НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

ГРОМОЗОВА Олена Миколаївна

УДК 575.16.017.22:582.28

Поліваріантність онтогенезу міцеліальних мікроміцетів

03.00.14 – біологія розвитку

автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Підгорський Валентин Степанович, Інститут мікробіології та вірусології НАН України, завідувач відділу фізіології промислових мікроорганізмів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Горовий Леонтій Федорович, Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, завідуючий лабораторією клітинної біології і біотехнології грибів;

доктор медичних наук, професор Войцеховський Валерій Григорович, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, професор кафедри мікробіології, вірусології та імунології;

доктор біологічних наук, професор Бєлоусов Лев Володимирович, Московський державний університет ім. М.В. Ломоносова, професор кафедри ембріології.

Провідна установа: Київський Національний університет імені Тараса Шевченка Міністерства освіти і науки України

Захист відбудеться "30" січня 2007 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .202.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ, вул. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 148).

Автореферат розісланий 27.12. 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник О.А. Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Поліваріантність онтогенезу є однією з важливих задач біології розвитку. З одного боку мова йде про макроструктури модульних організмів, їх функціональні та специфічні особливості та необхідность вивчення споріднених архитектурних моделей різного рівня організації. З іншого боку, питання формоутворення, як на етапі утворення окремих модулів, так і на стадії формування цілих структур, представляють значний інтерес для вивчення проблеми морфогенезу.

Літературні дані свідчать про те, що при усій специфічності подій формоутворення у біологічних об’єктів різної складності, безперечно, є загальні принципи та механізми, дослідження яких легше здійснити на більш простих моделях. На думку С. Шноля (1979), особливо актуальними є дослідження морфогенезу на рівні клітини та складно організованих одноклітинних організмів. Поряд з цим ми вважаємо перспективним вивчення відносно простих організмів, що розглядаються як перехід до багатоклітинних утворень. Такою моделлю може бути процес формоутворення міцелію мікроміцетів в умовах глибинного культивування.

Новизна та актуальність роботи визначаються також тим, що механізми формоутворення та особливості функціонування міцелію в глибинних умовах ще недостатньо вивчені. Більшість робіт, як свідчать літературні дані [Gibbs et al., 2000], мають описувальний характер та мало уваги приділяють причинам цього явища. Хоча відомо, що формі росту грибів відповідає певна спрямованість біосинтетичних процесів, вибір форми для біотехнологічного впровадження частіше за все здійснюється емпірично. Констатуючи наявність пелетного або нитчастого міцелію при зміні умов культивування, дослідники приділяють увагу коагуляційному шляху появи пелет, не пропонуючи модель молекулярного механізму цього явища, у більшості випадків заперечуючи його біологічну природу [Masanori et al., 1994]. Основні дослідження, що присвячені формоутворенню міцелію у глибинних умовах культивування, пов’язані з проблемами масообміну, обростання обладнання, фільтрації біомаси, впливу змішування на подрібнення міцелію тощо. В той же час деякі літературні дані свідчать на користь можливого біологічного морфогенезу [Wold, Suzuki, 1973; Gerin et al., 1993; Ziyu Dai et al., 2004]. В оглядах літератури Metz, Kossen, 1977; Seviour, Schmid, 2000] вказується на те, що невирішеними залишаються питання фізіолого-біохімічної та ультраструктурної гетерогенності окремих частин гіф, механізму фізико-хімічних впливів на метаболічні та морфологічні особливості мікроміцетів та інше. Визнаючи багатофакторний, і тому важко вивчаємий, характер формоутворення глибинного міцелію, Znidarsic, Pavko (2001) вважають, що без цього неможливо наблизитися до ефективного використання грибів в біотехнологічних процесах. Питання регуляції формоутворюючих процесів як на рівні сприйняття та передачі морфогенного сигналу, так і на рівні клітинної відповіді, не вивчено. За думкою Gadd (1994), передача сигналу є складною інтегральною системою багатьох процесів, що відбуваються в клітині, які у нитчастих мікроскопічних грибів мало досліджені на фізіологічному, клітинному та молекулярному рівнях.

Мета роботи: встановити роль адаптаційних процесів у поліморфному розвитку міцелію деяких мікроміцетів в умовах глибинного культивування та розробити модель механізмів керування їх морфогенезом на етапі передачі зовнішнього сигналу на внутрішньоклітинний регулятор.

Для досягнення вказаної мети були поставлені та вирішені наступні задачі:

1. Визначення впливу зовнішніх факторів на процес формування міцеліальних структур та їх типологізація на прикладі мікроміцетів з різною екологічною стратегією розвитку.

2. Вивчення механізмів взаємодії конідій на початкових стадіях формоутворення і регуляторних процесів, які забезпечують розвиток певної форми міцелію відповідно до умов культивування

3. Вивчення ролі ендогенних регуляторів: цАМФ, цГМФ, іонів кальцію в морфогенезі Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain.

4. Порівняльне дослідження фізіолого-біохімічних та енергетичних особливостей функціонування модульних та унітарних грибних об’єктів.

5. Розробка молекулярної моделі поліморфізму глибинного міцелію на прикладі T..

Об'єкт дослідження: регуляторні механізми морфогенезу.

Предмет дослідження: формоутворення міцелію мікроскопічних грибів в умовах глибинного культивування.

Методи дослідження: вивчення особливостей пелетного та нитчастого міцелію проводили за допомогою комплексу мікробіологічних фізико-хімічних методів в умовах періодичного та безперервного культивування. Для дослідження поверхневих властивостей конідій застосовували методи атомно силової та електронної мікроскопії, з використанням лектинів мічених колоїдним золотом.

Наукова новизна. Вперше на основі комплексного вивчення структурних, функціональних та регуляторних аспектів запропоновано розглядати пелетну форму росту міцелію поряд з нитчастою, як прояв поліваріантності онтогенезу мікроміцетів, що розвиваються в умовах глибинного культивування. Вперше теоретично обґрунтовано та експериментально підтверджено механізм початкових етапів регуляції пелетного та нитчастого росту T., що включає зміну роботи аденілатного комплексу шляхом варіації значень зовнішніх факторів середовища (рН, температура, тощо) та концентрації інокулюму або впливом високої концентрації глюкози, теофіліну, екзогенного цАМФ, агентів, що деполяризують мембрану. Доведено, що пелетна форма існування міцелію є проявом адаптивних реакцій організму на несприятливі умови існування. Вперше на підставі результатів комплексних фізіолого-біохімічних досліджень показано відповідність пелетного міцелію T. поведінці одноклітинних мікроорганізмів в умовах неспецифічного стресу, що підтверджує положення про функціональну подібність макроморфологічних структур модульних організмів з системами популяційного рівня.

Вперше встановлена стадія компетентності в морфогенезі грибів, що має чіткі часові межі та відповідає аналогічному періоду в ембріогенезі вищих організмів. Підтверджено положення про значну детермінуючу роль середовища у поліваріантності онтогенезу модульних організмів.

Вперше за допомогою методу атомно-силової мікроскопії виявлено відмінності в ультраструктурі поверхні та силах молекулярної взаємодії конідій з різною спрямованістю формоутворюючих процесів.

Вперше, на підставі порівняння одержаних експериментальних даних з літературними відомостями про класичний гіфально-дріжджовий диморфізм, запропоновано розширити це поняття до „поліморфізму вегетативних форм розвитку грибів”, залучивши до нього пелетну форму.

Вперше запропоновано використовувати процеси формоутворення міцелію у глибинних умовах культивування як експериментальну модель для вивчення регуляторних механізмів морфогенезу.

Практична цінність роботи. Одержані результати можуть бути використані при розробці біотехнологічних процесів за участю мікроміцетів (одержання білкових продуктів, біологічно активних речовин, у технології очистки стічних вод тощо), а також при викладанні курсу біології розвитку міцеліальних грибів. Виявлені закономірності дозволяють здійснити спрямоване культивування тієї чи іншої міцеліальної форми з відповідним типом метаболізму і тим самим підвищити ефективність біотехнологічних процесів отримання важливих для народного господарства продуктів. Отримані дані дозволяють розглядати пелетну форму T., Chaetomium globosum Kunze et Fr. та темнозабарвлених мікроміцетів як індикатор на несприятливі умови культивування.

Розроблено методичні підходи на основі методів атомно-силової мікроскопії, хемілюмінесценції та механоемісії до вивчення механізмів клітинних взаємодій у лаг-фазі. Дані про роль лаг-фази як важливого періоду визначення морфофізіологічних особливостей росту мікроскопічних грибів мають враховуватися для активізації синтезу біологічних продуктів.

Зв’язок роботи з науковими програмами та темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планами наукових досліджень ІМВ НАНУ 01.9.10057657, а також наукових програм з фундаментальних та прикладних досліджень Міністерства освіти та науки України: 0195VO277711, 11-05-95-5.3/74, 5/89. Форма участі автора у цих проектах: науковиий керівник або відповідальний виконавець.

Конкретна особиста участь автора в одержаних результатах. Автору належить ідея адаптивності форм міцелію у глибинних умовах культивування до факторів зовнішнього середовища та механізму їх формоутворюючих процесів як прояву поведінки самоорганізуючої системи. Здобувач розробив та виконав програму комплексних досліджень, здійснив аналіз та обробку одержаних даних, виконав теоретичні роботи та відповідні розрахунки, сформулював висновки, узагальнення та наукові положення. Експериментальні матеріали, що викладені в дисертації, отримані автором особисто та разом зі співробітниками очолюваної автором групи відділу фізіології промислових мікроорганізмів. Вивчення енергетичної ефектив-ності росту, вміст АТФ и ІК-спектрометрію проводили в Інституті мікро-біологіі ім. А. Кирхенштейна АН Латвії разом з д.б.н. Швидке Ю., к.б.н. Галининою Н., к.б.н. Загребою Е., к.б.н. Грубе М. Розділ .2 виконано сумісно з д.б.н. Садовським М. – співробітником Інституту біофізики Сиб. відд. АН Росії, атомно-силову мікроскопію проведено за допомогою к.ф-м.н. Литвина П.М. (Інститут фізики напівпровідників ім. В.Є. Лашкарьова НАН України), электронну мікроскопію – за участю Степанка В.В. (ІМВ ім. Д.К. Заболот-ного НАНУ). Електромагнітне випромінювання досліджувалося за допомо-гою обладнання фізико-технічної лабораторії Інституту онкології МОЗ України, під керівництвом проф., д.б.н. Орла В.Е. Автор висловлює подяку д.б.н., проф. Ждановій Н.М. та к.б.н. Захарченко В.А. за допомогу у питаннях мікології.

Апробація роботи. Матеріали та основні положення дисертації доповідалися на IV Всесоюзній конференції "Управляемое культивирование микроорганизмов", Пущино, 1986 р., Всесоюзних конференціях: "Теоретические основы микробной конверсии", 1988м. Рига, "Лимити-рование и ингибирование роста микроорганизмов", Пущино, 1989 р. "Антропогенная экология микромицетов, аспекты математического моделирования и охрана окружающей среды", м. Київ, 1990 р., VII, VIII з’їздах Українського мікробіологічного товариства (Чернівці, 1989 р., та Одеса, 1994 р.), на 9-му з’їзді Українського ботанічного товариства, Дніпропетровськ, 1992 р., на семінарі з проблем морфогенезу, МДУ, Москва, 1996 р., на 8-му Європейському конгресі по біотехнології, Будапешт, 1997 р., на конференції "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии" МДУ, 1998 р., на 2-й Міжнародній конференції "Неравновесные когерентные системы в биологии, биофизике и биотехнологии", Москва, 1999 р., на II-му Міжнародному конгресі "Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине", Санкт-Петербург, 2000 р. на III-му Міжнародному семінарі: "Минералогия и жизнь: биоминеральные гомологи", Сиктивкар, 2000 р., на Міжнародній конференції "Микробиология и биотехнология ХХ1 столетия", Мінськ, 2002 р., на І-му та IV-му Всеросійському конгресі з медичної мікології, Москва, 2002 - 2006 рр., на засіданні ботанічної секції в Інституті ботаніки НАНУ, неодноразово на конференціях та семінарах ІМВ НАНУ.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 43 наукових праці, у тому числі 30 статей у фахових журналах, 13 тез доповідей на наукових конференціях та з'їздах.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів власних досліджень, обговорення результатів, висновків та списку цитованої літератури (396 першоджерел). Робота викладена на 306 сторінках друкованого тексту, ілюстрована 23 таблицями, 99 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури складається з 2 підрозділів. В першому підрозділі дана загальна характеристика сучасного стану проблеми морфогенезу. Розглянуто його основні положення та механізми. Представлено складність і багатофакторність проблеми, яка не зводиться лише до вивчення генетичних аспектів при поясненні розвитку просторової конфігурації живих об’єктів. Дана характеристика основних механізмів розвитку організмів різних ступенів складності. Обгрунтовано проведення досліджень щодо аспектів морфогенезу на більш простіших моделях.

В підрозділі два розглянуто як модель морфогенезу поліморфізм міцелію мікроскопічних грибів в умовах глибинного культивування. Особлива увага приділяється дискусійним питанням щодо процесу пелетоутворення і механізмів цього явища. Розглянуто фізичні причини агрегації конідій та їх поведінка як колоїдних часток.

Матеріали та методи дослідження. Предметом дослідження є формоутворення міцелію мікроскопічних грибів в умовах глибинного культивування. Дослідження проводили на прикладі Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain (оптим. темп. 37 - 42 оС, рН ,0), продуцент кормового білка [Билай и др., 1985], Cladosporium cladosporioides (Fresen) de Vries – продуцент меланіну та його alb-мутант, одержаний при опроміненні батьківського штаму високими дозами -променів [Жданова и др., 1985], а також Cladosporium gerbarum (Pers.) Lk: S.F.1453, Cladosporium Penzig, 1059, Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc., 2416, Ulocladium botrytis Press, 2075 (опт. темп. 25 - 28 оС, рН ,0) з колекції відділу фізіології та систематики мікроміцетів ІМВ НАНУ та Chaetomium globosum Kunze et Fr., №209 з ВКМ (оптим.темп. 25 - 28оС, рН7,0).

Культивування грибів проводилося в качалочних колбах, у ферментерах "АНКУМ-2" і "Вiotec", на рідкому середовищі Чапека в періодичних та безперервних умовах. Стаціонарний стан контролювали за концентрацією кисню.

Фізіологічні показники (економічний, метаболічний коефіцієнти, коефіцієнт підтримання, питома швидкість росту, константа насичення та інгібування) розраховували, базуючись на отриманих експериментальних даних за відомими формулами [Перт, 1978]. Апікальну швидкість росту визначали при проростанні конідій, що були орієнтовані на нитчастий чи пелетний ріст, у препараті "висяча крапля" шляхом вимірювання довжини гіфи через певні часові інтервали за допомогою мікроскопу МБІ-15 (ЛОМО). Дослідження, що пов’язані з визначенням енергетичної ефективності росту, проводили при трьох типах С-ліміту: в стаціонарній фазі періодичної культури, при лімітуванні вуглецевим субстратом у режимі хемостату та в умовах глибокого лімітування після зупинки протоку та виходу СО2 у постійний режим. Енергетичну ефективність росту () розраховували за описаним [Бабурин и др., 1987] способом. Експериментальні дані для розрахунків одержували, використовуючи імпульсний метод підживлення різними джерелами вуглецю (по 5 - 10 мл 5го розчину глюкози, лактози, ксилози, ацетату та етанолу), вимірюючи при цьому концентрацію кисню в повітрі, що виходить з ферментера. Вимірювання інтенсивності дихання проводили газо-балансовим методом за допомогою пульту газоаналізаторів ПГА (виробництва експриментального електромеханічного заводу фізико-енергетичного інституту, Латвія). Біологічне споживання кисню визначали шляхом інтегрування кривої інтенсивності змін його концентрації.

Ростові характеристики T. на твердому поживному середовищі досліджували, використовуючи платівки кремньокислого гелю, що були насичені рідким середовищем Чапека з різною концентрацією глюкози (0,005 - 40 г/л). Відповідні розрахунки здійснювали загальновідо-мими методами [Тrinci, 1971]. Периферійну зону росту визначали морфометричним методом з покривними скельцями [Bainbridge, 1976].

В умовах глибинного культивування пелетний та нитчастий ріст отримували шляхом зміни рН-середовища, температури, концентрації інокулюму. Біомасу визначали ваговим методом. Вміст вуглецю в біомасі та культуральній рідині встановлювали шляхом спалювання зразків у кисні з наступним вимірюванням об’єму вуглецевого газу в аналізаторі АН 7560 (Гомельский завод вимірювальних приладів). Вміст метаболітів визначали з урахуванням неспожитої глюкози.

Для руйнування агломератів конідій спорову суспензію обробляли за допомогою установки УЗДН-2 при силі струму 0,2 мА, частоті 22 кГц впродовж 1; 3; 5; 8 хвилин. Підрахунок конідій проводили в камері Горяєва.

З метою визначення тотипотентності конідій T. спорову суспензію вносили в середовище Чапека при рН ,0. Через 24 години інкубації при оптимальній для цього гриба температурі біомасу відокремлювали від культуральної рідини фільтруванням. Конідії, що не проросли в цих умовах, осаджували центрифугуванням, поділивши навпіл, та інкубували як за умов "пелетного" (рН ,0), так і "нитчастого" росту (рН ,0). Усі операції проводили в стерильних умовах. Підрахунок конідій здійснювали у камері Горяєва та статистично обробляли. Результати експериментів фіксували візуально.

При виконанні робіт по визначенню впливу передісторії посівного матеріалу, на формоутворення T. проводили на середовищі Чапека з відповідними стосовно рН умовами розвитку пелетної чи нитчастої форми. Посівний матеріал для наступного культивування одержували шляхом гомогенізації дводобового міцелію за допомогою гомогенізатора MPW-302 та в різній кількості вносили в середовище Чапека. Через 48 годин культивування гриба фіксували форму росту та визначали кількість біомаси.

При дослідженні впливу поживних речовин на морфологію міцелія в середовище вносили азотнокислий амоній в концентрації від 0,025 до 2, та глюкозу – від 0,05до 8В дослідах з визначення впливу кисню на формоутворення перші 10 годин культивування проводили з використанням аргону. Вплив механічної дії оцінювали при зміні швидкості обертання мішалки (120 - 140 оберт/хв.) та в системі барботажу. Оцінка міцелію проводилася як візуально, так і при мікроскопіюванні (у тому числі конідій на різних етапах проростання) у світловому, фазово-контрастному, електронному та атомно-силовому мікроскопах. Ультратонкі зрізи конідій фіксували КМnО4 и 1им розчином ОsO4 у веронал-ацетатному буфері з рН ,3 [Степанюк, Квасников, 1981]. У процесі дегідратації конідії обробляли 2вим розчином уранілацетату та контрастували, використовуючи цитрат свинцю. Аналізували конідії в електронному мікроскопі "JEOL", Японія, при збільшенні у 10 - 40 тис. разів.

Дослідження структури поверхні конідій, а саме адгезійних та в’язкопружних її властивостей, провадили методом атомно-силової мікроскопії (АСМ) [Binnig et al., 1986] за допомогою AСM DI NanoScope a, серії Dimention 3000. Вимірювання здійснювали у резонансному режимі (tapping mode) з використанням стандартних зондів з нітриду кремнію (Si3N4). Радіус кривизни вістря зонду складав   нм, довжина консолі – 125 м, частота механічного резонансу – 300 - 340 кГц, швидкість сканування дорівнювала 4,2 м/с. При АСМ одночасно з картографуванням висоти рельєфу (топографії) фіксувалася зміна коливань зонда, що дозволяло після обробки на ЕОМ кількісно визначати адгезійні та в’язкопружні властивості досліджуваної поверхні.

Візуалізацію приклітинних вуглеводів при розвитку конідій T. здійснювали за допомогою лектинів, що мічені колоїдним золотом. Зразки досліджували в електронному мікроскопі ЕМВ-БР (Суми, Україна) при збільшенні у 10 - 20 тис. разів. Підготовка проб здійснювалася за методикою [Скрипаль и др., 1996]. Використовували рослинні лектини сої, картоплі, пшениці, фасолі, конканавалін А виробництва "Лектинотест" (Львів, Україна).

Визначення АТФ проводили біолюмінесцентним методом на LKB-люмінометрі, попередньо відмивши інтактний міцелій від культуральної рідини та обробивши його 5%-им розчином трихлороцетової кислоти [Lundin et al., 1976]. Пул ендогенного цАМФ и цГМФ визначали, використовуючи набір реактивів "Amersham". Підготовка проб міцелію та конідій проводилася згідно з методикиою [Scott, Solomon, 1975]. Дію екзогенного цАМФ вивчали, вносячи 0,1 - 1,6 мМ на початку культивування конідій та на стадії експонен-ціального росту гриба. Теофілін вносили в ті самі строки в концентрації 10 мМ. Дія солей кальцію на формоутворення міцелію вивчалася при внесенні кальцію: хлористого 1 - 100 мМ, оцетовокислого 1 - 30 мМ, сірчанокислого 0,1 - 100 мМ, вуглекислого 1 - 100 мМ та азотнокислого 1 - 500 мМ. Морфогенні концентрації хлористого кальцію (завбільшки 30 мМ) вносили на різних стадіях розвитку гриба: в стадії набряку конідій, в період їх проростання, в період створення септ та на початку розгалуження. З метою інгібування кальмодуліну застосовували хлорпромазин (5 - 200 мМ), а для інгібування кальцієвих каналів – веропаміл (1 мМ).

Дослідження дії одно- та двохвалентних солей на характер росту T. проводили, використовуючи хлористий калій, натрій, амоній, кальцій, магній, стронцій, нікель, цинк у концентрації від 10 до 100 мМ.

Участь цитоплазматичної мембрани (ЦПМ) у процесах формоутворення досліджували методом інгібіторного аналізу, використовуючи ністатин (3 мкг/мл), 2,4-динітрофенол (60 мкМ/мл), фторцианід-м-хлорфенілгідразон (FCCP) (6 мкМ/мл) та високі концентрації хлористого калію (від 100 до 900 мМ). Інгібітори вносили на різних стадіях культивування. Експозиція складала від 15 хвилин до 1 години. Проби ретельно відмивали, тричі центрифугуючи при 4000 оберт/хв. 5 хв., та продовжували культивування у свіжому поживному середовищі без інгібітору. Вплив інгібіторів оцінювали за морфологією міцелію, візуально та при його мікроскопії.

Інтенсивність ендогенного дихання визначали полярографічним методом (полярограф LP-7) у 0,2 М фосфат-цитратному буфері в діапазоні рН ,5-8,0. Рівень ендогенного дихання відбивали в н.г-атомах О2 мг-1 білка хв.-1. Досліди проводили в термостатованій комірці при температурі 37 С для T. и 28 С для C. у 0,2 М натрій-фосфатному буфері.

Як хімічні та функціональні аналоги мембранотропних ауторегуляторів використовували 4-н-гексилрезорцин (аналог d1) та олеїнову кислоту (аналог d2) [Єль-Регістан, 1988] (у концентраціях: 6·10-3; 6·10-4; 6·10-6; 6·10-7; 6·10-8; 6·10-9 М, та - 0,01; 0,1 - 1,0 об.% відповідно). Для підрахунків діаметру та кількості агломератів використовували мікроскоп типу МПБ-2.

Електричні властивості конідій досліджували методом мікроелект-рофорезу [Глоба, Гордієнко, 1980]. Ступінь гідрофобності конідій визначали у пробах з додаванням н-гексадекану [Rosenberg et al., 1980]. Наявність лектинів досліджували за реакцією гемаглютинації кролячих еритроцитів [Луцик и др., 1980].

Дію поверхнево-активних речовин на агрегацію конідій та ріст Cladosporium cladosporioides встановлювали при внесенні в поживне середовище катіонної ПАР (ацетилтриметиламонію броміду) в концентраціях 0,001 - 0,1аніонної ПАР (додецилсульфату натрію) в концентрації від 0,001до 0,01та не іонних ПАР (стеарокс-920, гідронол -200, твін-80) у концентраціях від 0,01 до 0,1

Клітинні стінки пелетного та нитчастого міцелію одержували шляхом гомогенізації препаратів на гомогенізаторі MPW-302 впродовж 2, 4, 6 хвилин та обробки міцелію ультразвуком при 22 кГц 5 - 7 хвилин з наступним відмиванням зразків, тричі центрифугуючи їх при 5000 оберт/хв. впродовж 5 хв.

Склад клітинних стінок та біомаси міцелію аналізували методом ІК-спектроскопії на приладі UR-20 (Німеччина). Результати кількісного аналізу окремих компонентів відображено у відсотках від ваги абсолютно сухої біомаси. Вміст амінокислот у біомасі визначали за допомогою амінокислотного аналізатора ААА-339 Т "Мікротехніка" після гідролізу міцелію при 105 оС 6соляною кислотою впродовж 24 - 48 годин. Енергетичні витрати при біосинтезі амінокислот розраховували по коефіцієнтах, запропонованих у роботах [Stouthamer, 1973; Иванов, Стабникова, 1987].

Вплив інгібіторів генної експресії на формоутворення T. досліджували додаючи до середовища культивування: актиноміцин Д (20; 50 мкг/мл "Rеanal" Угорщина), рибонуклеазу В (РНКаза В) (0,02; 0,2; 2,0; 20,0 мкг/мл) ICN "Biomedical" USA, DL-етіанін (0,1; 1,0; 10,0; 20,0 мкг/мл) ICN "Biomedical", пуроміцин (0,1; 1,0; 10,0; 20,0 мкг/мл) "Fluka" (Switzerland).

Протопласти одержували з різних ділянок нитчастого та пелетного міцелію шляхом обробки його комплексом літичних ферментів травного соку виноградних равликів. Особливості протопластування детально викладено в роботі [Блажчук и др., 1991]. Фракціонування протопластів досягали шляхом різної експозиції досліджуваного міцелію у літичному середовищі з наступним відокремленням їх шляхом центрифугування.

Вимірювання спонтанної хемілюмінесценції (СХЛ) у діапазоні 200 - 650 нм проводили за допомогою хемілюмінометру ХЛМЦ-О1 (Україна) за методикою [Барабой и др., 1991]. Вимірювання механоемісії (МЕ) у діапазоні 100 Гц - 0,1 МГц було проведено на приладі ТРА-3 зі застосуван-ням методики, що описана [Орел и др., 1994]. Побудову фазового портрету МЕ спор проведено за допомогою комп’ютерної програми Microsoft Excel ,0.

Розрахунки енергії взаємодії конідій у рідкому середовищі Чапека було проведено за відповідними формулами, поданими в роботах [Кройт, 1955; Seaman, 1967; Napper, 1983; Bell et al., 1984;]. Значення вихідних параметрів одержано експериментально та з літературних джерел. Усі розрахунки та графічні роботи проводили за допомогою комп’ютерної програми Microsoft Excel 2000.

Статистична обробка даних проведена загальноприйнятими методами [Ашмарін, Воробйов, 1961].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вивчення дії системи формоутворюючих факторів у мікроміцетів.

Для перевірки висунутої нами гіпотези щодо адаптивності форми міцелію до умов культивування ми дослідили характер росту меланінсинтезуючих грибів, а також термофільного мікроміцету T.(Apinis) Malloch et Cain (T 37 - 42 oC) та мезофільного Chaetomium globosum (T 25 - 28 oC). Ці мікроорганізми відрізнялися також оптимальними для життєдіяльності значеннями кислотності середовища (рН ,0 для T., рН 7,0 для C. globosum).

На прикладі T. та C. показано, що кислотність середовища, температура інкубації та концентрація посівного матеріалу є морфогенними факторами, які визначають форму міцелію. Відмінність одержаних нами результатів за відомими з літератури даними полягає в тому, що в оптимальних для життєдіяльності мікроміцетів умовах фіксували нитчасту форму росту, а у несприятливих – пелетну. З даних таблиць та 2 видно, що форма міцелію залежить від початкових значень рН середовища, але перш за все вона визначається фізіологічними особливостями мікроміцетів. Низькі значення рН, висока температура та концентрація посівного матеріалу сприяють розвитку нитчастої форми термофільного гриба T., тоді як пелетний ріст відмічався при високих значеннях рН, низькій температурі та концентрації інокулюма. Для мезофільного організму C. нитчаста форма відповідає високим значенням рН, низькій температурі, у той час як пелетна низьким значенням рН та високій температурі.

Таблиця 1

Вплив рН середовища та концентрації інокулюму на формування міцелію, T. (змив спор з твердого середовища)

Таблиця 2

Вплив концентрації інокулюму та рН середовища на
морфологію C. (T 25 oC)

Ці дані вказують на адаптивний характер формоутворення грибів. Разом з тим впливу кисню, вуглерод- та азотвміщуючих субстратів (0,5 – 2на морфологію не виявлено. Виключення становлять високі концентрації глюкози (більше 3котрі призводять до розвитку нитчастого міцелію у презумптивно пелетному рості. Додавання глюкози при культивуванні конідій з "нитчастою" стратегією росту не впливало на форму розвинутого міцелію, залишаючи її нитчастою.

Показано, що пелетоутворення C., у першу чергу, обумовлено високим (99,8 0,17ступенем гідрофобності конідій та нерівністю їх поверхні, що пов’язано з наявністю меланінового пігменту (рис. ). Обробка спорової суспензії ультразвуком впродовж 7 хвилин призводила до повного руйнування агломератів. Але після цього спори знов коагулювали з утворенням у перші хвилини дрібних, а через деякий час – великих (до 100 - 200 од.) агрегатів. З метою гідрофілізації поверхні конідій у середовище вносили катіонні, аніонні та неіоногенні поверхнево-активні речовини (ПАР).

Рис. . Електронограми ультратонких зрізів конідій C. (а) та його alb-мутанту (б).

Як показали наші дослідження, їх дія була неефективною. Гідрофобність вдалося знизити лише до 70Усі ПАР відзначалися токсичністю по відношенню до C.. З метою зниження ступеня обростання грибом обладнання та одержання більш однорідної за розмірами та формою біомаси можна рекомендувати вводити в середовище Твін-80 (0,001Пелетна форма C., на наш погляд, є наслідком високої резистентності цього гриба до умов зовнішнього середовища, про що свідчить характер росту alb-мутанту, гідрофобність поверхні якого дорівнює 14  ,7Незважаючи на відсутність меланіну при зміні умов культивування (рН, температуру, концентрацію інокулюму та ін.), мутантний штам розвивався тільки у пелетній формі.

Дослідження, проведені з іншими темнозабарвленими грибами: C., C., A., U., підтвердили ці висновки та продемонстрували, що за допомогою факторів зовнішнього середовища регулюються біосинтетичні процеси, розміри пелет та морфологія гіф, ступінь конідіації, адгезивні властивості. Однак всі ці зміни відбуваються у межах единої програми пелетного росту.

Експериментально було показано, що передбаченість розвитку інкубованих конідій в нитчасту або пелетну форми відсутня, тобто вони тотипотентні.

На прикладі T. доведена відсутність початкової запрограмованості розвитку конідій у нитчасту чи пелетну форми, тобто їх тотипотентність. Показано, що крім факторів зовнішнього середовища велике значення має передісторія посівного матеріалу. Форма міцелію, що використовується як посівний матеріал впливає на форму наступного покоління, визначаючи як точку переходу від однієї форми до іншої, так і межі її розповсюдження. Тобто, якщо інокулюм представлено подрібненим нитчастим міцелієм, то нитчаста форма розвивається в межах рН ,0 - 5,0 при різних концентраціях інокулюму. У цьому випадку пелетна форма проявляється при рН ,0 та рН ,0 лише при низьких концентраціях посівного материалу. Межі існування гриба за фактором рН звужуються. При рН ,0 - 8,0 спостерігається мізерний ріст, що морфологічно фіксується як суспензія (табл. ).

У випадку пелетної передісторії у широких межах рН фіксується ріст у вигляді кульок. Нитчастий ріст зафіксовано лише при рН ,0, концентрації інокулюму 1410-4 г/100мл. При рН ,0 (концентрація інокулюму 7-14 10-4 г/100мл ) та при рН ,0 відмічається змішаний ріст. Гриб розвивається при рН ,0 - 8,0, створюючи пелети та "крупу" (табл. ).

Таблиця 3

Вплив рН середовища та концентрації інокулюму на формування
міцелію з нитчастою передісторією

Таблиця 4

Вплив рН середовища та концентрації інокулюму на формоутворення
міцелію з пелетною передісторією

Значення рН при якому здійснюється перехід від однієї форми міцелію до іншої позначимо як точку переходу. Скориставшись прийнятою нами формалізацією, позначимо явище зміни форми міцелію по відношенню до

попереднього росту при певних умовах культивування як "ціна переходу". Припустимо, що мікроміцети розвивалися у вигляді нитчастих форм, тобто в умовах S1 (рис. ). |

Рис. . "Ціна" переходу адаптивных форм (АФ). К1(S) нитчаста форма, K2(S) пелетна форма. КР коефіцієнт розмноження запропонований Горбань [1984]; S умови культивування.

Потім обривки міцелію було інокульовано в умови S2 , отже з них повинні розвиватися пелети. Вводимо величину Р2,1 0 та назвемо її "ціною переходу" від нитчастої до пелетної стратегії росту. Зміст її полягає в тому, що при позначеному переході КР буде дорівнювати не К2(S), а

K2(S)exp[-P2,1]. (1)

Витрати на "переключення" програм, що відображені в частках КР формулою (1), означають, що реально перехід здійсниться не при переході зовнішних умов через точку S*, а при переході їх через точку S+, що визначається рівнянням:

K2(S+) = K2(S*)exp [-P2,1], S+>S*. (2)

Аналогічна картина спостерігається при зворотньому переході від пелет до нитчастого росту. Інтервал (S-,S+) визначається певним фізіологічним статусом міцеліальних клітин та при фіксованих внутрішніх станах не змінюється. Природньо назвати його інтервалом гістерезису при переході від однієї адаптивної форми до другої (рис. ):

Рис. . Гістерезис в переходах між адаптивними формами: 1,2 – частка колоній у вигляді АФ1 та АФ2; стрілки вказують на зміну екологічних умов.

По обидва боки від точки перетину логарифму відношення коефіцієнтів розмноження двох різних АФ повинні мати різний знак. Ця ситуація називається структурно-стійкою.

Одержані дані дозволяють обгрунтувати явище гістерезису в переходах між адаптивними формами, що є одним з доказів прояву самоорганізації.

Встановлено, що програма формоутворюючих процесів сприймається клітиною в стадії набряку конідій, котра відповідає на кривій росту лаг-фазі. Це період компетентності в морфогенезі глибинного міцелію. Саме в цей час, за нашими даними, проявляється чітка часова залежність сприйняття конідіями гриба морфогенного сигналу (рис. ). Як у випадку пелетної, так і нитчастої стратегії росту зміна умов культивування у період появи ростової трубки сприяє змішаному росту, що можна пояснити неодночасним проростанням конідій. Зміна умов культивування на більш піздніх етапах розвитку мікроміцетів впливала на морфологію міцелію тільки у межах кожної форми (пелетної чи нитчастої).

Порівняння одержаних даних з літературними відомостями про дріжджово-гіфальний диморфізм дозволяє зробити висновок про загальні закономірності цих процесів та пояснити необхідність зупинки клітинного циклу для "включення" програм з морфогенезу з позицій теорії саморозвитку.

Вивчення ультраструктури та сил молекулярної взаємодії поверхні конідій T. методом атомно-силової мікроскопії показало, що зміна

Рис. . Схема керування морфологією міцелію шляхом зміни зовнішніх умов у період лаг-фази.

цих показників відбувається не тільки внаслідок їх набряку, але й залежно від спрямованості формоутворюючих процесів. На початку культивування поверхня конідій (у режимі картографування зміни фази коливань зонда) виглядає як зерниста структура (рис. ). Поряд з хаотично розподіленими зернами (розміром близько 50 нм) фіксуються ланцюжки з окремих зерен довжиною 100 - 200 нм. Ця картина відрізняється від так званих "rodlet", білкових структур, які за даними літератури [Dufrene et al., 1999; Белозерская, 2001] визначають гідрофобність поверхні у більшості мікроміцетів. Їх відсутність на поверхні конідій T. співпадає з показниками її гідрофільності (61,1  ,2

Рис. . Поверхня конідій T. у режимі реєстрації зсуву фази коливань зонда (АСМ).

У процесі набряку конідій структура поверхні змінювалася. Поверхня конідій з нитчастою стратегією росту на протязі 8 - 10 годин культивування демонструвала лише зернисту структуру (30 - 80 нм) та відрізнялася від початкової більш рідким покриттям поверхні. Фібрилярні структури з’являлися на поверхні конідій, що не проросли лише через 18 годин (рис. ). У випадку презумптивно пелетного росту на поверхні конідій відмічено фібрилярні структури шириною близько 10 нм та довжиною до 260 нм.

Рис. . Поверхня конідій T. з презумптивно нитчастим ростом через 18 годин культивування.

Поруч з ними спостерігалися зернисті утворення з латеральними розмірами 100 х  нм. При культивуванні на протязі 10 годин довжина фібрилярних структур збільшувалась до 1000 нм. Кількість зернистих утворень зменьшувалась (з 20 до 5 од/нм), але їх розміри збільшувалися до 300 - 400 нм (рис. ).

Рис. . Поверхня конідій T. з презумптивно пелетним ростом через 10 годин культивування.

У цей період спостерігається зниження адгезивних та в’язко-пружних властивостей конідій (рис. ), більш виражене у нитчастому варіанті. Це може бути пов’язано з тим, що у процесі набряку поверхня конідій набуває більшої пластичності. Але на фоні загального зниження сил взаємодії в окремих ділянках поверхні сили адгезії можуть збільшуватися [Dufrene et al., 1999].

Рис. . Залежність в’язко-пружних властивостей конідій від часу та умов культивування, наведена як величина зсуву фаз між керуючим та реєструючим сигналами АСМ: а пелетна стратегія, б нитчаста стратегія.

Одержані розрахункові дані підтвердили висновки, зроблені Геріном та співавторами [Gerin at al., 1993, 1999], про можливу участь полісахаридних містків в агрегації конідій та неспроможність припущень про провідну роль у пелетоутворенні електричних властивостей поверхні конідієспор.

Аналіз енергетичних кривих показав, що сили ван-дер-ваальсового тяжіння домінують над силами електростатичного відштовхування незалежно від значення електрокінетичного потенціалу поверхні конідій. Це означає, що на основі врахування тільки електростатичної взаємодії конідії грибів у поживному середовищі Чапека повинні завжди коагулювати. Значення -потенціалу конідій T. при рН ,0 наближаються до ізоелектричної точки, однак саме в цих умовах ми спостерігаємо нитчастий міцелій.

У дійсності поряд з розвитком пелетного ми спостерігаємо розвиток нитчастого міцелію та утворення пелет з поодиноких конідій. Випадки відсутності агрегації спор при дотриманні відповідних умов за електростатичними характеристиками можуть бути пов’язані з наявністю певного прошарку біомолекул на поверхні конідій, наприклад полісахариду (так звана стерична складова). З її урахуванням характер взаємодії конідій суттєво змінюється. При цьому має значення як відстань між конідіями, так і об’єм сегменту макромолекул, котрі утворюють адсорбовані прошарки навколо клітини (рис. ).

Рис. . Енергія взаємодії конідій гриба з урахуванням стеричної складової з різним об’ємом сегмента макромолекул (*10-28 м3): (1) – 0,5; (2) – 0,8; (3) – 1,0; (4) – 1,2; (5) – 1,4.

Наявність полісахариду при набряку конідій було підтверджено нами експериментально. Як видно з рис. , навколо взаємодіючих конідій спостерігається фаза з відмінними пружними характеристиками. При обробці зразків конканаваліном А, міченим колоїдним золотом, на електронограмі було виявлено оточуючі конідію контрастні частинки (рис. ). Це може свідчити про наявність вуглеводів у складі яких: Д-глюкоза, Д-маноза та N-ацетіл-D-глюкозамін.

Рис. . АСМ-зображення взаємодіючих у лаг-фазі конідій T. у режимі регістрації висоти (ліворуч) та зміни фази коливань зонду (праворуч).

Рис. . Електронограма конідії T. у стадії набряку, що оброблена конканаваліном А, міченим колоїдним золотом

(х тис.).

У межах низьких концентрацій полімеру домінує ефект флокуляції за містковим типом, тобто структурно-механічний тип взаємодії. Цей механізм може визначати взаємодію конідій при пелетоутворенні. При більш високих концентраціях полімеру спостерігається стерична стабілізація, що забезпечує розвиток окремих конідій, тобто нитчастого міцелію. Ми вважаємо, що вказаний механізм адгезії є специфічним. Біополімер синтезується самою клітиною за певних умов існування та у певні періоди розвитку. Тобто це дає змогу розглядати механізм пелетоутворення як прояв процесу адаптації.

Вивчаючи механізм рецепції та передачі в клітину морфогенного сигналу, ми дослідили участь у цьому процесі аналогів мембранотропних, універсальных для різних мікроорганізмів [Ель-Регістан, 1989], ауторегуляторів (4-н-гексилрезорцину та олеїнової кислоти). Показано, що вони впливають на синтез біомаси, діаметр та кількість пелет, але це відбувається в межах заданої фенотипової програми розвитку.

Участі лектинів у процесах формоутворення міцелію T. terrestris на стадії набряку конідій та їх проростання не виявлено. Гемаглютинуюча активність культуральної рідині і на поверхні клітин у випадку презумптивно нитчастого або пелетного міцелію не встановлена.

Аналізуючи стан конідій у лаг-фазі культивування, слід зазначити їх відмінності у характері електромагнітного випромінювання. З представлених на рис. результатів виміру спонтанної хемілюмінесценції (СХЛ) конідій видно, що у випадку презумптивно- нитчастого росту інтенсивність оптичного випромінювання вище (в середньому на 17від пелетного.

Рис. . Спонтанна хемілюмінесценція конідій T. з презумптивно нитчастим () та пелетним () міцелієм.

Параметричні впливи: (1) температура, (2) рН, (3) концентрація глюкози.

Найбільш відчутна різниця у випроміненні відмічена при зміні температури та концентрації в середовищі глюкози. Природньо, що досліджувані параметри впливали на характер випромінювання, але, як видно з контрольних вимірів (при відсутності конідій у пробах), ця тенденція була зворотньою (рис. ). Виключення складали виміри СХЛ під дією температури (з підвищенням температури інтенсивність випромінювання збільшується).

Рис. . Спонтанна хемілюмінесценція контрольних зразків середовища без конідій: (А) умови для нитчастого, (Б) для пелетного росту.

Параметри впливу ті ж самі, як на рис. 12.

За сучасними уявами, низькоінтенсивна люмінесценція біологічних об’єктів є безпосереднім результатом релаксації електронно-збуджених станів окремих молекул, що були активовані при проходженні вільнорадикальних окисних реакцій. Причиною більш низького рівня СХЛ конідій з презумптивно пелетною формою в порівнянні з нитчастою може бути інгібування продуктів вільнорадикального окислення як захисної реакції на неоптимальні умови зовнішнього середовища [Веселова и др., 1993]. Якщо взяти до уваги, що процеси формоутворення можуть бути обумовлені колективними механохімічними факторами, а зараз цей науковий напрям активно розробляється [Белоусов, Миттенталь, 1992], то доцільно було дослідити механоемісію (МЕ) конідій при різних параметричних впливах середовища культивування.

Аналізуючи одержані дані, слід відмітити більш хаотичний характер випромінювання у конідій з пелетною стратегією, в порівнянні з нитчастою (рис. ). Площа атрактора у передбачених пелет була на 25більше. Ця тенденція зберігалася через 20 годин після початку культивування, хоча не в такій мірі.

Рис. . Фазовий портрет механоемісії конідій T. з