ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

КАМІНСЬКА МАРТА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 577.1:579.22:663.12/14:636.087

КАРОТИНОГЕНЕЗ У РІЗНИХ ШТАМІВ ДРІЖДЖІВ PHAFFIA RHODOZYMA

ТА ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ У ЖИВЛЕННІ КУРЕЙ-НЕСУЧОК

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Львів – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор Сологуб Леонід Ілліч, Інститут біології тварин УААН,

завідувач лабораторії обміну речовин.

Офіційні опоненти : доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник

Стапай Петро Васильович,

Інститут біології тварин УААН,

завідувач лабораторії фізіолого-біохімічних основ вовноутворення;

доктор біологічних наук, професор

Гончар Михайло Васильович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляторних систем клітини.

Провідна установа – Державний науково-дослідний контрольний інститут ветпрепаратів і кормових добавок, відділ фармакології та імунології Міністерства аграрної політики України, м. Львів

Захист відбудеться “ 14 ” березня 2006 р. о “ 10 ” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН за адресою: вул. Стуса, 38, м. Львів, 79034.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: вул. Стуса, 38, м. Львів, 79034.

Автореферат розісланий “ 13 ” лютого 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Віщур О. І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Організація повноцінного живлення тварин і птиці – необхідна умова інтенсифікації сучасного тваринництва. Велике значення при цьому має забезпечення раціонів білково-вітамінними добавками, ферментними препаратами, амінокислотами та іншими біологічно активними речовинами (БАР), які прискорюють ріст та підвищують продуктивність тварин і птиці (Калунянц К. А., Ездаков Н. В., Пивняк И. Г.,1980).

Одним із важливих джерел балансування кормів сільськогосподарських тварин і птиці є дріжджі. В Україні традиційними кормовими дріжджами є Saccharomyces cerevisiae i Candida tropicalis. За даними літератури (Квасников Е.И., Щелокова И.Ф., 1991), добавка їх біомаси до корму не забезпечує повної його збалансованості за біологічно активними речовинами. Тому створення нових кормових препаратів залишається актуальним. Резервом для цього є нетрадиційні дріжджі, які здатні синтезувати широкий спектр біологічно активних речовин. До них належать, наприклад, дріжджі Pichia guilliermondii і Candida famata, які здатні синтезувати підвищені кількості вітаміну В2, та Phaffia rhodozyma, біомаса яких є джерелом каротиноїдів та інших біологічно активних речовин.

В Україні виробництво кормових дріжджів, як джерела каротиноїдів не налагоджено. Біомасу, збагачену каротиноїдами, виготовляють з використанням як продуцента гетероталічного мукорового гриба Blakeslea trispora (Феофилова Е. П., 1994). Вартість такої біомаси досить висока, що робить її малодоступною для більшості господарств. Відомо, що каротиноїди є важливими компонентами системи антиоксидантного захисту (САЗ) в організмі тварин (Olson J., 1993). Вони відіграють значну роль в інактивації активних форм кисню, котрі негативно впливають на організм (Куртяк Б. М., Янович В. Г., 2004). Тому доцільно селекціонувати штами, що синтезують підвищені кількості каротиноїдів для збагачення раціону тварин і птиці цими біологічно активними речовинами.

У літературі є мало даних стосовно селекції та залежності каротиногенезу від умов вирощування штамів дріжджів P. rhodozyma, їх біохімічної характеристики та застосування у годівлі тварин, зокрема птахів. Тому отримання штамів, надсинтетиків каротиноїдів, вибір оптимальних умов вирощування, біохімічна характеристика селекціонованих штамів та дослідження впливу біомаси як кормової добавки на організм птиці є актуальною проблемою для цієї галузі тваринництва.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт лабораторії мікробіологічного синтезу біологічно активних речовин Інституту біології тварин УААН і виконувалась у межах таких завдань: “Розробити ефективні способи отримання нових форм вітамінів, білково-вітамінних препаратів на основі сучасних біотехнологічних методів та вивчити фізіолого-біохімічні основи їх використання” (номер держреєстрації 0198U009006); “Селекція нових штамів мікроорганізмів – продуцентів біологічно активних речовин та розроблення технології їх виробництва” (номер держреєстрації 0101U003436), в яких автор досліджувала умови селекції та біохімічний склад біомаси, процеси перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) та зміни стану САЗ у курей за умов використання у раціоні біомаси дріжджів P. rhodozyma.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було отримати штами дріжджів P. rhodozyma з підвищеним рівнем синтезу каротиноїдів, встановити оптимальні умови вирощування для посиленого каротиногенезу, провести їх біохімічну характеристику, з’ясувати вплив добавки біомаси селекціонованих штамів на інтенсивність ПОЛ, активність ферментів САЗ в організмі молодняку і курей-несучок, їх продуктивність та якість яєць.

У задачі роботи входили дослідження:–

факторів, що викликають мутації в напрямку надсинтезу каротиноїдів у дріжджів P. rhodozyma;–

умов вирощування мутантних штамів для максимальної продукції каротиноїдів;–

біохімічних параметрів штамів-надсинтетиків;–

впливу добавки каротиносинтезуючих дріжджів на процеси ПОЛ і САЗ у курей-несучок та молодняку курей, продуктивність та якість яєць.

Об’єкт дослідження. Каротиногенез та селекція у штамів дріжджів P. rhodozyma – надсинтетиків каротиноїдів, САЗ та ПОЛ у курей-несучок та молодняку.

Предмет дослідження. Визначення продуктивності культур P. rhodozyma за кількістю каротиноїдів, визначення продуктів ПОЛ, активності ферментів САЗ, якості яєць, умов селекції, вирощування штамів-надсинтетиків.

Методи дослідження. Біохімічні – визначення білкового та ліпідного складу клітин різних штамів, вмісту каротиноїдів, кількісного вмісту продуктів ПОЛ та показників САЗ; морфометричні – визначення якості яєць; генетичні – отримання штамів-надсинтетиків; статистичні – оцінки вірогідності одержаних результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. У результаті ступінчатої селекції штамів дріжджів P. rhodozyma отримано нові штами-мутанти, що синтезують підвищені кількості каротиноїдів (до 1 мг/г сухої маси (мг/г с. м.)). Підібрано оптимальні умови вирощування селекціонованих штамів для максимального росту і каротиногенезу.

Вперше досліджено білковий та ліпідний склад штамів дикого типу і селекціонованих варіантів. При цьому встановлено характерні особливості у біохімічному складі біомаси дріжджів P. rhodozyma. Для них характерним є високий вміст лізину (до 5 %) та низький вміст метіоніну (до 0,1 %), а також високий вміст ненасичених жирних кислот, зокрема олеїнової.

Показано позитивний вплив добавки біомаси дріжджів P. rhodozyma до корму на процеси ПОЛ і активність ферментів САЗ в тканинах курей, продуктивність та якість яєць. Встановлено зростання вмісту каротиноїдів у жовтку яєць у 2,3 раза при заміні 2 % кормових дріжджів такою ж кількістю каротиносинтезуючих дріжджів селекціонованого штаму.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано штам 6с дріжджів P. rhodozyma, надсинтетик каротиноїдів, що синтезує близько 1 мг каро-тиноїдів на грам сухої маси, придатний для промислового вирощування. Вивчено оптимальні умови культивування для отримання біомаси з високим вмістом каротиноїдів. Дріжджова біомаса, збагачена каротиноїдами використана у складі комбікормів для курей-несучок. Введення 2 % біомаси дріжджів P. rhodozyma до раціону курей підвищує їх продуктивність, збільшує масу яєць та покращує їх якість.

Особистий внесок здобувача. Здобувач особисто підготувала обґрунтування теми дисертаційної роботи, провела підбір і опрацювання літератури за темою дисертаційної роботи, розробила методичні підходи до вирішення поставлених завдань, освоїла необхідні методи досліджень, виконав експериментальну частину роботи. Планування, аналіз та обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи доповідались на таких наукових конференціях:–

міжнародній конференції “Фізіологія і біохімія сільськогосподарських тварин”, присвяченій 100-річчю від дня народження професора С. З. Гжицького (м. Львів, 2000 р.);–

аспірантській конференції, присвяченій 85-річчю від дня народження професора З. П. Скородинського (м. Львів, 2000 р.);–

науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів “Досягнення молодих вчених у вирішенні проблем тваринництва” (м. Львів, 2003 р.);–

міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 80-річчю від дня народження професора П. З. Лагодюка (м. Львів, 2004 р.);–

ІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції “Біотехнологія. Освіта. Наука” (м. Львів, 2004р.);–

науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів “Досягнення молодих вчених у вирішенні проблем тваринництва” (м. Львів, 2004 р.).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 7 наукових робіт, включаючи 6 статей і 1 тези, з них 4 – у фахових виданнях, отримано 1 патент на корисну модель.

Структура і об’єм дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків і пропозицій виробництву, списку використаних джерел літератури. Обсяг дисертації – 144 сторінки, в тому числі 30 таблиць і 5 рисунків (13 сторінок). Список використаних джерел включає 273 публікації, у тому числі 187 – закордонних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Складається з 3 підрозділів, у яких наведено дані літератури стосовно використання каротиноїдів у різних сферах життєдіяльності людини, годівлі тварин, характеристиці та використанню каротиносинтезуючих дріжджів Phaffia rhodozyma.

Загальна методика та основні методи досліджень. При виконанні роботи використовували штами дріжджів Phaffia rhodozyma: ВКМ 2274 – штам дикого типу з Всесоюзної колекції мікроорганізмів; NRRL Y-10921 – штам дикого типу, люб’язно наданий доктором біологічних наук, професором, п. М. В. Гончаром (Інститут біології клітини, м. Львів). Дріжджі P. rhodozyma штаму ВКМ-2274 культивувались у середовищі такого складу: КН2РО4 – 2 г/л; МgSO4x7H2O – 1 г/л; (NH4)2SO4 – 1 г/л; сахароза – 20 г/л; вітамін В1 – 200 мкг/л, у колбах Ерленмейера об’ємом 500 мл із 100 мл середовища при температурі 24 °С і постійному перемішуванні протягом 5-и діб. Для штаму NRRL Y-10921 та його похідних використовувалось середовище такого складу: КН2РО4 – 1 г/л; МgSO4x7H2O – 0,5 г/л; (NH4)2SO4 – 2 г/л; CaCl2 х6 Н2О – 0,1 г/л, дріжджовий екстракт – 2 г/л, сахароза – 20 г/л, біотин – 2 г/л, до якого для окремих дослідів вносили у відповідних концентраціях джерела вуглецю й азоту. Для приготування середовищ з промисловими субстратами використовували профільтровану післяспиртову барду, мелясу і пивне сусло. Культивування проводилось у колбах Ерленмейера на 500 мл із 100 мл середовища при температурі 20 °С і постійному перемішуванні протягом 5 діб.

Дослідження умов культивування (температури, аерації) проводились у апараті неперервного культивування АНКУМ-2М (загальний об’єм ферментера 20 л, робочий – 10 л) з мішалкою (300 об/хв). Засів проводили інокулятом 2-добової культури з розрахунку 0,3 – 0,5 г клітин/л середовища.

Для досягнення поставленої мети нами було проведено чотири етапи досліджень.

На перших етапах вивчали умови мутагенезу (тип мутагену, час дії), які забезпечили отримання штамів-надсинтетиків за ознакою каротиногенез. Визначали летальну та мутагенну дію мутагенів (нітрозогуанідин, УФ-промені) методом макроколоній (Суденко В. І., Квасников Є. І., 1977; Стент Г., Кэлиндар Р., 1981). Досліджували залежність виживання клітин після обробки УФ-променями від вмісту в них каротиноїдів.

У другій серії дослідів вивчали каротиногенез за оптимальних умов вирощування штаму-надсинтетика (вибір джерела вуглецю, азоту, промислових середовищ, кількості посівного матеріалу, температури, аерації, динаміки росту). Після вирощування культури визначали біомасу дріжджів (Егоров Н. С., 1986), вміст каротиноїдів (Крицкий М. С., Чернышева и др.,1977) та продуктивність культури.

Після вибору оптимальних умов вирощування клітин штаму-надсинтетика отриману біомасу досліджували за біохімічним складом: вмістом сирого протеїну (Остапець Н. Г., Романська Н. М., 1974), амінокислотним складом (Алексеенко, 1964), вмістом загальних ліпідів (Folch J., Lee M. е. a., 1957), співвідношенням окремих класів ліпідів (Кирхнер Ю., 1981), жирнокислотним складом ліпідів (Кейтс, 1975). У біомасі дріжджів визначали перетравність клітин мутантного штаму (Остапець Н. Г., Романська Н. М., 1974) у порівнянні з вихідним штамом та традиційними кормовими дріжджами.

З метою з’ясування впливу згодовування у складі комбікормів біомаси дріжджів надсинтетиків каротиноїдів Phaffia rhodozyma на організм курей і якість яєць проведено два досліди.

Перший дослід проведено у віварії Інституту біології тварин УААН на молодняку курей яєчного напряму продуктивності кросу Ломанн Браун починаючи з 30-денного віку. Було сформовано дві групи курей (контрольну і дослідну) по 20 голів у кожній, яким згодовували комбікорм ПК 3-4 ДСТУ № 18221-72. Для дослідної групи 2 % кормових дріжджів заміняли відповідною кількістю дріжджів Phaffia rhodozyma штаму 6с. Утримання і годівля курчат відповідали загальноприйнятій технології утримання молодняку курей. Контрольний і дослідний комбікорми були ізопротеїновими, ізокалорійними та збалансованими за основними елементами живлення. Тривалість досліду – 60 днів. У кінці досліду проведено забій птиці по 5 голів з групи і забір тканин для проведення біохімічних досліджень. У крові, тканинах печінки, підшлункової залози, слизової 12-палої кишки та яйцепроводу визначали вміст гідропероксидів ліпідів (Мирончик В. В., 1984) і малонового діальдегіду (Мартинюк В. Б. та ін., 1991).

Другий дослід проведено у господарстві ВАТ “Птахофабрика “Львівська” (с. Заставне, Буський р-н, Львівська обл.) на двох групах (контрольній і дослідній) курей-несучок кросу Ломанн Браун по 50 голів у кожній, віком 180 днів. Утримання і годівля курей відповідали загальноприйнятій технології кліткового утримання птиці з вільним доступом до корму і води. Курям контрольної та дослідної груп згодовували комбікорми ПК 1-18 ДСТУ № 18221-72.

Аналогічно досліду, проведеному на молодняку курей, у дослідному комбікормі замінювали 2 % кормових дріжджів відповідною кількістю каротиносинтезуючих дріжджів Phaffia rhodozyma. Комбікорми були збалансованими за основними елементами живлення.

Тривалість досліду – 60 днів. Протягом досліду вели облік яєчної продуктивності. У кінці досліду провели забій птиці по 5 голів з групи і взяли тканини для проведення біохімічних досліджень. У крові і тканині печінки визначали вміст гідропероксидів ліпідів (Мирончик В. В., 1984) і малонового діальдегіду (Мартинюк В. Б. та ін., 1991), а також активність антиоксидантних ферментів: супероксиддисмутази КФ 1.15.1.1 (Дубініна Е. Е. та ін., 1983), каталази КФ 1.11.1.6 (Королюк М. А. та ін., 1988), глутатіонпероксидази КФ 1.11.1.9 (Моин В. М., 1986). Для визначення якості яєць з кожної групи було відібрано по 10 яєць, у яких досліджували вміст каротиноїдів (Маслієва О. І., 1975), вітамінів А і Е (Скуріхін В. Н., 1991) та морфометричні показники яєць (Методики досліджень з фізіології та біохімії сільськогосподарських тварин, 1998).

Біометричну обробку одержаних результатів проводили на ПК за допомогою програми Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Отримання мутантних штамів дріжджів P. rhodozyma – надсинтетиків каротиноїдів за допомогою нітрозогуанідину та УФ-опромінення. Методом ступінчастої селекції з використанням нітрозогуанідину, коли відібраний мутант на першому етапі служить вихідним штамом на наступному етапі, отримано штами-надсинтетики, що синтезували приблизно у 3 – 4 рази більше каротиноїдів, ніж дикий штам. Однак, із кожним наступним етапом селекції спостерігається зменшення ефективності мутагенезу (у 3,5 та 1,7 раза відповідно на II та III етапах селекції).

У наших дослідженнях при дії УФ-опромінення на клітини дріжджів P. rhodozyma відзначено значно більшу стійкість до мутагену клітин штамів з підвищеним у 2,4 раза (р0,05) вмістом каротиноїдів, ніж штаму вихідного типу. При опроміненні виживає у 2 рази (р<0,05) більше клітин штаму-надсинтетика, ніж штаму дикого типу. Білі колонії мутантного штаму виявились чутливішими до дії опромінення, ніж клітини вихідного штаму в 10 разів, та ніж клітини штаму-надсинтетика у 20 разів. Це, очевидно, свідчить про захисну дію каротиноїдів від опромінення, що є однією із функцій каротиноїдних пігментів у клітині.

Після серії досліджень, пов’язаних з обробкою клітин штаму NRRL Y-10921 нітрозогуанідином, що характеризувались високим рівнем виживання клітин (2,7 %) та великим відсотком мутантних клонів (5,8 %), ми відібрали 4 штами (12а,14а, 3с, 6с), що синтезували від 0,576 до 0,826 мг каротиноїдів/ г с. м., що в 1,6 – 2,2 раза більше порівняно із штамом дикого типу. Ці штами були стабільними і не ревертували. Висушена при 24 °С та подрібнена біомаса цих штамів була використана для визначення біохімічного складу клітин.

Каротиногенез у дріжджів P. rhodozyma за різних умов культивування. Синтез каротиноїдів дріжджами відзначається генетичними особливостями та фізіологічним станом і залежить від умов культивування. Ми показали зменшення біомаси дріжджів на 11 % (р<0,05) із збільшенням вмісту сахарози у середовищі з 1 до 4 %. Потрібно відзначити також зростання вмісту каротиноїдів у клітинах мутантного штаму на 52 % (р<0,001) при зменшенні концентрації сахарози з 4 до 1%. Це, можливо, пояснюється катаболічною репресією вуглеводним субстратом каротиногенезу.

Досліджено вплив різних азотовмісних солей та їх концентрацій у середовищі на ріст та каротиногенез штаму 6с дріжджів Phaffia rhodozyma. Із зменшенням концентрації сульфату амонію у середовищі від 0,84 г/л до 0,14 г/л не змінюється кінцева кількість біомаси культури на 5-у добу, але зменшується інтенсивність каротиногенезу на 54 % (р<0,001). Продуктивність культури на середовищах з діамонійфосфатом при різних концентраціях була приблизно у 2 рази нижчою, ніж на середовищах з сульфатом амонію та в 1,3 раза нижчою, ніж на середовищах з сечовиною.

Відібрано два найкращі синтетичні середовища, які забезпечують високу продуктивність каротиногенезу (до 2 мг/л). Для них характерним є використання сульфату амонію, як джерела азоту та сахарози як джерела вуглецю.

З метою пошуку можливостей отримання в перспективі каротиноїдів у виробничих масштабах для потреб народного господарства за допомогою мікробіологічного синтезу нами проведено дослідження біосинтезу каротиноїдів дріжджами Phaffia rhodozyma на середовищах з відходами та напівпродуктами харчової промисловості (меляса, післяспиртова зернова барда, ячмінне сусло). Встановлено, що при рості на барді штам-надсинтетик 6с наростав за 4 доби до біомаси 2,69 г/л, але синтезував малу кількість каротиноїдів (до 0,1 мг/г с. м.). Можливо, у барді присутні речовини, що пригнічують каротиногенез. Що стосується меляси, то добавка її у синтетичне середовище стимулювала ріст культури в 1,7 раза (р0,05) відносно середовища з сахарозою, хоч також пригнічувала каротиногенез (вміст каротиноїдів на 57 % менший, р<0,001) У результаті добавки до середовища 1,5 % (за сухою речовиною) ячмінного сусла спостерігався в 1,5 раза (р0,001) вищий ріст культури, ніж у синтетичному середовищі, та інтенсивний каротиногенез у клітинах штаму (до 0,615 мг/л). Збільшення концентрації сусла в середовищі від 1,5 до 4,5 % не впливало на ріст та каротиногенез культури.

Аналіз отриманих даних свідчить, що оптимальною температурою для вирощування мутантного штаму 6с дріжджів P. rhodozyma на синтетичному середовищі з 1,5 % сусла є температура 20 °С. При цій температурі забезпечується нагромадження біомаси культури (4,81 г/л) та висока продуктивність (2,93 мг/л). Біомаса дріжджів при температурі 20 °С була в 1,3 раза (р0,001) вищою, ніж при температурі 24 °С, що свідчить про сповільнення росту клітин при температурі вищій від оптимальної.

Рис. 1. Динаміка росту клітин штаму 6с дріжджів P. rhodozyma за різних умов культивування 1 – температура 20 °С, аерація 0,3 л·хв-1·л-1 середовища; 2 – температура 20 °С, аерація 0,6 л·хв-1·л-1 середовища; 3 – температура 22 °С, аерація 0,3 л·хв-1·л-1 середовища; 4 – температура 22 °С, аерація 0,6 л·хв-1·л-1 середовища.

Рис. 2. Динаміка каротиногенезу штаму 6с дріжджів P. rhodozyma за різних умов культивування: 1 – температура 20 °С, аерація 0,3 л·хв-1·л-1 середовища; 2 – температура 20 °С, аерація 0,6 л·хв-1·л-1 середовища; 3 – температура 22 °С, аерація 0,3 л·хв-1·л-1 середовища; 4 – температура 22 °С, аерація 0,6 л·хв-1·л-1 середовища.

Зменшення виходу біомаси на фоні стабільного каротиногенезу привело до зменшення продуктивності культури при такій зміні температури.

Враховуючи отримані дані про ріст клітин (рис. 1) та вміст у біомасі каротиноїдів (рис. 2) при різній температурі та аерації, пропонуємо для культивування дріжджів Phaffia rhodozyma штаму 6с у лабораторних умовах такий режим вирощування: середовище з добавкою 1,5 % сусла, температура 20 °С, аерація 0,3 л·хв-1·л-1 середовища, час культивування – 120 годин. За таких умов біомаса клітин на 120 год досягала 4,82 г/л, а вміст каротиноїдів у біомасі – 0,610 мг/г с. м.

Характеристика хімічного складу клітин мутантних штамів дріжджів P. rhodozyma. У клітинах мутантних штамів дріжджів P. rhodozyma вміст протеїну, порівняно з вихідним штамом дикого типу коливається від 22,8 до 26,9 %.

Співставлення амінокислотного складу біомаси дикого та мутантного штаму 6с дріжджів P. rhodozyma вказує, що між ними немає достовірних відмінностей у вмісті окремих амінокислот. Для цих дріжджів характерний високий (до 5 %) вміст лізину, що збільшує цінність біомаси при використанні її як кормової добавки до раціону тварин, та низький (до 0,1 %) вміст метіоніну.

У біомасі штаму-надсинтетика 6с в 1,9; 4; 2,5; 1,9; 1,8 раза більший вміст відповідно лізину, гістидину, аргініну, гліцину та лейцину і в 3,8 раза нижчий вміст метіоніну, ніж для кормових дріжджів, що використовуються в раціонах тварин та птиці як джерело амінокислот та вітамінів.

Порівнюючи жирнокислотний склад клітин мутантних та вихідного штамів, відзначено менший вміст стеаринової (на 2 – 4 %) та олеїнової (на 5 – 11 %) кислот (табл. 1).

Для штамів 3с та 14а характерною виявилась більша кількість ненасичених жирних кислот на 9,5 та 8 % відповідно за рахунок збільшення вмісту лінолевої та ліноленової кислот. Ліпіди біомаси штаму 6с містять на 1,5 % більше насичених жирних кислот, у порівнянні з вихідним штамом.

Аналізуючи дані щодо жирнокислотного складу дріжджової біомаси, нами відзначено значний вміст ненасичених жирних кислот, таких як олеїнова, лінолева, ліноленова (сумарно біля 84 %) та насичених таких як пальмітинова. Порівнюючи жирнокислотний склад кормових дріжджів відзначаємо більший вміст у біомасі каротинсинтезуючих дріжджів штаму 6с пальмітинової (в 1,3 раза), стеаринової (в 1,6 раза) та олеїнової (у 2,2 раза) кислот на фоні меншого вмісту лінолевої (в 3,9 раза), що робить таку біомасу цінною ліпідною добавкою до раціонів тварин і птахів.

Таблиця 1

Жирнокислотний склад ліпідів дріжджів P.rhodozyma, % (М+m, n=3). |

Код

кис-лоти | Штами дріжджів P.rhodozyma

10921 | 6с | 3с | 14а

Лауринова | 12:0 | 0,080,02 |

0,070,02 | 0,030,01 | 0,020,01

Міристинова | 14:0 | 0,500,01 | 0,630,02

** | 0,150,01

*** | 0,260,02

***

Пальмітинова | 16:0 | 15,920,62 | 19,451,12 | 11,530,73

* | 11,200,59

**

Пальмітолеїнова | 16:1 | 2,260,07 | 2,260,07 | 0,780,06

*** | 1,150,04

***

Стеаринова | 18:0 | 7,480,89 | 5,290,54 | 2,820,45

** | 4,540,47

*

Олеїнова | 18:1 | 68,992,15 | 63,542,86 | 47,750,98

*** | 47,771,61

**

Лінолева | 18:2 | 3,440,30 | 7,090,44

** | 33,061,37

*** | 29,241,19

***

Ліноленова | 18:3 | 1,310,08 | 1,640,06

* | 3,870,16

*** | 5,810,11

***

насичених | 23,98 | 25,44 | 14,53 | 16,02

ненасичених | 76,00 | 74,54 | 85,46 | 83,97

Загальна сума | 99,98 | 99,98 | 99,99 | 99,99

Примітка. Різниця в даному показнику і в показнику для штаму 10921 (дикий тип) вірогідна (*– р<0,05, ** – р<0,01 і *** – р<0,001).

Вивчаючи фракційний склад ліпідів біомаси у мутантних штамах 14а, 12а, 3с та 6с ми встановили на 8,5 % (р<0,01); 13,7 % (р<0,01); 5,3 % (р<0,05); 18,6 % (р<0,001) відповідно менший вміст фосфоліпідів (табл.2).

Таблиця 2

Характеристика фракційного складу ліпідів штамів дріжджів P. rhodozyma, (М+m, n=3).

Показник | Штами

10921 | 14а | 12а | 3с | 6с

Вміст каротиноїдів, мг/г с. м. | 0,370+0,008 | 0,576+0,012

*** | 0,686+0,009

*** | 0,734+0,008

*** | 0,826+0,020

***

Загальний вміст

ліпідів, % до с. м.

в тому числі: фосфоліпіди

діацилгліцероли

холестерол

вільні жирні кислоти

триацилгліцероли

ефіри холестеролу | 16,95+0,05

26,53+0,95

11,54+0,72

13,03+1,64

21,41+1,47

15,29+1,63

12,39+1,18 | 21,50+0,10

***

17,99+1,44

**

12,92+2,32

10,09+1,09

21,28+1,82

16,39+1,61

21,33+1,00

** | 25,70+0,95

***

12,85+2,15

**

11,96+1,03

12,67+3,01

11,52+1,51

**

25,22+0,64

**

25,79+1,42

** | 15,50+0,35

*

21,25+1,39

*

15,31+1,66

12,41+1,67

13,44+0,41

**

18,29+1,41

9,30+3,41 | 17,90+0,20

**

7,95+0,42

***

9,59+1,89

8,60+1,95

13,74+0,88

*

39,00+1,91

**

21,11+1,89

*

Примітка. Різниця в даному показнику і в показнику для штаму 10921 (дикий тип) вірогідна (*– р<0,05, ** – р<0,01 і *** – р<0,001).

У штамів 14а, 12а, 3с, 6с на 1,1 %; 9,9 % (р<0,05); 3,0 %; 23,7 % (р<0,01) відповідно більше триацилгліцеролів, ніж у штаму вихідного типу. Збільшення загальної кількості ліпідів у клітинах штамів-надсинтетиків, можливо, відбувається за рахунок каротиноїдів, котрі, як неполярні речовини, є у комплексі з ліпідами.

Вплив згодовування дріжджів P. rhodozyma штаму 6с у складі комбікормів для молодняку і дорослих курей на вміст продуктів пероксидації ліпідів та активність ферментів системи антиоксидантного захисту в їх організмі. Отримані дані свідчать, що згодовування дослідного комбікорму молодняку курей впливало на рівень продуктів пероксидації ліпідів у організмі (табл. 3).

Таблиця 3

Вміст продуктів пероксидації ліпідів у організмі молодняку курей та курей-несучок (М±m, n=5).

Показники | Групи

Контрольна | Дослідна

Кров (молодняк)

Гідропероксиди ліпідів, од. Е480/мл | 0,760±0,032 | 0,537±0,024***

Малоновий діальдегід, мкмоль/мл | 1,006±0,125 | 1,015±0,187

Кров (кури-несучки)

Гідропероксиди ліпідів, од. Е480/мл | 0,709±0,073 | 0,590±0,051

Малоновий діальдегід, мкмоль/мл | 1,750±0,171 | 1,247±0,083*

Печінка (молодняк)

Гідропероксиди ліпідів, од. Е480/г | 5,830±0,427 | 4,705±0,350

Малоновий діальдегід, мкмоль/г | 4,744±0,399 | 4,320±0,030

Печінка (кури-несучки)

Гідропероксиди ліпідів, од. Е480/г | 12,433±0,913 | 11,200±1,900

Малоновий діальдегід, мкмоль/г | 2,393±0,214 | 2,363±0,238

12-пала кишка (молодняк)

Гідропероксиди ліпідів, од. Е480/г | 2,375±0,159 | 1,850±0,126*

Малоновий діальдегід, мкмоль/г | 2,083±0,198 | 2,500±0,213

Підшлункова залоза (молодняк)

Гідропероксиди ліпідів, од. Е480/г | 3,025±0,315 | 2,450±0,247

Малоновий діальдегід, мкмоль/г | 6,346±0,484 | 6,955±0,489

Яйцепровід (молодняк)

Гідропероксиди ліпідів, од. Е480/г | 2,325±0,149 | 1,150±0,119***

Малоновий діальдегід, мкмоль/г | 3,045±0,302 | 1,699±0,132**

Примітка. Різниця в даному показнику між дослідною і контрольною групами вірогідна (*– р<0,05, ** – р<0,01 і *** – р<0,001).

Так, у крові молодняку дослідної групи, яким згодовували у складі комбікорму біомасу каротиносинтезуючих дріжджів, на 29 % (р<0,001) знижувався рівень гідропероксидів ліпідів, у порівнянні з контрольними курми. Концентрація кінцевого продукту пероксидації ліпідів у курей обох груп була однаковою.

У тканині печінки суттєвих змін у досліджуваних показниках не виявлено, але встановлена помітна тенденція до зниження інтенсивності процесів пероксидації ліпідів.

Відмінностей у концентрації гідропероксидів ліпідів не спостерігалось також і в слизовій 12-палої кишки. Однак у молодняку дослідної групи на 22 % (р<0,05) знизився рівень малонового діальдегіду, в порівнянні з птицею, яку утримували на раціоні без додавання каротино-синтезуючих дріжджів. Деяке зниження цього продукту пероксидації ліпідів проходило і у тканині підшлункової залози на фоні незмінного рівня гідропероксидів ліпідів. З досліджуваних тканин підшлункова залоза характеризувалась найвищим рівнем малонового діальдегіду.

Згодовування курям дослідного комбікорму призвело до зниження вмісту досліджуваних показників у тканині яйцепроводу. Так, у молодок дослідної групи, у порівнянні з контрольною, у 2 рази знизився рівень гідропероксидів ліпідів (р<0,001) і на 44 % (р<0,01) вміст малонового діальдегіду.

Введення до складу комбікорму дорослих курей-несучок 2 % біомаси дріжджів Phaffia rhodozyma впливало на стан системи антиоксидантного захисту та вміст продуктів пероксидації ліпідів у їх тканинах.

Показано, що у крові курей дослідної групи на 28 % (р<0,05) знизився рівень малонового діальдегіду, в порівнянні з контрольними курми. При цьому концентрація гідропероксидів ліпідів у курей цієї групи теж була дещо нижчою. У тканині печінки відзначено тенденцію до зниження процесів пероксидації ліпідів у курей дослідної групи.

Аналізуючи дані щодо активності ферментів системи антиоксидантного захисту в крові курей, встановлено зростання каталазної активності у плазмі дослідної птиці в 1,8 раза (р<0,001), у порівнянні до контрольної. Супероксиддисмутазна активність суттєво не змінювалась в еритроцитах крові курей контрольної і дослідної груп.

Стосовно активності глутатіонпероксидази, то зміни мали діаметрально протилежний характер. Зокрема, активність цього ферменту в еритроцитах дослідних курей була у 1,5 раза (р<0,001) вищою, ніж у контрольних.

Згодовування у складі комбікорму біомаси дріжджів P. rhodozyma штаму 6с призвело до зростання активностей деяких антиоксидантних ферментів у тканині печінки. Зокрема, у тканині печінки курей дослідної групи на 22,5 % (р<0,05) зросла супероксиддисмутазна і на 18,2 % (р<0,05) каталазна активності, у порівнянні з аналогічними показниками у контрольних курей. Глутатіонпероксидазна активність при цьому не зазнавала суттєвих змін.

Таким чином, одержані результати свідчать про те, що введення у комбікорм 2 % дріжджів Phaffia rhodozyma знижує інтенсивність процесів пероксидації ліпідів та стабілізує систему антиоксидантного захисту організму як молодняку курей, так і дорослої птиці.

Вплив згодовування дріжджів P. rhodozyma штаму 6с у складі комбікормів для курей-несучок на продуктивність та якість яєць. При заміні частини кормових дріжджів у раціоні курей-несучок біомасою дріжджів P.rhodozyma штаму 6с фізіологічних змін у всіх дослідних курей не виявлено. Поряд з цим прослідковували незначне збільшення приросту маси дослідних курочок порівняно з контрольними. Курочки, до раціону яких вносили біомасу цих дріжджів, почали заноситись на 6 днів швидше, а їх продуктивність була на 4 % вищою, ніж у курей контрольної групи.

Поряд із підвищенням яйценосності спостерігалось збільшення маси яєць у середньому на 1,5 г за рахунок білка та маси шкаралупи. Змін у кислотності білка та жовтка та у коефіцієнтах рефракції не відзначено.

Стосовно каротиноїдів, то їх вміст у жовтку яєць курей дослідної групи збільшився у 2,3 раза (р<0,001) на фоні деякого зростання вмісту вітаміну А (табл. 4).

Таблиця 4

Вміст каротиноїдів, вітамінів А і Е у жовтку яєць при згодовуванні курям біомаси дріжджів

P. rhodozyma штаму 6с ( М+m, n=10).

Показники | Контрольна група | Дослідна група

Каротиноїди, мкг/ г | 14,380,97 | 32,251,44***

Вітамін А, мкг/ г | 5,830,93 | 7,530,48

Вітамін Е, мкг/ г | 101,9813,65 | 91,6611,06

Примітка. Різниця в даному показнику між дослідною і контрольною групами вірогідна (*– р<0,05, ** – р<0,01 і *** – р<0,001).

Таким чином, біомаса дріжджів P. rhodozyma, селекціонованих нами мутантних штамів – надсинтетиків каротиноїдів, при використанні у вигляді кормової добавки до раціону птиці, підвищує його кормову цінність, у результаті чого збільшується продуктивність курей та покращуються якісні показники яєць.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що полягає в отриманні нових штамів дріжджів Phaffia rhodozyma з покращеним синтезом каротиноїдів, придатних для промислового використання. Підібрано оптимальні умови їх вирощування та склад середовища. Вивчено біохімічний склад біомаси вихідного та мутантних штамів, у порівнянні з кормовими дріжджами. Досліджено вплив добавки біомаси дріжджів Phaffia rhodozyma на інтенсивність перебігу процесів перекисного окиснення ліпідів та стан системи антиоксидантного захисту в організмі курей різних вікових груп. Встановлено позитивний вплив біомаси дріжджів штаму 6с на продуктивність курей та якість яєць.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1.

2.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

АНОТАЦІЇ

Камінська М. В. Каротиногенез у різних штамів дріжджів Phaffia rhodozyma та їх застосування у живленні курей-несучок. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біології тварин УААН, Львів, 2005.

Робота присвячена селекції штамів дріжджів P. rhodozyma – надсинтетиків каротиноїдів, визначенню умов, що стимулюють ріст та продуктивність різних штамів, вивченню біохімічних характеристик біомаси у порівнянні з кормовими дріжджами та іншими добавками у корм птиці, дослідженню впливу добавки біомаси дріжджів P. rhodozyma до раціону курей на процеси перекисного окислення ліпідів та стан системи антиоксидантного захисту.

Методом ступінчатої селекції з використанням нітрозогуанідину отримано штами дріжджів P. rhodozyma, що продукують до 1 мг каротиноїдів на грам сухої маси клітин. Показано резистентність клітин до дії УФ-променів залежно від вмісту в них каротиноїдів.

Підібрано оптимальний склад середовища та режим культивування для отримання більшого виходу дріжджової біомаси та каротиноїдів мутантних штамів у лабораторних умовах.

Представлено хімічну характеристику біомаси селекціонованих штамів. Визначено вміст білка, жирнокислотний та фракційний склад ліпідів біомаси дріжджів P. rhodozyma.

Вперше використано як добавку до раціону курей-несучок та молодок біомасу мутантного штаму дріжджів P. rhodozyma, надсинтетика каротиноїдів. Досліджено позитивний вплив цієї добавки на процеси перекисного окиснення ліпідів, стан системи антиоксидантного захисту, продуктивність птиці та якість яєць.

Ключові слова: дріжджі, каротиноїди, селекція, кормова добавка.

Каминская М. В. Каротиногенез у разных штаммов дрожжей Phaffia rhodozyma и их использование в кормлении кур-несушек. – Рукопись

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биологии животных УААН, Львов 2005.

Работа посвящена селекции штаммов дрожжей P. rhodozyma, сверхсинтетиков каротиноидов, определению условий, которые стимулируют рост и продуктивность различных штаммов, изучению химических характеристик биомассы по сравнению с кормовыми дрожжами и другими добавками в корм птиц.

Методом ступенчатой селекции с использованием химического мутагена нитрозогуанидина выделено четыре штамма дрожжей P. rhodozyma 6с, 12а, 14а, 3с, которые продуцируют от 0,6 до 0,9 мг каротиноидов на грамм сухой массы, что в 2–3 раза больше, по сравнению со штаммом дикого типа. Исследовано резистентность клеток к действию УФ-лучей в зависимости от содержания в них каротиноидов.

Разработан лабораторный режим культивирования мутантных штаммов P. rhodozyma на среде с использованием сусла. Выбраны оптимальные источники углерода и азота, температурный режим и