НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

ВОЙТЕНКО

Леся Василівна

УДК 577.175.1 : 582.263.3

ФІТОГОРМОНИ В ПРОЦЕСІ РОСТУ ХАРОВИХ ВОДОРОСТЕЙ

(Chara contraria A. Braun ex Kutz. та Chara vulgaris L.)

03.00.12 – фізіологія рослин

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2006

Дисертація є рукопис.

Робота виконана у відділі фітогормонології Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, м. Київ

Науковий керівник: доктор біологічниї наук, професор,

член-кореспондент НАН України,

заслужений діяч науки і техніки,

МУСАТЕНКО Людмила Іванівна

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України,

завідувачка відділу фітогормонології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

ЯВОРСЬКА Вікторія Казимирівна

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,

завідувачка відділу фізіології росту і розвитку рослин

доктор біологічних наук

САКЕВИЧ Олександр Йосипович

Інститут гідробіології НАН України,

провідний науковий співробітник відділу

екологічної фізіології водяних рослин

Провідна установа: Київський національний університет

імені Тараса Шевченка

Захист відбудеться „19” жовтня 2006 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ-22, вул. Васильківська, 31/17

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ

Автореферат розіслано 8 вересня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, д.б.н. Є.Ю. Мордерер

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Основою структурної і функціональної організації всіх організмів є ріст, розмноження і диференціація клітин. Найбільш зручними об'єктами дослідження ростових процесів на клітинному рівні були і є корінь, апекси, відрізки колеоптилів і гіпокотилів судинних рослин (Іванов, 1974; Ситник, Мартин, Мусатенко, 1977; Мартин, Мусатенко, 1985). Серед водоростей надзвичайно зручним об'єктом для фізіологічних досліджень є багатоклітинні харофіти. Величезні розміри клітин хари (від кількох мм до 25 і більше см), що складають міжвузля, дозволяють вивчати ріст, проникність цитоплазматичних мембран, закономірності руху цитоплазми, біоелектричні потенціали клітин тощо (Харові водоросли, 1973). Подібність морфологічної будови, мітозу та цитокінезу клітин харофітів з вищими рослинами давали підстави деяким дослідникам відносити їх до вищих рослин (Sluiman, 1985; Stewart, Mattox, 1975; Stewart, Mattox, 1978).

Однією з нагальних проблем сучасної фітобіології є дослідження регуляторних систем, що забезпечують морфогенез, ріст, розвиток і репродукцію рослин. Доведено, що важлива роль у регуляції цих процесів у вищих рослин належить гормональній системі. Дослідження такого плану у спорових, зокрема у водоростей, на жаль, досить обмежені (Мусатенко, 1993; Kazmierczak, 2001; Kazmierczak, Rosiak, 2000; Kwiatkowska, Godlewski, 1988; Mooney, van Staden, 1984; de Nys, Jameson, Chin and et. all., 1990). Не менш актуальним є вивчення взаємозв'язку ростових і формотворчих процесів з наявністю та розподілом ендогенних фітогормонів у водоростей. Дослідження такого плану дозволять виявити не тільки фізіологічну роль фітогормонів у спорових, зокрема у водоростях, але й встановити риси їх подібності і принципові відмінності у різних за ступенем еволюційної просунутості організмів. Вирішення цих питань необхідне, перш за все, для розробки теоретичних основ гормональної регуляції росту і розвитку нижчих рослин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась відповідно до плану науково-дослідних робіт відділу фітогормонології Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України у межах бюджетної теми „Гормональна регуляція ростових процесів різних органів рослин”, номер державної реєстрації 0104U000060, одним з відповідальних співвиконавців якої була дисертантка.

Мета і завдання досліджень. Метою даної роботи було дослідження характеру ростової та функціональної диференціації клітин харових водоростей на різних етапах їх індивідуального розвитку та участі у цих процесах фітогормонів.

Для досягнення поставленої мети визначені такі завдання:

1.

2.

3.

Об'єкт досліджень – корелятивні зв'язки між інтенсивністю росту і розвитку та якісним і кількісним вмістом різних форм нативних фітогормонів у цілому таломі водоростей та у його метамерах різного віку у період вегетативного та репродуктивного розвитку харофітів.

Предмет дослідження – зелені прісноводні гетеротрихальні водорості Chara contraria A. Braun ex Kutz. та Chara vulgaris L., представники популяцій яких були знайдені та зібрані у водоймах на околицях Києва.

Методи дослідження. Анатомо-морфологічні та морфо-фізіологічні дослідження талому харофітів виконували за допомогою світлової та скануючої електронної мікроскопії, визначення якісного складу та кількісного вмісту ендогенних фітогормонів – методами високоефективної рідинної хроматографії, імуноферментного аналізу та біотестовими.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджено комплекс фітогормонів (індоліл-3-оцтової кислоти – ІОК, цитокінінів – ЦТК, гібереліноподібних речовин – ГПР, абсцизової кислоти – АБК) стерильного та фертильного таломів харофітів, їх накопичення та розподіл у метамерах різного ступеня диференціації (листках, міжвузлях) та у зрілих ооспорах. Встановлено корелятивний зв'язок між вмістом вільних та кон'югованих форм досліджуваних фітогормонів та інтенсивністю росту і розвитку різних частин талому.

Встановлено, що дозрівання ооспор Ch. contraria супроводжується накопиченням вільних форм ЮК, ЦТК, АБК та зв'язаних ГПР.

Вперше досліджено вміст та розподіл фітогормонів у структурних елементах міжвузлів фертильного талому зеленої водорості Ch. contraria: окремо в протопласті з органелами, клітинній оболонці міжвузля з коровими клітинами та у вузлах обох кінців кожної відпрепарованої клітини. Виявлена наявність прямого градієнта розподілу вздовж стебла фертильного талому водорості різних форм фітогормонів у цілих міжвузлях та у їх складових. В результаті виконаної роботи можна однозначно стверджувати, що у водоростях, як і у вищих рослин, у регуляції фізіологічних та морфогенетичних програм беруть участь одні і ті ж фітогормони, але у різних співвідношеннях та кількостях.

Оцінка морфологічних показників різних частин талому хари дала можливість конкретизувати (за розміром листків та антеридіїв) видові критерії діагностики водоростей.

При дослідженні особливостей структури клітинних оболонок вегетативних та репродуктивних метамерів Ch. contraria показано, що зміцнення скелету старих нижніх клітин пов'язане зі збільшенням розмірів кальцієвих відкладів на поверхні клітинних оболонок різних структур в процесі росту.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати розширюють уявлення про регуляторну роль фітогормональної системи у водоростей, як на клітинному, так і на організмовому рівні, і, безперечно, важливі для подальшого з'ясування фізіологічної ролі фітогормонів як у ростових та формотворчих процесах, так і в регуляції фізіологічних і морфогенетичних програм у рослин різного еволюційного походження.

Результати досліджень можуть бути включені в програми лекційних та спецкурсів „Фізіологія рослин”, „Ріст і розвиток рослин”, „Нижчі рослини” та

„Альгологія” в університетах і педагогічних інститутах.

Особистий внесок здобувана полягає в опрацюванні даних літератури, розробці планів досліджень, освоєнні та модифікації методів, проведенні збору та аналізі матеріалу, обґрунтуванні та статистичній обробці отриманих результатів, підготовці до друку наукових робіт. Рисунки, мікрофотографії та гербарій виконані дисертантом власноруч. Результати, що викладено у дисертації, отримані здобувачем самостійно.

Апробація результатів дисертації. Матеріали, які викладені у дисертації, доповідалися на наукових семінарах відділу фітогормонології Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України; на конференції молодих вчених-ботаніків України „Актуальні проблеми ботаніки та екології” (Чернігів, Седнів, 2000; Ніжин, 2001); на III з'їзді Українського товариства фізіологів рослин (Тернопіль, 2002); на 13-му конгресі Федерації Європейських Товариств Фізіологів Рослин (РЕSРР) (Кріт, Херсонісос, Греція, 2002); на VIII конференції молодих вчених „Сучасні напрямки у фізіології та генетиці” (Київ, 2002); на 2-му симпозіумі Європейського Товариства Біотехнології Мікроводоростей „Мікроводорості і продукти морських викидів у системі рослина/грунт” (Мошонмагіровар, Угорщина, 2004); на 2-ій Міжнародній конференції „Онтогенез рослин у природному середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти” (Львів, 2004); на 14-му конгресі Федерації Європейських Товариств Біологів Рослин (РЕSРВ) (Краків, Польща, 2004); на XVII міжнародному ботанічному конгресі (Відень, Австрія, 2005); на конференції молодих учених-ботаніків „Актуальні проблеми дослідження та збереження фіторізноманіття” (Умань, Національний дендрологічний парк „Софіївка” НАНУ, 2005); на XII з'їзді Українського ботанічного товариства (УБТ) (Одеса, 2006).

Публікації за темою дисертації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових праць, в тому числі 5 статей у провідних вітчизняних фахових і зарубіжному журналах та 10 тез у збірниках матеріалів наукових конференцій і конгресів.

Структура дисертації. Дисертація складається з переліку умовних скорочень, вступу, трьох розділів, висновків, списку використаних джерел. Робота викладена на 160 сторінках, ілюстрована 19 таблицями і 30 рисунками. Список використаних джерел містить 298 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

ВСТУП

Обґрунтовано актуальність теми, визначено мету та завдання досліджень, розкрито наукову новизну і практичне значення роботи, вказано особистий внесок здобувача у виконанні дослідження і представлена структура роботи.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Узагальнені дані стосовно нативних фітогормонів у водоростях – ідентифікація, біологічна активність, кількісний вміст та біосинтез, фізіологічна роль та їх використання у господарській практиці.

РОЗДІЛ 2. ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Талом досліджуваних харофітів представлений кущувато-розгалуженими, стеблоподібними пагонами членисто-кільчастої будови, які складаються з почергово розташованих вузлових клітин стебла, здатних до поділу, та міжвузлів, які не діляться, а ростуть розтягуванням (Голлербах, Паламар-Мордвинцева, 1991). У Ch. contraria досліджували: стерильний (статево не зрілий) і фертильний (статево зрілий) цілі таломи; ооспори; ризоїди з бульбочками; II, IV, VI та VIII від ризоїдів міжвузля різного розміру та віку (без листків), відібрані на головній осі пагона фертильного талому та їх складові – окремо протопласт з органелами (далі протопласт), клітинну оболонку міжвузля з коровими клітинами (далі оболонка) та вузли обох кінців кожної відпрепарованої клітини (далі вузли); кільця (мутовки) з листків з антеридіями І-ІП нижніх стеблових вузлів; листки з заплідненими оогоніями IV-VI середніх вузлів і листки з об'єднаними гаметангіями верхньої частини пагона VIII-XI стеблових вузлів. У Ch vulgaris – цілий фертильний талом, кільця з листків І-ІП нижніх стеблових вузлів та листки з об'єднаними гаметангіями трьох верхніх вузлів апікальної частини головного пагона (тут і далі назви умовні).

Ріст і розвиток листків, міжвузлів і репродуктивних органів характеризували за морфологічними і ростовими показниками (довжина, ширина і діаметр) та визначали масу їх сирої і сухої речовини. Для вивчення структури клітинної оболонки міжвузлів та листків Ch. contraria клітини фіксували відразу ж після збору в 2,5 %- ному розчині глютаральдегіду і 5 %-ному розчині параформальдегіду на 0,05 % какодилатному буфері (1:1) протягом кількох годин (рН 7,2). Потім клітини дофіксовували 2 %-ним розчином ОsO4 на ідентичному буфері. Клітини обезводнювали у серії спиртів зростаючої концентрації (30>50>70>80>96>100>ацетоні>суміші смола:ацетон (1:3, 1:1, 3:1) і заключали в чисту смолу. Обезводнені зрізи клітин кріпили на столики, поверхню клітин напиляли вуглецем та золотом (Гайер, 1974). Препарати вивчали за допомогою електронного мікроскопа JSM-35.

Визначення фітогормонів. Виділення, очищення та фракціонування ЮК, ЦТК, ГПР та АБК у водоростей здійснювали методами, які прийняті для вищих рослин (Методические рекомендации, 1988). Кількісне визначення вмісту фітогормонів проводили методом абсолютного калібрування на високоефективному рідинному хроматографі фірми Pye Unicam 4000 та методом твердофазного імуноферментного аналізу (Кудоярова, Веселов, Каравайко и др., 1986; Кудоярова, Веселов, Еркеев и др., 1990). Активність ГПР визначали методом біотестування, використовуючи як маркер стандартний розчин гіберелінової кислоти (ГКз) (Муромцев, Агнистикова, 1984). Коефіцієнт балансу фітогормонів розраховували за формулою Вр=(ІОК+ЦТК)/АБК (Ракитина, 1991).

Статистичне опрацювання результатів експериментів. Дослідження фітогормонів проводили у трьох біологічних і трьох аналітичних повторностях; анатомічні - у 10-ти для кожного кількісного показника. Одержані дані обробляли за допомогою комп'ютерної статистичної програми TSTAT 1,4. Визначали значення середнього арифметичного, стандартної похибки, середнього квадичного

відхилення. Достовірність різниці оцінювали за критерієм Ст'юдента, використовуючи 5 % рівень значущості (Р<0,05).

РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Ріст талому досліджуваних харофітів.

Загальна довжина основних пагонів талому Ch. contraria, які складалися із 9-11 міжвузлів та вузлів, становила 67-73 см. Показано, що перехід від вегетативного росту до репродуктивного розвитку водорості супроводжувався інтенсивним видовженням молодих (апікального і субапікального) міжвузлів із верхньої та середньої частин головного пагона стерильного талому. Довжина нижніх міжвузлів фертильного талому хари була майже такою ж, як і у стерильних рослин. Інтенсивність росту бічних гілок І та II порядків у період формування і розвитку репродуктивних органів (гаметангіїв) була також досить низькою, і їх довжина майже не змінилася. Листки другого-шостого вузлів головного пагона і нижніх листків з антеридіями, листки першого вузла бічних гілок першого порядку були довшими у фертильному таломі в порівнянні з стерильним. Розміри (ширина і довжина) репродуктивних органів Ch. contraria (коронки, оогоніїв і ооспор) наближалися до верхньої межі розмірних параметрів, що відповідає літературним даним, тоді як діаметр атеридіїв був вдвічі більшим (Голлербах, Паламар-Мордвинцева, 1991). Загальна довжина головного пагона Ch. vulgaris, який складався із 6-7 міжвузлів, становила 13,1 ±0,6 см, гілок 1-го порядку – 6,2±0,3 см, гілок ІІ-го порядку – 3,4±0,2 см. Довжина апікального і субапікального міжвузлів бічних гілок І порядку не відрізнялася від таких головного пагона і становила 0,2 см і 0,5 см, відповідно.

Кожне міжвузля Ch. contraria являє собою одну клітину, яка зовні вкрита коровими клітинами (кора). Кора представлена циліндрично витягнутими клітинами, які розташовані паралельними рядами трохи навскіс – первинні корові смуги, та невеликими округлими клітинами – вузли. Під час поділу вузлових клітин кори у бічному напрямку формуються вторинні смуги без вузлів, які розростаються між первинними коровими смугами вверх і вниз кожна. Корові клітини щільно прилягають до міжвузлів і ростуть з такою ж швидкістю, як і центральна клітина. Товщина міжвузлів становила у нижньому (II) зрілому міжвузлі – 628,9±29,5 мкм, у середніх (IV та VI) – 595,8±14,7 та 550,0±22,6 мкм, відповідно, у верхньому (VIII) молодому – 485,7±26,3 мкм. Листки Ch. contraria також вкриті корою, яка складається лише з двох однакових циліндричних клітин, що утворюються із двох сусідніх вузлів. Два верхніх листкових членика не містять кори.

Показано, що нижні старі листки та міжвузля хари, які закінчили ріст, характеризуються на порядок вищим вмістом маси сирої речовини порівняно з верхніми молодими (рис. 1, 2). Значне збільшення маси сухої речовини, яке спостерігали у листках середньої частини фертильного талому відносно верхніх і нижніх, можливо, пов'язано з формуванням ооспор в оогоніях на листкових вузлах, а також з інтенсивним синтезом крохмалю та глюкози (Kazmierczak and Rosiak, 2000; Kazmierczak, 2001). Незначна маса сухої речовини нижніх метамерів може свідчити, з одного боку, про зниження синтезу органічних речовин при уповільненні ростових процесів, з другого – про атрагуючу здатність репродуктивних органів. Накопичення води у вакуолі обумовлює більш високу масу сирої речовини зрілих клітин. В тонкому шарі гіалоплазми міжвузля Ch. contraria, який примикає до оболонки, розташовані паралельними рядами округлі, відносно однакового розміру, хлоропласти та витягнутої форми ядра, які у 7-8 разів більші, ніж хлоропласти (рис. 3). Нижні зрілі клітини характеризуються максимальним розміром і кількістю хлоропластів (табл. 1). Всю центральну частину клітини займає вакуоля. Живі міжвузля мають високий тургорний тиск, який під час препарування цих клітин обумовлює вихід („вистрілювання”) протопласта, що містить хлоропласти і ядра. Таким чином, отримані дані про особливості будови талому двох досліджуваних видів хари дали можливість розширити і доповнити спектр їх морфологічних показників (за рахунок розмірів листків та антеридіїв), що може бути використано в таксономії харових. Ці результати були застосовані під час дослідження фітогормонального балансу у харових водоростей в процесі їх росту та репродуктивного розвитку.

Таблиця 1

Характеристика хлоропластів центральної клітини міжвузля головного пагона фертильного талому Сhara contraria

Параметри хлоропластів | Міжвузля

IV | VІ | VIII

Довжина, мкм | 21,3±1,1 | 19,5±0,8 | 13,6±0,7

Ширина, мкм | 12,6±0,5 | 11,0±0,3 | 10,1±0,5

Кількість на площі 100 мкм2 | 882±42,1 | 784±38,2 | 448±22,4

Особливості структури клітинних оболонок Chara contraria

на різних стадіях росту.

Поверхня клітин верхівкових молодих листків (розміром 1,2±0,5 см) нерівна, вкрита нерівномірним за товщиною шаром горбкоподібних виступів завтовшки до 10 мкм, які зрідка витягуються у вигляді голкоподібних структур (рис. 4, А), довжиною від 40 до 300 мкм, ширина яких біля основи становить від 2 до 2,5 мкм, біля апекса – 1 мкм. Їх середня щільність на площі 1000 мкм2 становить 2,6±0,4. Поверхні оболонки, де відсутні виступи більш-менш гладка (Ситник, Недуха, Мусатенко, Войтенко, 2002). За морфологією виступи та голкоподібні структури ідентичні кальцієвим відкладам, які складаються із СаСО3 та CaHPO4 і утворюються в апопласті при виході із цитоплазми іонів Са2+ та деяких аніонів (у тому числі НСО3?), а також при зміні рН (Borowitzka, Larkum, 1977; Kiyosawa, 2001).

На відміну від молодих клітин структура поверхні оболонок сформованих нижніх листків (розміром 5,3±0,7 см) характеризується наявністю суцільного шару кальцієвих виступів та появою великих відкладів площею до 40 мкм2, від яких відходять 2-6 кальцієвих „голок”, які в основі удвічі ширші, ніж у молодих клітин. Від основних товстих голок йде розгалуження удвічі тонших голок (рис. 4, Б), які вкривають всю поверхню безладно накопичених кальцієвих виступів.

Щільність голкоподібних структур молодих клітин майже на порядок нижча від щільності подібних кальцієвих структур у зрілих (0,3±0,005/1000 мкм2). На поверхні клітинних оболонок генеративних органів (оогоніїв та антеридіїв) кальцієві відклади майже відсутні в основі та центрі і лише злегка помітні на вершині оогоніїв.

Таким чином, кальцифікація клітинних оболонок, ступінь якої корелює з ростом вегетативних клітин хари, зміцнює скелет нижніх зрілих клітин (які закінчили ріст розтягуванням) і, можливо, стабілізує розмір пор в їх оболонках. На користь останнього свідчать дані про значне (майже в 5 разів) збільшення діаметру пор у клітинних оболонках Chara corallina (від 1,9 – 2,1 нм до 10 нг) під дією хелаторів (Berestovsky G., Ternovsky V., Kataev A., 2001). Відомо, що міцність клітинної оболонки та проникність через неї водних розчинів залежить також від наявності кальцію по периферії пори. Якщо кальцій десорбувати із клітинної оболонки, то пора стає ослабленою, і розмір її значно збільшується (Taiz, 1984).

Фітогормони в процесі росту та розвитку харофітів.

Показано, що рівні та співвідношення різних форм ІОК та АБК у цілих таломах (стерильному та фертильному) Ch. contraria змінювалися в процесі росту та розвитку (Войтенко, Мусатенко, 2002). Стерильний талом хари характеризується підвищеним вмістом зв’язаної, а фертильний – вільної ІОК (рис. 5). Рівень вільної ІОК у період репродуктивного розвитку хари був у 1,5 рази більшим, ніж у вегетативному таломі, тоді як вміст зв’язаної ІОК майже не змінився. Більш високий рівень кон’югованої ІОК у стерильному таломі водорості може свідчити про інактивацію надлишку активних вільних форм, які як і у вищих рослин можуть брати активну участь у регуляції росту (Ситник, Мусатенко, Васюк та ін., 2003). Подібний розподіл обох форм ІОК виявлено у цілому фертильному таломі Ch. vulgaris (рис. 6).

Дослідження фітогормону інгібіторної дії – АБК, викликало особливий інтерес у мер. зв'язку з наявністю повідомлень як про її відсутність у водоростей (навіть у підручнику „Физиология растений” В.В. Кузнецова та Г.О. Дмитрієвої, видавництва „Высшая школа”, М., 2005, 736 с. на с. 490 є категоричне твердження „Её (АБК) нет у водорослей”), так і про її ідентифікацію та визначення у морських водоростей-макрофітів (серед багатьох повідомлень – роботи співробітників відділу фітогормонології Інституту ботаніки ім. М.Г.Холодного НАНУ) і у представників прісноводних, в т.ч. у таломі та в ооспорах Chara foetida, Chara connivens та Ch. сontraria (Hirsch, Hartung and Gimmler, 1989; Sabbatini, Arguelo, Fernandez and Bottini, 1987; Tietz, Ruttkowski, Kohler and Kasprik, 1989). Проведені нами дослідження (методами ВЕРХ та ІФА) дозволили виявити наявність в невеликих кількостях АБК у стерильному та фертильному таломах двох видів хари (рис. 5, 6). В обох таломах Ch. сontraria спостерігали переважання вільних форм над зв'язаними. При цьому у фертильному таломі кількість вільної АБК була у 2,5 рази вищою, ніж у стерильному, а зв'язаної – меншою (див. рис. 5). Виявлені співвідношення різних форм АБК, можливо, пов'язані з відмінністю протікання фізіологічних процесів у стерильному та фертильному таломах хари, про що може свідчити наявність в останньому поряд із сформованими гаметангіями зрілих ооспор, у процесах дозрівання і старіння яких АБК бере активну участь. У таломі Ch. vulgaris також спостерігали кількісне превалювання вільної форми АБК над зв'язаною (див. рис. 6). Слід відмітити, що якщо цілий фертильний талом Ch. сontraria з більшою інтенсивністю росту порівняно з Ch. vulgaris характеризується майже однаковим рівнем вільної і дещо більшим - зв'язаної ЮК, то уповільнений ріст Ch. vulgaris супроводжується майже вдвічі більшим вмістом обох форм АБК.

Можливо, такий розподіл різних форм ЮК та АБК у цілих таломах харофітів у різні періоди розвитку водоростей обумовлений різною інтенсивністю їх ростових (поділ і розтягування клітин) та формотворчих (утворення і розвиток репродуктивних органів) процесів.

Дослідження ІОК та АБК у різних частинах фертильного шолому Ch. сontraria показало, що полярно протилежні частини талому (ризоїдальний і таломний полюси) характеризуються значно більшим вмістом (особливо зв'язаних форм) ЮК, який на порядок перевищує їх рівень у середній частині т.з. таломного полюса. Найбільший вміст ЮК виявлено у верхніх молодих листках, найменший – у нижніх сформованих старих (табл. 2). У листках з верхньої та середньої частин головного пагона хари серед знайдених форм ЮК кількісно переважала зв'язана, а у нижніх – вільна форма гормону. Найвищий вміст обох форм ІОК спостерігали у ризоїдах з бульбочками (Войтенко, Мусатенко, 2002). Аналогічна картина розподілу ЮК виявлена також у листках Ch. vulgaris (див. табл. 2): вміст ІОК у верхніх молодих листках був вищим, ніж у нижніх зрілих; у листках з верхньої частини головної осі пагона кількісно домінувала зв'язана форма гормону, у нижніх – обидві форми ІОК були однаково низькими. Слід підкреслити, що листки різних видів досліджуваних харофітів характеризуються різним вмістом ІОК, ймовірно обумовленим їх різною інтенсивністю росту, зокрема, у низькорослого виду Ch. vulgaris рівні ЮК були значно нижчими порівняно з високорослою Ch. сontraria.

Таблиця 2

ІОК у різних частинах фертильного талому харофітів, нг/г м.ср.

Метамери | Вільна | Зв'язана

Chara сontraria

Ризоїди | 56,5±3,5 | 80,5±4,7

Листки:

І-ПІ, зрілі з антеридіями |

4,8±0,2 |

1,4±0,03

IV-VI з заплідненими оогоніями | 3,8±0,4 | 5,4±0,5

VIII-XI молоді з об'єднаними гаметангіями | 25,8±1,4 | 30,5±1,8

Chara vulgaris

Листки:

І-ПІ зрілі без антеридіїв |

1,2±0,1 |

1,2±0,1

V-VII молоді з об'єднаними гаметангіями | 3,1±0,3 | 6,2±0,3

Очевидно, у водоростей, як і у вищих рослин, вільні форми ЮК беруть активну участь у ростових процесах, а зв'язані є джерелом їх поповнення в результаті гідролізу. Накопичення зв'язаної ЮК у листках з верхньої та середньої частин пагона фертильного талому хари, може бути пов'язано з формуванням та розвитком репродуктивних органів водоростей, а висока активність апікальних частин ризоїдів (аналогів апікальних меристем коренів вищих рослин) забезпечує інтенсивний синтез і найбільш високий вміст порівняно з іншими частинами талому в них як зв'язаної, так і вільної ІОК. У різних частинах фертильного талому обох видів хари (табл. 3) виявлено невелику кількість АБК, яка визначена в межах від 0,2 до 4,1 нг/г м.с.р.

Таблиця З

АБК у різних частинах фертильного талому харофітів, нг/г м.с.р.

Метамери | Вільна | Зв'язана

Chara сontraria

Ризоїди | 1,2±0,2 | 0,7±0,1

Листки:

І-ПІ, зрілі з антеридіями |

0,8±0,1 |

0,2±0,01

IV-VI з заплідненими оогоніями | 2,5±0,2 | 3,8±0,2

VIII-XI молоді з об'єднаними гаметангіями | 3,8±0,4 | 1,2±0,2

Chara vulgaris

Листки:

І-ПІ зрілі без антеридіїв |

3,7±0,2 |

1,8±0,2

V-VII молоді з об'єднаними гаметангіями | 4,1±0,3 | 1,9±0,2

Показано, що верхні молоді листки фертильного талому Ch. сontraria містили більше АБК порівняно з нижніми зрілими. При цьому вміст вільних форм перевищував вміст зв'язаних. Виняток становили листки із середньої частини головного пагона талому, у яких кількість зв'язаної АБК превалювала над вільною, що, можливо, пов'язано із розвитком ооспор в оогоніях, які розташовані на листкових вузлах. Подібні результати розподілу АБК спостерігали також у листках верхньої та нижньої частин головного пагона фертильного талому Ch. vulgaris. Можна припустити, що по аналогії з вищими рослинами у водоростей активний ріст верхньої частини пагона на фоні високих рівнів АБК, з одного боку, обумовлений зниженням чутливості „тканин” чи клітин до цього фітогормону (Powell and Maybee, 1987). З іншого боку, відомо, що для підтримання нормального водного балансу як у суходільних, так і у водних рослин (можливо і у водоростей) необхідна АБК, яка запобігає надлишковим втратам води в період активного росту їх клітин (Курчий, 2000; Eze, Dumbroff and Thompson, 1981). Крім того, високий рівень АБК в активно ростучих тканинах не спричиняє інгібіторного ефекту, який може нівелюватися значним вмістом ІОК – її компенсаторною дією в них, забезпечуючи таким чином гомеостатичну рівновагу всієї фітогормональної системи.

Гібереліни у цілих шоломах. Встановлено, що фертильний талом Ch. сontraria містив більшу кількість гіберелінів, ніж стерильний, і рівень кон'югованих форм у ньому був вищим (Васюк, Войтенко, Мусатенко, 2004; Vasyuk, Voytenko, Musatenko, 2004). У бутанольних фракціях (БФ) обох таломів переважали речовини з Rf 0,4-0,6 (рис. 7). Підвищену кількість зв'язаних ГПР у порівнянні з віль-ними формами було знайдено також у фертильному таломі Ch. vulgaris (рис. 8). При цьому у БФ виявлено більш широкий спектр і високі рівні ГПР, ніж в етилацетатній фракції (ЕФ). У БФ переважали речо-вини з Rf 0,1 та 0,5-0,7, а в ЕФ – з Rf 0,4-0,6. Згідно даних літератури це – гібереліни ГК3, ГК4, ГК7, ГК9 (Муромцев, Агнистикова, 1984; Муромцев, Чкаников, Кулаева, Гамбург, 1987; Полевой, 1982). Такий характер накопичення ГПР у таломі фертильних рослин, очевидно, обумовлений актив-ним розвитком репродуктивних органів на бічних листкових вузлах хари. Високий вміст зв’язаних гіберелінів, можливо, є резервом функціонально активних вільних форм, які контролюють активацію фізіологічних процесів росту та розвитку (Иванова, Анцыгина, Ярин, 1999; Муромцев, Агнистикова, 1984).

Якісний склад та кількісний вміст гіберелінів у різних частинах головного пагона фертильного талому Ch. contraria представлений на рис. 9. Вміст ГПР ЕФ та БФ верхніх молодих листків значно вищий, ніж у нижче розташованих і у ризоїдах з бульбочками. Серед гіберелінів ЕФ з апікальної частини пагона високу активність проявляли речовини з Rf 0,1 та 0,4-0,6, у БФ – 0,2 та 0,4-0,5. Рівні цих речовин у середніх листках були нижчими. В нижніх зрілих листках виявлено більш широкий спектр гіберелінів БФ з підвищеною активністю. Слід відмітити, що ГПР ризоїдів з бульбочками представлені лише речовинами з Rf 0,4 (ЕФ) та 1,0 (БФ). Аналогічний розподіл ГПР виявлено у листках різного ступеня диференціації Ch. vulgaris у період її репродуктивного розвитку (рис. 10). Вміст речовин БФ із верхніх молодих листків був вищим порівняно з ЕФ. При цьому серед гіберелінів БФ високу активність проявляли речо-вини з Rf 0,2 та 0,4-0,7, а серед речовин ЕФ – 0,4-0,5 та 1,0. У нижніх зрілих листках Ch. vulgaris знайдено підвищений вміст вільних форм ГПР, які, очевидно, утворюються в результаті гідролізу кон’ю-гованих форм гіберелінів, оскільки їх рівні у цих листках були низькими. Виявлений розподіл ГПР можна пояснити різною інтенсивністю ростових процесів частин талому та підготовкою водоростей до формування та розвитку гаметангіїв (оогоніїв, анте-ридіїв). З іншого боку, підвищений рівень ГПР у листках апікальної частини головного пагона хари та речовин БФ у нижніх зрілих листках Ch. contraria, може бути, обумовлений високим вмістом гіберелінів у репродуктивних органах водоростей – антеридіях.

Таким чином, верхні молоді листки Ch. contraria, на яких розвивалися репродуктивні органи, характеризуються високим вмістом вільної та зв’язаної форм ГПР, а листки середньої частини головного пагона зі зрілими та заплідненими гаметангіями – низьким. У нижніх листках із зрілими антеридіями виявлено підвищений вміст кон’югованих форм гіберелінів. Ймовірно, з одного боку, це обумовлено транспортом зв’язаних ГПР до апікальної частини пагона і ризоїдів від нижніх зрілих листків по міжвузлях, а з другого боку, підвищеною активністю ГПР у репродуктивних органах хари – антеридіях.

ЦТК у цілих таломах Ch. contraria виявлені у вигляді вільних форм – зеатину (З), зеатинрибозиду (ЗР), ізопентеніладеніну (іП) та ізопентеніладенозину (іПА). Їх рівні змінювалися в процесі росту та розвитку водоростей (Войтенко, Мусатенко, 2005). У стерильному таломі хари серед знайдених форм ЦТК домінували ЗР та іПА, у фертильному – ЗР (рис. 11). Показано, що рівні різних форм ЦТК у період репродуктивного розвитку водорості були майже у 10 разів вищими, ніж у період вегетативного росту. При цьому більш значним було накопичення З, ЗР та іП, ніж іПА. Дослідження цілого фертильного талому Ch. vulgaris показало, що серед знайдених вільних ЦТК кількісно переважали ізопентенільні форми, тоді як рівні З та ЗР були нижчими і майже однаковими (рис. 12). Встановлено, що вміст З та ЗР у цілому таломі Ch. vulgaris був значно нижчим, ніж у таломі Ch. contraria в репродуктивний період розвитку водоростей, а рівні іП та іПА в обох видів були майже на однаковому рівні. Щодо функціонального значення різних форм ЦТК можна припустити, що високі рівні вільних форм ЦТК у репродуктивному таломі хари пов’язані з підвищеною інтенсивністю метаболічних перетворень, обумовлених розвитком гаметангіїв.

Рівні ЦТК у різних частинах фертильного талому Ch. contraria показано у табл. 4. У верхніх молодих листках знайдено високий вміст ЗР, а рівні З, іП та іПА були нижчими і майже однаковими. У листках середньої частини пагона виявлено значно менші кількості ЗР, іП та іПА. У нижніх зрілих листках рівень всіх форм ЦТК був незначним. У ризоїдах на фоні низьких кількостей З, іП та іПА спостерігали дещо підвищений вміст ЗР. Можливо, активну участь у формотворчих процесах та метаболічних перетвореннях у верхніх та середніх листках водорості беруть З та ЗР, вміст яких був найвищим. Такий же розподіл цитокінінів був виявлений у період репродуктивного розвитку в листках Ch. vulgaris (див. табл. 4). Вміст ЦТК у молодих листках був вищим, ніж у зрілих. При цьому серед вільних форм ЦТК у листках апікальної частини пагона кількісно превалювали іП та іПА, рівні яких у 2,5 та 7,0 разів, відповідно, були більшими, ніж у нижніх зрілих метамерах. Кількості З та ЗР у верхніх молодих листках Ch. сontraria був значно вищим, ніж у Ch. vulgaris. Таким чином, виявлено пряму кореляцію між інтенсивністю ростових і формотворчих процесів різних частин головного пагона хари та рівнем у них нативних вільних форм ЦТК.

Фітогормони у зрілих ооспорах Ch. сontraria представлені високим вмістом ІОК (зі значним переважанням вільної форми над зв’язаною) та накопиченням обох форм АБК, рівні яких були майже однаковими (рис. 13). Серед ГПР в ооспорах, які відділились від материнської рослини, найбільшу активність проявляли речовини БФ (зв’язані форми гіберелінів), зокрема, з Rf 0,1-0,2 (рис. 14). Серед виявлених вільних ЦТК домінуючими формами були – ЗР та іПА (рис. 15).

Показано, що дозрівання ооспор Ch. сontraria (як і насіння вищих рослин) супроводжується значним накопиченням вільних форм ІОК, ЦТК (в основному ЗР та іПА), АБК та зв’язаних ГПР, які, очевидно, необхідні для їх проростання за сприятливих умов, а також для забезпечення синтезу запасних білків.

Таблиця 4

Цитокініни у різних частинах фертильного талому харофітів, нг/г м.с.р.

Метамери | З | ЗР | іП | іПА

Chara contraria

Ризоїди | 2,2±0,4 | 11,2±2,4 | 4,5±0,2 | 3,7±0,2

Листки:

I-III зрілі з антеридіями |

1,1±0,1 |

5,3±1,2 |

1,5±0,2 |

1,5±0,03

IV-VI з заплідненими оогоніями | 10,5±2,1 | 8,5±1,6 | 4,1±1,2 | 7,5±1,4

XIII-XI молоді з об’єднаними гаметангіями | 11,5±3,2 | 57,7±4,1 | 13,5±2,7 | 15,4±2,7

Chara vulgaris

Листки:

I-III зрілі без антеридіїв |

1,5±0,1 |

1,8±0,04 |

4,8±0,7 |

0,9±0,01

V-VІI молоді з об’єднаними гаметангіями | 2,4±0,4 | 4,1±0,5 | 11,3±1,4 | 6,2±1,4

Фітогормональний комплекс міжвузлів.

Було досліджено баланс фітогормонів у міжвузлях різного ступеня диференціації фертильного талому прісноводної водорості Ch. contrari: VIII верхнє молоде, VI і IV середні, та II нижнє зріле міжвузля з вузлами та їх складові –протопласт, оболонка центральної клітини міжвузля з коровими клітинами та відпрепаровані від цілого міжвузля вузли. В процесі росту змінювалися рівні та співвідношення фітогормонів у міжвузлях різного ступеня диференціації. Кількісний вміст різних форм ІОК та АБК у цілих міжвузлях з вузлами подано у табл. 5. Так, у IV міжвузлі переважали зв'язані форми ІОК над вільними. Найбільший рівень АБК знайдено у VIII міжвузлі, яке входить до складу апікальної частини головного пагона хари. При цьому у міжвузлях з верхньої та середньої частин пагона фертильного талому водорості превалювали вільні форми АБК, а у нижніх - зв'язані. Найнижчі рівні обох форм ІОК та АБК були у II нижньому зрілому міжвузлі.

Таблиця 5

ІОК та АБК у міжвузлях фертильного талому Chara contrari, нг/г м.с.р.

Міжвузля з вузлами | ІОК

вільна | зв’язана

ІІ нижнє | 5,2±0,5 | 3,8±0,4

ІV середнє | 141,7±7,0 | 205,0±9,7

Міжвузля з вузлами | АБК

вільна | зв’язана

ІІ нижнє | сліди | 1,5±0,3

ІV середнє | 7,2±0,4 | 11,5±2,4

VІ середнє | 28,5±1,3 | 9,0±0,4

VIII верхнє | 156,0±7,5 | 132,0±6,2

Відомо, що кількісний розподіл кон'югованих форм фітогормонів у стеблі вищих рослин має певну специфіку, яка пов'язана з періодом його росту та розвитку (Гамбург, 1976; Кефели, 1989). Кон'юговані фітогормони як потенційне джерело вільних форм можуть транспортуватися у місця їх дії, де піддаються гідролітичному розщепленню з вивільненням активних вільних форм, які прямо, або опосередковано беруть участь у ростових процесах (Гамбург, 1976; Кефели, 1989; Терек, 1985). Можливо, підвищений вміст фітогормонів у цілому VIII міжвузлі з апікальної частини пагона фертильного талому хари пов'язаний, в першу чергу, з його інтенсивним ростом, а також з транспортуванням до репродуктивних органів різних форм фітогормонів, в основному зв'язаних, які необхідні для процесів формування та розвитку гаметангіїв. З віком та уповільненням інтенсивності росту міжвузлів вміст всіх форм фітогормонів у них зменшується.

Дослідженнями різних форм ЦТК та їх розподілу у міжвузлях різного віку, відібраних на головному пагоні фертильного талому хари показано (рис. 16), що найвищу кількість вільних форм ЦТК – ЗР та 3+іПА спостерігали у верхньому VIII міжвузлі. іП визначений лише у IV та VI міжвузлях середньої частини талому. У верхніх міжвузлях він відсутній. Найнижчий вміст всіх форм ЦТК знайдено у IV зрілому міжвузлі. Таке співвідношення вільних форм цитокінінів у міжвузлях різного ступеня диференціації віддзеркалює різну інтенсивність протікання в них ростових і формотворчих процесів.

Таким чином, показана наявність певного градієнта розподілу вздовж стебла водорості різних форм ІОК, АБК та ЦТК у цілих міжвузлях різного віку. На основі отриманих даних можна зробити висновок, що ріст міжвузлів головного пагона хари знаходиться під контролем збалансованого комплексу фітогормонів. Як нами уже відмічалось, дослідження ролі нативних фітогормонів у процесах росту, розвитку та репродукції у водоростей різних систематичних груп були зосереджені, основним чином, на вивченні їх у цілому таломі. Специфічність будови прісноводних харових водоростей дає можливість визначити вміст та локалізацію фітогормонів в одній окремій клітині різного ступеня диференціації – міжвузлі, розмір якого коливається у межах 20-150 мм. У зв'язку з цим нами вперше досліджено вміст різних форм ІОК та АБК у структурних елементах однієї клітини (міжвузля): у протопласті, клітинній оболонці (з коровими клітинами) та у вузлах обох кінців кожної відпрепарованої клітини. Порівняння вмісту фітогормонів у структурних елементах II нижнього та IV і VI середніх міжвузлів різного розміру показало, що рівні та співвідношення вільних і кон'югованих форм ІОК змінювалися в процесі їх росту та формування (табл. 6). Протопласт всіх міжвузлів відрізняється від оболонки (з коровими клітинами) та вузлів значно більшим вмістом (за рахунок вільної форми) ІОК. Градієнт розподілу як вільної, так і зв'язаної форм ІОК характеризується збільшенням їх кількості від II до VI міжвузлів. Слід зазначити, що зв'язана форма ІОК була знайдена лише у