Національна академія наук України

Інститут молекулярної біології та генетики

ПАНАСЮК ГАННА ГРИГОРІВНА

УДК 577.218

577.217

Функціональна взаємодія кінази S6 рибосомного білка S6K1 та протеїнкінази 2

03.00.03 - молекулярна бiологiя

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата бiологiчних наук

КИЇВ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі структури та функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник: кандидат медичних наук, старший науковий співробітник

Гут Іван Тарасович,

Інститут молекулярної біології та генетики

НАН України,

провідний науковий співробітник відділу структури та функцій нуклеїнових кислот.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Негруцький Борис Сергійович,

Інститут молекулярної біології та генетики

НАН України,

завідувач лабораторії біосинтезу білка

відділy механізмів трансляції генетичної інформації;

доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

Київcький національний університет

імені Tapaca Шевченкa,

професор кафедри біохімії.

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАН України, м.Київ.

Захист відбудеться “23” травня 2006 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ-680, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Автореферат розіслано ____ квітня 2006 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В.Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Нормальне функціонування організму передбачає координовану регуляцію росту, проліферації та диференціації кожної клітини. Відповідно, порушення контролю цих процесів призводить до цілої низки важких патологій, у тому числі, і до злоякісної трансформації клітин. Регуляція ж цих процесів на молекулярному рівні відбувається за рахунок передачі позаклітинних стимулів, що індукуються гормонами, факторами росту, цитокінами від рецепторів клітинної мембрани до відповідних компартментів клітини (ядро, рибосоми, мітохондрії), що, в свою чергу, призводить до зміни експресії відповідних генів як на рівні транскрипції, так і на рівні трансляції мРНК. Сама передача такого позаклітинного стимулу опосередкована функціонуванням множинних сигнальних каскадів, в основі яких покладено принцип послідовних білково-білкових та білково-ліпідних взаємодій, що залежать від пострансляційних модифікацій білків чи ліпідів, наприклад фосфорилювання/дефосфорилювання (Taniguchi et al., 2006).

Детальне вивчення та з’ясування закономірностей передачі позаклітинних стимулів лежить в основі розуміння шляхів міжклітинної комунікації та регуляції функціонування окремо взятої клітини.

Однією із регуляторних ланок сигнальних шляхів є родина Ser/Thr протеїнкіназ S6 білка 80S рибосом (S6K1 та S6K2), що належать до РІ3К/mTOR-залежного сигнального шляху, який є одним із провідних у регуляції основних клітинних функцій, а саме росту клітин, проліферації, диференціації та апоптозу (Volarevic et al., 2001). Згідно існуючої на сьогоднішній день моделі, регуляція активності S6K відбувається за рахунок фосфорилювання/дефосфорилювання множинних сайтів, індукованого позаклітинними мітогенними стимулами (Harrington et al., 2005). Цілий ряд білкових кіназ та фосфатаз здатні використовувати S6K як субстрат in vitro, але молекулярні механізми регуляції активності S6K кіназ in vivo достеменно невідомі.

Найбільш досліджена активність S6К полягає у фосфорилюванні рибосомного білка S6 і, як наслідок, активації трансляції цілого субкласу мРНК, що кодують компоненти апарату трансляції – рибосомні білки та деякі фактори трансляції (Fingar et al., 2004). На сьогодні існують підтвердження того, що з активацією S6К пов’язана активація транскрипції генів рибосомних РНК і, відповідно, функціонування S6К1 безпосередньо пов’язане з регуляцією біогенезу рибосом (Hannan et al., 2003). Таким чином, S6K є одним із ключових ензимів, причетних до регуляції білкового синтезу індукованого мітогенними стимулами.

Доведено, що S6К здатна фосфорилювати in vitro цілу низку інших субстратів, а саме: проапоптичний білок BAD; білок SKAR, що бере участь у сплайсингу мРНК; фактор транскрипції CREM; субстрат інсулінового рецептора (IRS); фактор ініціації трансляції білкового синтезу 4В (eIF4B) (Thomas, 2002).

Беручи до уваги вище зазначене, дуже актуальним є ідентифікація нових білків-партнерів (субстратів або індукторів) S6K1, особливо із використанням методичних підходів, що максимально відповідали б умовам in vivo або ж підтвердження існування in vivo вже виявлених in vitro взаємодій, що дасть змогу виявити нові функціональні зв’язки в сигнальних системах.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась за бюджетною темою №2.2.4.10 – “Дослідження сигнальних шляхів при злоякісній трансформації та пошук пухлиноспецифічних антигенів” (номер державної реєстрації - 0101U000360, 2001-2005рр.), а також у рамках співробітництва з Інститутом ракових досліджень Людвіга (Велика Британія) згідно договору про наукове співробітництво від 1999р.

Мета та завдання дослідження. Метою дослідження було ідентифікувати білки-партнери активованої форми кінази рибосомного білка S6 із використанням методу двогібридної системи дріжджів та проаналізувати функціональне значення виявлених взаємодій у клітині. Відповідно до мети було поставлено такі завдання:

1. Розробити високоефективний метод трансформації клітин дріжджів кДНК бібліотекою.

2. Провести скринування кДНК бібліотеки клітин лінії НеLa із використанням “байт”-конструкції активованої форми S6K1 Т412D та відібрати позитивні клони, що містять кДНК потенційних білків-партнерів.

3. Визначити нуклеотидні послідовності кДНК позитивних клонів та ідентифікувати їх за базою даних первинних послідовностей GenBank.

4. Експресувати рекомбінантні S6K1-зв’язувальні білки у клітинах бактерій та очистити їх до гомогенності. Отримати моноклональні антитіла проти S6K1-зв’язувальних білків.

5. Підтвердити існування виявлених взаємодій in vitro та in vivo методом імунопреципітації білково-білкових комплексів.

6. З?ясувати функціональний зв’язок між S6K1 та S6K1-зв’язувальними білками.

Об’єкт дослідження – молекулярні механізми функціонування сигнальних систем клітини.

Предмет дослідження – механізми регуляції S6K1-опосередкованого сигналювання.

Методи дослідження – двогібридна система дріжджів, клонування кДНК фрагментів у плазмідні конструкції, метод сайт-спрямованого мутагенезу, тимчасова трансфекція клітин ссавців кДНК конструкціями, імунопреципітація та Вестерн-блот аналіз, конфокальна сканувальна мікроскопія, визначення ензиматичної активності S6К1 та протеїнкінази 2 (СК2), субклітинне фракціонування клітин.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблено високоефективний метод трансформації клітин дріжджів з їхнім подальшим вирощуванням у напіврідкому середовищі.

За допомогою методу двогібридної системи дріжджів шляхом аналізу кДНК бібліотеки клітин лінії HeLa із використанням мутантної форми S6K1 Т412D як “байту” ідентифіковано десять S6K1-зв’язувальних білків, вісім з яких ідентифіковано вперше.

Показано, що одним із 8 нових S6K1-зв’язувальний білків є регуляторна субодиниця протеїнкінази 2 (СК2). Доведено існування комплексу S6K1-CK2 in vitro. Показано, що S6K1 здатна утворювати комплекс in vivo не лише з регуляторною субодиницею СК2, а і з каталітичними - СК2 та .

Ідентифіковано новий in vitro сайт фосфорилювання СК2 у складі S6K1 – Ser17.

Методами конфокальної мікроскопії клітин та субклітинного фракціонування виявлено, що субклітинна локалізація S6K1 змінюється у відповідь на дію ростових факторів. Показано роль фосфорилювання СК2 Ser17 у складі S6K1 у регуляції експорту S6K1 з ядра клітини.

Запропоновано модель регуляції ядерно-цитоплазматичного транспорту S6K1.

Отримано моноклональні антитіла проти рекомбінантної СК2.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати дають можливість охарактеризувати низку закономірностей функціонування S6K1 та механізмів, які лежать в основі передачі S6К1-опосередкованих регуляторних сигналів.

Отримано моноклональні антитіла проти СК2в, що можуть бути використані для подальшого дослідження функціональних особливостей зв'язку між S6K1 та СК2 у різних типах клітин і тканин імунохімічними та імуногістохімічними методами.

Матеріали дисертаційної роботи можуть бути використані у спецкурсах з молекулярної біології та біохімії для студентів біологічних факультетів.

Особистий внесок здобувача. Всі дослідження виконувались за безпосередньої участі здобувача. Обробку і аналіз отриманих результатів виконано особисто пошукачем. Експерименти з використанням дріжджової двогібридної системи було виконано спільно з к.б.н. О.М. Живолупом і к.б.н. І.О. Немазаним; метод трансформації клітин дріжджів кДНК бібліотекою з подальшим вирощуванням трансформантів у напіврідкому агарозному середовищі розроблено спільно з к.б.н. І.О. Немазаним. Дослідження субклітинної локалізації S6K1 та мутантів із використанням конфокальної мікроскопії виконували спільно з к.б.н. І.О. Немазаним. Автор висловлює подяку д.б.н., с.н.с. В.В. Філоненку та к.б.н. О.М. Живолупу за корисні поради та зауваження під час підготовки експериментів та в обговоренні отриманих результатів. Автор щиро вдячний к. мед. н., с.н.с. І.Т. Гуту за керівництво, корисні поради у плануванні експериментів та в обговоренні результатів. Одержані результати обговорено та опубліковано в спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації апробовано на семінарах відділу структури та функцій нуклеїнових кислот та наукових конфереnнціях ІМБіГ НАНУ і представлено у вигляді усних та стендових доповідей на ІV Парнасівській конференції (Вроцлав, Польща, 2002), на VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), на 17-му конгресі Європейської асоціації ракових досліджень (EACR) (Мадрид, Іспанія, 2002), на спеціальному конгресі FEBS із сигнальних шляхів (Брюссель, Бельгія, 2003), на Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), на 29-му конгресі FEBS (Варшава, Польща, 2004), на IV Конференції із сигнальних шляхів (Дубровник, Хорватія, 2004), на V Парнасівській конференції (Київ, 2005), на 30-му Конгресі FEBS (Будапешт, Угорщина, 2005), на Конференції присвяченій молекулярним механізмам передачі сигналу в клітині в нормі та при злоякісній трансформації (Спетцес, Греція, 2005).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 11 праць, з них 4 статті у фахових наукових журналах, та тези 7 доповідей у збірниках матеріалів з’їздів і конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел, який охоплює 209 найменувань. Дисертацію викладено на 150 сторінках стандартного машинопису, вона містить 32 рисунки та 4 таблицi.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. У роботі використано двогібридну систему дріжджів DupLexA фірми OriGene (США). Великомасштабну трансформацію дріжджових клітин кДНК-бібліотекою клітин лінії HeLa (OriGene, США) проведено згідно модифікованого нами протоколу (Panasyuk et al., 2002). Скринування і тестування позитивних клонів методом статевого злиття проведено відповідно до оригінального кількісного методу (Живолуп та інші, 2000) та згідно з рекомендаціями виробника.

При виконанні роботи використовували лінії клітин ембріональної нирки людини (НЕК293) та фібробластів миші (NIH3T3). Клітини культивували в середовищі DMEM, яке містило 10% телячої ембріональної сироватки, 2 мМ L-глутамін, 10 мкг/мл пеніциліну і 0,25 мкг/мл стрептоміцину.

Для створення рекомбінантних форм СК2 кДНК послідовності ампліфікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції з використанням специфічних олігонуклеотидів із відповідними сайтами розпізнавання ендонуклеазами рестрикції. Ампліфіковану і плазмідну ДНК розщеплювали відповідними ендонуклеазами рестрикції. Очищені фрагменти ДНК лігували, використовуючи ДНК лігазу фірми “Fermentas” (Литва) згідно з протоколом виробника.

Для одержання мутантних форм S6K1, що містили точкові мутації, використовували набір для мутагенезу “Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit” (“Stratagene”, США). Нуклеотидну послідовність кДНК отриманих мутантних форм S6K1 визначали за допомогою автоматичного секвенатора ABI 377 (“Applied Biosystem”, США).

Трансфекцію клітин НЕК293 та NIH3T3 плазмідними ДНК здійснювали, використовуючи реагенти ExGene (“Fermentas”, Литва) та Lipofectamine 2000 (“Invitrogene”, США), згідно з протоколами виробників. Через 24 години після трансфекції середовище замінювали на безсироваткове та клітини інкубували ще 36 годин. Стимуляцію клітин здійснювали додаванням ембріональної сироватки телят до кінцевої концентрації 10%. В експериментах із використанням інгібіторів кіназ клітини інкубували у присутності зазначених концентрацій рапаміцину (15 хв) чи TBB (4,5,6,7-тетрабромобензотриазол) (3, 6, 9 годин) перед стимуляцією сироваткою, або ж інгібітори у зазначених концентраціях додавали у середовище.

Імунопреципітацію рекомбінантних форм кіназ, злитих із ЕЕ-таг епітопом та рекомбінантних форм СК2 та СК2/? з Мус-таг епітопом та НА-епітопом відповідно, здійснювали, інкубуючи лізати клітин із анти-ЕЕ-таг, анти-Мус-таг та анти-НА-таг моноклональними антитілами і білок-А-сефарозою (“GE-healthcare”, CША). Аналіз імунопреципітатів проводили методом Вестерн-блот аналізу.

Активність S6К1 в імунопреципітатах визначали, використовуючи як субстрат 40S субчастинки рибосом, очищені з гомогенату печінки щура (Thomas et al., 1978). Продукти кіназної реакції розділяли електрофорезом у 12,5%-му поліакриламідному гелі, а рівень фосфорилювання S6 білка визначали за допомогою PhosphorImager(„BioRad”, Велика Британія).

Активність СК2 визначали, використовуючи рекомбінантну СК2 (“NEB”, США) згідно рекомендацій виробника. Продукти кіназної реакції розділяли електрофорезом у поліакриламідному гелі, а рівень фосфорилювання S6K1 або казеїну визначали за допомогою PhosphorImager.

Для імунофлуоресцентних досліджень використовували клітини лінії NIH3T3, що були трансфіковані відповідними плазмідами. Клітини фіксували 4%-им параформальдегідом та обробляли відповідними антитілами. Флуоресцентно мічені клітини досліджували за допомогою конфокального лазерного сканувального мікроскопа Zeiss LSM510, а зображення аналізували за допомогою програми LSM510.

Збагачені ядерні фракції клітин NIH3T3 та НЕК293 отримували згідно з описаною раніше методикою, чистоту отриманих фракцій аналізували Вестерн-блотом за допомогою специфічних антитіл: проти -тубуліну – маркеру цитоплазматичної фракції, проти ламіну А/С або топоізомерази-І – маркерів ядерної фракції.

Результати досліджень та обговорення.

Розробка високоефективного методу трансформації клітин дріжджів штаму EGY-48 кДНК бібліотекою клітинної лінії HeLa. Для пошуку білків-партнерів S6K1 в роботі було використано двогібридну систему дріжджів. Пошук білків-партнерів цим методом передбачає на першому етапі проведення великомасштабної трансформації клітин дріжджів кДНК бібліотекою. Стандартний протокол трансформації середньостатистичної кДНК бібліотеки (106 незалежних клонів) вимагає розсіву клітин-трансформантів на більш ніж двадцять чашок діаметром 150мм при густині колоній 5/мм2. Такий підхід є трудомістким, вимагає великої кількості реактивів, а головне – ріст колоній на чашці є нерівномірним, що стає причиною втрати цілісності бібліотеки. Розроблений нами підхід, який оптимізований для трансформації за допомогою ацетату літію, дозволяє отримати високу ефективність трансформації та забезпечує рівне оточення для росту кожної колонії, таким чином успішно зберігаючи цілісність первинної бібліотеки. Протокол було розроблено базуючись на кількох опублікованих методиках, однак саме внесені модифікації дозволяють використовувати меншу кількість реактивів для досягнення тієї ж ефективності трансформації. Застосування цього протоколу дозволило досягнути ефективності трансформації – 0,25–1х106 колоній/мкг плазмідної ДНК або 2–8х106 незалежних колоній на 400 мл напіврідкого агарозного середовища.

Аналіз позитивних клонів ідентифікованих шляхом скринування кДНК бібліотеки ембріона миші 19-дня розвитку з використанням як байту S6K1 дикого типу з застосуванням традиційного та модифікованого протоколів підтвердив ефективність останнього.

Ідентифікація зв’язувальних білків активованої форми S6K1. Для пошуку білків-партнерів активованої форми S6K1 проскриновано кДНК бібліотеки клітинної лінії HeLa (107 первинних клонів) байт-конструкцією LexA/S6K1 T412D, де було впроваджено мутацію, що мімікрує фосфорильований, тобто активований стан S6K1 (рис.1А). Для трансформації було використано штам дріжджів (EGY48) з максимально чутливим до активації репортерним геном Leu2 і максимально чутливу репортерну плазміду pSH18-34 з геном LacZ. Скринування проводили шляхом розсіву первинних трансформантів на селективне leu-, ura-, his-, trp- агаризоване середовище з галактозою, а після 48 годин інкубації на поверхню чашок нашаровували розчин агарози з X-gal.

Позитивні клони відбирали за здатністю клітин рости на селективному середовищі та за -галактозидазною реакцією. За результатами скринування було відібрано для подальшого аналізу 28 клонів, що містили кДНК потенційних білків-партнерів S6K1 T412D. На наступному етапі для підтвердження специфічності позитивних клонів використовували метод статевого злиття, що базується на явищі злиття двох гаплоїдних дріжджових клітин, які несуть різні плазміди (в одній байт - конструкція та репортерна плазміда pSH18-34, а в іншій плазміда, що кодує потенційний партнер LexA/S6K1 T412D), з подальшим аналізом фенотипу диплоїдних клітин (рис.1Б).

Згідно з отриманими даними було підтверджено галактозозалежність LacZ+, Leu+ фенотипів для 25 із 28 клонів, що підтверджує специфічність взаємодії LexA/S6K1 T412D. Взаємодії з неспецифічним байт-білком плазміди рBait, що є негативним контролем системи, не виявлено. Аналогічним методом було проаналізовано специфічність взаємодії партнерів S6K1 T412D з байтом S6K1 дикого типу. Відповідно як байт у цих експериментах використовували LexA/S6K1. Було виявлено, що більшість ідентифікованих партнерів S6K1 T412D взаємодіють з S6K1 (23 з 25). Це свідчить на користь того, що фосфорилювання за Thr 412 і як наслідок конформаційні зміни не впливають на виявлені білково-білкові взаємодії в клітинах дріжджів. Натомість для двох білків-партнерів S6K1 фосфорилювання за Thr 412 виявилось важливим для взаємодії.

Ідентифікація кДНК позитивних клонів, підтверджених методом статевого злиття. Секвенування відібраних клонів здійснено в Людвігівському Інституті (Лондон, Велика Британія) з використанням автоматичного секвенатора ABI Prizm. Для ідентифікації кДНК позитивних клонів було проведено пошук за базою даних первинних послідовностей GenBank з використанням програми BLAST. Таким чином ідентифіковано кДНК усіх клонів і показано, що вони кодують такі білки (Таблиця 1).

Серед виявлених партнерів S6K1 T412D, два клони кодували вже відомий партнер S6K1 – Rac-1 (Chou et al., 1996). Цікаво, що саме ці два клони при підтвердженні взаємодії методом статевого злиття не взаємодіяли з S6K1 дикого типу. Крім того, кДНК одного клону відповідала послідовності протеїнкінази PDK-1, про взаємодію якої із S6K1 також було показано раніше (Pullen et al.,1997). Інші білки як зв’язувальні партнери S6K1 в клітинах дріжджів ідентифіковані вперше. Цікавим білком-партнером S6K1 є індукований солями миш’яку білок, що зв’язується з РНК (AIRAP), для якого було виявлено два клони. Раніше було показано активацію S6K1 саме солями миш’яку (Wang et al., 1997). Дещо несподіваною є присутність аж 12 клонів одного й того ж білка з невідомою функцією – TRAP, що взаємодіє із білком скафолду PTAIRE2. Серед інших увагу привертають клони рибосомних білків L17 та S4X однак їх, як і білки цитоскелету та фактори транскрипції і трансляції, в багатьох скринуваннях з неспорідненими байт-білками виявляють як зв’язувальні партнери, і тому загалом зараховують до фальш-позитивів. Однак виявлення цих білків є цікавим оскільки відомо, що S6K1 асоціює з цитоскелетом (невідома функція), а також впливає на біосинтез білка, зокрема і через фосфорилювання рибосомного білка S6. Крім того, серед ідентифікованих білків кДНК трьох незалежних клонів кодували регуляторну в субодиницю СК2. Протеїнкіназа 2 є Ser/Thr кіназою, що не належить до РІ3К сигнального шляху (Olsten et al., 2004). Це надзвичайно консервативний і убіквітарно експресований білок, регуляція якого до кінця не з’ясована. При аналізі взаємодії S6K1 та субодиниці протеїнкінази 2 в клітинах дріжджів було підтверджено зв’язування СК2 з S6K1 дикого типу і мутантною формою (рис. 1Б).

Для деяких білків, що взаємодіють з СК2 та фосфорилюються було з’ясовано фізіологічну роль такого фосфорилювання, що полягає в регуляції субклітинної локалізації білків-субстратів СК2, зміні стабільності та активності білків. Оскільки субклітинна локалізація та активність S6K1 також регулюються під впливом мітогенних стимулів, то на роль одного із регуляторів цілком може претендувати і СК2. Відповідно, подальшу роботу було спрямовано на визначення фізіологічного значення взаємодії СК2 та S6K1.

Отримання моноклональних антитіл проти CK2в. Для подальшого аналізу взаємодії СК2 з S6K1 було отримано моноклональні антитіла проти субодиниці СК2. Для цього СК2 було клоновано в експресійний вектор pET42a у рамці з полігістидиновою послідовністю та GST і очищено з клітин E.coli з використанням Ni-NTA агарози. Очищений білок CK2-6His-GST використовували як антиген для імунізації мишей. Злиття клітин селезінки з мієломними клітинами лінії SP2/0 проводили згідно з описаним протоколом.

Відбір позитивних гібридомних клонів, що продукують антитіла проводили з використанням як антигену СК2-6His-GST та 6His-GST. В результаті було відібрано десять гібридних клонів, що продукують специфічні до CK2 антитіла, три з яких очищено за допомогою білок А сефарози із асцитної рідини, та п’ять, що впізнають 6His-GST.

Згідно даних наведених на рис.2, анти-СК2 антитіла (CK2-3, CK2-5, CK2-7) ефективно розпізнають ендогенний антиген у тканинах тварин та культивованих клітинах як у Вестерн-блот аналізі, так і при імуногістохімічному визначенні.

Підтвердження взаємодії між S6K1 та CK2 in vitro. Підтвердження взаємодії між СК2в та S6K1 було проведено in vitro двома шляхами. До іммобілізованої на глутатіон сефарозі CK2-6His-GST додавали експресовану в бакуловірусній системі рекомбінантну S6K1. Комплекси між СК2в та S6K1 надалі виявляли Вестерн-блотом з використанням поліклональних анти-S6K1 антитіл (рис.3). Контролем слугували зразки, в яких тестували неспецифічне зв’язування S6K1 до іммобілізованого на глутатіон сефарозі 6His-GST білка або ж лише до глутатіон сефарози. Як видно з наведених даних, S6K1 специфічно взаємодіє з в субодиницею СК2, але не з 6His-GST, та не зв’язується неспецифічно до глутатіон сефарози.

В іншому випадку до іммобілізованої через анти-S6K1 антитіла на протеїн А сефарозі рекомбінантної S6K1 додавали рекомбінантну в субодиницю СК2, а комплекси між S6K1 та CK2-6His-GST аналізували Вестерн-блотом із використанням моноклональних анти-6His-GST антитіл. Контролем у цьому експерименті були зразки, в яких тестували зв’язування 6His-GST до S6K1, а також зв’язування CK2-6His-GST та 6His-GST до білок А носія із зв’язаними анти-S6K1 антитілами. Специфічний сигнал було виявлено лише в одному зразку в присутності S6K1 та CK2-6His-GST. Таким чином, також підтверджено специфічну взаємодію між СК2в та S6K1 in vitro.

Аналіз взаємодії між ендогенною S6K1 та різними субодиницями CK2 in vivo. Оскільки СК2 – це чотирисубодиничний фермент, до складу якого входять дві регуляторні в субодиниці, поєднані з двома або ж та ’ каталітичними субодиницями, було досліджено здатність S6K1 до утворення комплексу з цими субодиницями. Для цього в клітинах НЕК293 тимчасово надекспресували окремо кожну субодиницю СК2 в рамці з Myc- (для СК2в) чи НА- (для СК2 та ’) тагами. Комплекси СК2 імунопреципітували з лізатів за допомогою анти-Мус та анти-НА антитіл, відповідно, з подальшим їхнім аналізом з використанням анти-S6K1 антитіл. Як видно з рис. 4А, ендогенна S6K1 взаємодіє з усіма субодиницями СК2. Неможливо зробити висновок про те, з якою із субодиниць ендогенна S6K1 взаємодіє ефективніше, оскільки рівень експресії субодиниць СК2 є різним (рис.4Б). Однак можна припустити, що ендогенна S6K1 може взаємодіяти з повним ферментом СК2 (вв’). Із літературних даних відомі факти про білки-субстрати СК2, що специфічно взаємодіють лише з певними каталітичними субодиницями СК2, наприклад, димером СК2 або ж ’ субодиниць. Згідно наведених даних, ендогенна S6K1 специфічно взаємодіє з усіма субодиницями СК2 in vivo.

Для підтвердження взаємодії між S6K1 та СК2 на рівні ендогенних білків було обрано інший підхід, а саме – присутність білка в комплексі виявляли не Вестерн-блот аналізом, а за продуктами його специфічної ферментативної активності.

Цей підхід є чутливішим, а з іншого боку дозволяє встановити, чи активні білки у комплексі. Відповідно, присутність СК2 в імунопреципітатах анти-S6K1 антитіл, отриманих із лізатів клітин НЕК293, визначали за СК2 кіназною активністю іn vitrо. При цьому використовували специфічний для СК2 субстрат – казеїн. Для визначення впливу мітогенних стимулів на утворення комплексу між СК2 та S6K1 клітини НЕК293 культивували у безсироватковому середовищі або стимулювали додаванням сироватки. Крім того, для підтвердження специфічності кіназної реакції іn vitrо клітини також попередньо обробляли ТВВ, що є прямим та селективним інгібітором СК2. З’ясувалося, що ендогенна СК2 ко-преципітується з ендогенною S6K1 не залежно від присутності ростових факторів, а активність СК2, принаймні у комплексі з S6K1, була нечутливою до стимуляції ростовими факторами, однак інгібувалася за умов додавання до середовища ТВВ.

Для того, щоб з’ясувати, чи активна S6K1 в комплексі з СК2, було імунопреципітовано тимчасово надекспресовану СК2 субодиницю, а S6K1 у комплексі виявляли за S6K1 кіназною реакцією іn vitrо. Як і в попередньому експерименті, для того, щоб підтвердити, що виявлено активність саме S6K1 до клітин додавали інгібітор S6K1 – рапаміцин, як наслідок активність S6K1 в комплексі з СК2 при цьому суттєво зменшувалася.

Аналіз СК2 опосередкованого фосфорилювання іn vitro повнорозмірної та N-кінцевого пептиду S6K1. Оскільки СК2 та S6K1 є протеїнкіназами, і мотиви фосфорилювання для них вже відомі, було проведено комп’ютерний аналіз первинних послідовностей СК2 та S6K1 на присутність потенційних сайтів фосфорилювання. Було знайдено чотири потенційні сайти фосфорилювання для СК2 в S6K1: Ser 17, Ser 357, Ser 375 та Thr 376, де Ser 17 є найбільш імовірним. Для перевірки результатів біоінформаційного аналізу проведено реакцію іn vitro фосфорилювання S6K1 рекомбінантною СК2. Для цього використовували рекомбінантну S6K1, експресовану в бакуловірусній системі, та рекомбінантну СК2 (New England BioLabs). Як видно з рис. 5А (доріжка 1), рекомбінантна СК2 здатна фосфорилювати S6K1. Для підтвердження локалізації сайту фосфорилювання як субстрат у кіназній реакції in vіtrо було використано пептид, що відповідає першим 45 амінокислотним залишкам з S6K1, і відповідно, містить найбільш імовірний сайт фосфорилювання Ser 17. За результатами кіназної реакції N-кінцевий пептид S6K1 (N/S6K1), і відповідно Ser 17 у його складі, є субстратом для СК2 іn vitrо (рис. 5Б).

СК2-залежне фосфорилювання S6K1 дикого типу та мутантної форми S6K1 S17А іn vitrо. Для підтвердження локалізації потенційного сайту фосфорилювання та подальшого виявлення фізіологічної ролі фосфорилювання в клітинах ссавців було проведено сайт-спрямований мутагенез залишка Ser 17 з його заміною на Glu або Ala. Надалі як субстрат СК2 у кіназній реакції іn vitro було використано S6K1 дикого типу та мутант – S6K1 S17А, надекспресовані в клітинах ссавців лінії НЕК293 з ЕЕ-таг епітопом та імунопреципітовані з використанням анти-ЕЕ антитіл. Реакцію фосфорилювання S6K1 іn vitro проводили відповідно до описаного вище протоколу, а сигнал отриманий ауторадіографічно, нормували відповідно до кількості білка в реакційній суміші, що визначали Вестерн-блот аналізом. Як видно з рис.6, як S6K1 дикого типу так і S6K1 S17А фосфорилюються СК2. Однак, очевидно, що мутант, в якому проведено заміну залишку Ser 17 на Ala, що унеможливлює фосфорилювання за цим сайтом, є менш ефективним субстратом для СК2 порівняно з S6K1 дикого типу. Якщо ж нормалізувати рівень фосфорилювання до кількості білка в реакції, стає очевидним, що із заміною Ser 17 на Ala рівень фосфорилювання S6K1 знижується майже на 60%, що підтверджує припущення про фосфорилювання Ser 17 як найімовірнішого, однак не єдиного cайту.

Аналіз субклітинної локалізації S6K1 дикого типу та сайт-специфічних мутантів. Згідно даних літератури N-кінець не є важливим для активності S6K1, відповідно було зроблено припущення, що фосфорилювання Ser 17 є важливим для регуляції субклітинної локалізації S6K1. Для виявлення фізіологічної ролі фосфорилювання Ser 17 S6K1 дикого типу та сайт-специфічні мутанти S6K1 S17A і S6K1 S17E було тимчасово надекспресовано в клітинах лінії NIH3T3 в рамці з ЕЕ-тагом. Після трансфекції та 24 годин експресії клітини інкубували в середовищі без ростових факторів та надалі стимулювали 10 % сироваткою. Локалізацію S6K1 дикого типу та мутантних форм аналізували за допомогою конфокальної сканувальної мікроскопії. У кожному випадку підраховували не менше 100 клітин, які розділяли на підгрупи згідно специфічності забарвлення. Як видно з рис.7А S6K1 дикого типу та мутантна форма S6K1 S17Е за умов відсутності ростових факторів переважно локалізована в цитоплазмі.

Натомість S6K1 S17А в більшості досліджуваних клітин локалізована в ядрі та в цитоплазмі. Однак, після стимуляції клітин сироваткою, спостерігали накопичення S6K1 дикого типу та мутантної форми – S6K1 S17А в ядрі. Субклітинна ж локалізація S6K1 S17Е, що мімікрує фосфорильований стан S6K1, була мітогенонезалежною та не змінювалася із стимуляцією клітин сироваткою. Таким чином, наведені дані вказують на важливу роль фосфорилювання S6K1 за Ser 17 у контролюванні субклітинної локалізації кінази, що може полягати в регуляції як ядерного імпорту, так і ядерного експорту.

Вплив лептоміцину В (LMB) на субклітинну локалізацію S6K1 дикого типу та сайт-специфічних мутантів. З метою подальшого з’ясування ролі фосфорилювання Ser 17 в регуляції субклітинної локалізації S6K1, на наступному етапі було досліджено локалізацію S6K1 та S6K1 S17Е за умови блокування crm1-опосередкованого ядерного експорту. Для цього використовували прямий інгібітор CRM1 – LMB. Експорт білків з ядра – це активний процес, що відбувається декількома відомими шляхами, серед яких найбільш вивченим є CRM1-залежний експорт. Механізм дії LMB базується на його прямій взаємодії з CRM1 і блокуванні його подальшого зв’язування з білками, що експортуються з ядра. Відповідно, додавання клітинам LMB призводить до затримки в ядрі лише тих білків, що екпортуються за crm1-залежним шляхом. Як видно з рис.7 Б, у присутності LMB спостерігається накопичення як S6K1 дикого типу, так і S6K1 S17Е в ядрі навіть при інкубації клітин у середовищі без сироватки. У контрольних зразках за цих умов S6K1 дикого типу та її мутантна форма локалізуються переважно в цитоплазмі (рис.7). Узагальнюючи наведені дані, можна зробити висновок про існування ядерного імпорту як S6K1, так і, що є найбільш важливим, мутантної форми S6K1 S17Е навіть за умови культивування клітин без сироватки.

Відповідно, фосфорилювання S6K1 за Ser 17 не впливає на ядерний імпорт. Таким чином, найбільш імовірним поясненням накопичення S6K1 S17Е в цитоплазмі (рис.7 А) може бути активація СRM1-залежного ядерного експорту, індукованого фосфорилюванням S6K1 в ядрі за Ser 17.

Підтвердження взаємодії ендогенних S6K1 та crm1. Оскільки аналіз субклітинної локалізації S6K1 дикого типу та мутанту S6K1S17Е за умов блокування CRM1-залежного експорту проводили в клітинах ссавців, за умови надекспресії відповідних білків, для підтвердження отриманих результатів було проведено експерименти із ко-імунопреципітації ендогенних CRM1 та S6K1 білків із клітин ліній НЕК293 та NIH3T3. З’ясували, що взаємодія між CRM1 та S6K1 індукується після 24 годин інкубації без сироватки клітин лінії NIH3T3 та після 12 годин у клітинах лінії НЕК293. Більше того, ефективність утворення комплексу між цими білками різко знижувалася при стимуляції клітин сироваткою упродовж 1 години. Ці дані підтверджують результати аналізу субклітинної локалізації S6K1 дикої форми та мутантів методом конфокальної мікроскопії, коли спостерігали, в основному, цитоплазматичну локалізацію S6K1, імовірно за рахунок активного експорту S6K1 до цитоплазми за умов відсутності ростових факторів у середовищі. Натомість, ядерна локалізація S6K1 суттєво зростала в разі стимуляції клітин сироваткою.

Вплив інгібітора СК2 - ТВВ на субклітинну локалізацію S6K1 та S6K1 S17Е. З огляду на те, що згідно представлених вище даних, СК2 здатна фосфорилювати S6K1 за Ser 17, було досліджено роль СК2 в регуляції субклітинної локалізації S6K1. Для цього використовували специфічний інгібітор СК2 – ТВВ. Клітини, в яких було тимчасово надекспресовано S6K1 дикого типу та S6K1S17Е, інкубували в присутності інгібітора впродовж 3, 6 та 9 годин та аналізували субклітинну локалізацію S6K1 за допомогою конфокальної мікроскопії. Додавання клітинам ТВВ, подібно до дії LMB, призводило до накопичення S6K1 дикого типу в ядрі, найбільш імовірно завдяки пригніченню ядерного експорту. Протягом 9 годин частка клітин, в яких S6K1 локалізується в ядрі, збільшувалася в два рази порівняно з контролем (в середовище додавали розчинник інгібітора – ДМСО).

Як було показано в попередніх експериментах, СК2 фосфорилює in vitro S6K1 не лише за Ser 17. Для підтвердження участі фосфорилювання саме Ser 17 СК2 у регуляції експорту S6K1 з ядра, було перевірено залежність субклітинної локалізації надекспресованого мутанта S6K1S17Е від дії ТВВ. Виявили, що субклітинна локалізація S6K1S17Е не чутлива до дії ТВВ, і це вказує на те, що Ser 17 – єдиний сайт для СК2 у складі S6K1, фосфорилювання якого причетне до регуляції субклітинної локалізації S6K1. Із застосуванням методу субклітинного фракціонування клітин, оброблених ТВВ, отримано додаткові свідчення того, що субклітинна локалізація ендогенної S6K1 залежна від СК2 (рис.8). Було показано достовірне накопичення S6K1 в ядрі клітин внаслідок дії ТВВ, яке корелювало із підвищенням концентрації інгібітора в середовищі, а також залежало від часу інкубації клітин з інгібітором.

Модель регуляції субклітинної локалізації S6K1. Як узагальнення результатів описаних вище пропонується модель регуляції ядерно-цитоплазматичного crm1-залежного транспорту S6K1 за участі ростових факторів. Наведена на рис.9 модель передбачає активний, індукований ростовими факторами імпорт S6K1 до ядра, однак характер імпульсів, що активують цей процес ще нез’ясований. Можна передбачити, що в ролі таких імпульсів можуть бути посттрансляційні, мітогенозалежні модифікації S6K1. З іншого боку, експорт S6K1 із ядра є CRM1-залежним та активується фосфорилюванням СК2 Ser 17 у складі S6K1.

Згідно із отриманими результатами, можна передбачити, що експорт S6K1 з ядра буде постійним як за умов інкубації клітин у середовищі без ростових факторів, так і при їхній стимуляції сироваткою, однак імпорт S6K1 до ядра відбувається винятково при стимуляції клітин ростовими факторами.

Висновки

У дисертаційній роботі методом двогібридної системи дріжджів ідентифіковано S6K1-зв’язувальний білок – регуляторну субодиницю СК2. Встановлено, що СК2 залучена до регуляції субклітинної локалізації S6K1 шляхом фосфорилювання Ser 17.

1. Розроблено високоефективной метод трансформації дріжджових клітин з їхнім вирощуванням у напіврідкому середовищі.

2. Методом двогібридної системи дріжджів шляхом аналізу кДНК бібліотеки клітин лінії HeLa, з використанням мутантної форми S6K1 Т412D як “байту”, ідентифіковано 8 нових S6K1-зв’язувальних білків.

3. Доведено існування комплексу S6K1-CK2 in vitro. Встановлено, що S6K1 здатна утворювати комплекс in vivo не лише з регуляторною субодиницею СК2, а і з каталітичними - СК2 та .

4. Встановлено, що Ser 17 у S6K1 є специфічним сайтом фосфорилювання СК2 in vitro.

5. Отримано моноклональні антитіла проти рекомбінантної СК2 експресованої в клітинах бактерій.

6. Методом імунофлуоресцентної мікроскопії встановлено, що фосфорилювання Ser 17 у S6K1 опосередковане СК2 призводить до активації експорту S6K1 з ядра клітин.

7. Запропоновано модель регуляції ядерно-цитоплазматичного CRM1 залежного транспорту S6K1 за участі ростових факторів.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ,

ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Panasyuk G., Nemazanyy I., Filonenko V., Zhyvoloup A. Large-scale yeast transformation in low-percentage agarose medium // BioTechniques.- 2004.- Vol. 36, №1.- P.40-44.Особистий внесок здобувача – розроблено та протестовано модифіковану методику великомасштабної трансформації з подальшим вирощуванням клітин у напіврідкому агарозному середовищі.

2. Panasyuk G., Nemazanyy I., Ovcharenko G., Lyzogubov V., Gout I., Filonenko V. Generation and characterization of monoclonal antibodies to protein kinase 2 (CK2) beta subunit // Hybridoma.- 2005.- Vol. 24, №4.- P.206-210. Особистий внесок здобувача – автором клоновано СК2в у вектор для бактеріальної експресії pET42a, очищено рекомбінантний білок CK2в-6His-GSТ та 6His-GSТ, отримано моноклональні антитіла проти СК2в та 6His-GSТ та протестовано їх в імуноферментному аналізі, імуноблотингу та імунопреципітації.

3. Панасюк Г.Г., Немазаний І.О., Живолуп О.М., Філоненко В.В., Гут І.Т. Бета субодиниця казеїн кінази 2 як новий зв’язувальний партнер кінази рибосомного білка S6 // Біополімери і клітина. – 2005. – Т.21, №5. – С.407-412. Особистий внесок здобувача – автором проведено дріжджове двогібридне скринування з використанням S6K1 T412D як байту. Показано фосфорилювання повнорозмірної S6K1 рекомбінантною СК2 в умовах реакції in vitro. Ідентифіковано сайт фосфорилювання СК2 у складі S6K1 в умовах реакції in vitro. Отримано точковий мутант S6K1 S17A, та показано, що Ser 17 є основним сайтом фосфорилювання СК2 у складі S6K1 in vitro. Підтверджено взаємодію між СК2 та S6K1 в умовах in vitro.

4. Панасюк Г.Г., Немазаний І.О., Живолуп О.М., Філоненко В.В., Гут І.Т. Регуляція субклітинної локалізації кінази рибосомного білка S6 казеїнкіназою 2 // Біополімери і клітина. – 2006. – Т.22, №1. – С.82-84. Особистий внесок здобувача – автором підтверджено утворення комплексу між СК2 та S6K1 in vivo та існування регульованого ростовими факторами ядерно-цитоплазматичного транспорту S6K1. Показано, що фосфорилювання Ser 17 S6K1, опосередковане СК2, залучене до регуляції crm1-залежного експорту S6K1 з ядра. Запропоновано модель регуляції ядерно-цитоплазматичного crm1-залежного транспорту S6K1 за участі ростових факторів.

5. Zhyvoloup A., Nemazany I., Panasyuk G.,Filonenko V., Matsuka G., Gout I. The use of yeast two-hybrid system for the identification of novel S6 kinase binding partners // Український біохімічний журнал. Матеріали VIII-го Українського біохімічного з’їзду. – Чернівці (Україна). - 2002. – Vol.74, №4b. Suppl.2. – P.30. Особистий внесок здобувача – автором створено та протестовано панель байт конструкцій S6K1, включно з активованою, інактивованою та S6K1 дикого типу.

6. Panasyuk G., Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Gout I. Yeast two hybrid system search by activated forms of S6 ribosomal kinase // EJB. – FEBS Special Meeting 2003 on Signal Transduction. – Brussels (Belgium). – 2003. – Vol.270, Suppl. 1. – P.195. Особистий внесок здобувача – автором проведено двогібридне скринування кДНК бібліотеки клітинної лінії HeLa байтом активованої форми S6K1 Т412D, ізольовано 19 позитивних клонів, які підтверджені методом статевого злиття та ідентифіковані секвенсом.

7. Panasyuk G., Nemazanyy I., Zhyvoloup A., Filonenko V., Gout I. Regulation of ribosomal S6 kinase by casein kinase 2 // 4th Dubrovnik Signalling Conference. – Dubrovnik (Croatia), 2004. – P.142. Особистий внесок здобувача – автором методом дріжджової двогібридної системи із використанням модифікованої методики трансформації клітин дріжджів проскриновано кДНК бібліотеку клітинної лінії HeLa байтом S6K1 Т412D, підтверджено методом статевого злиття та секвеновано 25 позитивів. Як новий зв’язувальний білок S6K1 було виявлено СК2. Показано фосфорилювання S6K1 рекомбінантною СК2.

8. Panasyuk G., Nemazanyy I., Zhyvoloup A., Palchevskii S., Filonenko V., Gout I. Casein kinase