НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

Білий Ростислав Олександрович

УДК 57.085.23+576.314+576.367+576.385+577.352.33+616-006

МЕМБРАННІ ГЛІКОПРОТЕЇНИ КЛІТИН ЗА УМОВ АПОПТОЗУ: ВИЯВЛЕННЯ, ХАРАКТЕРИСТИКА, БІОМЕДИЧНІ АСПЕКТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів-2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі регуляції проліферації клітин і апоптозу Інституту біології клітини Національної Академії Наук України.

Науковий керівник: Член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Стойка Ростислав Степанович, завідувач відділом регуляції проліферації клітин і апоптозу Інституту біології клітини Національної Академії Наук України.

Офіційні опоненти: Доктор біологічних наук, професор

Сибірна Наталія Олександрівна, завідувач кафедри біохімії Львівського національного університету імені Івана Франка

Доктор медичних наук, професор

Логінський Володимир Євстахович,

завідувач лабораторії імуноцитології та генетики пухлин крові Інституту патології крові та трансфузійної медицини Академії Медичних Наук України

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Захист відбудеться 3 липня 2007 року о 1400 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 35.246.01 при Інституті біології клітини НАН України (79005, м. Львів, вул. Драгоманова 14/16)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини за адресою: м. Львів, 79005, вул. Драгоманова 14/16.

Автореферат розіслано 18 травня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Убийвовк В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Запрограмована смерть клітини, або апоптоз, відіграє надзвичайно вагому роль у підтриманні життєдіяльності багатоклітинних організмів, оскільки завдяки цьому явищу забезпечується усунення “надлишкових” та пошкоджених клітин в тканинах та органах. За нормальних умов в організмі здорової людини щогодини шляхом апоптозу гинуть мільярди клітин (Alberts B. et al. 2002). Порушення процесів апоптозу веде до виникнення різноманітних захворювань, включаючи рак, автоімунні розлади та інші хвороби, які важко піддаються лікуванню (Horvitz H. R. 2003; Puck J.M. 2006; Schmid-Schonbein G. W. 2006).

Дослідження механізмів апоптозу проводять як на клітинному, так і молекулярно-біологічному рівнях із використанням клітинних ліній як експериментальної моделі. Проте незалежно від характеру такого дослідження та його мети, завжди постає проблема вибору способу виявлення запрограмованої загибелі клітини (Gobe G., Harmon B. 2005). Сьогодні відомо кілька способів виявлення апоптозу, що ґрунтуються на фізичних, цитологічних, біохімічних та молекулярно-біологічних методах (Фільченков О.О., Стойка Р.С. 2006). З огляду на надійність та відтворюваність результатів особливо важливими є біохімічні маркери апоптозу, пов’язані із зміною експресії, появою, руйнуванням чи модифікацією певних білків у складі сигнальних механізмів активації процесу апоптозу (Lawen A. 2003).

У головних компартментах клітини (мітохондріях, цитоплазмі, ядрі та плазматичній мембрані) виявлено різноманітні біохімічні маркери апоптозу (Yan N., Shi Y. 2005). Плазматична мембрана є найдоступнішим клітинним компартментом, однак вона залишається найменш вивченою частиною клітини щодо її участі в процесах апоптозу. До останнього часу вважалось, що єдиною зміною в плазматичній мембрані при апоптозі є екстерналізація фосфатидилсерину, відкрита Валері Фадок (Fadok) ще у 1992 році (Fadok V. A. et al. 1992), яку було успішно використано для виявлення апоптозу (Reutelingsperger C.P. 1998).

І хоч в кількох роботах, зокрема груп під керівництвом Dini (Dini L. et al. 1992; 1995) та Hall (Hall S. E. et al. 1994), повідомлялось про участь вуглевод-лектинових взаємодій у процесах фагоцитозу клітин під час їх загибелі, про систематичні зміни в складі глікопротеїнів плазматичної мембрани за умов загибелі клітини шляхом апоптозу не було відомо. Водночас, досягнення глікобіології останніх років (Lutteke T. et al. 2006; Ohtsubo K., Marth J. D. 2006) демонструють важливу роль взаємодії вуглевод-вмісних компонентів плазматичної мембрани з відповідними лігандами при різних фізіологічних та патологічних станах клітини (Ohtsubo K., Marth J. D. 2006; Paulson J. C. et al. 2006).

Пошук нових маркерів апоптозу, зокрема глікопротеїнової природи, у складі плазматичної мембрани стимулювався не лише теоретичним інтересом, а й двома причинами прикладного значення: по-перше, наявність таких маркерів дозволила б ідентифікувати апоптичні клітини, уникаючи їх пошкодження; по-друге, поява змін на поверхні клітини могла б свідчити про їх роль у міжклітинних взаємодіях під час загибелі клітини, а, отже, і про можливість впливати на цей процес. Тому у нашій роботі ми порівняли рівні експресії мембранних глікопротеїнів за умов апоптозу, використовуючи лектини – вуглевод-зв`язувальні білки різної специфічності. Виявивши певні зміни у складі глікопротеїнів при запрограмованій смерті клітини, ми намагалися з`ясувати можливість їх використання для виявлення апоптичних клітин.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами: Роботу було виконано у Відділі регуляції проліферації клітин Інституту біології клітини НАН України в рамках теми  “Механізми індукції антипроліферативної і цитотоксичної активності у нормальних і трансформованих клітин” упродовж 2003-2005 років, (номер державної реєстрації №0103U001404) та “Дослідження процесів, що відбуваються під час апоптозу, індукованого антинеопластичними препаратами з різним механізмом дії” упродовж 2006-2008 років, (номер державної реєстрації №0106U002599). У 2004-2005, 2005-2006 та 2006-2007 роках роботу було підтримано грантами Західно-Українського біомедичного дослідницького центру (WUBMRC), присудженими здобувачу. Окремі фрагменти роботи були підтримані грантами Фонду цивільних досліджень і розвитку США (CRDF) № #UST2-6130-XX-06-08, OPT-009 (2006 рік), Українського науково-технологічного центру (2004 рік) та стипендією Міжнародного товариства оптичної інженерії - SPIE (2006 рік).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було з`ясувати природу та механізм(и) змін в складі глікопротеїнів плазматичної мембрани апоптичних клітин, а також обґрунтувати можливості використання цих змін для кількісної оцінки апоптозу.

Для досягнення поставленої мети у роботі вирішували наступні завдання:

· Визначити рівні експонування глікопротеїнів плазматичної мембрани в інтактних клітин та клітин за умов апоптозу, а також з`ясувати локалізацію центрів зв’язування лектинів у клітині.

· Провести порівняльне дослідження змін рівня експонування мембранних глікопротеїнів за умов апоптозу у клітин різної видової та тканинної приналежності, а також за умов апоптозу, спричиненого індукторами хімічної, фізичної та біологічної природи, та за різних умов культивування клітин.

· Дослідити зміну рівня експонування мембранних глікопротеїнів за умов апоптозу в клітинних системах in vitro та in vivo.

· З’ясувати залежність змін у вмісті мембранних глікопротеїнів за умов апоптозу від концентрації апоптоз-індукуючого чинника та тривалості його дії.

· Встановити можливість інтерналізації центрів зв’язування лектинів у складі плазматичної мембрани за умов апоптозу, визначити локалізацію глікопротеїнів (інтегральні/периферичні) зі зміненим рівнем експонування за умов апоптозу у плазматичній мембрані.

· Виділити та підготувати до MALDI-TOF мас-спектрометричного аналізу мембранні глікопротеїни зі зміненим рівнем експонування за умов апоптозу.

· Розробити метод лектин-афінної хроматографії для виділення апоптичних клітин зі змішаної популяції із неапоптичними клітинами, розробити експрес-тест на основі індукованої лектином аглютинації для виявлення апоптичних клітин, зокрема клітин, виділених із крові пацієнтів з автоімунними захворюваннями.

· З`ясувати механізми зміни рівня експонування мембранних глікопротеїнів за умов апоптозу, перевіривши можливості синтезу de novo та модифікації попередньо існуючих глікопротеїнів.

Об’єктом дослідження були зміни у вмісті мембранних глікопротеїнів інтактних клітин та клітин за умов апоптозу in vitro та in vivo.

Предметом дослідження було обґрунтувати можливості використання змін у вмісті мембранних глікопротеїнів в інтактних клітинах та за умов індукції апоптозу для кількісної оцінки апоптозу, а також з`ясувати механізми цих змін.

Методи дослідження. У роботі використовували цитохімічні методи дослідження із застосуванням антитіл та лектинів із ферментативними, флуоресцентними чи біотиновими мітками та світлової, фазово-контрастної і флуоресцентної мікроскопії та їх поєднання. Крім того, застосовували афінну хроматографію, електрофорез білків у ПААГ (у присутності та за відсутності ДСН), вестерн- та лектиноблот аналізи, електрофорез ДНК в гелі агарози, MALDI-TOF мас-спектрометрію, методи аглютинації клітин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що апоптоз супроводжується збільшенням вмісту б-D-манозо- та в-D-галактозовмісних глікопротеїнів в складі плазматичної мембрани клітин. Виявлений феномен не залежить від тканинної та видової приналежності клітин, а також від природи та механізму дії апоптоз-індукуючого чинника. На основі отриманих результатів зроблено висновок про універсальність даного явища і, таким чином, доведено існування нового біохімічного маркеру апоптозу в складі плазматичної мембрани. Вперше виділено глікопротеїни, вміст яких зростає під час апоптозу, та з’ясовано їхню локалізацію в плазматичній мембрані. Ідентифікація виділених глікопротеїнів показала, що вони задіяні у процесах передачі внутрішньоклітинних сигналів, зокрема сигналів до апоптозу, а також у перебудові цитоскелету. Поява згаданих глікопротеїнів на плазматичній мембрані апоптичних клітин не пов`язана з процесами їх синтезу de novo. Вона залежить від активації мембранних нейрамінідаз при апоптозі, що веде до десіалування термінальних вуглеводних залишків глікопротеїнів плазматичної мембрани та експозиції манозильних та галактозильних залишків.

Практичне значення роботи. У процесі виконання роботи розроблено метод виділення апоптичних клітин зі змішаної популяції, який ґрунтується на використанні лектин-афінного сорбента. Запропоновано тест для експрес-діагностики апоптозу на основі аналізу аглютинації, індукованої лектином. Дані методи захищені міжнародною патентною заявкою (PCT, 67789-368). Розроблений тест проходить апробацію на кафедрі клінічної імунології та алергології Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького (Угода про науково-технічну співпрацю від 2006 року). Визначення підвищеного рівня експонування б-D-манозо-(Man) та в-D-галактозовмісних(Gal) глікопротеїнів у складі плазматичної мембрани було використано для детекції апоптичних клітин під час застосування лектиноцитохімічного, цитофлуориметричного методів дослідження, а також лектино-блот аналізу.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно зібрав та опрацював літературу за темою дисертації, виконав експериментальну частину роботи. MALDI-TOF мас-спетрометричний аналіз був здійснений професором Ульфом Гельманом (Інститут ракових досліджень Людвіга в м. Упсала, Швеція). Дисертант самостійно провів статистичний аналіз результатів досліджень, сформулював основні висновки та підготував до друку матеріали за результатами дисертаційної роботи. Визначення головних завдань роботи, а також обговорення результатів дослідження здійснено спільно з науковим керівником – членом-кореспондентом НАН України, проф. Стойкою Р.С. При проведенні електрофоретичних досліджень дисертант отримував консультації к.б.н. Ю.Я. Кота (Інститут біології клітини НАН України). У роботі було використано лектини та їх кон`югати, люб`язно надані к.фарм.н. В.О. Антонюком (Інститут біології клітини НАН України). Клінічний матеріал було отримано у рамках співпраці з кафедрою клінічної імунології та алергології Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького (завідувач кафедри – проф. Чоп’як В. В.).

Апробація результатів дослідження. Головні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на V Всеукраїнській студентській науковій конференції “Актуальні проблеми природничих та гуманітарних наук у дослідженнях студентської молоді” (Черкаси, 2003), Міжнародній конференції молодих вчених, аспірантів та студентів з молекулярної біології та генетики (Київ, 2003), Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), Форумі молодих вчених Федерації Європейських біохімічних товариств FEBS (Варшава, Республіка Польща, 2004), 29-му конгресі Федерації Європейських біохімічних товариств FEBS (Варшава, Республіка Польща, 2004), ІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції „Біотехнологія. Освіта. Наука” (Львів, 2004), Сесіях Хемії і Біохемії Наукового товариства ім. Шевченка у 2004, 2005, 2006 та 2007 роках (Львів), Інституті передових досліджень з біофотоніки НАТО (Оттава, Канада, 2004), 5-й Парнасівській конференції (Київ, 2005), 40-му З`їзді Польського біохімічного товариства (Люблін, Республіка Польща, 2005), Міжнародній школі молодих вчених та студентів з оптики, лазерної фізики та біофотоніки (Саратов, Російська Федерація, 2005), 4-ій Студентській науковій конференції (Вроцлав, Республіка Польща, 2006), ІІ Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2006), науково-практичній конференції з міжнародною участю “Імунодіагностика та імунотерапія ревматологічних хворих” (Львів, 2006), IX Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006). Окрім того, результати роботи було представлено на конференціях молодих вчених Інституту біології клітини НАН України у 2005 та 2006 роках.

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 6 статей, 14 тез матеріалів наукових конференцій, підготовлено 1 міжнародну патентну заявку.

Структура та обсяг дисертаційної роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини (матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, аналізу та узагальнення результатів досліджень), а також із висновків та списку використаної літератури, що налічує 229 джерел. Роботу викладено на 168 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 66 рисунками та 1 таблицею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано сучасні дані щодо відомих маркерів апоптозу в різних компартментах клітини, зокрема на плазматичній мембрані. Описано основні принципи виявлення маркерів апоптозу у різних компартментах клітини. Детально висвітлено будову та функції N-глікопротеїнів на поверхні плазматичної мембрани клітини та шляхи їх біосинтезу. Описано роль лектин-вуглеводних взаємодій у виявленні глікозильних структур різної будови.

Матеріали і методи дослідження. Для дослідження використовували: 1) клітини ліній L1210 та L1210R (резистентні до цисплатину) лімфоцитарної лейкемії миші, лінії L929 фібробластів миші, лінії А549 карциноми легені людини, та лінії Jurkat Т-клітинної лейкемії людини, клітини лінії MCF-7 аденокарциноми молочної залози людини, дикий тип (wt) та резистентні до доксорубіцину (DOX/R), клітини лінії СЕМ гострої лімфобластичної лейкемії людини; 2) спленоцити із селезінки білих лабораторних мишей; 3) лімфоцити здорових донорів та пацієнтів із автоімунними розладами. Отримання клінічного матеріалу здійснювалось з дотриманням етичних норм та згідно чинним процедурам, експериментальних тварин утримували відповідно до міжнародних стандартів.

Для індукції апоптозу в клітинних ліній використовували хімічні сполуки: цисплатин, дексаметазон, метотрексат, доксорубіцин, етопозид, а також рентгенівське опромінення (300 Рентген, 225 Рентген/хв), анти-CD95-антитіла, та білок галектин-3. Життєздатність клітин визначали шляхом їх фарбування 0,1% розчином трипанового синього та підрахунком зафарбованих (мертві) та не зафарбованих (живі) клітин.

У дослідженні використовували наступні лектини рослинного та тваринного походження: LABA, STA, HPL, PHA-E, ConA, PSL, WGA, PMRL, VAA, RCA, NPL, LVA, GNA, MAA-II, не кон`юговані чи попередньо помічені пероксидазою хрону (HRP), флуоресцеїнізотіоціанатом (FITC) чи біотином із використанням стандартних методик (Hermanson G.T. 1996) чи комерційно доступні кон`югати даних лектинів. Як специфічні вуглеводні інгібітори лектинів використовували -метил-D-манопіранозид (MMan), 4-O-(-D-галактопіранозил)-D-глюкопіранозу (лактозу), манозу, та N-ацетил-галактозамін (Fowlkes B. J. et al. 1980).

Лектиноцитохімічний аналіз із використанням ферментативних кон’югатів лектинів здійснювався, як описано (Herrington C. S., McGee J.O`D. 1992). Мазки клітин фіксували у суміші ацетон : метанол : формалін (19:19:2). Локалізацію вуглеводних детермінант, що зв`язували пероксидазно-мічені лектини, виявляли у присутності 3,3’-діамінобензидину, H2O2 та іонів Ni2+. Локалізацію вуглеводних детермінант, що зв`язували флуоресцентно-мічені лектини, виявляли, використовуючи мікроскоп Микмед К-2-12 (ЛОМО, РФ) із відповідними довжинами хвиль збудження та емісії.

Для дослідження флуоресценції барвників: акридинового оранжевого, пропідію йодиду, DAPI, кон’югатів авідину та лектинів із FITC використовували мікроскопи Микмед-2-12 та Люмам-2Р (ЛОМО, РФ) та відповідні довжини хвиль збудження/емісії (Barrett K. L. et al. 2001).

Виділення фракції плазматичних мембран проводили, як описано (Stasyk T.V. et al. 1998). Отриману фракцію плазматичних мембран розчиняли у буфері ТСБ, який містив 1% Тритону X-100, після чого здійснювали афінну хроматографію мембранних глікопротеїнів, використовуючи PSL-агарозу, PSL-бромціан-сефарозу, або VAA-бромціан-сефарозу, які попередньо синтезували шляхом кон`югації лектину із відповідним носієм згідно з інструкціями виробника.

Глікопротеїни, зв`язані з афінним сорбентом, елюювали відповідними цукрами після чого осаджували в ацетоні та розчиняли у буфері Леммлі (Laemmli U. K. 1970). Виділені білки розділяли електрофорезом відповідно до їх молекулярної маси, у 10% ПААГ чи градієнті ПААГ 7,5-17,5% та 7,5-22% за денатуруючих умов (у присутності 0,1% ДСН). Гелі фіксували та фарбували Coomasie G-250 чи AgNO3, як описано (Shevchenko A. et al. 1996).

Визначення локалізації білків у плазматичній мембрані здійснювали, використовуючи принцип диференційної розчинності у Тритоні X-114, як описано (Bordier C. 1981). Отримані фракції периферичних та інтегральних білків аналізували електрофорезом у ПААГ-ДСН.

Для здійснення блот-аналізу білки, розділені електрофорезом в ПААГ, електрофоретично переносили на нітроцелюлозну чи полівінілдифторидну мембрану, як описано (Lutsik M. D., Kusen' S. I. 1987; Towbin H. et al. 1979). Перенос здійснювали напівсухим методом, якість переносу перевіряли за фарбуванням Ponso S. Інкубацію з пероксидазним кон’югатом лектину, біотиновим кон’югатом лектину/авідин-пероксидазою чи першими/другими антитілами здійснювали відповідно до інструкцій виробника. Продукти виявляли за допомогою реакції ECL чи у системі DAB/H2O2.

Двовимірний гель-електрофорез мембранних білків використовували для виявлення надмолекулярних комплексів у складі фракцій плазматичних мембран. У першому напрямку білки фракціонували електрофорезом за неденатуруючих умов (Kit Yu.Ya. et al. 2005). У другому напрямку розділення здійснювали за денатуруючих умов у градієнті (7-20%) концентрації ПААГ.

MALDI-TOF мас-спектрометрію мембранних глікопротеїнів здійснював проф. Ульф Гельман (Інститут ракових досліджень Людвіга, м. Упсала, Швеція). Після електрофорезу білкові смуги вирізали та піддавали розщепленню в гелі, як описано (Hellman U. 2000). Після протеолізу та екстракції утворених пептидів суміш аналізували методом Peptide Mass Fingerprinting (PMF), використовуючи Bruker Ultraflex TOF/TOF (Bruker Daltonics, Бремен, Німеччина) відповідно до рекомендацій виробника.

Для виявлення олігонуклеосомних фрагментів ДНК здійснювали виділення ДНК клітин та її електрофорез в агарозному гелі (Herrmann M. et al. 1994).

Розділення клітин афінною хроматографією здійснювали за розробленою нами методикою, використовуючи як афінний сорбент PSL-кон’юговану крупнозернисту агарозу (4,5 мг білка PSL на мл агарози) чи лектин, сорбований на поверхню полістирольних чашок, та відповідні буфери для відмивки клітин та їх десорбції.

Дослідження аглютинації клітин здійснювали у аглютинаційних пробірках чи імунологічних планшетах, використовуючи серію послідовних розведень лектину (1:1), в які вносили досліджувані клітини. Після інкубації аглютинати виявляли за допомогою мікроскопу чи трансмісійного сканера.

Визначення активності нейрамінідази проводили за інтенсивністю аглютинації еритроцитів людини лектином арахісу (Arachis hypoglea) – PNA: за наявності нейрамінідази, яка відщеплює залишки N-ацетилнейрамінових кислот із глікопротеїнів, еритроцити аглютинували лектином PNA, специфічним до олігосахаридних структур в-Gal(13)GalNac (Lambre C. R. et al. 1991). Як стандарт використовували нейрамінідазу з Сlostridium perfringens (Sigma, США).

Cтатистичну обробку отриманих даних проводили у програмі Origin 7 (Microcal, США), відповідно до загальноприйнятих алгоритмів. Денситометричний аналіз, обробку та аналіз мікрофотографій клітин здійснювали за допомогою програм ImageJ (Національний інститут здоров’я, США), ImageTool (UTHSCSA, США) та Gel-Pro Analyzer 4.0 (Media Cybernetics, США). Досліди проводили у трьох паралелях у кожному варіанті. Для усіх дослідів, що проводились у паралелях, розраховували середнє значення “M” та середню похибку “m”, які й представлено на графіках та рисунках. Рівень достовірності отриманих результатів встановлювали при р<0,05. У роботі використовували три рівні достовірності: * –,05; ** –,01; *** –,001.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження експресії мембранних глікопротеїнів (ГП) за умов апоптозу. Лектино-цитохімічний аналіз клітин L1210 із використанням лектинів LABA, HPL, STA, PHA-E, ConA, PSL, WGA, VAA, RCA виявив достовірно інтенсивніше зв`язування б-D-манозоспецифічного лектину PSL (p<0,05), в-D-галактозоспецифічних лектинів VAA (p<0,05) і RCA (p<0,001) та лектину WGA (p<0,01), специфічного до складних GlcNAc-вмісних олігомерів, із апоптичними клітинами у порівнянні з інтактними. Між інтактними та апоптичними клітинами не виявлено достовірної різниці у здатності зв’язувати лектини LABA (L-Fuc), HPL (GalNAc), STA ([в-GlcNAc]3), PHA-E (комплексні N-глікани) та ConA (б-D-Man, б-D-Glu, GlcNAc), в усіх випадках p>0,05. Апоптоз індукували метотрексатом, 100 мкг/мл клітинної суспензії та цисплатином 0,5 та 5 мкг/мл, про наявність апоптозу судили за міжнуклеосомною фрагментацією ДНК. Контроль специфічності зв`язування лектинів здійснювали, використовуючи конкурентні інгібітори лектинів.

При використанні резистентної до цисплатину сублінії клітин L1210R дія цисплатину в концентрації 0,5 мкг/мл не спричиняла апоптоз, а також помітної зміни у рівні експонування манозо- та галактозовмісних глікокон’югатів (p>0,05). Дія на клітини L1210R цисплатину в концентрації 5 мкг/мл спричиняла апоптоз і одночасне зростання експонування на поверхні клітин Man- (p<0,01) та Gal-вмісних (p<0,05) глікоконґюгатів.

Мікроскопічне дослідження клітинних мазків виявило неоднорідний розподіл глікозильованих компонентів на плазматичній мембрані, зокрема, зв’язування PSL-HRP було інтенсивнішим у міхурцях та вип’ячуваннях на поверхні апоптичних клітин. Базуючись на даних мікроскопії є підстави припустити, що ці міхурці є апоптичними тільцями.

Флуоресцентна мікроскопія з одночасним використанням барвників DAPI, PI, та лектину RCA-FITC показала, що галактозовмісні глікоконґюгати експонуються саме на апоптичних клітинах.

З’ясування клітинної локалізації глікокон’югатів – мішеней зв’язування лектинів. Щоб з’ясувати клітинну локалізацію глікокон’югатів – центрів зв’язування лектинів, проведено фракціонування клітинної маси (лінія L1210) із виділенням цитоплазматичної фракції, яка містила усі цитоплазматичні органели, та фракції плазматичних мембран інтактних та апоптичних клітин. Електрофорез виділених фракцій плазматичних мембран та наступний лектиноблот-аналіз показали, що манозовмісні глікокон’югати – мішені зв’язування для лектину PSL – локалізовані у мембранній фракції та відсутні у розчинній (цитоплазматичній) фракції. Результати розділення глікокон`югатів, які зв`язують лектини, за допомогою електрофорезу в ПААГ-ДСН свідчать про наявність в них білкової компоненти, а позитивний сигнал при лектиноблот-аналізі свідчить про вміст у них глікозильної компоненти. Тому центри зв’язування лектинів було ідентифіковано як глікопротеїни, локалізовані у плазматичній мембрані.

Також проведено виділення ліпідної фракції плазматичних мембран, яке здійснювали за Фолчем (Folch J. et al. 1957). Мембранну фракцію було сорбовано на нітроцелюлозній мембрані, після чого проведено дот-блот детекцію із використанням лектину PSL-HRP. Звґязування лектину із фракцією ліпідів апоптичних клітин, розчинною у метанолі, було незначним; зв’язування лектину із фракцією ліпідів інтактних клітин, розчинною у метанолі, та фракціями інтактних та апоптичних клітин, розчинними у хлороформі, не спостерігалось.

Щоб з`ясувати клітинну локалізацію центрів зв`язування лектинів було здійснено аглютинаційне дослідження інтактних та апоптичних клітин лінії L929. Показано, що м`яка обробка клітин трипсином (1 мг/мл, 30 хв, 37°С) значно інгібує аглютинацію порівняно з нетрипсинізованими клітинами.

Оскільки трипсин пригнічував аглютинацію клітин, а зв`язування лектину з метанол-екстрагованою ліпідною фракцією апоптичних клітин було незначним, можна зробити висновок, що центрами зв`язування лектинів є переважно глікопротеїни, локалізовані на плазматичній мембрані.

Дослідження універсальності явища зміни рівня експонування мембранних глікопротеїнів за умов апоптозу. Щоб пересвідчитись в універсальності явища підвищення рівня експонування мембранних б-D-манозо- та в-D-галактозовмісних глікопротеїнів за умов апоптозу, було досліджено клітинні лінії різної тканинної та видової приналежності, а також вплив індукторів апоптозу різної природи: хімічної (протипухлинні препарати, синтетичні похідні стероїдних гормонів), фізичної (гіпертермія, рентгенівське опромінення) та біологічної (анти-CD95-антитіла та галектин-3). Крім того, вивчено вплив різних способів відокремлення клітин від поверхні культурального посуду (механічний спосіб чи трипсинізація) на рівень експонування досліджуваних глікопротеїнів.

Посилення зв`язування Man- та Gal-специфічних лектинів із апоптичними клітинами (у порівнянні з інтактними) спостерігали в клітинах наступних ліній: лінії L929 за дії гіпертермії (43С, 3 год) (як за умов механічного від`єднання клітин від субстрату так і при від`єднанні клітин шляхом трипсинізації) для лектинів PSL, WGA та RCA (p<0,001 в усіх випадках); лінії L929 за дії етопозиду (10 мкM, 72 год) для лектинів RCA (p<0,001), PSL (p<0,05) та WGA (p<0,001); лінії Jurkat за дії цисплатину (5 мкг/мл, 24 год) для лектинів PSL (p<0,001) та PMRL (p<0,001); лінії Jurkat за дії дексаметазону, (1 мкМ, 24 год) для лектинів RCA (p<0,01), PSL (p<0,001), PMRL (p<0,05) та WGA (p<0,001) (Рис. 1); лінії Jurkat для лектину PSL за дії галектину-3 (10 мкМ, 24 год) (p<0,01) та анти-CD95-антитіл (10 нг/мл, 24 год) (p<0,01); лінії MCF-7, субліній wt та DOX/R як за дії метотрексату (100 мкг/мл, 24 год), так і при дії рентгенівського опромінення (доза 300 Рентген, 225 Рентген/хв.) для лектинів PSL (p<0,01), GNA, (-D-Man-специфічного, p<0,05), RCA (p<0,05), VAA (p<0,001) та WGA (p<0,001).

Щоб виявити лектин, який найінтенсивніше зв`язується з мембранними глікопротеїнами апоптичних клітин, було використано ряд манозоспецифічних (PSL, GNA, PMRL та NPA) та галактозоспецифічних лектинів (RCA і VAA), якими діяли на інтактні та апоптичні (цисплатин, 10 мкг/мл, 24 год) клітини лінії А549 карциноми легені людини. Усі досліджувані лектини сильніше (p<0,01) зв’язувалися апоптичними клітинами порівняно з інтактними. Серед Man-специфічних лектинів найсильніше зв’язування виявляли лектини PSL та PMRL, а серед Gal-специфічних – RCA.

Щоб дослідити зміну рівня експонування мембранних глікопротеїнів за умов апоптозу in vivo, було використано клітини лінії L1210, які перевивали шляхом інтраперитонеальної інокуляції на мишах, гібридах першого покоління Black x DBA2; та спленоцити (непаренхімні клітини селезінки) білих лабораторних мишей. Апоптоз клітин лінії L1210, індукований доксорубіцином (2 мг/кг маси тварини), супроводжувався 1,4-кратним зростанням (p<0,01) рівня зв’язування лектину PSL апоптичними клітинами, порівняно з інтактними. Апоптоз мишачих спленоцитів, індукований дексаметазоном (40 мг/кг маси тварини), характеризувався таким самим (1,4-кратним) зростанням (p<0,01) інтенсивності зв`язування лектину PSL-HRP апоптичними клітинами. Виявлено гетерогенність зв`язування лектину PSL серед наявних клітин у популяції спленоцитів: лімфоцити (~85% популяції) фарбувались лектином PSL найінтенсивніше, у той час як моноцити (~11%), які також виявлялись у популяції, фарбувались даним лектином менш інтенсивно, гранулоцити виявлялись у незначній кількості (<4%).

В усіх дослідах наявність апоптозу перевіряли за міжнуклеосомною фрагментацією ДНК, а специфічність зв`язування лектину перевіряли, використовуючи відповідні конкурентні інгібітори (Fowlkes B. J. et al. 1980).

Залежність дози і часу дії індукторів апоптозу на експонування мембранних глікопротеїнів. Щоб з`ясувати рівень експонування мембранних глікопротеїнів залежно від часу після дії індуктора апоптозу (цисплатину), досліджено клітини лінії L1210. Цисплатин у концентраціях 0,5 – 5 мкг/мл індукував апоптоз (про що свідчила поява міжнуклеосомної фрагментації ДНК), спричиняючи зменшення кількості живих клітин та одночасне прямо пропорційне (r = 0,8950) збільшення рівня експонування Man- (PSL) та Gal-вмісних (RCA та VAA) глікопротеїнів (Рис. A). Між зміною (зменшенням) кількості живих клітин та рівнем фарбування клітин Man- та Gal-специфічними лектинами спостерігали сильну негативну кореляцію, r –0,9985 для лектину PSL, r –0,98992 для RCA, та r –0,9928 для VAA.

Часовий вплив апоптоз-індукуючого чинника на рівень експонування мембранних глікопротеїнів вивчали на клітинах лінії L929 фібробластів миші за умов гіпертермії (43C, 3 год) (Рис. 2Б). Дослідження проводили у часових точках 0, 3, 6, 9, 12, 18 та 24 год після 3-годинного інтервалу індукції апоптозу шляхом гіпертермії. Перші зміни в експонуванні мембранних глікопротеїнів спостерігали через 6 год після індукції апоптозу для глікопротеїнів, які виявляли лектином RCA, та через 12 год – для глікопротеїнів, що виявляли лектинами PSL та WGA.

.

Обробка клітин лінії L1210 упродовж 2 год лектинами RCA, VAA, WGA, PSL та PMRL і наступне зв`язування цих клітин з відповідним лектином, міченим HRP, призвели до достовірного (p<0,05 в усіх випадках) зменшення зв’язування лектину клітинами, що були попередньо оброблені цим же лектином, порівняно з необробленими клітинами. Отримані результати можна пояснити інтерналізацією глікопротеїнових рецепторів для відповідних лектинів.

Виділення, характеристика та ідентифікація мембранних глікопротеїнів апоп-тичних клітин. Із інтактних та апоптичних клітин виділяли фракції плазматичних мембран, які піддавали PSL-лектин-афінній хроматографії та наступному електрофорезу в градієнтному ПААГ. Профілі експресії білків порівнювали (Рис. 3), а білки із підвищеним рівнем експресії піддавали наступній MALDI-TOF мас-спектрометрії. Дослідження проводили на інтактних та апоптичних (вплив доксорубіцину) клітинах L1210, інокульованих мишам.

Для з`ясування локалізації білків із підвищеним рівнем експонування при апоптозі – периферичної (з одного із боків плазматичної мембрани, не пронизуючи мембрану) чи інтегральної (пронизуючи мембрану) – використали здатність цих білків по-різному розчинятись у 2% розчині детергенту Тритону X114 (Bordier C. 1981). Дослідження проводили на інтактних та апоптичних (вплив дексаметазону) мишачих спленоцитах. Інтегральні та периферичні білки розділяли електрофорезом у градієнтному ПААГ, профілі експресії білків порівнювали, білки із підвищеним

рівнем експресії піддавали наступній MALDI-TOF мас-спектрометрії. Ідентифіковано наступні мембранні ГП з підвищеною експресією за умов апоптозу: 2 інтегральні з ММ 12 та >200-А кДа, та 5 периферичних з ММ 34,5; 45; 60,5; >200-Б та >200-В кДа.

Із клітин лінії L1210 було виділено та ідентифіковано наступні мембранні глікопротеїни із підвищеним рівнем експресії при апоптозі: G-protein beta-subunit-like protein (Acc#.1, 34 кДа), Apoptosis-inducing factor (AIF)-like mitchondrion-associated inducer of death [Mus musculus] (Acc# AAH38129.1, 41,1 кДа), microtubule-actin cross-linking factor 1 (608 кДа). З мишачих спеноцитів виділено: dystonin isoform в (833 кДа), dynein heavy chain (530 кДа) та microtubule-actin cross-linking factor 1 (608 кДа).

Використання лектин-афінної хроматографії для виділення апоптичних клітин із їх змішаної популяції базувалось на явищі зміни рівня експонування манозовмісних мембранних глікопротеїнів за умов апоптозу. Ізолювання апоптичних клітин було здійснено із використанням мікрочастинок крупнозернистої агарози, кон’югованої з лектином PSL. Клітини розділяли на позитивну фракцію (клітини, зв’язані з PSL-агарозою), та негативну фракцію. При індукції апоптозу в клітин лінії L1210 (цисплатин, 5 мкг/мл, 24 год) отримано позитивну фракцію, яка становила 7,55±0,55% від загальної популяції клітин, та негативну фракцію, яка становила 92,35±0,55% клітин. Флуоресцентна мікроскопія ізольованих клітинних суспензій, із фарбуванням акридиновим оранжевим, та світлова мікроскопія клітин, із фарбуванням гематоксиліном, дозволила класифікувати клітини негативної фракції як “неапоптичні”, а клітини позитивної фракції – як “апоптичні”.

Для ізолювання апоптичних клітин із змішаних популяцій також було використано зв`язування клітин із поверхнею, активованою лектином. Для цього лектин PSL сорбували на поверхню полістирольних чашок Петрі, як контроль використовували чашки із сорбованим альбуміном. Клітини інкубували в чашках, після чого відділяли незв`язані та відмивали зв`язані клітини. У популяції Т-клітин лінії Jurkat, які не зазнали дії індуктора апоптозу, з лектином на поверхні чашок зв`язувалось 1,5% апоптичних клітин, присутніх у популяції. Водночас після індукції апоптозу із поверхнею чашок зв`язувалось 26,5% від присутніх у популяції апоптичних клітин.

Наскільки нам відомо, це перша успішна спроба використати лектин-кон’югований афінний сорбент та активовану лектином поверхню для виділення апоптичних клітин із їх змішаної популяції з неапоптичними клітинами.

Лектин-індукована аглютинація та її використання для експрес-діагнос-ти-ки апоптозу. Здатність лектинів викликати аглютинацію мікрочастинок, зокрема клітин (Луцик М.Д. та ін. 1981, Луцик А.Д. та ін. 1989), зумовлена полівалентністю молекул лектину. Цю властивість було використано для розробки методу індукованої лектином аглютинації інтактних та апоптичних клітин. В основу методу покладено застосування лектину, який специфічно зв`язує глікопротеїни, вміст яких на інтактних та апоптичних клітинах різниться, із наступним визначенням різниці у мінімальних концентраціях лектину, необхідних для аглютинації інтактних та апоптичних клітин. Було протестовано лектини VAA, SNA, PMRL, LLA, PAL, L-фукозо-специфічний лектин із ікри окуня річкового, HPL, RCA, PSL на їх здатність до аглютинації інтактних і апоптичних клітин ліній L1210 та Jurkat. Найефективніше розрізняв інтактні та апоптичні клітини лектин VAA, зумовлюючи відмінність у мінімальній концентрації лектину, необхідній для аглютинації, у 16-64 рази - залежно від типу клітин (Рис. 4).

Ефективність розробленого експрес-тесту для виявлення апоптичних клітин шляхом лектин-індукованої аглютинації було перевірено при детекції апоптозу в популяції лімфоцитів периферичної крові здорових донорів та хворих із автоімунними розладами. Розроблений метод також було використано для оцінки ефективності терапії пацієнтів із автоімунними розладами. Лектин VAA у концентрації 1000 мкг/мл не спричиняв помітної аглютинації лімфоцитів від здорового донора (Д) (Рис. 4-3.). Фарбування DAPI показало, що кількість апоптичних клітин у зразку становила менше 1%. Лімфоцити пацієнта із діагнозом “активна форма поліартриту суглобів” (Рис. 4-4), аглютинувались при концентрації лектину VAA 7,8 мкг/мл. Фарбування DAPI показало, що кіль-

кість апоптичних клітин у зразку становила 5,74%.

Всього було протестовано лімфоцити 34-ти хворих на автоімунні захворювання, у цих пацієнтів одночасно визначали основні імунологічні показники. У 18 хворих (із 34 проаналізованих) автоімунні захворювання супроводжувались збільшенням кількості апоптичних клітин. У більшості хворих із підвищеним рівнем апоптозу спостерігали кореляцію між аглютинацією лектином VAA і кількістю апоптичних клітин, які виявляли за фарбуванням DAPI. Між кількістю апоптичних клітин у популяції та мінімальною концентрацією лектину, необхідною для аглютинації популяції цих клітин виявлялась сильна негативна кореляція (r= –0,882).

З`ясування механізму перерозподілу мембранних глікопротеїнів за умов апоптозу. З метою з`ясування молекулярних механізмів, відповідальних за зростання рівня експонування б-D-манозо- та в-D-галактозовмісних глікопротеїнів на поверхні апоптичних клітин, ми перевірили гіпотезу про те, чи поява б-D-манозо- та в-D-галактозовмісних залишків у складі мембранних глікопротеїнів є наслідком біосинтезу модифікованих глікопротеїнів de novo. З цією метою було використано ряд інгібіторів глікозилювання, а саме – тунікаміцин, 2-дезокси-D-глюкозу та монензин. Оскільки шляхи біосинтезу глікопротеїнів є дуже різноманітними й містять кілька точок галуження, доцільним було використати інгібітори найбільш ранніх етапів біосинтезу глікозильних компонентів (тунікаміцин, 2-дезокси-D-глюкоза) та найбільш пізніх етапів такого біосинтезу чи транспорту глікопротеїнів (монензин). Перераховані інгібітори безпосередньо впливають на процес біосинтезу глікопротеїнів, блокуючи окремі етапи на шляху, що забезпечує появу новосинтезованих глікопротеїнів на плазматичній мембрані.

Результати цитохімічного дослідження на клітинах лінії Jurkat показали, що дія тунікаміцину веде до зростання рівня експонування мембранних Man-вмісних глікопротеїнів порівняно із необробленими контрольними клітинами (p<0,01), подібний ефект спричиняла й дія етопозиду (1 мкМ) (р<0,01). Сумісна дія етопозиду та тунікаміцину спричиняла ефект, близький до адитивного і рівень експонування манозовмісних глікопротеїнів був вищим, порівняно з рівнем експонування цих глікопротеїнів в апоптичних клітин та в клітин, оброблених тунікаміцином (p<0,001) (Рис.  5-А). Методом вестерн-блот-аналізу виявлено появу активної каспази 8 при дії етопозиду, а також підвищену експресію цієї каспази при сумісній дії етопозиду та тунікаміцину. Аналогічні дані отримано при використанні лектино-блот (PSL та RCA) аналізу для досліження фракцій мембранних глікопротеїнів клітин.

При вивченні впливу 2-дезокси-D-глюкози на рівень експонування мембранних Man-вмісних глікопротеїнів у клітинах лінії Jurkat спостерігали достовірне (р<0,001) зни-ження рівня експонування ГП при обробці клітин 2-дезокси-D-глюкозою порівняно з інтактними клітинами (Рис. -Б).

Дія етопозиду призводила до підвищення рівня експонування Man-вмісних ГП порівняно з контролем (p<0,01). За сумісної дії етопозиду та 2-дезокси-D-глюкози рівень експонування згаданих глікопротеїнів був достовірно вищим, порівняно з інтактними клітинами (p<0,05), та приблизно рівним такому, як за умов індукції апоптозу етопозидом (p=0,94). Аналогічні дані отримано для клітин лінії L1210.

При вивченні впливу монензину – інгібітора функцій транс-апарату Гольджі, що блокує транспорт новосинтезованих ГП до плазматичної мембрани (Mollenhauer et 1990) – на Т-клітини лінії Jurkat, було виявлено, що монензин не викликав помітного посилення зв`язування манозоспецифічного лектину PSL із поверхнею оброблених клітин (Рис. 3.48-А). Водночас, етопозид викликав достовірне збільшення зв`язування лектину з поверхнею (p<0,001). Одночасна дія монензину та етопозиду вела до подальшого зростання рівня експонування мембранних б-D-манозовмісних глікопротеїнів (p<0,001). Дія етопозиду спричиняла 6-кратне зростання рівня експресії активної форми каспази 8, а одночасна дія монензину та етопозиду– 14-кратне. Подібні дані отримано і для клітин лінії L1210.

На основі наведених даних можна зробити висновок, що біосинтез N-гліканів та транспорт глікопротеїнів у везикулах із транс-апарату Гольджі до плазматичної мембрани не пов`язаний із зростанням рівнів експонування Man- та Gal-вмісних глікопротеїнів на плазматичній мембрані.

Роль нейрамінідаз у перерозподілі мембранних глікопротеїнів за умов апоптозу визначали, досліджуючи дію інгібітору нейрамінідаз 2,3-дегідро-2-деокси-N-ацетилнейрамінової кислоти (DANA) (Azuma Y. et al. 2000) на експонування сіало-, галактозо- та манозовмісних мембранних глікопротеїнів на поверхні Т-клітин лінії Jurkat лейкемії людини. Показано, що при індукції апоптозу етопозидом рівень експонування сіаловмісних глікопротеїнів на поверхні клітин достовірно знижувався (р<0,001). Одночасна дія етопозиду та 15 мкМ DANA нівелювала ефект зменшення вмісту мембранних сіаловмісних глікопротеїнів при апоптозі. Одночасна дія етопозиду та 15 мкМ DANA також нівелювала ефект зростання експонування Man- та Gal-вмісних ГП на поверхні апоптичних клітин. Отже, дія інгібітора нейрамінідази перешкоджала зміні у експонуванні мембранних глікопротеїнів за умов апоптозу, вказуючи на безпосередню участь нейрамінідаз у даному процесі.

Визначення ферментативної активності нейрамінідази на поверхні інтактних та апоптичних клітин лінії Jurkat (які додавали до інкубаційної суміші) показало, що активність нейрамінідази в інтактних клітин становить 0,078 мU/млн. клітин, тоді як в апоптичних клітин – 3,26 мU/млн. клітин. Отже, за умов індукції апоптозу нейрамінідазна активність на поверхні клітин зростала більше, ніж у 40 разів. Таку активність у кондиціонованому середовищі інтактних та апоптичних клітин не виявлено.

На підставі отриманих в роботі даних зроблено висновок, що зростання експонування Man- та Gal-вмісних та зменшення експонування сіало-вмісних глікопротеїнів на плазматичних мембранах апоптичних клітин пов’язане із модифікацією вже існуючих глікопротеїнів нейрамінідазами в складі плазматичної мембран, а не синтезом глікопротеїнів de novo.

ВИСНОВКИ

Отримані в роботі результати доводять існування нового біохімічного маркеру апоптозу у складі плазматичної мембрани – підвищення рівня експонування б-D-манозо- та в-D-галактозовмісних глікопротеїнів. Даний маркер використано для виявлення та виділення апоптичних клітин із змішаних популяцій. Вперше запропоновано та експериментально обґрунтовано механізм, який лежить в основі змін у рівні експонування мембранних глікопротеїнів за умов апоптозу.

1. Під час апоптозу відбувається достовірне зростання рівня експонування мембранних б-D-манозо- та в-D-галактозовмісних глікокон’югатів, які ідентифіковано як глікопротеїни. Визначено лектини, які із найбільшою ефективністю виявляли ці глікопротеїни – PSL, PMRL, GNA та VAA, RCA, відповідно.

2. Зростання рівня експонування мембранних б-D-манозо- та в-D-галактозовмісних глікопротеїнів за умов індукції апоптозу не залежить від тканинної чи видової приналежності досліджуваних клітин і справджується як для клітинних систем in vitro, так й in vivo. Дане явище також не залежить від природи індуктора апоптозу – хімічної, фізичної чи біологічної, та від особливостей культивування клітинних ліній та способу від`єднання клітин від поверхні