ТАВРIЙСЬКИЙ НАЦIОНАЛЬНИЙ УНIВЕРСИТЕТ

IМ. В.I. ВЕРНАДСЬКОГО

ПАРФЬОНОВА ІРИНА ОЛЕКСАНДРIВНА

УДК 612.22:591.11:597.2/.5

ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ГЕМОГЛОБІНУ Й ЕРИТРОЦИТІВ МОРСЬКИХ РИБ, СТІЙКИХ ДО ЗОВНІШНЬОЇ ГІПОКСІЇ

Спецiальность 03.00.13 – Фізіологія людини i тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Сімферополь – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії Таврійського національного університету імені В.І. Вернадського Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, профессор,

Коношенко Світлана Володимирівна,

Таврійський національний університет

iм. В. I. Вернадського,

завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

Лущак Володимир Iванович,

Прикарпатський національний університет

iм. В. Стефаника,

завідувач кафедри біохімії

кандидат бiологiчних наук,

Мартынюк Виктор Семенович,

Київський нацiональний унiиверситет

iм. Т. Шевченка,

докторант кафедри бiофiзики

Провідна установа Iнститут фiзiологiї iм. O.O. Богомольца

НАН України

Захист відбудеться 14.12.2006 р. у ___13___годин на засіданні спеціалізованої вченої ради К 52.051.04 Таврійського національного університету імені В.І. Вернадського (95007, Сімферополь, просп. Вернадського, 4).

З дисертацією можна ознайомитись у біблотеці Таврійського національного університету імені В.І. Вернадського (95007, Сімферополь, просп. Вернадського, 4).

Автореферат розісланий 10.11.2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Хусаїнов Д.Р.

кандидат біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Кисень разом із температурою та солоністю є одним із найважливіших чинників, що впливають на поширення організмів у водному середовищі [Романенко, 2004]. Обмеження водообміну, евтрофікація, пов'язана з антропогенним навантаженням на водойми, є основними причинами, що призводять до виникнення зон стійкого дефіциту кисню [Бордовський, Іваненков, 1979; Романенко, 2004]. Останнім часом це явище вельми часто охоплює високопродуктивні шельфові зони Світового океану, призводячи до якісної трансформації існуючих екосистем [Виноградов, 1968; McEnroe et al., 1998; Kuharev, 1998; Duncombe-Rue et al., 2000; Shulman et al., 2002]. Чорне море в такому контексті не є виключенням. Зони стійкої придонної гіпоксії були порівняно нещодавно виявлені на його північно-західному шельфі [Фесюнов, Назаренко,1991; Берлінський, Диханов, 1991; Фащук та ін.,1991; Виноградов та ін., 1992; Зуєв, 2000].

Спостереження, зроблені в Аденській затоці, в акваторіях Каліфорнійського узбережжя та Західної Африки, дозволили багато в чому переглянути попередні уявлення про необхідність присутності кисню у водному середовищі для існування гідробіонтів [Виноградов, 1968; McEnroe et al., 1998; Kuharev, 1998]. Виявлено, що значна кількість організмів, у тому числі й оксифільні, здатні тривалий час знаходитись у середовищі із залишковим вмістом кисню (менше 0.4 мл л-1).

Фізіологічним та біохімічним чинникам існування гідробіонтів в умовах гострої гіпоксії приділяється пильна увага протягом останніх 30-ти років [Waversveld et al., 1989 a,b; Савина, 1992; Shulman et al., 1998; 2002; Shulman, Love, 1999; Lushchak et al., 2005; Lushchak, Bagnyukova, 2006 та ін.]. Особливу зацікавленість викликає вивчення стану систем кисневого забезпечення організму, зокрема крові, функціональна реалізованість яких в умовах гострої гіпоксії суттєво знижена. Дослідження, проведені в означеному напрямку, дозволили виявити в крові риб, стійких до зовнішньої гіпоксії, наявність гемоглобінів, які не чутливі до рН [D’Avino et al., 1994; Pellegrini et al., 1995; Taiwo, 1995], а також володіють зворотним ефектом Бора в лужному діапазоні рН [Fago et al., 1995; Feuerlein, Weber, 1996]. Досить несподівані реакції були відзначені і на рівні циркулюючих ядерних еритроцитів: свелінг клітин [Perry, Thomas, 1991], активізація трансмембранного Na+/H+-обміну [Nikinmaa, 1991; Perry, Reid, 1992; Reid, Perry, 1994], збільшення випадків амітотичного розподілу [Houston, Murad, 1995; Soldatov, 1996] тощо. Однак загальна функціональна значущість виявлених змін залишається до кінця не проясненою. Вивченню впливу водної гіпоксії на респіраторні системи гідробіонтів й присвячена дійсна робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження з теми дисертаційної роботи проводилися на кафедрі біохімії Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадского (м. Сімферополь) і на базі Інституту біології південних морів ім.О.О. Ковалевського НАН України (м. Севастополь) протягом 2001-2004 р.р. Виконання роботи здійснювалося в рамках держбюджетної теми: “Молекулярно-клітинні та системні механізми дії чинників різної природи на живі системи” (2001-2006 р.р., № держреєстрації 0101U005237).

Мета i завдання дослiдження. Мета дисертаційної роботи – дослідження функціонального статусу компонентів гемоглобінової системи, гематологічних характеристик та еритрограми циркулюючої крові в донних риб, толерантних до гострого дефіциту кисню.

Для реалізації поставленої мети потрібно вирішити такі завдання:

·

·

·

·

·

Об'єкт дослідження: представники донної іхтіофауни Чорного моря: скорпена (Scorpaena porcus L.), камбала-глосса (Platichthys flesus luscus P.), бички: кругляк (Neogobius melanostomus P.), мартовик (Gobius batrachocephalus P.), трав’яник (Gobius ophiocephalus P.).

Предметом дослідження є вивчення морфо-функціональних підстав адаптації червоної крові низки донних риб Чорного моря до існування в умовах гострого дефіциту кисню.

Методи дослідження. Для вирішення поставлених завдань було використано комплекс фізіологічних (гематологічні дослідження, спектрофотометричні методи побудови кривих оксигенації крові та гемоглобіну), біохімічних (електорофорез білків у ПААГі, активність ферментів, значення метаболітів та окисних модифікацій гемоглобіну), цитологічних (світлооптична мікроскопія та цитометрія клітин крові) та статистичних методів, а також методи моделювання гiпоксiї в умовах лабораторiї.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в умовах експериментальної гіпоксії вивчено киснезв’язуючі властивості гемоглобіну та морфометричні характеристики циркулюючої еритроцитарної маси чорноморських риб, що живуть у гіпоксичних акваторіях Чорного моря.

Показано, що кров стійких до гіпоксії видів (бичка-кругляка, скорпени) має водночас високу спорідненість до кисню та підвищену чутливістю до рН (ефект Бора). Цi ознаки ставали ще яскравіше виражени в умовах експериментальної гіпоксії. Вони визначалися властивостями гемоглобіну і не залежали від умов внутрішньоеритроцитарного мікрооточення (концентрацій NTP, Mg2+).

Методом диск-електрофорезу в ПААГі досліджено гетерогенну систему гемоглобіну риб, стійких до гіпоксії. Вперше виявлено компонент, якому притаманні водночас висока спорідненістю до кисню та вираженість ефектів Бора й Рута. Показано, що його вміст у крові істотно підвищується в умовах зовнішнього дефіциту кисню, що призводить до змін киснезв’язуючих характеристик крові в цілому.

Вперше відзначено, що гемоглобін риб може легко переходити в окислений стан (мет-форма) і за умов природного процесу оксигенації крові, і за умов гіпотермії. На разі відбувається зниження стійкості еритроцитів до осмотичного шоку. Таке явище визначається присутністю малоефективної NADH2-діафорази в клітинах червоної крові риб, чутливих до умов навколишнього середовища.

Вперше описано феномен росту обсягу ядер та збільшення ядерно-плазмових відносин у зрілих еритроцитах риб за умов зовнішнього дефіциту кисню.

Практичне значення одержаних результатів. Морфологічні та цитометричні реакції еритроцитарної маси на гіпоксію, одержані в дисертаційному дослідженні, можуть бути використані при діагностиці гіпоксичних станів риб у сучасному рибництві.

Одержані результати дозволяють скорегувати уявлення про причини, що викликають розвиток метгемоглобінемії в риб при риборозведенні. Показано, що в основі означеного стану може лежати не лише інтоксикація організму нітритами та нітратами, але й чинники водного середовища, що виходять за межі толерантності виду (гіпотермія).

Камбала-глосса є одним iз перспективних об'єктів сучасного рибництва. Результати, отримані в дійсній роботі з респіраторних характеристик крові даного виду, можуть бути використані при визначенні й уточненні меж фізіологічних норм, які варто дотримувати в умовах штучного риборозведення.

Теоретичні положення та практичні розробки дисертації можуть бути використані при читанні курсів лекцій з фізіології та біохімії адаптаційних процесів, екологічної фізіології та біохімії риб студентам факультетів біологічного та рибогосподарського профілю.

Особистий внесок дисертанта. Дисертантом самостійно зібрано й проаналізовано спеціальну літературу за темою роботи. Виконано всі експериментальні дослідження, лабораторна обробка фізіологічних, біохімічних проб та цитологічних препаратів. Проведено статистичний аналіз отриманих результатів. Постановка мети та задач дослідження, а також інтерпретація отриманих даних виконані при участі наукового керівника і співавторів опублікованих робіт.

Апробація результатів дисертації. Результати дослідження, представлені в дисертації, були повідомлені на 12-ти наукових конференціях: Конференції молодих учених “Проблеми екології Азово-чорноморського басейну: сучасний стан та прогноз. Понт-Евкінський II” (Севастополь, 2001); V Міжнародній конференції “Водні екосистеми й організми” (Москва, 2003); Міжнародному науковому семінарі “Особливості механізмів адаптації риб до чинників середовища” (Феодосія, 2003); Міжнародній конференції “Сучасні проблеми фізіології та біохімії водних організмів” (Петрозаводськ, 2004); I З'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); XIX З'їзді Фізіологічного товариства ім. І. П. Павлова (Росії) (Єкатеринбург, 2004); VІІ Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Екологія. Людина. Суспільство” (Київ, 2004); I З'їзді фізіологів СНД (Сочі, 2005); IV З'їзді гідроекологічного товариства України (Феодосія, 2005); Міжнародної наукової конференції "Проблеми біологічної океанографії XXІ століття" (Севастополь, 2006); 32, 33 науково-практичній конференції професорсько-викладацького складу Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського (Сімферополь, 2004; 2005).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 14 наукових праць, із них 6 – статті, опубліковані у провідних наукових фахових виданнях, 8 – тези доповідей за матеріалами конференцій. Особистий внесок дисертанта у цих роботах визначено й подано у списку публікацій автора в авторефераті.

Структура дисертації. Робота складається зі вступу, огляду літератури (4 розділи), матеріалів та методів досліджень (6 розділів), результатів дослідження (4 розділи), обговорення (3 розділи), висновків, списку використаних джерел. Робота викладена на 146 сторінках, містить 18 малюнків та 22 таблици. Список використаних джерел включає 300 найменувань (68 кирилицею, 232 латиницею).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. У розділі охарактеризовано гіпоксичні акваторії Світового океану та Чорного моря. Розглянуто причини виникнення цих зон, їхнє поширення, описано стан екосистем та стійкість гідробіонтів до дефіциту кисню. Подано розгорнуту морфологічну, ультраструктурну та функціональну характеристики еритроїдної популяції клітин крові риб. Описано структурно-функціональні особливості гемоглобінів означеної систематичної групи організмів. Розглянуто особливості функціонування системи червоної крові риб в умовах дефіциту кисню.

Матеріали і методи досліджень. Матеріалом для досліджень стала кров 5-ти видів донних риб, що живуть біля узбережжя Кримського півострова: бичка-кругляка (Neogobius melanostomus P.), бичка-мартовика (Gobius batrachocephalus P.), бичка-трав’яника (Gobius ophiocephalus P.), камбали-глосси (Platichthys flesus luscus P.) та скорпени (Scorpaena porcus L.). Всього використано 317 особин. Рибу відловлювали в Севастопольській бухті (ІнБЮМ НАН України) та в районі Кара-Дагу (Карадагський природний заповідник). Під час проведення експериментальної частини роботи використовували спеціально виготовлений стенд. Він дозволяв підтримувати задану температуру та концентрацію кисню у воді протягом необмеженого часу і застосовувався при визначенні критичних та межових концентрацій кисню, а також у експериментах з вивчення впливу гіпоксії та гіпотермії на організм риб. У момент вилучення особин із камери для запобігання розвитку маніпуляційного стресу застосовували уретановий наркоз [Солдатов, 2003].

Концентрацію гемоглобіну в крові та розчинах контролювали за допомогою геміглобінцианідного методу. Застосовували стандартний набір реактивів ТОВ “Агат-мед” (Росія). Кількість еритроцитів у крові підраховували в камері Горяєва [Золотницька, 1987]. Гематокрит визначали шляхом центрифугування зразків крові в гепаринізованих капілярах (750 g; 30 хвилин). На підставі одержаних значень розраховували еритроцитарні індекси (MCV, MCH, MCHC) [Золотницька, 1987]. Водночас визначали осмотичну резистентність у циркулюючих еритроцитів за мікроскопічним методом Яновського [Стенко, 1975]. Мазки крові забарвлювали за комбінованим методом Паппенгейма [Золотницька, 1987]. На мазках підраховували процентний вміст незрілих еритроїдних форм: пронормобластів (ПрН), базофільних (БН) та поліхроматофільних нормобластів (ПН); за допомогою окуляр-мікрометра вимірювали великий та малий діаметри в зрілих еритроцитах (Lc; Bc) та їхніх ядрах (Ln; Bn). На підставі значень Ln та Bn за формулою еліпсоїда обертання розраховували обсяг ядра еритроцита (Vn) [Ташке, 1980]. Для порівняльної оцінки змін MCV та Vn визначали індекс: Vn / MCV (ядерно-плазмові відношення).

Криві кисневого насичення для цільних гемолізатів та розчинів окремих фракцій гемоглобіну будували за допомогою спектрофотометричного методу з використанням кювет-десатураторів [Крикливий та ін., 1979]. Величину рН крові та гемолізатів оцінювали на рН-метрі ELWRO N 5123 (Польща). Величину напівнасичення гемоглобіну киснем (P50) та коефіцієнт Хілла (n) розраховували з кривих кисневого насичення. Ефект Бора (r) оцінювали за рівнянням Ділла. Водночас визначали сумарний вміст нуклеотидтрифосфатів (NTP) в еритроцитах за допомогою неферментативного методу Сейца (гідроліз лабільного фосфату) [Терехов, Петров, 1983] та внутрішньоклітинний вміст Mg2+ – спектрофотометрично за допомогою стандартного набору реактивів фірми “Lacheme” (Чехія). Фракціонування гемолізатів проводили за допомогою диск-електрофорезу в поліакриламідному гелі. Концентрація акриламіду – 7.5 % [Маурер, 1971]. Розподіл оптичних щільностей між фракціями оцінювали за допомогою денситометра “Carl Zeiss” (Німеччина). Стійкість гемоглобіну до окислювання контролювали за вмістом його феррі-форми (метгемоглобін) у крові. Контроль здійснювали спектрофотометрично з використанням реагента ацетон-циангідрину [Кушаковський, 1970]. Водночас визначали активність НАДН2-діафорази в циркулюючих еритроцитах за швидкістю відновлення метгемоглобіну [Кушаковський, 1970].

Цифровий матеріал оброблено статистично за допомогою t-критерію Стьюдента, а також методів кореляційного аналізу [Лакін, 1980]. Результати представлені як .

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Критичні та межові концентрації кисню. Порівняльна оцінка чутливості та стійкості до гіпоксії була виконана на 5-ти видах донних риб (табл. 1). Вибір цієї групи був обумовлений розходженнями в їхній толерантності до дефіциту кисню. Як критерії чутливості та стійкості до гіпоксії обрані показники критичної (Ркр.О2) та межової напруги кисню (Рпор.О2) у воді. Перший відбиває момент переходу організму на залежний тип дихання, а другий – факт загибелі тварини.

За результатами визначення показників цих величин встановлено, що найменш чутливими до зміни концентрації кисню в середовищі виявилися кругляк та скорпена (табл. 1). Перехід на залежний тип дихання в них відбувався при найбільш низьких Ркр.О2 у середовищі (p<0.01). Аналіз Рпор.О2 показав, що найбільш стійким до гіпоксії видом є кругляк. Загибель його особин спостерігалася при найбільш низьких значеннях даного показника – 4.9 гПа. Під час експерименту в двох особин кругляка відзначали здатність переносити повну аноксію. В інших риб межові напруги кисню були в 2-3 рази вищими (p<0.001). Це означає, що організм скорпени та кругляка має функціональні можливості, які дозволяють цим видам існувати в умовах гострого дефіциту кисню. За цим повинні стояти і відповідні молекулярні комплекси. Результати вивчення гемоглобінової системи підтвердили таке припущення.

Гемоглобінова система. Порівняльний аналіз кривих оксигенації цільних гемолізатів показав, що для гемоглобіну стійких до гіпоксії риб (кругляка та скорпени) характерне поєднання двох ознак: високої спорідненості до кисню та підвищеної чутливості до рН. Величини напівнасичення гемоглобіну киснем (Р50) у кругляка та скорпени мали мінімальні значення (p<0.01), що відбивало високу сполучну здатність цього білка. Про підвищену чутливість до рН свідчили високі значення ефекту Бора (p<0.001) (табл. 2). Величини коефіцієнта Хілла були низькими і збігалися у всіх риб, що відбивало низький ступінь кооперативної взаємодії субодиниць у молекулі гемоглобіну.

Таблиця 2

Характеристики кривих оксигенації цільних гемолізатів

Види риб | P50, гПа | Коефіцієнт Хілла | Ефект Бора (r)

n | n | n

Кругляк | 27 | 16.8+0.6 | 27 | 1.36+0.02 | 7 | -0.31+0.02

Мартовик | 30 | 19.3+0.6 | 30 | 1.41+0.02 | 9 | -0.19+0.01

Трав’яник | 26 | 19.4+0.6 | 26 | 1.49+0.02 | 6 | -0.17+0.01

Глосса | 20 | 24.9+0.9 | 20 | 1.18+0.02 | 10 | -0.15+0.01

Скорпена | 21 | 15.7+0.6 | 21 | 1.27+0.03 | 10 | -0.28+0.02

Примітка: n – кількість особин

Розглянуті вище особливості функціональних властивостей гемоглобіну риб, стійких до зовнішньої гіпоксії, мають яскраво виражений адаптивний характер, що призводять до певних суттєвих наслідків:

· зростання спорідненості гемоглобіну до кисню полегшує його насичення в умовах низького РО2 у середовищі;

· підвищення чутливості гемолгобіну до рН сприяє розвантаженню оксигенованої молекули на тканинному рівні, особливо в умовах тканинного ацидозу, що супроводжує розвиток тканинної гіпоксії.

Розходження в спорідненості до кисню та чутливості до рН можуть бути пов'язані і з особливостями самого пігменту, і з умовами мікрооточення молекули. Для встановлення причин розходжень були вивчені особливості складу внутрішньоеритроцитарного середовища (табл. 3). Основними алостеричними регуляторами спорідненості гемоглобіну до кисню в риб є ATP і GTP. Тому в еритроцитах риб визначалася сумарна фракція NTP. Показники, наведені в таблиці, дають змогу контатувати, що принципових розходжень у вмісті цього з'єднання між досліджуваними видами риб немає. Природним конкурентом за NTP в еритроцитах риб виступає Mg2+. У перерахуванні на NTP (індекс Mg2+/NTP) розходження також не були встановлені. Це означає, що Mg2+ не впливав на характер асоціації NTP з молекулою гемоглобіну. Визначення рН гемолізатів еритроцитів риб також не продемонструвало значних розходжень.

Таблиця 3

Особливості складу внутрішньоеритроцитарного середовища в донних риб

Види

риб | NTP 

ммоль л-1 | Mg2+

ммоль л-1 | Mg2+/NTP | рН

n | n | n | n

Кругляк | 7 | 8.04+0.39 | 12 | 9.8+0.7 | 7 | 24.6+1.8 | 7 | 7.71+0.03

Мартовик | 8 | 7.25+0.50 | 10 | 11.3+0.8 | 8 | 30.2+2.2 | 8 | 7.72+0.02

Трав’яник | 6 | 7.82+0.42 | - | - | - | - | - | -

Глосса | 10 | 7.49+0.48 | - | - | - | - | 10 | 7.79+0.03

Скорпена | 11 | 8.39+0.45 | 15 | 12.8+0.7 | 11 | 28.4+2.4 | 11 | 7.74+0.03

Примітка: n – кількість особин

Результати, представлені в цій таблиці, дозволяють зробити висновок про те, що внутрішньоеритроцитарне середовище не могло вплинути на відзначені раніше розходження в киснезв’язуючих властивостях гемоглобінів риб, чутливих та стійких до дії зовнішньої гіпоксії.

Відзначені вище властивості гемоглобінів риб, стійких до гіпоксії (висока спорідненість до О2 та підвищена чутливість до рН), ще більш посилювалися в умовах експериментальної гіпоксії (мал. 1). Перебування особин кругляка протягом 10-ти діб у воді з концентрацією кисню 1.7-1.8 мг л-1 (20 % насичення) супроводжувалося зсувом кривих оксигенації гемоглобіну вліво (Р50 знижувалося на 21.8 %, p<0.01), що свідчить про збільшення спорідненості гемоглобіну до кисню. Водночас підвищувалась чутливість пігменту до рН. При зміні рН інкубаційного середовища в діапазоні 8.3>7.8 зсув кривих оксигенації вправо був більше вираженим у риб, що знаходяться в умовах гіпоксії. Ефект Бора підвищувався в 3.2 рази (p<0.001). Водночас проявлявся й ефект Рута. Про це свідчило зниження ступеня насичення гемоглобіну киснем при високих значеннях РО2 в інкубаційному середовищі (100 гПа). У риб, що знаходяться в умовах нормоксії, цього не спостерігалося.

Відзначені вище закономірності демонструють розрахунки середньостатистичних параметрів: показника Р50, ефектів Бора та Рута (табл. 4). Поєднання високої спорідненості до кисню з підвищеною чутливістю гемоглобіну до рН, що було відзначено в порівняльних дослідженнях, та посилення цієї властивості в умовах експериментального навантаження означає, що така адаптаційна стратегія, мабуть, має певне функціональне значення.

Гемоглобін бичка-кругляка було розділено за допомогою вертикального диск-електорофорезу в поліакриламідному гелі на чотири компоненти: два головних (F1 та F2) та два мінорних (M1 та M2) (мал. 2). Відносна електрофоретична рухливість F1 та F2 склала відповідно 0.224+0.004 та 0.254+0.003, а M1 та M2 – 0.198+0.004 та 0.272+0.003. Денситометрування одержаних електрофореграм дозволило визначити процентне співвідношення основних компонентів у системі . В особин, що знаходяться в умовах гіпоксії, вміст F2 збільшувалося на 41.8 % (p<0.001), а рівень F1 знижувався на 26.8 % (p<0.001).

Для уточнення функціональної значущості розглянутих перебудов гемоглобінової системи компоненти F1 та F2 були елюйовані з гелевих стовпчиків. Одержані зразки гемоглобінів потім були використані для вивчення їхній киснезв’язуючих властивостей. Криві оксигенації F2 розташовувалися лівіше, ніж F1, тобто даний компонент гемоглобіну мав більш високу спорідненість до кисню (мал. 3). Водночас він мав підвищену чутливість до рН. При зміні рН інкубаційного середовища в діапазоні 8.3>7.8 його криві оксигенації зміщувалися вправо значніше, ніж у F1. Форма кривої оксигенації у F2 була більш близькою до гіперболи, ніж у F1. Розходження були статистично вагомі (табл. 5). Наявність F2 у гемоглобіновій системі кругляка пояснювала особливості газотранспортних властивостей крові в цілому, а також стійкість цього виду до зовнішньої гіпоксії.

Стійкість гемоглобіну до окислювання. Гемоглобіни риб відрізняються низькою стійкістю до окислювання. Рівень феррі-форми в крові може досягати 27 % без ознак токсичної метгемоглобінемії. При утриманні особин скорпени в умовах експериментальної гіпоксії (15 і 30 % насичення води киснем) нами був зареєстрований факт зниження концентрації метгемоглобіну в крові (табл. 6). Це відбувалося на тлі підвищення стійкості еритроцитів до осмотичного шоку (мал. 4).

Одержані результати дозволяють говорити про те, що процес природної оксигенації крові трансформував частину гемоглобіну скорпени в окислений стан. Подібна ситуація можлива лише у випадку низької ефективності антиоксидантних систем еритроцита та, зокрема, NADH2-діафорази, що перешкоджає утворенню феррі-форми. Про те, що це дійсно має місце, свідчить зміна осмотичної стійкості еритроцитів, мембрани яких чутливі до рівня окисних процесів у клітині.

При проведенні досліджень було виявлено, що окисна стійкість гемоглобінів риб знижується в умовах низьких температур. Для уточнення цих аспектів були проведені додаткові експерименти.

При інкубації in vitro гепаринізованих зразків крові скорпени при 5, 10 і 15о С значний ріст феррі-форми (до 7 % Hb, p<0.01) був відзначений при 5оС. Аналогічні дані були одержані in vivo і при адаптації особин кругляка до низьких температур (20>10о С). При цьому ріст концентрації метгемоглобіну відбувався на тлі зниження активності NADH2-діафорази еритроцитів. В умовах довготривалої адаптації (15 діб) було показано, що організм бичка міг компенсувати підвищення рівня метгемоглобіну в крові, відновлюючи активність NADH2-діафорази.

Гематологічні дослідження. Порівняльна оцінка гематологічних характеристик та еритроцитарних індексів у риб різної толерантності до гіпоксії не дозволила виявити статистично вагомих розходжень.

В умовах експериментальної гіпоксії відзначалось істотне зростання показників гематокриту (30-40 %, p< 0.05) при збереженні концентрації гемоглобіну та кількості еритроцитів у крові. Це реєструвалося і щодо кругляка, і щодо скорпени (табл. 7, 8). Розрахунки еритроцитарних індексів показали збільшення середньоклітинного обсягу (20-25 %, p<0.05), що відбувалося на тлі зменшення середньоклітинної концентрації (15-20 %, p<0.001) та збереженні середньоклітинного вмісту гемоглобіну. Таке співвідношення процесів вказує на набрякання (свелінг) циркулюючих еритроцитів.

Випадки свелінга клітин червоної крові в умовах зовнішньої гіпоксії були описані раніше для багатьох риб [Tetens, Christensen, 1987; Perry, Thomas, 1991; Plante et al., 1998]. В основі такого явища лежить трансмембранний обмін Na+/H+, що індукуєтсья підвищенням концентрації катехоламінів у крові [Perry, Thomas, 1991]. Вихід H+ із клітини запобігає значним змінам рН еритроциту в умовах плазмового ацидозу, що сприяє нормальному функціонуванню його молекулярних систем, насамперед гемоглобіну. Водночас відбувається надходження Na+ у клітину, що підвищує осмотичний тиск і супроводжується оводненням еритроциту. Очевидно, ці процеси і визначали збільшення обсягу клітин червоної крові у скорпени в умовах експериментальної гіпоксії. Для уточнення деталей нами були досліджені морфометричні характеристики циркулюючих еритроцитів.

Морфометричні характеристики еритроцитів. В умовах експериментальної гіпоксії в еритроцитах скорпени візуально не відзначалися зміни забарвлення цитоплазми чи наявність будь-яких деформацій. Однак клітини при цьому ставали більшими та набували більш округлої форми. Значно збільшувався обсяг їхніх ядер. Подібні зміни були найкраще виражені в особин, що знаходяться в умовах гострого дефіциту кисню протягом 45 діб. Це видно і на прикладі середньостатистичних величин (ріст малого діаметра еритроцитів та обсягу ядра), і на прикладі зсуву максимумів розподілів (табл. 9; мал. 5). Слід зазначити, що ріст обсягу ядра перевершував збільшення обсягу клітини, про що свідчать більш високі значення ядерно-плазмових відношень у піддослідної групи риб.

Таблиця 9

Цитометричні характеристики циркулючої еритроцитарної маси скорпени в умовах експериментальної гіпоксії

Показники | n | Умови експерименту

Нормоксія | Гіпоксія

Lc, мкм | 8 | 13.90+0.17 | 14.20+0.21

Bc, мкм | 8 | 8.63+0.20 | 9.62+0.22

Lc-Bc, мкм | 8 | 5.27+0.16 | 4.58+0.21

Ln, мкм | 8 | 5.31+0.13 | 5.89+0.09

Bn, мкм | 8 | 3.72+0.13 | 4.15+0.09

Vn, мкм3 | 8 | 39.3+3.9 | 53.4+2.83

Vn/MCV | 8 | 0.160+0.019 | 0.178+0.014

Примітка: n – кількість особин; Lc, Bc – великий та малий діаметри еритроциту; Ln, Bn – великий та малий діаметри ядра еритроциту; Vn – обсяг ядра еритроциту; MCV – середньоклітинний обсяг

Збільшення обсягу ядра клітини зазвичай спостерігається у випадках: функціональної активізації структури, поліплоїдії, токсичної дії. У нашому випадку більш ймовірна перша причина, якщо враховувати перебудову гемоглобінової системи в умовах гіпоксії, розглянуту вище, що вимагає активізації певних локусів генома.

Гіпоксія викликала також підвищення вмісту незрілих еритроїдних форм у крові більш, ніж у 2 рази (p<0.001). Ріст був обумовлений переважно підвищенням вмісту поліхроматофільних нормобластів. На ранніх етапах адаптації до гіпоксії була відзначена також поява в крові кліток більш ранніх стадій диференціювання – базофільних нормобластів.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

СПИСОК ПРАЦЬ,

ОПУБЛІКОВАНИХ З ТЕМИ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Солдатов А.А., Парфенова И.А.Влияние температуры на устойчивость гемоглобинов морских рыб к окислению // Экология моря. –2000. –Вып.53. –С.49-53 (внесок автора – проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

2. Солдатов А.А., Парфенова И.А. Уровень метгемоглобина в крови и устойчивость циркулирующих эритроцитов скорпены Scorpaena porcus P. к осмотическому шоку в условиях экспериментальной гипоксии // Ж. эволюц. биохим. физиол. –2001. –Т.37, №6. –С.477-479 (внесок автора – проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

3. Солдатов А.А., Парфенова И.А., Коношенко С.В. Гемоглобиновая система черноморского бычка – кругляка в условиях экспериментальной гипоксии // Укр. биохим. ж. –2004. –Т.76, №3. –С.85-90 (внесок автора – проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

4. Парфенова И.А., Солдатов А.А., Коношенко С.В. Кислородосвязующие свойства гемоглобинов рыб, устойчивых к внешней гипоксии // Доп. НАН України. –2005. –№5. –С.160-164 (внесок автора – проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб, статистичний аналіз одержаних результатів, участь у підготовці тексту рукопису статті).

5. Парфенова И.А., Солдатов А.А. Эритрограмма циркулирующей крови скорпены в условиях экспериментальной гипоксии // Морск. экол. ж.- 2005. –Т.4, №2. –С.59-67 (внесок автора – проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб, статистичний аналіз одержаних результатів, участь у підготовці тексту рукопису статті).

6. Парфенова И.А. Морфометрические характеристики циркулирующих эритроцитов Scorpaena porcus L. в условиях экспериментальной гипоксии // Наук. зап. Терноп. нац. пед. ун-та. Серiя: бiологiя. –2005. –Т.4, №27. –С.170-172.

7. Парфенова И.А. Влияние гипоксии и гипотермии на устойчивость гемоглобинов морских рыб к окислению / Конференция молодых ученых “Понт Эвксинский 2; Проблемы экологии Азово-Черноморского бассейна: современное состояние и прогноз, Севастополь, 18-20 сентября 2001: Тез. докл. –Севастополь, 2001. –С.14-15.

8. Солдатов А.А., Коношенко С.В., Парфенова И.А. Сравнительная оценка устойчивости к гипоксии черноморских рыб // Ecological Studies, Hazards, Solutions. –2004. –V. 7. –P. 91 (внесок автора – проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

9. Солдатов А.А., Парфенова И.А., Коношенко С.В. Цитохромная и гемоглобиновая системы бычка-кругляка Neogobius melanostomus (P.) в условиях внешней гипоксии / Мат. Межд. конф. “Совр. пробл. физиол. и биох. водных организмов”, Петрозаводск, 6-9 сентября 2004: Тез. докл. –Петрозаводск, 2004. –С.131-132 (внесок автора – проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

10. Soldatov A.A., Parfyonova I.A., Konoshenko S.V. Nuclear erythrocytes of marine fishes under experimental hypoxia conditions: morphological and biochemical investigations / First (Inaugurel) Ukr. Congr. Cell Biol., Lviv, 25-28 April 2004: Abstr. –Lviv, 2004. –P.229 (внесок автора – проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

11. Парфенова И.А. Критические и пороговые напряжения кислорода у морских рыб различной толерантности к внешней гипоксии / VІІ Міжн. науково-практ. конф. студентів, аспірантів та молодих вчених “Экологiя. Людина. Суспiльство.”, Київ, 13-15 травня 2004: Тез. доп. –Київ, 2004. –С. 53.

12. Солдатов А.А., Парфенова И.А., Коношенко С.В. Молекулярные системы транспорта и утилизация кислорода у морских рыб в условиях экстремальной гипоксии / XIX Съезд физиол. об-ва им. И.П. Павлова (мат. съезда), Екатеринбург, 19-24 сентября 2005: Тез. докл. –Екатеринбург, 2004. –С.204-205 (внесок автора – проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

13. Солдатов А.А., Парфенова И.А., Коношенко С.В. Молекулярные основы устойчивости организма некоторых морских рыб к условиям экстремальной гипоксии / Науч. тр. I Съезда физиологов СНГ. Т. 1. Сочи (Дагомыс), 19-23 сентября 2005: Тез. докл. –М.: Медицина-Здоровье, 2005. – С.168 (внесок автора – проведення експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

14. Солдатов А.А., Головина И.В., Гостюхина О.Л., Андреенко Т.И., Столбов А.Я., Парфенова И.А., Коношенко С.В. Молекулярные и функциональные основы адаптации черноморских гидробиотов к гипоксии, аноксии и различным видам окислительных нагрузок / Межд. научн. конф. “Проблемы биологической океанографии XXI века”, Севастополь, 19-21 сент. 2006: – Севастополь: Экоси-гидрофизика, 2006. – С. 166. (внесок автора – проведення частини експериментальних досліджень, лабораторна обробка проб та статистичний аналіз одержаних результатів).

АНОТАЦІЯ

Парфьонова І.О. Функціональний стан гемоглобіну й еритроцитів морських риб, стійких до зовнішньої гіпоксії. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук зі спеціальності 03.00.13 – фізіологія людини та тварин. – Таврійський національний університет імені В.І. Вернадського, Сімферополь, 2006.

В умовах експериментальної гіпоксії вивчено киснезв’язуючі властивості гемоглобіну та морфометричні характеристики циркулюючої еритроцитарної маси чорноморських риб, що живуть у гіпоксичних акваторіях Чорного моря.

Показано, що кров стійких до гіпоксії видів (бичка-кругляка, скорпени) має водночас високу спорідненість до кисню та підвищену чутливістю до рН (ефект Бора). Ця властивість стає ще більш вираженою в умовах експериментальної гіпоксії. Вона визначається показниками гемоглобіну і не залежить від умов внутрішньоеритроцитарного мікрооточення (концентрацій NTP, Mg2+).

Методом диск-електрофорезу в ПААГі досліджено гетерогенну систему гемоглобіну риб, стійких до гіпоксії. Вперше виявлено компонент, що має водночас високу спорідненістю до кисню й виражені ефекти Бора та Рута. Показано, що його вміст у крові істотно підвищується в умовах зовнішнього дефіциту кисню, що призводить до змін киснезв’язучих характеристик крові в цілому.

Відзначено, що гемоглобін риб може легко переходити в окислений стан (мет-форма) і в умовах природного процесу оксигенації крові, і в умовах гіпотермії. На разі відбувається зниження стійкості еритроцитів до осмотичного шоку. Таке явище визначається присутністю малоефективної NADH2-діафорази в клітинах червоної крові риб, чутливих до умов навколишнього середовища.

Показано, що в умовах довготривалої експериментальної гіпоксії (більш 10-ти діб) у особин скорпени та бичка-кругляка відбувається зростання значень гематокриту. Названа реакція обумовлена свелінгом циркулюючих еритроцитів внаслідок гідратації їхньої цитоплазми. Про це свідчить характер змін еритроцитарних індексів. Зазначеній реакції передує зморщення еритроцитів, що розвивається в умовах короткочасної адаптації особин до гіпоксії (90 годин). У крові при цьому відбувається підвищення вмісту поліхроматофільних нормобластів та поява менш диференційованих форм – базофильних нормобластів.

Вперше описано феномен росту обсягу ядер та ядерно-плазмових відношень у зрілих еритроцитів риб в умовах зовнішнього дефіциту кисню.

Ключові слова: спорідненість гемоглобіну до кисню, ефекти Бора та Рута, гетерогенність гемоглобіну, метгемоглобін, еритрограма крові, цитометрія, гіпоксія.

АННОТАЦИЯ

Парфенова И.А. Функциональное состояние гемоглобина и эритроцитов морских рыб, устойчивых к внешней гипоксии. – Рукопись.

Диссертация на соискание на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 – физиология человека и животных. – Таврический национальный университет имени В.И. Вернадского, Симферополь, 2006.

В условиях экспериментальной гипоксии изучены кислородосвязующие свойства гемоглобина и морфометрические характеристики циркулирующей эритроцитарной массы у черноморских рыб, обитающих в гипоксических акваториях Черного моря.

Показано, что кровь устойчивых к гипоксии видов (бычка-кругляка, скорпены) обладает одновременно высоким сродством к кислороду и повышенной чувствительностью к рН (эффект Бора). Это качество становится еще более выраженным в условиях экспериментальной гипоксии. Оно определяется свойствами гемоглобина и не зависит от условий внутриэритроцитарного микроокружения (концентраций NTP, Mg2+).

Методом диск-электрофореза в ПААГе исследована гетерогенная система гемоглобина рыб, устойчивых к гипоксии. Впервые выявлен компонент, обладающий одновременно высоким сродством к кислороду и выраженными эффектами Бора и Рута. Показано, что его содержание в крови существенно повышается в условиях внешнего дефицита кислорода и направлено изменяет кислородосвязующие характеристики крови в целом.

Отмечено, что гемоглобин рыб может легко переходить в окисленное состояние (мет-форма) как в условиях естественного процесса оксигенации крови, так и гипотермии. При этом происходит снижение устойчивости эритроцитов к осмотическому шоку. Данное явление определяется присутствием малоэффективной NADH2-диафоразы в клетках красной крови рыб, чувствительной к условиям окружающей среды.

Показано, что в условиях долговременной экспериментальной гипоксии (более 10-ти суток) у особей скорпены и бычка-кругляка происходит рост значений гематокрита. Данная реакция обусловлена свелингом циркулирующих эритроцитов вследствие гидратации их цитоплазмы. Об этом свидетельствует характер изменения эритроцитарных индексов. Этой реакции предшествует сморщивание эритроцитов, которое развивается в условиях краткосрочной адаптации особей к гипоксии (90 часов). В крови при этом происходит повышение содержания полихроматофильных нормобластов и появление менее дифференцированных форм – базофильных нормобластов.

Впервые описан феномен роста объема ядер и увеличения ядерно-плазменных отношений у зрелых эритроцитов рыб в условиях внешнего дефицита кислорода.

Ключевые слова: сродство гемоглобина к кислороду, эффекты Бора и Рута, гетерогенность гемоглобина, метгемоглобин, эритрограмма крови, цитометрия, гипоксия.

RESUME

Parfyonova I.A. Functional state of hemoglobin and erythrocytes in marine fish resisted to external hypoxia. – Manuscript.

Thesis for candidate’s degree of biological sciences in speciality 03.00.13 – physiology of man and animals – V. I. Vernadsky’s Taurida National University, Simferopol, 2006.

Hemoglobin oxygen binding and erythrocyte morphometrycal parameters in fish from hypoxic regions of Black Sea were studied in experimental hypoxia conditions.

It was shown that the blood of resistant to hypoxia fishes (Neogobius melanostomus P., Scorpaena porcus P.) has both a high oxygen affinity and higher sensitivity to pH (Bohr effect). This quality becomes more expressive under experimental hypoxia conditions. It was determined by hemoglobin properties and wasn’t connected with intra-erythrocyte medium conditions (NTP, Mg2+ concentrations).

Polymorphism hemoglobin of resistant to hypoxia fish was investigated by PAAG electrophoresis method. The hemoglobin component (fraction) having high oxygen affinity