МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ВІННИЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. М.І. ПИРОГОВА

БАКУН ОКСАНА ВАЛЕРІАНІВНА

УДК 618.177 – 089.888.11:612.017.1

ПІДВИЩЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ЗАПЛІДНЕННЯ IN VITRO ПРИ ЛІКУВАННІ ЖІНОЧОГО БЕЗПЛІДДЯ ТРУБНОГО ПОХОДЖЕННЯ З УРАХУВАННЯМ РОЛІ АНТИОВАРІАЛЬНИХ АНТИТІЛ

14.01.01 – акушерство і гінекологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Вінниця – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Буковинському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Юзько Олександр Михайлович, Національна медична академія післядипломної освіти ім. П. Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри акушерства і гінекології №1

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Жук Світлана Іванівна, Вінницький національний медичний університет ім. М. І. Пирогова МОЗ України, професор кафедри акушерства і гінекології №1;

доктор медичних наук, професор Пирогова Віра Іванівна, Львівський національний медичний університет

ім. Данила Галицького, завідувач кафедри акушерства, гінекології та перинатології факультету післядипломної освіти.

Провідна установа:

Інститут педіатрії, акушерства і гінекології АМН України, відділ планування сім’ї та статевого дозрівання дівчат та підлітків.

Захист відбудеться “_13__”_червня_2007 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 05.600.01 при Вінницькому національному медичному університеті ім. М.І. Пирогова МОЗ України (21018, м. Вінниця, вул. М.І. Пирогова, 56).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Вінницького національного медичного університету ім. М. І. Пирогова (21018, м. Вінниця, вул. М.І. Пирогова, 56).

Автореферат розісланий “_4__”_травня_2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої ради,

доктор медичних наук, професор С.Д. Хіміч

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Безпліддя – важлива медико-соціальна проблема сучасної медицини (В.І. Грищенко і співавт., 2004; И.Т. Говоруха, 2004). Патологія маткових труб є однією з найбільш поширених причин інфертильності в жінок репродуктивного віку. Зміни в трубах виявляються у 35,0-74,0% хворих з безпліддям. У більшості жінок причиною оклюзійних порушень маткових труб є запальний процес, який ініціюється генітальною інфекцією, тривала персистенція якої втягує в запальний процес і тканину яєчників (В.И. Кулаков, Б.В. Леонов, 2000; И.Ю. Госкодеря, 2004). Хронічний сальпінгоофорит, як типова запальна реакція, тісно пов’язаний з імунітетом і процесами регенерації. Значний інтерес викликають дослідження, присвячені вивченню ролі імунокомпетентних систем у патогенезі запальних захворювань жіночих статевих органів (Д.В. Лалаян, 2002; А.П. Пархоменко, 2002). За станом факторів специфічного клітинного імунітету можна судити про наслідки запального процесу. Імунологічна недостатність послаблює компенсаторно-пристосувальні механізми, гальмує процеси регенерації. Утворення автоантитіл до антигенів яєчника й маткових труб ускладнює перебіг запального процесу та сприяє рецидивам. Аномальний рівень автоантитіл супроводжує репродуктивні невдачі (Е.А. Калинина, 2002; К.А. Габелова и соавт., 2003).

При даній формі безпліддя реконструктивно-пластичні операції на маткових трубах недостатньо ефективні. Успішні операції спостерігаються в 13,2-45,7% випадків, частота настання трубної вагітності після лікування складає 4,7-16,1% (В.Ю. Смольников, Е.Я. Финогенова, 2000). Ефективність відновлення репродуктивної функції при трубно-перитонеальному безплідді знаходиться в прямій залежності від ступеня розповсюдження злукового процесу. У зв’язку з цим необхідно проаналізувати можливі причини неефективності спроб запліднення in vitro і переносу ембріонів у жінок з безпліддям трубного походження, яке обумовлене запальними змінами. Ця процедура – дороге й складне втручання. Тому надзвичайно важливим є пошук нових методів, які дозволяють підвищити ефективність цієї програми і зменшити медикаментозне навантаження на організм жінки. Усе це призводить до необхідності підготовки хворих до програми запліднення in vitro з урахуванням даних про стан системи гемостазу, імунної системи, систем детоксикації, тканинного дихання. Цьому відповідає такий метод екстракорпоральної гемокорекції, як плазмаферез (К.А. Яворская, 2000; Е.А. Калашникова, 2004; R. Druckmann, 2001).

У літературі не наведені дані щодо впливу плазмаферезу на ефективність запліднення in vitro, рівень антиоваріальних антитіл, гормональний гомеостаз, імунний статус. Відсутні також відомості про вплив антиоваріальних антитіл на ефективність запліднення in vitro. Тому роботи, які спрямовані на підвищення ефективності запліднення in vitro у хворих з безпліддям трубного походження шляхом комплексної підготовки з включенням плазмаферезу, є актуальними.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом наукової тематики кафедри акушерства і гінекології з курсом дитячої та підліткової гінекології Буковинського державного медичного університету: “Вивчення перинатальних чинників захворюваності, розробка та впровадження методів діагностики, лікування і профілактики патологічних станів репродуктивної функції у дівчат і жінок Північної Буковини”
(№ державної реєстрації 01.06 U 008499).

Мета роботи: підвищити ефективність лікування жіночого безпліддя трубного походження при застосуванні допоміжних репродуктивних технологій шляхом комплексної підготовки до запліднення in vitro з використанням плазмаферезу.

Завдання дослідження:

1. Оцінити ефективність запліднення in vitro у жінок з безпліддям трубного походження.

2. Визначити роль антиоваріальних антитіл у жінок з безпліддям трубного походження.

3. Вивчити особливості функціонування системи гормонального гомеостазу у жінок з безпліддям трубного походження.

4. Дослідити стан імунітету в даної категорії пацієнток у зіставленні з гормональним балансом, наявністю антиоваріальних антитіл та продукцією лімфоцитами IL-4 і TNF-?.

5. Впровадити методику плазмаферезу в жінок з безпліддям трубного походження на етапі підготовки до програми запліднення in vitro.

6. Оцінити ефективність використання плазмаферезу при застосуванні запліднення in vitro в жінок з безпліддям трубного походження.

Об’єкт дослідження – безпліддя трубного походження, яке лікується за програмою допоміжних репродуктивних технологій.

Предмет дослідження – гормональний гомеостаз, рівень антиоваріальних антитіл, імунологічні взаємовідносини при безплідді в жінок у програмі допоміжних репродуктивних технологій.

Методи дослідження – клінічні, імуноферментні, імунологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше комплексно досліджено рівень антиоваріальних антитіл, гормональний гомеостаз, імунний статус і функціональний стан репродуктивної системи в жінок із безпліддям трубного походження в програмі лікування методами допоміжних репродуктивних технологій. Встановлено залежність між рівнем антиоваріальних антитіл та ефективністю лікування безпліддя шляхом запліднення in vitro. Доведено доцільність скринінгу визначення рівня антиоваріальних антитіл перед використанням запліднення in vitro одночасно з дослідженнями імунного стану пацієнток.

Вперше запропоновано метод плазмаферезу при комплексній підготовці з метою підвищення ефективності запліднення in vitro в пацієнток з безпліддям трубного походження та вивчено вплив його на імунну відповідь, гормональний гомеостаз та рівень антиоваріальних антитіл.

Запропоновано новий спосіб підготовки пацієнток із безпліддям, які лікуються за програмою запліднення in vitro з використанням плазмаферезу.

Практичне значення одержаних результатів. За допомогою розробленого способу підготовки жінок із безпліддям до проведення допоміжних репродуктивних технологій з використанням плазмаферезу вдалось підвищити ефективність запліднення in vitro на 10,6%. Спосіб рекомендується для впровадження в практичну медицину.

Впровадження результатів дослідження в практику. Спосіб комплексної підготовки жінок перед заплідненням in vitro впроваджено в клінічну практику міського клінічного пологового будинку №1 м. Чернівці, Буковинського центру репродуктивної медицини, Вінницької обласної клінічної лікарні ім. М.І. Пирогова, Інституту репродуктивної медицини м. Київ, дорожньої клінічної лікарні №1 ст.м. Київ. За матеріалами дисертації отримані деклараційний патент України на корисну модель №11622, МПК А 62С 35/00, А 61М 1/36 “Спосіб лікування загрози невиношування вагітності після застосування допоміжних репродуктивних технологій” та раціоналізаторська пропозиція “Підвищення ефективності екстракорпорального запліднення шляхом використання плазмаферезу” №6/05 від 10.01.2005 р. Теоретичні положення роботи використовуються в навчальному процесі на кафедрі акушерства та гінекології №1 НМАПО ім. П.Л. Шупика.

Особистий внесок здобувача в одержані наукові результати, що виносяться на захист. Дисертант разом з науковим керівником створила методологічну основу роботи, адекватну меті та завданням дисертації. Персонально проаналізувала наукову літературу й дані інформаційного пошуку з вказаної проблеми. Провела клініко-лабораторне обстеження жінок із безпліддям. Брала участь при проведенні трансвагінальної пункції яєчників та при переносі ембріонів. Самостійно провела статистичну обробку отриманих результатів, аналіз і узагальнення їх, розробила висновки та практичні рекомендації. Написала всі розділи кандидатської дисертації.

Розробила і втілила в практику спосіб комплексної підготовки жінок із безпліддям з використанням плазмаферезу перед проведенням запліднення in vitro.

Апробація результатів роботи. Результати досліджень доповідались та обговорювалися на III Міжнародній науково-практичній конференції “Здорова дитина: здоров’я дитини та її сім’ї” (м. Чернівці, 2005); щорічних наукових конференціях співробітників Буковинського державного медичного університету (2006); Міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні питання сучасного акушерства” (м. Тернопіль, 2007); 76 міжвузівській науковій конференції студентів та молодих учених з міжнародною участю “Працюємо, творимо, презентуємо” (м. Івано-Франківськ, 2007).

Публікації. За результатами проведених досліджень дисертантом опубліковано 10 наукових праць, із яких шість статей у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, троє тез у матеріалах і збірниках наукових конференцій. Отримано один деклараційний патент на корисну модель.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація оформлена на 147 сторінках комп’ютерного набору. Побудована за стандартним типом і складається з наступних розділів: вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій і списку використаних джерел. Дисертація ілюстрована 37 таблицями та 26 рисунками. Список літератури містить 318 літературних джерел, з яких 106 латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Проведено загальноклінічне, гінекологічне, клініко-лабораторне та ультразвукове обстеження у 109 жінок, які були розділені на 2 групи: І група (основна) – 58 жінок з безпліддям трубного походження, яким застосована методика запліднення in vitro, II група (контрольна) – 51 практично здорова фертильна жінка. Клініко-лабораторне обстеження жінок проводили клінічним, імуноферментним та імунологічним методами. Комісією з біоетики Буковинського державного медичного університету (протокол №8 від 15.04.2006 р.) встановлено, що проведене дослідження не суперечить загальноприйнятим біоетичним нормам і може бути використане в дисертаційному дослідженні.

Запліднення in vitro у жінок основної групи з безпліддям трубного походження проводили за загальноприйнятою методикою (Наказ МОЗ України №24 від 04.02.1997 р. “Про затвердження умов та порядку застосування штучного запліднення та імплантації (ембріонів) та методів їх проведення”.

З метою дослідження гормонального гомеостазу в обстежених жінок проводилося визначення вмісту в сироватці крові гонадотропних гормонів – лютропіну (ЛГ), фолітропіну (ФСГ), стероїдного гормону яєчника – естрадіолу (Е2). Рівень гормонів визначали імуноферментним методом (ІФА) з використанням наборів реагентів: “ИФА-АФ-Естр”; “Гонадотропин ИФА-ФСГ”; “Гонадотропин ИФА-ЛГ” на апараті “Пікон” (заводський номер 542; дата, вид метрологічного контролю – 20.04.06. св. №143). Рівень естрадіолу у відповідності до інструкцій визначали в пг/мл.

Для приведення його до стандартів системи СІ був проведений перерахунок: 1 пг/мл ,67 пмоль/л і 1 пмоль/л ,001 нмоль/л.

Для характеристики імунного статусу обстежених жінок, виявлення дефектів і встановлення ступеня їх порушення в клітинній, гуморальній ланках імунітету та в системі факторів неспецифічного протиінфекційного захисту організму використовували наступний комплекс показників: 1) абсолютна та відносна кількість імунокомпетентних клітин у периферичній крові жінок одержана шляхом визначення: загального аналізу крові з лейкоцитарною формулою (абсолютної кількості лейкоцитів у х*109/л, відносної кількості паличкоядерних і сегментоядерних нейтрофільних лейкоцитів, еозинофілів, базофілів, лімфоцитів та моноцитів); 2) абсолютна (109 клітин/л) та відносна (%) кількість субпопуляцій Т- та В-лімфоцитів (кількість СD3+ лімфоцитів, СD4+, СD8+, СD22+); 3) функціональна активність B-лімфоцитів: за визначенням концентрації сироваткових імуноглобулінів основних класів (Ig M, Ig G, Ig А) та циркулюючих імунних комплексів; 4) основні характеристики функціональної активності поліморфноядерних лейкоцитів крові в: фагоцитарній реакції за визначенням фагоцитарного числа (ФЧ) і фагоцитарної активності (ФА) та спонтанному НСТ-тесті за методом Park у модифікації Нестерової; 5) характеристика неспецифічної ефекторної системи захисту з урахуванням активності системи комплементу з визначенням титру комплементу та титру нормальних антитіл; 6) розрахункові параметри: лейкоцитарний індекс інтоксикації, індекс алергізації, ефекторний індекс, імунорегуляторний індекс – вираховували за формулою.

Загальний аналіз крові проводили за загальноприйнятою методикою з визначенням відсоткового співвідношення імунокомпетентних клітин при підрахунку їх у камері Горяєва.

Визначення кількості субпопуляцій Т- та В-лімфоцитів проводили в реакції непрямої поверхневої імунофлуоресценції з моноклональними антитілами до поверхневих диференційованих антигенів клітин (CD3+ – маркер, який присутній на мембранах загальної популяції Т-клітин; CD4+ – специфічний маркер Т-лімфоцитів-хелперів/індукторів; CD8+ – специфічний маркер Т-лімфоцитів-супресорів/цитолітичних; CD22+ – ідентифікаційний маркер загальної популяції В-лімфоцитів). Для визначення Т-лімфоцитів та їх субпопуляцій, а також В-лімфоцитів використовували мишачі моноклональні антитіла та FITC-кон’югати вторинних антитіл фірми “ДИА-М” (Росія) з позначкою “Флюоресцеин-изотихоцианат”.

Рівень імуноглобулінів основних класів (A, M, G) у сироватці крові визначали, застосовуючи прямий метод радикальної імунодифузії в агарі (реакція преципітації за Манчіні). Для цього брали дослідну сироватку, агар “Difco”, медіналовий буфер і стандартні моноспецифічні антисироватки проти імуноглобулінів класів A, M, G. Сироватки розводили дистильованою водою.

Фагоцитарну активність нейтрофілів крові визначали у фагоцитарній реакції за визначенням фагоцитарного числа й фагоцитарної активності у відсотках фагоцитуючих клітин у декілька етапів за методикою І.В. Нестерової. Проводили підрахунок відсотка клітин, які фагоцитують, та визначали фагоцитарне число – середнє число частинок латексу, яке поглинула одна клітина. Титр комплементу в сироватці крові визначали за 100,0% гемолізом. Рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) визначали за методом селективної преципітації в розчині поліетиленгліколь.

TNF-? і IL-4 ELISA розроблений для кількісного визначення in vitro фактора некрозу пухлин-? та інтерлейкіну-4. Людський TNF-? і IL-4 являє собою твердофазний двошаровий ензимний імунозв’язуючий сорбентний метод ELISA. Моноклональні антитіла специфічні для TNF-? та IL-4 були нанесені на лунки поділок мікротитру. Одночасно культивувались антиген і поліклональні антитіла, характерні для TNF-? та IL-4.

Визначення рівня антиоваріальних антитіл у крові проводилось за допомогою імуноферментного набору фірми Bioserv Ovari-Antibodi – ELISA для визначення в сироватці крові автоантитіл, направлених проти оваріальних антигенів на апараті “Пікон”. Даний аналіз ґрунтується на непрямому твердофазовому методі.

Обстеження проводилось до початку програми запліднення, з початком та в процесі контрольованої стимуляції яєчників, у день пункції яєчників.

У залежності від комплексу заходів підготовки до запліднення in vitro жінки основної групи були розділені на 2 підгрупи: 1 – 38 жінок, яким проводилася традиційна підготовка до запліднення in vitro, друга – 20 жінок, яким у комплекс підготовки до запліднення був включений плазмаферез. Дискретний плазмаферез проводився за 14 – 21 день до початку контрольованої стимуляції яєчників за загальноприйнятою методикою (Методичні рекомендації. – Донецьк, 2004, 28 с.) і складається з кількох етапів:

1. Етап забору першої порції крові.

2. Етап центрифугування крові.

3. Етап відділення плазми від формених елементів крові.

4. Етап повернення формених елементів крові.

5. Етап забору другої порції крові.

6. Завершення сеансу плазмаферезу.

Статистичний аналіз отриманих даних проводився за методами варіаційної статистики з визначенням середніх величин, середньої похибки, сереньоквадратичного відхилення. Достовірність вибіркової різниці вимірювалася довірливим критерієм точності. Величину р (достовірність різниці) визначали за таблицею Студента – Фішера. Різниці між середніми величинами, що порівнювалися, вважалися достовірними при р ,05.

Статистичний аналіз отриманих даних у невеликих групах (n ) проводився з використанням методу різниць.

Результати досліджень та їх обговорення. Середній вік пацієнток основної групи склав 33,4 ± ,6 роки, контрольної – 32,1 ± ,8 роки (р ,05). В основній групі службовців було 22,9 ± ,2%, робітниць – 14,5 ± ,1%, інтелігенції – 35,4 ± ,6%, домогосподарок – 27,2 ± ,9%. У контрольній групі ці цифри склали, відповідно, 19,6 ± ,7%, 19,6 ± ,2%, 39,2 ± ,7% та 21,6 ± ,5%. В основній групі достовірно більшою була кількість жінок з порушенням менструального циклу (51,7 ± 4,7%, в контрольній групі 31,3 ± ,3%, р ,05). Хронічний сальпінгоофорит в основній групі спостерігався в 50,0 ± ,2%, в контрольній – у 19,6 ± ,9%. Апендектомії проводились у 5,2 ± ,5% жінок основної групи та в 13,7 ± ,0% жінок контрольної групи (р ,05). Кесарів розтин проводився в 1,7 ± ,05% жінок основної групи та в 3,9 ± ,09% контрольної групи (р ,05). Вишкрібання стінок порожнини матки з діагностично-лікувальною метою проводилось у 1,7 ± ,05% жінкам основної групи та в 11,7 ± ,9% (p ,05) жінкам контрольної групи.

У жінок з безпліддям трубного походження позитивні результати запліднення in vitro при першій спробі були в 33,3%, при повторних спробах – у 16,6%.

При дослідженні рівня антиоваріальних антитіл нами показано, що в контрольній групі їх рівень був 7,1 ± ,9 Од/мл, а в основній групі – 4,1 ± ,5 Од/мл, що в 1,7 раза менше (р ,05) (табл.1). Зниження рівня антиоваріальних антитіл у пацієнток основної групи обумовлено обтяженим акушерсько-гінекологічним анамнезом (хронічні сальпінгоофорити, штучні аборти, самовільні викидні, захворювання яєчників, у тому числі полікістоз яєчників, порушення оваріально-менструального циклу, вишкрібання матки, прийом оральних контрацептивів, проведення лапароскопічних операцій, неодноразові контрольовані стимуляції яєчників), що могло призвести до виснаження яєчників. З іншого боку, саме за рівнем антиоваріальних антитіл можна говорити про функціональну активність яєчників.

Таблиця 1

Показники рівня антиоваріальних антитіл
в обстежених жінок (М ±

Групи обстежених жінок | n | Показники антитіл

Основна група | 20 | 4,1 ± ,5* ОД/мл

Контрольна група | 10 | 7,1 ± ,9 Од/мл

Примітка: * – р ,05

Рівень антиоваріальних антитіл у жінок основної групи ми визначали в день пункції фолікулів, яка проводилась орієнтовно від 12 до 16 дня менструального циклу під час контрольованої стимуляції яєчників. Нами відмічено, що на 12 день менструального циклу рівень антиоваріальних антитіл був 4,25 ОД/мл, на 13 – 4,5 ОД/мл, на 14 – 5,73 ОД/мл, на 15 – 4,2 ОД/мл, на 16 – 1,2 ОД/мл.

Проаналізувавши рівень антитіл в обстежених пацієнток основної групи, нами було встановлено, що його підвищення відмічалось у пацієнток із вторинним безпліддям, які не вагітніли більше 5 років, у яких була проведена тубектомія, кістектомія, аднексектомія. Знижений рівень антиоваріальних антитіл спостерігався у пацієнток з первинним безпліддям, в яких вагітність не наступала до 5 років, а також в яких були аномалії розвитку матки та міоми.

Одночасно з вивченням рівня антиоваріальних антитіл проводилося дослідження стану імунної системи. Порушення, які виявлені при визначенні основних імунокомпетентних клітин у периферичній крові, проявлялися зниженням абсолютної кількості лейкоцитів на 6,1% (в основній групі – 5,54 ± ,01%, у контрольній – 5,9 ± ,08%, р ,05), відносної кількості моноцитів на 42,7% (в основній групі – 5,1 ± ,16%, у контрольній – 8,9 ± ,24%, р ,01) та лімфоцитів на 14,6% (в основній групі – 25,7 ± ,4%, в контрольній – 30,1 ± ,1%, р ,05). Ці зміни є сигналом про те, що в жінок з безпліддям має місце процес, обумовлений мікроорганізмами, які персистують в організмі жінок. Це підтверджується зростанням лейкоцитарного індексу на 40,56% (в основній групі – 2,22 ± ,08%, в контрольній – 1,32 ± ,04%, р ,05) та індексу імунореактивності організму жінок на 31,24% (в основній групі – 5,25 ± ,09%, в контрольній – 3,61 ± ,04%, р ,05) і зменшенням індексу алергізації на 34,74% (в основній групі – 0,62 ± ,04%, в контрольній – 0,95 ± 0,03%, р ,05).

Порушення при визначенні основних показників факторів неспецифічної ефекторної системи протиінфекційного захисту в жінок з безпліддям проявлялись у зростанні відносної кількості О-лімфоцитів на 25,7% (в основній групі – 38,6 ± ,54%, в контрольній – 30,7 ± ,31%, р ,05), титру нормальних антитіл на 4,4% (в основній групі – 4,12 ± ,12%, в контрольній – 3,94 ± ,07%, р ,05) та імунологічного коефіцієнта на 12,0% (в основній групі – 0,25 ± ,01%, в контрольній – 0,22 ± ,01%, р ,05).

Зменшення загальної відносної кількості лімфоцитів, абсолютної кількості лейкоцитів, індексу алергізації та зростання індексу імунореактивності свідчить про можливі зміни показників клітинної та гуморальної ланок системного імунітету. Тому наступним етапом було вивчення функціональної спроможності імунокомпетентних клітин.

При цьому відмічено тенденцію до зниження CD3+ на 14,6% (в основній групі кількість – 25,7 ± ,4%, у контрольній – 30,1 ± ,1%, р ,05), а зниження відносної кількості Т-лімфоцитів здійснюється за рахунок CD4+ та CD8+, що можна пояснити тим, що в даному випадку можлива персистенція вірусної інфекції, при якій формується клітинна імунна відповідь із залученням переважно Т-цитолітичних лімфоцитів і Т-лімфоцитів-супресорів/цитолітичних.

Про стан гуморальної імунної відповіді судили за відносною кількістю зрілих В-лімфоцитів (СD22+), за концентрацією імуноглобулінів основних класів (Іg M, Іg G і Іg A) у сироватці периферичної крові, за концентрацією загальних ЦІК і за аналітичними коефіцієнтами, що характеризують імуноглобулінсекреторну функцію В-лімфоцитів. У жінок із безпліддям не встановлено глибоких порушень гуморальної імунної відповіді. Однакова концентрація циркулюючих імунних комплексів у сироватці крові підтверджує однакову ефективність гуморальної імунної відповіді на антиген у жінок із безпліддям у порівнянні з практично здоровими жінками.

З метою визначення ролі прозапальних та протизапальних цитокінів у жінок, що страждають безпліддям, нами вивчена концентрація протизапального цитокіну інтерлейкіну – 4 (IL-4) та прозапального – фактора некрозу пухлин – альфа (TNF-?). Результати вивчення концентрації IL-4 та TNF-? показали, що в жінок з безпліддям концентрація цих цитокінів не відрізняється від такого показника у практично здорових жінок, але встановлена тенденція до зростання на 3,3% концентрації протизапального IL-4 (в основній групі – 408,7 ± ,67 пг/мл, в контрольній – 395,4 ± ,2 пг/мл, р ,05) та зменшення на 4,2% концентрації прозапального TNF-? (в основній групі – 509,2 ± ,10 пг/мл, в контрольній групі – 531,3 ± ,7 пг/мл, р ,05).

Таким чином, у жінок з безпліддям зменшується абсолютна кількість лейкоцитів, відносна кількість моноцитів та загальний пул лімфоцитів, останніх за рахунок Т-лімфоцитів і частково за рахунок
В-лімфоцитів; зменшується коефіцієнт активності фагоцитозу за рахунок зниження активності системи комплементу та бактерицидної активності фагоцитуючих клітин, зниження концентрації Ig А. Вказане вище свідчить, що в жінок із безпліддям формується прихований імунодефіцитний стан, який не проявляється клінічними симптомами.

Разом з тим, зростання лейкоцитарного індексу інтоксикації, відносної кількості нейтрофільних лейкоцитів, індексу імунореактивності, імунологічного коефіцієнта засвідчують про можливу персистенцію умовно-патогенного, швидше за все внутрішньоклітинного, збудника, що персистує на епітеліоцитах слизових оболонок, змінюючи їх антигенну структуру, що є проявом автоімунної агресії.

При дослідженні функціонального стану репродуктивної системи констатовано, що в жінок із безпліддям трубного походження на 2-3 день менструального циклу виявлено збільшення концентрації естрадіолу в крові (в основній групі – 0,216 ± ,004 нмоль/л, в контрольній – 0,135 ± 0,003 нмоль/л, р ,01). Підвищення рівня естрадіолу в крові пацієнток основної групи до контрольованої стимуляції яєчників підкреслює на відхилення в ендокринній функції, в першу чергу яєчників.

Рівень ЛГ на 2-3-ій день менструального циклу у пацієнток з безпліддям майже не відрізнявся від показників у контрольній групі (в основній групі – 5,8 ± ,70 МО/л, в контрольній – 6,22 ± ,21 МО/л, р ,05). Співвідношення ЛГ до ФСГ в основній та контрольній групах було в межах 0,58-0,63. У результаті контрольованої стимуляції яєчників має місце значне (9-кратне) збільшення рівня естрадіолу крові обстежуваних пацієнток (в основній групі – 5,85 ± ,7 нмоль/л, в контрольній – 0,64 ± ,1 нмоль/л, р ,01). У пацієнток з безпліддям на висоті контрольованої стимуляції яєчників констатовано статистично значуще зниження рівня лютеїнізуючого гормону (в основній групі – 1,1 ± ,06 МО/л, в контрольній – 16,2 ± ,27 МО/л, р ,001).

В обстежених жінок виявлено підвищення рівня фолітропіну (в основній групі – 10,7 ± ,16 МО/л, в контрольній – 7,1 ± ,8 МО/л, р ,05). Співвідношення ЛГ/ФСГ склало відповідно: 0,1 в стимульованому циклі, 2,2 в контрольній групі. Знижена секреція ЛГ у пацієнток з безпліддям трубного походження послаблює синтез попередників стероїдних гормонів.

Враховуючи те, що одним із завдань нашої роботи було вивчення ефективності використання плазмаферезу при застосуванні запліднення in vitro, ми провели вивчення впливу його на організм жінки з безпліддям трубного походження, враховуючи показники імунного статусу, гормонального гомеостазу та антиоваріальних антитіл. Для оцінки ефективності плазмаферезу жінки основної групи нами були розділені на дві підгрупи. Першу підгрупу склали жінки з безпліддям в кількості 38 осіб, яким проводилася традиційна підготовка до запліднення in vitro. Другу підгрупу склали пацієнтки з безпліддям в кількості 20 осіб, яким проводилася запропонована нами комплексна підготовка до запліднення in vitro з включенням плазмаферезу (1-3 сеанси) (табл. 2).

Таблиця 2

Показники позитивних та негативних результатів
при ЗІВ у жінок основної групи

Підгрупи основної групи | Кількість осіб у групі | Кількість вагітностей | Кількість невдач | Кількість невідомих

результатів

абс. | % | абс. | % | абс. | %

1 підгрупа | 38 | 15 | 39,4 | 16 | 42,1 | 7 | 18,4

2 підгрупа | 20 | 10 | 50,0 | 8 | 40,0 | 2 | 10,0

Кількість позитивних результатів запліднення in vitro була в 1,3 раза більша в жінок, яким проводилася запропонована нами комплексна підготовка з включенням плазмаферезу в порівнянні з групою, яким проводилася загальноприйнята підготовка до ЗІВ. Кількість негативних результатів у групі жінок, яким проводилася запропонована нами комплексна підготовка з включенням плазмаферезу, була у 1,1 раза менша в порівнянні з групою, де проводилась тільки загальноприйнята підготовка до ЗІВ. Кількість невідомих результатів у жінок, з якими втрачений зв’язок після ембріотрансферу, була в 1,8 раза більшою в групі, де проводилася загальноприйнята підготовка до ЗІВ у порівнянні з групою, в якій проводилася запропонована нами комплексна підготовка до ЗІВ з включенням плазмаферезу.

Рівень антиоваріальних антитіл до проведення плазмаферезу склав 4,1 ± ,4 Од/мл. В 1 підгрупі після проведеної традиційної підготовки до ЗІВ рівень антиоваріальних антитіл склав 4,6 ± ,8 Од/мл, що більше, але різниця не вірогідна (р ,05). Рівень антиоваріальних антитіл у 2 підгрупі відносно його ж рівня до проведеного лікування зменшився в 1,3 раза й склав 3,2 ± ,5 Од/мл, що має тенденцію до зниження в порівнянні з його рівнем до плазмаферезу та в порівнянні з першою підгрупою після традиційної підготовки до ЗІВ.

Отже, після проведення плазмаферезу підвищений рівень антиоваріальних антитіл різко зменшується, що вказує на його ефективність та можливість використання в програмі підготовки до ЗІВ.

При вивченні впливу плазмаферезу на гормональний гомеостаз слід відмітити, що всі показники досліджуваних гормонів у жінок після плазмаферезу знижувались. Так, рівень ЛГ знизився з 8,4 ± ,7 МО/л до 3,2 ± 0,4 МО/л (р ,05), тобто у 2,6 раза, рівень ФСГ з 5,2 ± ,4 МО/л – до 2,2 ± ,2 МО/л (р ,05), тобто у 2,2 раза, рівень естрадіолу – з 0,33 ± ,02 нмоль/л до 0,19 ± ,01 нмоль/л (р ,05), тобто в 1,7 раза. Концентрація гонадотропних гормонів зменшилася після проведеного дискретного плазмаферезу за рахунок виведення незначної кількості їх із плазмою крові й не досягла рівня у здорових жінок. Співвідношення ЛГ/ФСГ склало відповідно 1,6 до проведення плазмаферезу та 1,4 після проведеного плазмаферезу. Це досить важливо, оскільки нормальне функціонування яєчників можливе лише при співвідношенні ЛГ/ФСГ 1-1,5. При порівнянні показників естрадіолу до проведення плазмаферезу виявлено зростання його в 1,7 раза в порівнянні з показником після проведеного методу.

Зниження концентрації ЛГ у пацієнток з безпліддям трубного походження у фолікулінову фазу менструального циклу та недостатня концентрація ФСГ на фоні нормальної концентрації естрадіолу призводять до порушення фолікулогенезу, овуляції та наступних секреторних перебудов ендометрію. Це, у свою чергу, може бути однією з причин безпліддя.

Зниження рівня естрадіолу після плазмаферезу свідчить про ефективне збереження репродуктивного потенціалу яєчників.

Концентрація статевих стероїдних та гонадотропних гормонів свідчить про позитивний вплив запропонованої нами комплексної підготовки з включенням плазмаферезу на стероїдогенез в яєчниках у порівнянні з групою хворих з безпліддям трубного походження в стимульованому циклі.

Одержані результати проведених досліджень показали, що плазмаферез суттєво не впливає на показник фагоцитарної активності, в тому числі на його бактерицидну активність (НСТ-спонтанний і НСТ-стимульований), на коефіцієнт активності фагоцитозу та інші показники. Разом з тим відмічається позитивна тенденція до зростання захоплюючої ефективності фагоцитуючих клітин за рахунок збільшення титру нормальних антитіл, збільшення потенційної здатності до бактерицидної активності фагоцитуючих клітин та їх резерву, що засвідчує збільшення коефіцієнта активності фагоцитозу на 7,0% та імунологічного коефіцієнта.

Проведення плазмаферезу сприяє покращанню загального стану неспецифічного протиінфекційного захисту організму жінок, що страждають безпліддям. Покращується коефіцієнт активності фагоцитозу та імунологічний коефіцієнт, а також зростає активність системи комплементу. Використання проведення плазмаферезу призводить до ряду позитивних змін у неспецифічній ефекторній системі протиінфекційного захисту, при цьому зменшується відносна кількість О-лімфоцитів, зростає фагоцитарна активність нейтрофільних лімфоцитів, захоплююча здатність фагоцитарних клітин, потенційна здатність до бактерицидної активності фагоцитів та її резерви, що призводить до зростання коефіцієнта активності фагоцитозу у порівнянні з жінками, яким не проводили плазмаферез, а використовували традиційну підготовку.

Таким чином, проведення плазмаферезу в жінок з безпліддям є більш ефективним заходом, який покращує провідні показники (фагоцитарне число, НСТ-стимульований, коефіцієнт активності фагоцитозу) неспецифічного протиінфекційного захисту організму жінок. Проведення в жінок з безпліддям плазмаферезу не впливає на показники клітинної ланки системного імунітету: загальний пул CD3+ лімфоцитів має деяку тенденцію до зменшення за рахунок CD8+ лімфоцитів. При цьому покращується імунорегуляторна функція Т-лімфоцитів.

Провівши порівняння характеристики клітинної ланки системного імунітету в жінок з безпліддям, у залежності від традиційної реабілітації та імунореабілітації плазмаферезом констатовано, що традиційна базова реабілітація жінок, які страждають безпліддям, не призводить до значних змін показників клітинної ланки системного імунітету. Спостерігається при цьому незначна тенденція до поліпшення відносної кількості імунорегуляторних Т-лімфоцитів: незначне зростання відносної кількості CD3+-лімфоцитів (CD4+-Т-лімфоцитів), що свідчить про поліпшення процесів розпізнання антигенів системою імунітету та збереження відносної кількості CD8+-лімфоцитів. Такі незначні зміни сприяють поліпшенню імунорегуляторного індексу. Останній свідчить про поліпшення автономної саморегуляції в системі імунітету.

Проведення жінкам з безпліддям плазмаферезу призводить до тенденції зростання загального пулу CD3+-лімфоцитів за рахунок CD4+-лімфоцитів, що сприяє підвищенню процесів розпізнання та тенденції до зростання імунорегуляторного індексу.

Результати вивчення ефективності плазмаферезу в жінок, що страждають безпліддям, на показники гуморальної ланки системного імунітету вказують на те, що проведення плазмаферезу не призводить до помітних змін у показниках функціонального стану гуморальної ланки системного імунітету. Виходячи з цього, можна зробити висновок про те, що плазмаферез не порушує функцію В-лімфоцитів та продукцію ними імуноглобулінів основних класів (Ig M, Ig G та Ig A). Стабільність ЦІК засвідчує про адекватність гуморальної імунної відповіді.

У жінок, що страждають безпліддям, концентрація протизапального цитокіну IL-4 після проведення плазмаферезу має незначну тенденцію до зростання, на 7,65%, (р ,05). Разом з тим концентрація прозапального цитокіну TNF-? після проведення плазмаферезу знижується на 21,1% (p ,05). Зниження концентрації TNF-? та тенденція до зростання IL-4 вказує на те, що проведення плазмаферезу є ефективним засобом зменшення запальної реакції в організмі.

Загальноприйнята підготовка до ЗІВ призводить до тенденції зниження як прозапального, так і протизапального цитокіну відповідно на 14,5% і 8,3%. Але це зниження концентрації інтерлейкінів статистично не істотне.

Проведення плазмаферезу більш ефективно впливає на показники концентрації протизапального цитокіну. Концентрація IL-4 у жінок, що страждають безпліддям, суттєво зростає, що засвідчує про те, що плазмаферез знижує запальні процеси. Підтвердженням цього є тенденція до зниження концентрації TNF-? у порівнянні з жінками, яким проводили загальноприйняту підготовку до ЗІВ, та суттєве зниження у порівнянні з контролем.

Таким чином, проведення плазмаферезу жінкам, що страждають безпліддям, призводить до зниження автоімунних запальних процесів в їхньому організмі та є ефективним засобом імунореабілітації у цієї категорії пацієнток.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне удосконалення та нове вирішення актуального завдання сучасної гінекології щодо підвищення ефективності лікування безпліддя трубного походження з використанням запліднення in vitro, яке включає вдосконалену методику комплексної підготовки жінок з використанням плазмаферезу на основі вивчення рівня антиоваріальних антитіл в крові, гормонального гомеостазу та стану імунної системи.

1. В обстежених жінок з безпліддям трубного походження при використанні загальноприйнятого комплексу обстеження та підготовки до запліднення in vitro позитивні результати при першій спробі склали 33,3 ± ,2%, при повторних спробах – 16,6 ± ,5% (p ,05).

2. У контрольній групі рівень антиоваріальних антитіл в крові був у 1,73 раза вищим, ніж у жінок основної групи (відповідно 7,1 ± ,9 ОД/мл та 4,1 ± ,5 ОД/мл, p ,05). На 12 день менструального циклу під час контрольованої стимуляції яєчників рівень антиоваріальних антитіл був 4,3 ОД/мл, на 13 – 4,5 ОД/мл, на 14 – 5,7 ОД/мл, на 15 – 4,2 ОД/мл, на 16 – 1,2 ОД/мл, що вірогідно менше в порівнянні з показниками в основній та контрольній групах та характеризує функціональну активність яєчників у обстежених жінок.

3. У жінок із безпліддям трубного походження на 2-3 день менструального циклу мало місце статистично значуще збільшення в 1,6 раза концентрації естрадіолу в крові (з 0,16 ± ,003 нмоль/л до 0,22 ± ,004 нмоль/л). Рівень ЛГ у пацієнток із безпліддям відрізнявся від показників у контрольній групі незначно. Співвідношення ЛГ/ФСГ в основній та контрольній групах було в межах 0,58-0,63. У пацієнток у день пункції яєчника в циклі контрольованої стимуляції яєчників рівень естрадіолу в крові був 5,85 ± ,7 нмоль/л, що в 9 разів більше, ніж в контрольній групі (р ,05). Відмічено статистично значуще зниження рівня ЛГ (1,1 ± ,06 МО/л) в порівнянні з контрольною групою (16,2 ± ,27 МО/л). Виявлено деяке підвищення рівня ФСГ в обстежених жінок (10,7 ± ,16 МО/л) у порівнянні з контрольною групою (7,05 ± ,8 МО/л). Співвідношення ЛГ/ФСГ склало відповідно 0,1 в стимульованому циклі та 2,2 в контрольній групі.

4. Зростання лейкоцитарного індексу інтоксикації на 40,56%, індексу імунореактивності на 31,24%, імунологічного коефіцієнта на 12,0% свідчило про можливу персистенцію умовно-патогенного, швидше за все внутрішньоклітинного, збудника, що персистує на епітеліоцитах слизових оболонок статевих шляхів у жінок з безпліддям. Тенденція до зростання на 3,3% концентрації протизапального IL-4 та зменшення на 4,2% концентрації прозапального TNF-?, зменшення абсолютної кількості лейкоцитів на 6,1%, відносної кількості моноцитів на 42,7% та загального пулу лімфоцитів на 14,6% (останній за рахунок Т-лімфоцитів і незначно за рахунок В-лімфоцитів), зменшення коефіцієнту активності фагоцитозу за рахунок зниження активності системи комплементу та бактерицидної активності фагоцитуючих клітин, зниження концентрації Ig А свідчить, що в жінок з безпліддям формується прихований імунодефіцитний стан, який не проявляється клінічними симптомами.

5. Базовий рівень антиоваріальних антитіл у крові в жінок з безпліддям трубного походження становив 4,1 ± ,4 ОД/мл, після проведеної традиційної підготовки до запліднення in vitro – 4,6 ± ,8 ОД/мл, а після проведеної нами підготовки з включенням плазмаферезу – 3,2 ± ,5 ОД/мл (р ,05), що вказує на його ефективність та можливість використання в програмі підготовки до запліднення in vitro. Концентрація ФСГ, ЛГ та естрадіолу не зазнає суттєвих змін під час проведення плазмаферезу, що свідчить про відсутню негативну дію еферентної терапії на гонадотропну функцію гіпофіза та стероїдогенез в яєчниках. Плазмаферез сприяє поліпшенню загального стану неспецифічного протиінфекційного захисту, зменшенню активності системи комплементу та імунологічного коефіцієнта, імунорегуляторної функції Т-лімфоцитів, підвищенню процесів розпізнання та тенденції до зростання імунорегуляторного індексу, зниження концентрації TNF-? та зростання IL-4.

6. Використання запропонованої нами комплексної підготовки до запліднення in vitro з включенням плазмаферезу сприяло підвищенню ефективності допоміжних репродуктивних технологій з 39,4% до 50,0%.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. У жінок з безпліддям трубного походження в процесі підготовки до запліднення in vitro рекомендовано дослідження рівня антиоваріальних антитіл в крові.

2. При виявленні підвищеного рівня антиоваріальних антитіл необхідно скеровувати їх на комплексну підготовку з включенням плазмаферезу.

3. Дискретний плазмаферез (від 1 до 3 сеансів) проводиться за 14-21 днів до початку контрольованої стимуляції яєчників за загальноприйнятою методикою.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Бакун О.В., Юзько О.М. Плазмаферез в програмі допоміжних репродуктивних технологій (огляд літератури) // Репродуктивное здоровье женщины. – 2006. – №2(26). – С. 156-158. (Автором проведено літературний пошук, підготовка до друку).

2. Бакун О.В. Методи лікування автоімунного оофориту (огляд літератури) // Буковинський медичний вісник. 2006. – Т.10., №3. – С. 137-141.

3. Бакун О.В. Вплив плазмаферезу на гормональний гомеостаз жінок із безпліддям трубного генезу на етапі підготовки до запліднення in vitro // Biomedical and biosocial anthropology. – 2006. – №7. – С. 116-118.

4. Бакун О.В. Характеристика рівня антиоваріальних антитіл в нормі і при патології // Здобутки клінічної і експериментальної медицини.-2007. – №1. – С. 99-101.

5. Бакун О.В. Концентрація гіпофізарних гормонів в крові жінок із безпліддям // Здоровье женщины. – 2007. – №1. – С. 186-187.

6. Юзько О.М., Бакун О.В. Вплив плазмаферезу на імунологічні показники у жінок з безпліддям трубного походження при заплідненні in vitro // Репродуктивное здоровье женщины. – 2007. – №1. – С.194-197. (Автором проведено клінічні дослідження, аналіз та узагальнення результатів, підготовка до друку).

7. Деклараційний патент України на корисну модель №11622,МПК А 62 С 35/00,А 61 М 1/36. Спосіб лікування загрози невиношування вагітності після застосування допоміжних репродуктивних технологій / Бакун О.В., Юзько О.М. Опубл. 16.01.06. Бюл. №1 (Автором проведено патентний пошук та оформлена патентна документація. Проведено клінічні дослідження в пацієнток із застосуванням даного способу).

8. Юзько О.М., Бакун О.В., Юзько Т.А. Вагітність, роди та стан новонароджених після екстракорпорального запліднення // III Міжнародна науково-практична конф. “Здорова дитина: здоров’я дитини та її сім’ї” / Тези доп. 29-30 вересня 2005 р. – Чернівці, 2005. – С. 71-72. (Автором проведено клінічні дослідження, аналіз та узагальнення результатів).

9. Бакун О.В. Деякі аспекти впливу плазмаферезу на гормональний гомеостаз // IV Міжнародна медико-фармацевтична конференція студентів і молодих вчених / Тези доп. 3-5 квітня 2007 р. – Чернівці: Хист, 2007. – Вип.9. – С. 18.

10. Бакун О.В. Показники рівня антиоваріальних антитіл у жінок із безпліддям // 76 Міжвузівська наук. конф. студ. та молодих вчених з міжнародною участю “Працюємо, творимо, презентуємо” / Тези доп. 25-27 квітня 2007 р. – Івано-Франківськ, 2007. – С. 142.

АНОТАЦІЯ

Бакун О.В. Підвищення ефективності запліднення in vitro при лікуванні жіночого безпліддя трубного походження з врахуванням