.

Утворення жовчі гепатоцитами пов’язують із процесами активного транспорту жовчних кислот та неорганічних іонів із гепатоцитів у жовчні канальці, що здійснюється внаслідок функціонування відповідних транспортних систем плазматичних мембран гепатоцитів [Синельник, 2004]. Аналіз ефектів дії гетерополіядерних сполук на Na+,K+- та Мg2+,Са2+-АТФазну активність ПМ гепатоцитів та жовчосекреторну функцію печінки свідчить про їх аналогію: хлоридна та бромідна сполуки пригнічують активність мембранозв’язаних ферментів, тим самим знижують процес жовчовиділення печінки, тіоціанатна сполука викликає протилежні ефекти.

Виходячи з отриманих результатів, можна зробити висновок, що досліджені гетерополіядерні комплексні сполуки змінюють стан жовчосекреторної функції печінки шляхом впливу на активність іон-транспортних АТФаз мембран гепатоцитів, а саме на Мg2+,Са2+- та Na+,K+-АТФазні активності.

ВИСНОВКИ

1. Гетерополіядерні комплексні сполуки Cu (II) та Co (III) з діетаноламіном проявляють мембранотропні властивості, які виражаються в їх здатності взаємодіяти з мембранними структурами різного рівня організації і змінювати активність мембранозв’язаних ферментів.

2. Інтенсивність взаємодії гетерополіядерних комплексних сполук з штучними ліпідними і біологічними мембранами в значній мірі визначається типом аніону цих сполук. В цілому за двовимірним тиском і граничним стрибком потенціалу моношарових ліпідних мембран, за електричною ємністю і електричною провідністю бімолекулярних ліпідних мембран, за екто-АТФазною, Na+,K+-АТФазною і Мg2+,Са2+-АТФазною активностями плазматичних мембран гепатоцитів найвищими ефектами характеризуються тіоціанатна та ацетатна сполуки, а найменшими – хлоридна, бромідна та йодидна сполуки.

3. При взаємодії з моно- та бімолекулярними ліпідними мембранами хлоридна, бромідна та йодидна гетерополіядерні комплексні сполуки адсорбуються переважно в зоні заряджених головок ліпідів. Тіоціанатна та ацетатна сполуки здатні активно взаємодіяти з ліпідним матриксом мембрани, інкорпоруючись в його гідрофобну зону.

4. Взаємодіючи з бімолекулярними ліпідними мембранами складові гетерополіядерних сполук – діетаноламін, іони міді та кобальту проявляють більш виражені мембраномодулюючі властивості порівняно з самими сполуками, тоді як тіоціанатний та ацетатний аніони з меншою інтенсивністю змінюють електричні параметри БЛМ відносно тіоціанатної та ацетатної сполук. Такі ефекти впливу свідчать про те, що гетерополіядерні комплексні сполуки Cu (II) та Co (III) з діетаноламіном при взаємодії з мембранною структурою виявляють мембранотропну активність в недисоційованому стані.

5. Всі досліджені гетерополіядерні комплексні сполуки викликають дозозалежні зміни активності мембранозв’язаних ферментів. В діапазоні концентрації 10-9-10-4 М вони пригнічують екто-АТФазну активність ПМ. Максимальний ефект пригнічення (на 70-85%) спостерігається при концентрації речовини 10-4 М.

6. Хлоридна і бромідна сполуки, які адсорбуються на мембрані в області полярних головок ліпідів, не істотно впливають (знижують) на Мg2+, Са2+-АТФазну активність плазматичних мембран. Тіоціанатна сполука, локалізуючись в гідрофобній зоні мембранного матриксу, викликає зворотній ефект – підвищує ферментативну активність, причому ця залежність від її концентрації має параболічний характер.

7. Хлоридна сполука викликає ефективне дозозалежне зниження (на 80%) Na+,K+-АТФазної активності плазматичних мембран гепатоцитів. Ефект тіоціанатної сполуки є протилежним і менш вираженим – підвищення Na+,K+-АТФазної активності на 50% відбувається лише при концентрації 10-5 М.

8. Хлоридна, йодидна та ацетатна гетерополіядерні комплексні сполуки проявляють гальмівну дію на об’ємну швидкість секреції жовчі печінкою; тіоціанатна – на початку інфузії призводить до підвищення цього показника. Оскільки між АТФазними активностями плазматичних мембран гепатоцитів та секрецією жовчі встановлена пряма залежність, то припускається, що ефекти впливу гетерополіядерних комплексних сполук на жовчосекреторну функцію печінки обумовлені (принаймні частково) їх дією на іон-транспортні АТФази мембран гепатоцитів.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Філінська О.М., Бичко А.В., Рибальченко Т.В., Островська Г.В. Вплив гетерополіядерних сполук міді (ІІ) та кобальту (ІІІ) з диетаноламіном на штучні ліпідні мембрани // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. Збір. наук. праць. – 2004. – Вип. 10 (63). – С.35-41. (Здобувачем проаналізовано літературу, досліджено електричні характеристики БЛМ, проведено статистичну обробку).

2. Ostrovska G., Yablonska S., Rybalchenko T., Zelenyuk V., Filinska O., Rybalchenko V. The influence of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid on the rat hepatocyte plasma membrane Ca2+, Mg2+-ATPase activity in vivo and in vitro // Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska. Sectio DDD. Pharmacia. – Lublin (Poland): Wschod, 2004.– Vol. 17. – №2. – P. 325-327. (Здобувачем проведено визначення активності мембранозв’язаних ферментів).

3. Філінська О.М., Рибальченко Т.В. Вплив хлоридної та тіоціанатної гетерополіядерних сполук на іон-транспортні АТФази плазматичної мембрани гепатоцитів щура // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. Збір. наук. праць. – 2005. – Вип. 5 (68). – С.59-67. (Здобувачем проаналізовано літературу, досліджено активність ферментів, проведено інтерпретацію даних).

4. Філінська О.М., Бичко А.В., Рибальченко Т.В., Киливник К.Є. Зміна властивостей ліпідного бішару під впливом складових гетерополіядерних Cu(II)/Co(III) сполук з діетаноламіном // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. Збір. наук. праць. – 2005. – Вип. 6 (69). – С.84-93. (Здобувачем досліджено електричні параметри БЛМ, проведено статистичну обробку).

5. Філінська О.М., Рибальченко Т.В., Островська Г.В., Кокозей В.М., Маханькова В.Г., Яблонська С.В., Лозовий В.П., Рибальченко В.К. Екто-АТФазна та Mg2+,Са2+-АТФазна активності плазматичних мембран гепатоцитів щурів за умов дії гетерополіядерних Cu(II)/Co(III) комплексів з діетаноламіном // Доповіді НАН України. – 2006. – № 3. – С. 173-175. (Здобувачем досліджено активність мембранозв’язаних ферментів, проведено статистичну обробку та інтерпретацію даних).

6. Яблонська С., Рибальченко Т., Філінська О., Лозовий В. Біохімічні особливості безрецепторної міжклітинної сигналізації // Установчий з’їзд Українського товариства клітинної біології (25-28 квітня 2004). – Львів, 2004. – С.23.

7. Бичко А.В., Філінська О.М., Рибальченко В.К. Мембранотропна активність гетерометалічних комплексів [NiL][ZnHal4] // II з’їзд токсикологів України (12-14 жовтня 2004). – Київ, 2004. – С.70.

8. Філінська О.М., Бичко А.В., Рибальченко Т.В., Яблонська С.В., Лозовий В.П., Островська Г.В. Дослідження механізмів біологічної активності гетерометальних комплексів Cu(II) та Co(III) // Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи: Матеріали міжнародної конференції (7-9 жовтня 2004). – Львів, 2004. – С.74.

9. Рибальченко Т.В., Філінська О.М., Яблонська С.В., Лозовий В.П., Бичко А.В., Синельник Т.Б. Дослідження впливу гетерополіядерних сполук Cu(II), Co(III) та Ni(II) з діетаноламіном – потенційних лікувальних речовин на Mg2+,Ca2+- АТФазну активність гепатоцитів печінки щурів // Молодь і поступ біології: Матеріали I Міжнародної конференції студентів та аспірантів (11-14 квітня 2005). – Львів, 2005. – С.6.

10. Філінська О.М., Рибальченко Т.В., Лозовий В.П., Яблонська С.В., Островська Г.В. Вплив гетерополіядерних сполук Cu(II) та Co(III) з діетаноламіном на активність мембранозв’язаних ферментів // Актуальні проблеми токсикології. Безпека життєдіяльності людини: Матеріали VI міжнародної науково-практичної конференції (1-3 жовтня 2005). – Київ, 2005. – С. 51-52.

11. Філінська О.М., Лозовий В.П., Рибальченко Т.В. Вплив гетерополіядерних сполук на Mg2+,Ca2+- АТФазну активність плазматичної мембрани гепатоцитів печінки щурів // Біологічні дослідження молодих вчених в Україні: Матеріали V Всеукраїнської наукової конференції студентів та аспірантів (15-16 вересня 2005). – Київ, 2005. – С.115-117.

12. Yablonska S.V., Filinska O.M., Rybalchenko T.V., Ostrovska G.V., Synelnyk T.B., Lozoviy V.P., Rybalchenko V.K. Influence of хenobiotics of a different nature on specific functions of rat hepatocytes and stomach myocytes // Neural-humoral and cellular regulatory mechanisms of digestion processes: 2nd International conference (5-7 October Kyiv) – Kyiv, 2005. – P. 39.

АНОТАЦІЇ

Філінська О.М. Біохімічні механізми мембранотропної активності гетерополіядерних сполук. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2006.

Дисертаційна робота присвячена вивченню біохімічних особливостей дії гетерополіядерних комплексних сполук Cu2Co2(H2L)2(L)4X2 (H2L, L = діетаноламін та його депротонований залишок; X = Cl (CCl), Br (CBr), I (СІ), NCS (СNCS), CH3СОO (САс) на ліпідний матрикс мембрани, мембранозв’язані ферменти – екто-АТФазну, Мg2+,Са2+-АТФазну та Nа+,K+-АТФазну активності плазматичних мембран гепатоцитів щурів. Встановлено, що CCl-, CBr-, СІ-сполуки не проявляють значної мембранотропної активності, тоді як СNCS- та САс-сполуки здатні активно взаємодіяти з ліпідним матриксом мембрани, інкорпоруючись в його гідрофобну зону. Припускається, що зміна активності мембранозв’язаних ферментів при дії гетерополіядерних сполук залежить від ступеня їх проникності в ліпідний матрикс. Так, CCl-, CBr- та СNCS-сполуки знижують екто-АТФазну активність ПМ гепатоцитів щурів. CCl- та CBr-сполуки також пригнічують Мg2+,Са2+- та Nа+,K+-АТФазні активності, тоді як СNCS-сполука призводить до зростання ферментативних активностей ПМ. Зміна жовчосекреторної функції печінки під впливом гетерополіядерних сполук, можливо, залежить від їх впливу на іон-транспортні АТФазні активності мембран гепатоцитів.

Ключові слова: мембранотропна активність, гетерополіядерні комплексні сполуки, штучні ліпідні мембрани, плазматична мембрана, екто- , Мg2+,Са2+- та Nа+,K+-АТФазна активність.

Филинская Е.М. Биохимические механизмы мембранотропной активности гетерополиядерных соединений. – Рукопись.

Дисcертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2006.

Дисcертационная работа посвящена изучению биохимических особенностей действия новосинтезированных гетерополиядерных комплексных соединений Cu2Co2(H2L)2(L)4X2 (H2L, L = диэтаноламин и его депротонированный остаток; X = Cl (CCl), Br (CBr), I (СІ), NCS (СNCS), CH3СОO (САс) на липидный матрикс мембраны, экто-АТФазную, Мg2+,Са2+-АТФазную и Nа+,K+-АТФазную активности плазматической мембраны (ПМ) гепатоцитов крыс. Интенсивность взаимодействия гетерополиядерных комплексных соединений с искусственными липидными и биологическими мембранами определяется типом анионного остатка этих соединений. Показано, что CCl-, CBr-, СІ-соединения проявляют незначительную мембранотропную активность, они адсорбируються на поверхности липидного матрикса мембраны. СNCS- и САс-соединения более интенсивно изменяют механические и электрические характеристики липидных мембран, свидетельствующие об их проникновении в мембранные структуры. Изучая влияние составляющих гетерополиядерных соединений на электрические параметры БЛМ показано, что диэтаноламин, ионы кобальта и меди проявляют более выраженные мембраномодулирующие свойства по сравнению с самими соединениями, тогда как тиоцианатный и ацетатный анионы с меньшей интенсивностью изменяют электрические параметры БЛМ в сравнении с СNCS- и САс-соединениями. Такие эффекты свидетельствуют о том, что гетерополиядерные комплексные соединения Cu (II) и Co (III) с диэтаноламином при взаимодействии с мембранной структурой влияют на мембранную активность в недиссоциированом состоянии. Гетерополиядерные CCl-, CBr-, СNCS-соединения вызывают изменения активности мембраносвязанных ферментов. Они снижают экто-АТФазную активность ПМ (максимальный эффект 70-85%). CCl- и CBr-соединения незначительно снижают Мg2+,Са2+-АТФазную активность ПМ. СNCS-соединение вызывает противоположный эффект – повышает АТФазную активность, причем эта зависимость имеет параболический характер. CCl-соединение снижает Nа+,K+-АТФазную активности на 75%, тогда как эффект СNCS-соединения менее выраженый. Предполагается, что изменение активности мембраносвязанных ферментов при действии