ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

БАЛКО ОЛЕКСАНДР БОГДАНОВИЧ

УДК 579.842.1/.2+578.81/578.811

СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНА ОРГАНІЗАЦІЯ КАРОТОВОРІЦИНІВ

ТА ЇХ РОЛЬ В МІКРОБНОМУ АНТАГОНІЗМІ

03.00.06 – вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ-2007

Дисертація є рукописом.

Робота виконана у відділі молекулярної біології вірусів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Товкач

Федір Іванович, Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу молекулярної

біології вірусів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник,

Щербатенко Іван Степанович, Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фітопатогенних

вірусів

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник, Семчук

Лідія Іванівна, Київський національний університет імені Тараса

Шевченка, старший науковий співробітник кафедри вірусології

Провідна установа: Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова, кафедра

мікробіології і вірусології, Міністерство освіти і науки України

Захист відбудеться "18" квітня 2007 р. о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680 МСП, Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680 МСП, Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано " 16 " березня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

Актуальність теми. Бактеріоциногенність є однією із найбільш поширених систем захисту бактерій. Згідно із Klaenhammer, 99% усіх відомих мікроорганізмів здатні синтезувати, принаймні, хоча б один тип бактеріоцинів. Для деяких видів бактерій можна спостерігати утворення від 10 до 100 різних антибактеріальних пептидів. Сучасний рівень знань про бактеріоцини характеризується значною неоднорідністю - одні кілерні фактори вивчені досконало (коліцини і лактоцини), тоді як про інші відомо лише частково.

Широкомасштабні дослідження бактеріоцинів дають можливість не лише встановити шляхи їх еволюційного розвитку та екологічне значення для мікроорганізмів, але й створюють передумови для подальшого практичного використання даних антибактеріальних пептидів. Показано високу ефективність дії бактеріоцинів щодо збудників карантинних захворювань рослин, як інсектицидів в сільському господарстві, а також безпечних для людини консервантів у харчовій промисловості (Stockwell, 2002). Перспективним є застосування бактеріоцинів в медицині та ветеринарії (Gillor, 2005).

Лізогенна система фітопатогенних бактерій Erwinia carotovora є унікальною моделлю для дослідження бактеріоцинів, оскільки особливістю даних мікроорганізмів є одночасне виділення каротоворіцинів двох типів - макромолекулярних та коліциноподібних (Товкач, 1998). Схожа множинність синтезу кілерних факторів відмічена лише у незначної кількості бактерій. Бактеріоцини E. carotovora здатні лізувати ряд мікроорганізмів родини Enterobacteriaceae, які спричиняють захворювання людини та тварин. При цьому, отримані із даних бактерій препарати (наприклад, L-аспарагіназа) викликають менше побічних ефектів при парентеральному введенні, ніж аналогічні речовини інших продуцентів. В даний час основна увага приділяється дослідженню особливостей молекулярно-генетичної організації каротоворіцинів. Натомість, механізми індукції та виділення бактеріоцинів E. carotovora, основні способи їх впливу на чутливі клітини мікроорганізмів, а також роль даних кілерних факторів в екології бактерій залишаються малодослідженими. Тому, зважаючи на значну перспективність застосування каротоворіцинів, вивчення цих процесів є актуальним і потребує більш детального дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Робота виконана згідно планів науково-дослідних робіт відділу молекулярної біології вірусів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за темами: "Молекулярно-генетична організація та біотехнологічне застосування лізогенних систем Erwinia carotovora", державний реєстраційний номер 0105U000788, та "Отримання і використання макромолекулярних бактеріоцинів (каротоворіцинів) Erwinia carotovora для біоконтролю в оточуючому середовищі", державний реєстраційний номер 0102V003706.

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідження структурної організації та властивостей каротоворіцинів різних типів. Відповідно до мети роботи були поставлені наступні завдання:

1. Встановити роль бактеріоцинів в процесах міжбактеріального антагонізму.

2. Вивчити особливості індукції та виділення каротоворіцинів за допомогою голодування Thy- мутантів E. carotovora і впливу на прототрофні штами даних бактерій мітоміцину С і налідиксової кислоти.

3. Дослідити властивості коліциноподібних та макромолекулярних бактеріоцинів E. carotovora та встановити механізми їх кілерного впливу на чутливі клітини ентеробактерій.

4. Вивчити поліпептидний склад та структурну організацію кілерних факторів ервіній.

Об’єктом дослідження були препарати бактеріоцинів E. carotovora підвиду carotovora штаму J2, одержані за допомогою різних методів індукції, сконцентровані та розділені на окремі типи.

Предметом дослідження були фізико-хімічні, біологічні, літичні та нуклеазні властивості каротоворіцинів E. carotovora, особливості їх лізогенної індукції, виділення і кілерної дії, а також поліпептидний склад, структурна організація та роль даних бактеріоцинів в процесах антагонізму між бактеріями.

Матеріали і методи дослідження. Для виконання поставлених в роботі завдань застосовували вірусологічні, мікробіологічні, фізико-хімічні, біохімічні та молекулярно-генетичні методи досліджень.

Наукова новизна результатів досліджень. Вперше описано асоціацію низькомолекулярних бактеріоцинів E. carotovora J2 із неспецифічною ендонуклеазною активністю; встановлено причетність даної активності бактеріоцинів до лізогенної індукції бактеріофагів; показано високу ефективність сумісної літичної дії коліциноподібних та макромолекулярних каротоворіцинів на чутливі клітини ентеробактерій.

Вперше досліджено структурно-морфологічну організацію та тип симетрії кілерних факторів типу фагових базальних пластинок E. carotovora штаму J2, а також здійснено їх порівняння із аналогічними частками інших штамів E. carotovora і фага ZF-40.

Доведено високу ефективність застосування Thy--мутантів E. carotovora, як універсальних продуцентів бактеріоцинів. Для вибіркового отримання кілерних факторів вперше запропоновано два методи голодування тимінзалежних ауксотрофів ервіній.

Вперше використано чотири різні методи індукції коліциноподібних та макромолекулярних бактеріоцинів E. carotovora, а також запропоновано кількісні показники для оцінки ефективності їх індукції. Вперше проведено розділення різних типів каротоворіцинів за допомогою центрифугування в градієнтах густини метризаміду та сульфату цезію.

Практичне значення отриманих результатів. Запропонована чутлива система з індикаторного та бактеріоцинпродукуючого штамів може бути використана для дослідження взаємодії бактеріальних популяцій на рівні їх бактеріоциногенності.

Методи лізогенної індукції за рахунок голодування тимінових ауксотрофів E. carotovora створюють передумови для вибіркового отримання бактеріоцинів різних типів із високими показниками кілерної активності. Вказані методи є менш трудомісткими для одержання бактеріоцинів, порівняно із застосуванням мітоміцину С в якості індуктора.

Використані підходи до індукції кілерних факторів E. carotovora за допомогою налідиксової кислоти та методу "виснаження тиміну" забезпечують зниження в отриманих препаратах вмісту білка і підвищення питомих кілерних активностей каротоворіцинів. Це відкриває перспективи для мінімізації кілерної структури бактеріоцинів з метою їх можливого подальшого застосування в медичній практиці.

Застосування розроблених нами схем концентрування та розділення бактеріоцинів дає можливість отримувати високоочищені препарати кілерних факторів різних типів за умови множинності їх виділення бактеріями-продуцентами з метою подальшого дослідження або практичного використання.

Показана висока специфічність синтезу кілерних факторів забезпечує можливість проведення бактеріоцинотипування бактерій за властивостями утворюваних ними антибактеріальних речовин, а також за чутливістю даних культур до бактеріоцинів.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно проаналізовано, відповідно до обраної теми, наукову літературу, проведено практичні дослідження, узагальнено отримані результати та здійснена підготовка матеріалів до опублікування. Вивчено біологічні властивості бактеріоцинів E. carotovora та їх роль в антагонізмі між бактеріями, досліджено вплив різних індукуючих факторів на характер виділення каротоворіцинів, здійснено очистку, концентрування та розділення кілерних факторів ервіній за допомогою ряду фізико-хімічних методів. Досліджено характер кілерних та нуклеазних властивостей каротоворіцинів на різних етапах їх виділення, концентрування та розділення, показано індукуючий вплив бактеріоцинів на виділення бактеріофагів, проведено комп’ютерну обробку електронограм фагових базальних пластинок, встановлено їх будову та здійснено порівняння з іншими аналогічними структурами. Одержання тимінзалежних мутантів E. carotovora та дослідження їх властивостей було виконано спільно із к.б.н. М.С. Муквичем. Концентрування, розділення та встановлення поліпептидного складу різних типів кілерних факторів E. carotovora було проведено у співавторстві із к.б.н. Л.О. Максименко. Аналіз результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати проведеної роботи доповідались на щорічних конкурсах науково-дослідних робіт та робіт молодих вчених Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (2004 р., 2005 р.), на Міжнародній науково-практичній конференції "Пробіотики – XXI століття. Біологія. Медицина. Практика" (Тернопіль, 2004), на X з'їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004), на IV-ій Міжнародній конференції "Біоресурси і віруси" (Київ, 2004), на 9-ій Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих вчених "Биология – наука XXI века" (Пущино, 2005), на Міжнародній науковій конференції "Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія" (Київ, 2005), на II-ій Міжнародній науковій конференції молодих вчених "Молодь і досягнення науки у вирішенні проблем сучасності" (Чернівці, 2005), на науковій конференції молодих вчених "Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології" (Ужгород, 2005), на 10-ій Пущинській школі-конференції молодих вчених, присвяченій 50-річчю Пущинського наукового центру РАН "Биология – наука XXI века" (Пущино, 2006).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 11 робіт (з них 4 статті в профільних журналах і 7 тезисів доповідей).

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 157 сторінках машинописного тексту і має такі розділи: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали і методи”, “Результати досліджень”, “Обговорення результатів дослідження”, “Висновки”, “Список літератури”. Робота містить 7 таблиць, 26 рисунків, 224 посилання (з яких 189 іноземних авторів).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Розділ 1. Огляд літератури

В огляді літератури розглядається явище бактеріоциногенності та природа бактеріоцинів, наводяться основні принципи їх класифікації, описується структура та механізми кілерної дії типових бактеріоциногенних факторів. Охарактеризовано хромосомно- та плазміднолокалізовані генетичні детермінанти бактеріоцинів, основні способи їх SOS-індукції, а також поширеність кілерних факторів серед представників родини Enterobacteriaceae. Особливу увагу приділено дослідженим особливостям бактеріоцинів роду Erwinia. В окремому розділі описано практичне значення та перспективи застосування бактеріоцинів.

Розділ 2. Матеріали і методи

Вивчення міжбактеріального антагонізму проводили шляхом вирощування у змішаній культурі бактеріоцинпродукуючого штаму Erwinia carotovora subsp. carotovora J2 (Есс J2) та індикаторної культури Escherichia coli BЕ (Есо ВЕ). Індукцію каротоворіцинів (CTV) фіксували за появою негативних зон лізису на газоні індикаторного штаму. Дослідження характеру впливу клітинних метаболітів E. coli BE на ріст та можливу індукцію CTV здійснювали шляхом інкубування бактерій Есс J2 із 0, 5, 8 і 24-х годинними культуральними рідинами Есо ВЕ. Через 0, 3, 6 та 22 год визначали інтенсивність впливу надосадових рідин E. coli на характер росту E. carotovora.

Дослідження процесу індукції та виділення бактеріоцинів проводили на залежних по тиміну ауксотрофних мутантах E. carotovora, отриманих за стандартною методикою із чотирьох штамів різного походження (Миллер, 1976). Для кожного клону встановлювали мінімальну потребу в тиміні, частоту спонтанних реверсій, а також кількісний вихід каротоворіцинів. Індукцію CTV здійснювали кількома вперше запропонованими методами. Метод "надлишкового тиміну" полягав у вирощуванні мутантної культури протягом 24 год в мінімальному середовищі М9 із низьким вмістом ростового фактора (0,025 мкг/мл). Після цього, в бактеріальну суспензію додавали тимін до кінцевої надлишкової концентрації 100 мкг/мл і продовжували культивування. Через 24 год суспензію обробляли хлороформом і очищали від клітинного дебрісу. Одержаний препарат позначали як plen-лізат. При застосуванні методу "виснаження тиміну" ауксотрофи вирощували протягом 48-96 год в середовищі М9 із мінімальною концентрацією тиміну – від 0,5 до 0,001 мкг/мл. В результаті отримували препарат CTV dep-лізат.

Індукцію каротоворіцинів також здійснювали за допомогою впливу на прототрофні клітини E. carotovora J2 мітоміцину С у концентрації 1 мкг/мл (mit-лізат) та налідиксової кислоти 20 мкг/мл (nal-лізат).

Літичну активність бактеріоцинів визначали за появою негативних зон лізису на двохшарових середовищах LB із чутливими культурами - E. carotovora 66А і М2-4/RI, а також E. coli BE та K12. Відносну кілерну активність CTV (Arel) встановлювали через співвідношення діаметрів негативних зон до діаметру максимальної зони лізису, одержаної в даній серії експериментів. Показник Ae визначали за об’ємом препарату CTV, який необхідно внести в середовище для виживання на ньому 37% або е-1 клітин мікроорганізмів. Питому кілерну активність каротоворіцинів (Aesp) розраховували як співвідношення показника Ae до концентрації білка в препараті.

Концентрування CTV здійснювали ультрацентрифугуванням при 110 тис. g, висолюванням 30-80%-ним сульфатом амонію та преципітацією 10%-ним поліетиленгліколем 6000. Для розділення бактеріоцинів застосовували іонообмінну хроматографію на ДЕАЕ-сефарозі, а також центрифугування в градієнті густини метризаміду і сульфату цезію.

Для визначення нуклеазної активності каротоворіцинів ДНК плазмід pBR322, pUC18, а також фага л обробляли препаратами CTV при 37°С протягом 2 год. Одержану суміш розділяли за допомогою електрофорезу в гелях 0,9–1% агарози при напруженості електричного поля 6-7 В/см. За інтенсивністю гідролізу відповідних форм ДНК оцінювали характер нуклеазних властивостей бактеріоцинів E. carotovora. Для аналізу експериментальних даних застосовували комп’ютерну програму TotalLab 2.01.

Дослідження впливу каротоворіцинів на індукцію фага л проводили шляхом обробки бактеріальної суспензії E. coli K12 препаратами CTV при 37°С протягом 4 год. Титр індукованого фага в одержаних лізатах встановлювали за появою фагових бляшок на газоні індикаторного штаму E. coli С600.

Вивчення поліпептидного складу каротоворіцинів здійснювали за допомогою електрофорезу концентрованих препаратів бактеріоцинів у 10%-ому поліакриламідному гелі при 120А протягом 5-6 год. Як маркери використовували стандартну суміш білків фірми Pharmacia.

Дослідження структурно-морфологічної організації часток типу фагових базальних пластинок E. carotovora J2 (часток BPJ). Фотографічні зображення електронно-мікроскопічних препаратів часток BPJ, а також базальних пластинок інших штамів E. carotovora та фага ZF-40 були надані д.б.н. Товкачем Ф.І. Електронограми переводили в цифрову форму та обробляли за допомогою комп’ютерної програми Adobe Photoshop 7.0.

Розділ 3. Результати досліджень

Взаємодія бактеріальних культур у змішаних популяціях. Для встановлення ролі бактеріоцинів в процесі міжбактеріального антагонізму досліджували динаміку росту у змішаній культурі бактеріоцинпродукуючого штаму E. carotovora J2 та індикаторного штаму E. coli BE. На початок експерименту у дослідній суспензії містилося 3,4Ч107 кл/мл Eсс J2 і 3,6Ч107 кл/мл Eсо BE. Взаємне пригнічення росту бактерій розпочиналось одразу після їх змішування і продовжувалось протягом 3 год культивування (рис. 1). В кінці вказаного періоду в дослідному зразку виявляли 3,2Ч107 кл/мл Eсс J2 та 2,6Ч108 кл/мл Eсо BE. В цей же час у E. carotovora було відмічено початок виділення бактеріоцинів, Arel яких становила 0,46 од. Протягом наступних трьох годин культивування титри обох мікроорганізмів підвищувались і досягали максимальних значень на 6 год росту. Їх концентрації зростали приблизно втричі, проте не досягали титрів відповідних бактерій у чистих культурах. В даний період активність CTV була найвищою (Arel=1 од). В подальшому спостерігалось повторне падіння титрів бактерій-антагоністів.

Таким чином, було відмічено не менше двох циклів коливань значень B/B0 для обох мікроорганізмів. Тривале спостереження за дослідними зразками протягом наступних 72 год дозволило встановити, що ріст культур в суміші носить циклічний характер. Чергування періодів наростання і падіння концентрацій бактерій одразу в обох популяціях може свідчити про протікання в даній системі взаємопов’язаних антагоністичних процесів. Описані особливості росту культур, на нашу думку, були зумовлені наявністю в живильному середовищі кілерних факторів, які пригнічували ріст мікроорганізмів як на початкових етапах спостереження, так і при тривалому культивуванні.

В подальшому проводили дослідження впливу надосадових рідин E. coli BE різної тривалості культивування на ріст та виділення бактеріоцинів клітинами E. carotovora J2. На початковому етапі інкубування (0-3 год) супернатанти Eсо BE суттєво не впливали на вміст в суспензії Eсс J2. Додавання надосадових рідин в період з 3 по 6 год призводило до падіння титру ервіній. Загибель клітин E. carotovora пов'язували з індукцією та виділенням каротоворіцинів, оскільки бактерії E. coli BE не здатні продукувати кілерних факторів. Після 6 год росту супернатанти Eсо BE не впливали на титр Eсс J2. В результаті проведених досліджень було зроблено висновок, що індукція бактеріоцинів E. carotovora пов’язана із виділенням певних клітинних метаболітів E. coli.

Дослідження індукції та синтезу бактеріоцинів за допомогою голодування тимінзалежних мутантів E. carotovora. Для вивчення процесів індукції і виділення бактеріоцинів використовували тимінзалежні ауксотрофи E. carotovora. З цією метою було отримано серію мутантних клонів: для штаму Б1 – 14, 48A – 12, J2 – 14. Одержані ауксотрофи за мінімальною потребою в тиміні розділили на дві групи. Клони із високою потребою у факторі росту по аналогії до Thy--мутантів E. coli були позначені як мутанти типу thyA, а з низькою – як мутанти типу deo. Більшість Thy- ауксотрофів штамів Б1 і 48А ревертували до фенотипу Thy+ із частотами 1,0-5,2Ч10-7 кл/мл, що свідчить про точковий характер утворених мутацій. Середня частота реверсій мутантів штаму J2 була суттєво нижчою і становила 3,3Ч10-8 кл/мл.

Відмічено, що при тривалому голодуванні (24 год) Thy--мутанти Eсс Б1 виділяли бактеріоцини одного типу. Дані кілери впливали лише на індикаторну культуру E. carotovora 66A і були позначені як каротоворіцини типу С (CTV-C). Мутанти Eсс 48А характеризувались утворенням бактеріоцинів, які викликали лізис виключно штамів E. coli К12 (кілери типу CTV-K). Бактеріоцини, що лізували чутливу культуру E. coli BE позначали, відповідно, CTV-B. При застосуванні методу голодування із наступним відновленням нормальної концентрації тиміну частки CTV-C синтезувались двома “хвилями”. Максимуми їх появи припадали на 30 та 150 хв голодування і не залежали від типу Thy--мутацій. Також відмічено залежність індукції CTV від складу живильного середовища та вплив різних умов голодування на кількісний та якісний склад синтезованих бактеріоцинів. Наведені дані свідчать про множинний характер дефектної лізогенії і, відповідно, бактеріоциногенності E. carotovora.

При дослідженні загальних закономірностей лізогенної індукції бактеріоцинів використовували Thy--мутанти E. carotovora штаму J2. Останні характеризувались низькою частотою реверсій і високими показниками відносної кілерної активності CTV. За показником Arel каротоворіцинів та їх впливом на індикаторні культури, мутанти штаму J2 були поділені на 3 групи. Представники першої групи виділяли лише частки CTV–C невисокої активності (0,37-0,50 од). Ауксотрофи другої групи синтезували каротоворіцини типу С із значно вищими показниками Arel - 0,40-0,67 од, а також кілери типу CTV-B. До складу третьої групи було віднесено два високоактивні продуценти (Thy--6 і Thy--4), CTV яких впливали на усі індикаторні штами. У представників усіх трьох виділених груп прослідковувалась загальна тенденція – зростання показника Arel часток типу С супроводжувалось збільшенням діапазону кілерної активності каротоворіцинів.

В подальшому, як універсальний продуцент кілерних часток було використано мутантний клон Thy--6. Виявилось, що при внесенні в середовище М9 тиміну у концентрації 2 мкг/мл і більше відбувався ріст клітин-продуцентів. Відсутність ростового фактора спричиняла зниження титру життєздатних бактерій або ефект "безтимінової смерті". При чому, за обох варіантів розвитку процесу (ріст клітин або їх загибель) помітного виділення бактеріоцинів не спостерігалося. Встановлено, що індукція каротоворіцинів можлива при додаванні в середовище менше, ніж 0,5 мкг/мл тиміну. При внесенні ростового фактора вище даного рівня, кількість синтезованих CTV зменшувалась.

Для індукції бактеріоцинів із E. carotovora Thy--6 було використано два методи: "надлишкового тиміну" і "виснаження тиміну". У першому випадку в одержаних лізатах виявляли високі концентрації каротоворіцинів усіх типів. Застосування методу "виснаження тиміну" призводило до утворення кілерних факторів виключно типу С. Відносна кілерна активність останніх виявилась на 20% нижчою за таку часток CTV-С, отриманих методом "надлишкового тиміну". За наявності в ростовому середовищі оптимальних концентрацій тиміну, клітини ауксотрофів мали вигляд дрібних, поодиноко розташованих паличок. Після тривалого голодування бактерії подовжувались і набували характерний вигляд витягнутих тяжів, в середині яких виявлялись перетяжки.

Встановлено, що при застосуванні методу "виснаження тиміну" індукція та виділення каротоворіцинів можливі за наявності в суспензії не менше 3,7106кл/мл бактерій Есс Thy--6. Для методу "надлишкового тиміну" мінімальний титр клітин в середовищі становив 1,7107 кл/мл. При використанні обох методів було відмічено лінійну залежність між вихідною концентрацією бактерій-продуцентів і кількістю виділених ними бактеріоцинів.

При застосуванні методу "виснаження тиміну" спостерігалось два піки виходу кілерних факторів. Активність утворених бактеріоцинів залежала від концентрації внесеного у вихідне середовище ростового фактора (рис. 2). Додавання до ауксотрофів в стані голодування тиміну у надлишковій кількості (метод "надлишкового тиміну") призводило не лише до збільшення загального пулу каротоворіцинів, але і до збереження двохвильового характеру їх синтезу. Для обох методів вихідні концентрації тиміну, за яких відбувалося максимальне і мінімальне виділення CTV, мали тенденцію до повторення. В результаті було зроблено припущення, що утворення каротоворіцинів регулюється окремими репресорами, які проявляють різну чутливість по відношенню до активованої RecA-протеази. Ймовірно, що несприятливі умови культивування - підвищення ступеню голодування мутантних культур при зменшенні в середовищі концентрації вихідного тиміну можуть збільшувати загальний пул активованого RecA-білка. Тому, на нашу думку, кожний пік виділення бактеріоцинів відповідає розщепленню репресорів відповідного типу.

Таким чином, застосування двох способів індукції тимінзалежних мутантів Ecc Thy--6 при різних вихідних концентраціях клітин-продуцентів і внесеного в середовище тиміну призводить до виходу бактеріоцинів кількох типів. Виділенню каротоворіцинів притаманний хвилеподібний процес, зумовлений різною чутливістю репресорів даних кілерних факторів до активованої RecA-протеази.

Процеси індукції бактеріоцинів клітинами E. carotovora під дією мітоміцину С та налідиксової кислоти. Для підтвердження отриманих результатів на наступному етапі дослідження у якості модельної культури використовували прототрофні клітини E. carotovora J2. Індукторами кілерних факторів слугували мітоміцин С (1 мкг/мл) та налідиксова кислота (20 мкг/мл), які відрізняються за механізмом дії та характером ушкодження клітинної ДНК.

Вплив налідиксової кислоти на клітини E. carotovora J2 зумовлював утворення бактеріоцинів трьох типів. Першими серед кілерних факторів на 2 год культивування виявлялися частки CTV-C (рис. 3). Вихідні значення Arel каротоворіцинів даного типу становили 0,14 од, а титр бактерій - 5Ч107 кл/мл. Рівень індукції CTV в дослідній суспензії співвідносили із концентрацією клітин в контролі, оскільки дія навіть незначних концентрації мітоміцину С та налідиксової кислоти призводить до припинення поділу бактерій і неможливості встановлення їх титру в дослідному зразку. Початок утворення часток CTV-B та CTV-K було відмічено на 3 та 4 год культивування. Вихідні значення їх Arel становили 0,25 і 0,4 од, відповідно. В подальшому концентрація бактеріоцинів усіх типів підвищувалась. Максимальні показники відносної кілерної активності CTV виявлялись на 6 год інкубування при титрі бактерій-продуцентів 6Ч108 кл/мл. Протягом наступного періоду (7-9 год) вміст каротоворіцинів в середовищі знижувався. Встановлено, що від початку виявлення до досягнення пікових концентрацій Arel кілерів CTV-C і CTV-B підвищувалась у 7 та 4 рази, відповідно. Натомість, аналогічний показник часток CTV-K зростав лише вдвічі. Це свідчить, що бактеріоцинам типів C і B притаманний поступовий процес індукції, тоді як частки CTV-K, очевидно, синтезуються одразу у високих концентраціях. Проте, виділення бактеріоцинів усіх типів має схожі закономірності: показник Arel зростає до певного максимального значення, після чого спостерігається його часткове зниження. При тривалому інкубуванні (24 год) бактерій Eсс J2 із налідиксовою кислотою відмічено декілька подібних циклів виділення кілерних факторів. Вплив мітоміцину С на клітини E. carotovora J2 зумовлював схожий характер індукції бактеріоцинів. В результаті зроблено висновок, що каротоворіцинам притаманний хвилеподібний тип виділення.

Далі проводили порівняння ефективності індукції бактеріоцинів E.carotovora мітоміцином С, налідиксовою кислотою, а також методами голодування Thy--мутантів. Для цього в препаратах CTV визначали концентрацію білку, активність Аe та питому кілерну активність Aesp (табл. 1).

Таблиця 1

Кілерні активності каротоворіцинів, одержаних за допомогою різних методів лізогенної індукції

Індуктор / метод | Штам

Есс | Аrel,

од | Аe ,

од/мл | С, мг/мл | Аesp ,

од/мг білка

Мітоміцин С | J2 | 1,00 | 13,5 | 0,168 | 80

Налідиксова кислота | J2 | 0,84 | 12,5 | 0,064 | 195

Метод "надлишкового тиміну" | J2 Thy–6 | 1,00 | 13,0 | 0,150 | 87

Метод "виснаження тиміну" | J2 Thy–6 | 0,82 | 12,9 | 0,093 | 139

Примітка: Аrel встановлена на індикаторі Eсс 66A окремо для бактеріоцинів із прото- та ауксотрофних штамів. Аrel – відносна кілерна активність. Аe – кілерна активність, встановлена за виживанням індикаторних культур. Аesp – питома кілерна активність. С – концентрація білка в препараті.

Встановлено, що значення Аe були однаково високими для бактеріоцинів отриманих різними методами. Проте, дія налідиксової кислоти зумовлювала накопичення в препаратах відносно низького вмісту білку. В результаті кілерні фактори nal-лізатів характеризувались максимальними показниками Аesp. Питомі активності CTV, індуковані мітоміцином С і методом "надлишкового тиміну", були приблизно однаковими. Це вказує на високу ефективність застосування методів голодування для одержання бактеріоцинів.

Отже, за допомогою різних методів лізогенної індукції із E. carotovora J2 було виділено каротоворіцини різних типів, що свідчить про дефектну лізогенність даного штаму. Відмічено високу ефективність індукції CTV мітоміцином С та налідиксовою кислотою. Вплив мітоміцину С спричиняв вихід бактеріоцинів одразу у високих концентраціях. Дія налідиксової кислоти зумовлювала більш поступове утворення кілерних факторів. Характер виділення CTV усіх типів був хвилеподібним і характеризувався етапністю їх появи в середовищі. Наведені факти вказують на існування в клітині окремих репресорів для каротоворіцинів кожного типу та їх поступове руйнування RecA-білком.

Ідентифікація бактеріоцинів E. carotovora J2. В процесі роботи було відмічено, що частки CTV здатні утворювати на індикаторних культурах негативні зони різного діаметру і морфології. Так, вплив кілерних факторів на клітини Eсс 66А характеризувався появою зон лізису великих розмірів, які виходили за межі нанесених крапель (рис. 4, А). При цьому, середній діаметр негативних зон становив 10 мм, а їх максимальні значення в окремих випадках досягали 17 мм. Частки досліджуваних препаратів на індикаторах E. coli BE і K12 утворювали зони лізису, розміри яких співпадали із розмірами нанесеної рідини (рис. 4, В, Г). При цьому, різниця між середніми діаметрами негативних зон на чутливих культурах Eсс 66А та Есо ВЕ (Есо К12) досягала 30%. Низькомолекулярні структури, порівняно із високомолекулярними білковими комплексами, швидше дифундують у напіврідкому агарі. Тому, ймовірно, великі розміри зон лізису свідчать про належність кілерних факторів типу CTV-C до низькомолекулярних коліциноподібних бактеріоцинів. Частки CTV-В і CTV-К утворювали негативні зони значно менших розмірів, що дозволило попередньо віднести ці кілери до макромолекулярних бактеріоцинів.

Вплив каротоворіцинів на чутливу культуру Eсс М2-4/RI зумовлював утворення плям лізису особливої морфології (рис. 4, Б). Останні характеризувались центральною зоною високої чіткості та стабільних розмірів, навколо якої виявлявся "розмитий" ореол. Центральна зона, на нашу думку, формується внаслідок літичної дії суміші бактеріоцинів або виключно макромолекулярних кілерів. Зовнішній ореол – виникає наслідок впливу коліциноподібних каротоворіцинів. В результаті було зроблено припущення, що культура E. carotovora М2-4/RI чутлива до кілерних факторів обох типів.

Одним із критеріїв диференціювання бактеріоцинів вважається їх різна чутливість до впливу підвищених температур. Відмічено, що кілери dep-лізату не втрачали кілерної активності після обробки температурою 100°С протягом 5 хв (рис. 5). Даний препарат містив у своєму складі виключно частки типу С. Згідно класифікації Bradley, стійкими до впливу підвищених температур є коліциноподібні бактеріоцини.

Дані препарати характеризувались схожими, двохетапними кривими термоінактивації. На першому етапі, при підвищенні температури до певного значення, відмічалося поступове зниження показника Аrel бактеріоцинів. При цьому, криві термоінактивації досліджуваних лізатів співпадали із такими часток CTV-C dep-лізату. На другому етапі, після поступового зниження показника Аrel, наступала стадія повної втрати кілерної активності каротоворіцинів. Даний етап виявився однаково коротким для CTV усіх препаратів. Повна інактивація бактеріоцинів nal-лізату наступала при 65°С, mit-лізату – при 90°С, а plen-лізату – при 95°С. В результаті на другому етапі криві інактивації досліджуваних препаратів кардинально відрізнялись від таких часток CTV-C. За класифікацією Bradley, висока чутливість до підвищених температур властива макромолекулярним бактеріоцинам.

Отже, застосування різних методів індукції призводить до вибіркового накопичення в бактеріальних лізатах каротоворіцинів двох типів у різному процентному співвідношенні. Термостабільні бактеріоцини CTV–C зберігають кілерну активність навіть при дії високих температур і належать до коліциноподібних каротоворіцинів. Частки CTV–B та CTV–K характеризуються термолабільністю і тому були віднесені до макромолекулярних бактеріоцинів.

Очистка бактеріоцинів E. carotovora фізико-хімічними методами. Для проведення наступних етапів дослідження слід було отримати концентровані препарати бактеріоцинів та провести їх розділення на окремі типи. З цією метою застосовували різні фізико-хімічні методи (рис. 6). За допомогою ультрацентрифугування було одержано осаджені препарати, які в подальшому позначали як С-осад. При порівнянні показників відносної кілерної активності бактеріоцинів до і після ультрацентрифугування було відмічено значний концентруючий ефект. За допомогою даного методу вдалося підвищити Аrel часток CTV-C в 5 разів, CTV-В – в 9 разів, а CTV-К – в 12 разів. При цьому в одержаних препаратах активність кілерів типу В і К знаходилась на однаковому рівні, а показники Аrel CTV-С виявлялись лише частково нижчими.

Наступним методом концентрування кілерних часток було висолювання сульфатом амонію різної концентрації (30–80%). Внесення (NH4)2SO4 до 40-60%-ного насичення дозволило перевести практично усі частки бактеріоцинів в осад (позначено як S-осад). Проте, в супернатантах частково залишались каротоворіцини типу К. Після діалізу одержаних препаратів концентрація CTV суттєво не знижувалась. За допомогою даного методу було досягнуто максимальне зростання активності каротоворіцинів усіх типів: часток типу С у 70 разів, типу В – у 50 разів, а типу К – у 46 разів.

В подальшому для осадження бактеріоцинів застосовували поліетиленгліколь з м.м. 6000. В одержаних ПЕГ-преципітатах (Р-осадах) переважали макромолекулярні частки, тоді як вміст коліциноподібних каротоворіцинів був доволі незначним. В результаті за допомогою даного методу було досягнуто зростання Аrel CTV-B у 52 рази, а CTV-К – у 6 разів. Активність часток типу С, натомість, знижувалась у 16 разів. Отже, використання ПЕГ-6000 дозволило не лише вибірково підвищити активності макромолекулярних кілерів, але й досягнути часткового розділення бактеріоцинів різних типів.

Для повного розділення кілерних факторів Е. carotovora було використано іонообмінну хроматографію на ДЕАЕ-сефарозі. Встановлено, що фракції 1-10, елюйовані 0,01М фосфатним буфером (РВ) із 0,1М NaCl не проявляли літичної активності. Елюція матеріалу РВ із 0,2М NaCl (фракції 11-20) призводила до змиву часток CTV-К. Використання РВ із 0,3М хлориду натрію (фракції 21-30) спричиняло елюцію часток CTV–В, а також повторне змивання кілерів CTV–K. Максимальні активності бактеріоцинів обох типів було відмічено в 25 фракції (Аrel - 0,57 од). Застосування РВ із 0,4М NaCl (фракції 31-40) дозволило отримати частки CTV–С, пікова активність яких виявлялася в 36-37 фракціях (1 од). Отже, наведені дані свідчать про високу ефективність застосування іонообмінної хроматографії для розділення каротоворіцинів на окремі типи.

Для виключення можливості часткового змішування різних типів кілерних факторів проводили центрифугування концентрованих препаратів каротоворіцинів в градієнті густини метризаміду та сульфату цезію. За характером літичної активності бактеріоцинів отримані фракції було поділено на 3 групи: фракції із низькою густиною (L-фракції), фракції із високою густиною (Н-фракції) та проміжні M-фракції (рис. 7). Низькомолекулярні коліциноподібні бактеріоцини типу С виявлялись в L-фракціях (с=1,024-1,081 г/см3) і впливали лише на близькоспоріднені штами E.carotovora. Високомолекулярні частки CTV-В і CTV-К притаманні Н-фракціям (с=1,227-1,285 г/см3). Каротоворіцини даних типів характеризувались ширшим спектром кілерної активності, оскільки лізували як клітини E. coli ВЕ і К12, так і E. carotovora М2-4/RI. М-фракції активних бактеріоцинів не містили. Отримані дані підтвердили припущення, що індикаторні штами Еco ВЕ і Еco К12 чутливі до часток CTV-В і CTV-К, тоді як клітини Еcc 66А – виключно до кілерів типу С. Індикаторну культуру Е. carotovora М2-4/RI лізували каротоворіцини обох типів. Наведені результати були підтверджені при центрифугуванні концентрованих препаратів CTV в градієнті густини сульфату цезію, що свідчить про високу ефективність використаних методів для розділення бактеріоцинів різних типів.

Вивчення нуклеазної активності каротоворіцинів та їх дії на чутливі клітини бактерій. Відмічено, що в окремих випадках вплив каротоворіцинів на індикаторні культури супроводжувався індукцією бактеріофагів. Дане явище, на нашу думку, було пов’язано із нуклеазною активністю часток CTV і ушкодженням клітинної ДНК. Тому, в препаратах бактеріоцинів на всіх етапах їх концентрування і розділення перевіряли наявність нуклеазних властивостей.

Встановлено, що дія вихідного nal-лізату на ДНК плазмід pBR322, pUC18 та ДНК фага л спричиняла повний гідроліз їх лінійних та кільцевих форм. Так, відсоток лінійної форми ДНК фага л до обробки становив 25%, тоді як після обробки - лише 0,28%. Об’єм кільцевої суперспіралізованої форми плазміди pBR322 в обробленому зразку знижувався у 24 рази. Для ДНК плазміди pUC18 була відмічена аналогічна тенденція – повне розщеплення її лінійних та кільцевих молекул. Проте, отримані результати не дозволили однозначно стверджувати, що ДНКазна активність асоційована саме із бактеріоцинами E. carotovora.

Для виключення можливості забруднення дослідних зразків бактеріальними нуклеазами, застосовували високоочищені та розділені центрифугуванням в градієнті густини метризаміду препарати CTV. Показано, що обробка індикаторних ДНК коліциноподібними частками L-фракцій викликала інтенсивний гідроліз їх кільцевих форм (рис. 8). Даний препарат спричиняв зниження відсотку кільцевої суперспіралізованої форми плазміди pBR322 із 12,7% до 0,12%. Об’єм відкрито кільцевої форми плазміди pUC18 зменшувався у 8,3 рази, а кільцевої суперспіралізованої – у 44 рази. Лінійна форма ДНК розщеплялась лише частково. Аналогічні дослідження макромолекулярних каротоворіцинів H-фракцій показали, що дані частки не гідролізують ДНК. Характерні для лінійних та кільцевих форм піки в контрольних і дослідних зразках були однаковими. Отже, коліциноподібним часткам E. carotovora притаманна неспецифічна ендонуклеазна активність, тоді як для макромолекулярних каротоворіцинів дані властивості не характерні.

Наступним етапом роботи було дослідження впливу бактеріоцинів E. carotovora на SOS-індукцію фага л. У якості чутливого штаму застосовували бактерії E. coli К12, які містять у складі свого геному профаг л. Встановлено, що дія CTV концентрованого препарату С-осад спричиняла двократне зростання лізогенної індукції фага л, порівняно із рівнем його спонтанного виходу. Обробка культури Еco К12 коліциноподібними частками L-фракцій зумовлювала підвищення рівня фагової індукції в 1,5 рази. Вплив макромолекулярних часток, натомість, призводив до часткового зниження виходу фага л - 6Ч104 БУО/мл, при титрі його спонтанного утворення 8Ч104 БУО/мл. Використання суміші CTV обох типів викликало зростання рівня індукції фага л в 4,4 рази.

Отже, коліциноподібні каротоворіцини посилюють лізис чутливих культур за рахунок лізогенної індукції бактеріофагів. Макромолекулярні частки, очевидно, лізують клітини методом “вбиванням ззовні”, аналогічно високомолекулярним бактеріоцинам інших бактерій. В природних умовах, ймовірно, має місце сумісна дія каротоворіцинів обох типів. Це проявляється у посиленні макромолекулярними частками індукуючого і, відповідно, літичного впливу коліциноподібних кілерів.

Вивчення структурно-морфологічної організації каротоворіцинів E. carotovora. При дослідженні поліпептидного складу бактеріоцинів E.carotovora було показано, що до складу кілерних часток обох типів входить близько 10 поліпептидів із молекулярними масами від 20 до 91 кДа (рис. 9). Макромолекулярні каротоворіцини є складно організованими структурами і побудовані із 7 поліпептидів. Три поліпептиди належать до мажорних компонентів (поліпептид з м.м. 23 кДа або p23; р25 і р46), тоді як чотири інші – до мінорних (р31, р54, р58 і р91). Для коліциноподібних кілерних факторів, натомість, відмічено значне переважання вмісту одного поліпептида із м.м. 54 кДа. Інші поліпептиди виявлялись у незначних концентраціях і були віднесені до мінорних компонентів. На даний момент функції окремих поліпептидів залишаються невідомими і потребують подальших досліджень.

Вплив налідиксової кислоти на клітини E. carotovora спричиняє накопичення в бактеріальних лізатах структур типу фагових базальних пластинок (Товкач, 2002). В процесі роботи було відмічено, що часткам CTV-С притаманні специфічні властивості, які не характерні коліциноподібним кілерам інших бактерій. Тому, було зроблено припущення, що бактеріоцини типу С E. carotovora є структурними компонентами бактеріофагів і виявляються у вигляді фагових базальних пластинок (часток ВРJ). Подальшим етапом роботи було дослідження структурно-морфологічної організації часток ВРJ.

При аналізі електронограм показано, що часткам BPJ характерні нечіткі розмиті контури, а їх середній діаметр становить близько 40 нм. Основні структурні компоненти даних базальних пластинок мають вигляд темних та світлих полів характерної конфігурації, які чергуються між собою (рис. 10). В межах світлих полів виявляються парні округлі компоненти діаметром близько 3 нм, які формують їх внутрішню структуру. Чотири світлі ділянки утворюють одну структурно-морфологічну субодиницю вищого порядку (1 – 4, рис. 10, А). Дані субодиниці, ймовірно, регулярно повторюються по всій поверхні базальної пластинки.