ДОНЕЦЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМ. М.ГОРЬКОГО

ЧЕРНОБРИВЦЕВ ПЕТРО АРТАШЕСОВИЧ

УДК 616.611-002-036.12-091.811

Роль ендотеліальної дисфункції в патогенезі гломерулонефриту

(експериментально-клінічне дослідження)

14.03.04 – патологічна фізіологія

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Донецьк – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Донецькому державному медичному університеті ім. М. Горького МОЗ України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Зябліцев Сергій Володимирович, Донецький державний медичний університет ім. М.Горького МОЗ України, завідувач відділу молекулярно-генетичних досліджень Центральної науково-дослідної лабораторії

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Гоженко Анатолій Іванович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри загальної і клінічної патологічної фізіології;

доктор медичних наук, професор Казімірко Ніла Казімірівна, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри патологічної фізіології.

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця МОЗ України м.Київ, кафедра патологічної фізіології.

Захист відбудеться 26 червня 2007 року о 1100 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .600.02 при Донецькому державному медичному університеті ім. М.Горького (83003, м.Донецьк, пр.Ілліча, 16).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Донецького державного медичного університету ім. М.Горького (83003, м.Донецьк, пр.Ілліча, 16).

Автореферат розісланий 23 травня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, доктор медичних наук

професор Г.А.Ігнатенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Хронічний ГН належить до найчастіших захворювань нирок, яке завершується смертю хворих внаслідок розвитку прогресуючої ниркової недостатності (Пиріг Л.А., 2004, 2005; Мухін Н.А. та співавт., 2005; Семидоцька Ж.Д. та співавт., 2005). Поширеність його в Україні складає 81 випадків на 100 тис. дорослого населення (Колесник М.О., Сайдакова Н.О., 2004). що визначає подальше вивчення патогенезу захворювання одним з актуальних завдань сучасної медицини (Дудар І.О., Степанова Н.М., 2004).

Нирки більше, ніж інші органи, залежать від функціонального стану ендотелію в зв'язку з наявністю в них величезного пулу ендотеліоцитів, який є першим шаром на шляху ультрафільтрації в капілярах клубочків, він регулює процеси тканинного гомеостазу і судинного тонусу, коагуляцію, міграцію й проліферацію клітин, бере участь у реакціях запалення, тканинної регенерації та фіброзу, визначає фільтраційну функцію нирок, дифузію води й іонів (Корж А.Н., 2003; Kang.H. et al., 2002; Luscher T.F., 2002).

Поряд з подальшим поглибленням імунологічної концепції патогенезу ГН стає все більш актуальним вивчення механізмів, пов’язаних з пошкодженням функції і структури ендотеліальних клітин – дисфункції ендотелію. Встановлено, що ЕД відіграє значну роль в формуванні початкових стадій ГН, розвитку артеріальної гіпертензії, нефротичного синдрому і ниркової недостатності. Порушення ЕФ обумовлені в першу чергу активацією системи ЕТ-1 на тлі зниження синтезу і біодоступності ендотеліальних вазодилататорів, таких як NO (Малая Л.Т. и соавт., 2002; Визир В.А., Березин А.Е., 2003; Бобкова И.Н. и соавт. 2005; Камышова Е.С. и соавт. 2005; Лапчинська І.І., Рудюк Л.І., 2006; Uchimura., et al., 2005).

Слід зазначити, що при ГН не визначені чинники ЕД, які спроможні в найбільшому ступені сприяти розвитку захворювання і його ускладнень, в тому числі не встановлена роль прозапальних цитокінів (IL1в, IL6, TNFб) і вазоактивних ейкозаноїдів (PgI2, ТхА2). Можна припустити, що існує тісний взаємозв'язок порушень ЕФ не тільки із структурними змінами ендотеліоцитів гломерулярних капілярів і артеріол, але і з іншими патологічними механізмами, які лежать в основі ГН. Однак співставлення параметрів порушення ЕФ, характеру і ступеню ушкоджень ендотелію та запально-склеротичних і імунокомплексних змін з боку клубочків, канальців і строми нирок раніш не проводилось, тим паче, одночасно, на експериментальному і клінічному матеріалі.

З'ясування впливу ЕД на окремі ланки патогенезу ГН її зв'язок з тяжкістю морфологічних ознак хвороби, сприятиме розробці ефективних методів терапії та прогнозування результату лікування хворих.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася відповідно до основного плану НДР Донецького державного медичного університету ім. М.Горького і є фрагментом теми “Клініко-патогенетична характеристика функціонального стану нирок при артеріальній гіпертензії і супровідних захворюваннях” (№ держреєстрації 0104U010572). Здобувач є співвиконавцем роботи.

Мета і задачі дослідження. Встановити патогенетичну роль ЕД при ГН, взаємозв'язок її з тяжкістю морфологічних ознак захворювання в експерименті і клініці, патоморфоз і динаміку окремих складників ЕФ під впливом патогенетичної терапії.

Для досягнення мети були поставлені наступні задачі:

1. Вивчити на моделі ГН у тварин стан ЕФ, зіставивши її показники з морфологічними ознаками захворювання, оцінити динаміку параметрів метаболізму NO, ЕТ-1, сGMP і прозапальних цитокінів у взаємозв'язку з патоморфозом ГН під впливом гормонально-цитостатичної патогенетичної терапії, а також при використанні стимулятору синтезу NO.

2. Встановити на тваринах з експериментальним ГН патогенетичне значення ЕД в розвитку запально-склеротичних змін структур нирок, виявити залежність стану ЕФ від тяжкості морфологічних ознак захворювання.

3. Проаналізувати у хворих на мезангіальний ГН фактори, які впливають на вираженість ураження клубочків, канальців і строми нирок, у тому числі вивчити роль відкладень імунних комплексів у патогенезі захворювання.

4. З'ясувати стан ендотеліоцитів капілярів клубочків і артеріол при мезангіальних ГН, їхній взаємозв'язок зі змінами мезангіоцитів, епітеліоцитів гломерулярної капсули і канальців, а також із клітинною інфільтрацією і склерозом строми нирок.

5. Визначити стан ЕФ при мезангіальних ГН, здійснити кореляційні, регресійні і дисперсійні зіставлення показників між собою і з параметрами клініко-морфологічного перебігу захворювання, з'ясувати залежність синтезу NOё ET-1, сGMP, цитокінів, PgI2, ТхА2 від ступеня ушкодження окремих структур нирок.

6. Довести патогенетичну значимість ЕД у хворих на мезангіальний ГН у розвитку уражень клубочків, канальців, строми і судин нирок, установити зв'язок з характером імунокомплексного запалення, проліферацією гломерулярних і артеріолярних ендотеліальних клітин.

Об'єкт досліджень: білі безпородні щури-самці з моделлю ГН і хворі з мезангіальними ГН.

Предмет дослідження: стан ЕФ у тварин з моделлю ГН, зв'язок ЕД з тяжкістю морфологічних ознак патологічного процесу, у тому числі з характером проліферації ендотеліоцитів нирки, зміни лабораторних показників і патоморфоз під впливом патогенетичної терапії; стан ЕФ у хворих з мезангіальними ГН, зв'язок ЕД з характером змін ендотеліальних клітин клубочків і артеріол нирок, а також з відкладенням під ендотелієм імунних комплексів, патогенетичне значення порушень ЕФ у розвитку ушкоджень ниркових структур.

Методи дослідження: біохімічні (вивчення вмісту NO і креатиніну в крові), імуноферментні (дослідження в крові концентрацій ET-1, cGMP, IL1в, IL6, TNFб, PgI2, ТхА2), морфологічні (світлова і імунофлуоресцентна мікроскопія нефробіоптатів і тканин нирок експериментальних тварин), статистичні (варіаційний, кореляційний, регресійний, одно- і багатофакторний дисперсійний аналізи).

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше доведено патогенетичну роль різних ланок ЕД на моделі ГН у тварин і у хворих із МПГН і МКГН. Встановлено взаємозв'язок порушень ЕФ з тяжкістю ураження окремих структур клубочків, канальців і строми, а також зі ступенем проліферації гломерулярних і артеріолярних ендотеліоцитів, залежність ЕФ від характеру імунокомплексного ушкодження структур нирок. Вперше у тварин з експериментальним ГН визначено динаміку окремих параметрів ЕФ під впливом патогенетичної гормонально-цитостатичної терапії, а також з використанням стимулятора синтезу NO у зіставленні з наявним нефропатоморфозом.

Практичне значення отриманих результатів. У хворих на мезангіальний ГН виділено критерії ЕФ, які дозволяють прогнозувати перебіг захворювання, тяжкість ураження клубочків, канальців і строми нирок та ступінь проліферації ендотелію гломерулярних капілярів і артеріол.

Матеріали дисертаційної роботи впроваджені в практику нефрологічного відділення Донецького обласного клінічного територіального медичного об'єднання, в науковий процес Центральної науково-дослідної лабораторії Донецького державного медичного університету ім. М. Горького, відділу експериментальних досліджень Інституту невідкладної і відновної хірургії ім. В.К.Гусака АМН України, а також у педагогічний процес кафедр патологічної фізіології і пропедевтики внутрішніх хвороб Донецького державного медичного університету ім. М.Горького, кафедри загальної і клінічної патологічної фізіології Одеського державного медичного університету, кафедр патологічної фізіології Луганського державного медичного університету, Буковинського державного медичного університету, Запорізького державного медичного університету, Кримського державного медичного університету ім. С.І.Георгієвського.

Особистий внесок здобувача. Внесок здобувача в отримані результати є основним і полягає у формуванні мети і завдань дисертаційної роботи, проведенні патентно-інформаційного пошуку, в аналізі сучасних даних літератури з проблеми, у виконанні експериментів на щурах, у визначенні параметрів ЕФ і їхньому аналізі у тварин і хворих людей, у зіставленнях результатів лабораторного і морфологічного досліджень. Дисертант запропонував критерії, які дозволяють прогнозувати перебіг мезангіальних ГН. Здобувач самостійно виконав статистичну обробку результатів і впровадження їх у практику. Дисертантом не були використані результати й ідеї співавторів публікацій.

Апробація результатів дисертації. Дисертаційна робота апробована на спільному засіданні кафедр патологічної фізіології, гістології, патологічної анатомії, пропедевтики внутрішніх хвороб, внутрішніх хвороб і загальної практики сімейної медицини, медичної інформатики, Центральної науково-дослідної лабораторії Донецького державного медичного університету ім. М. Горького МОЗ України (лютий, 2007). Основні положення дисертаційної роботи обговорені на науково-практичній конференції з міжнародною участю „Морфологічний стан тканин і органів у нормі та при моделюванні патологічних процесів” (Тернопіль, 2006), науковій конференції „Актуальні питання патофізіології” (Сімферополь, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 наукових праць, серед яких 1 монографія, 7 робіт у журналах, 2 - у збірниках, 2 - у матеріалах наукових форумів, з них 5 - виконані здобувачем самостійно.

Структура й обсяг дисертації. Дисертацію викладено українською мовою на 156 сторінках тексту. Вона складається зі вступу, 7 розділів (у тому числі огляду літератури, матеріалів і методів, 5 розділів власних досліджень), узагальнення й аналізу отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел літератури, який містить 272 найменування (78 кирилицею і 194 латиницею). Роботу ілюстровано 32 таблицями і 22 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Експериментальна частина роботи виконана на 59 самцях білих щурів масою 190 – 220 г. Усі тварини були поділені на 4 групи. У 1-у групу (контрольну) увійшли 16 тварин. 2-а (основна) _включала 16 тварин, на яких моделювали ГН. У 3-й групі (15 тварин) після моделювання ГН проводили лікування основними засобами патогенетичної терапії ГН: глюкокортикоїдним гормоном дексаметазоном (1 мг/кг) та імунодепресантом цитотоксичної дії циклофосфамідом (5 мг/кг). У 4-й групі (12 щурів) до базисної терапії з метою корекції ЕД додавали ІАПФ – еналаприлат (0,1 мл). ГН моделювали триразовим введення щурам повного ад'юванту Фрейнда з нирковим антигеном і розчином селезінкової ДНК великої рогатої худоби. Доза 1-го введення ад'юванту – 5 мг/кг маси тварини. Дозу 2-го введення на 15-й добі від початку експерименту знижували в 2 рази порівняно з 1-м, а дозу 3-го на 25-й добі – ще в 2 рази порівняно з 2-м. Додатково тварин піддавали іонізуючому опроміненню в дозі 0,48 Гр через 14 днів після 1-го і через 9 днів після 2-го введення ад'юванту. Моделювання ГН здійснювали протягом 1 місяця. Лікування проводили щодня, протягом наступного місяця. Над контрольними тваринами виконували всі маніпуляції, як у дослідних групах, але замість ад'юванту Фрейнда і лікарських препаратів уводили відповідні об'єми 0,9розчину натрію хлориду. Тварин цієї групи впливу іонізуючого опромінення не піддавали. Усіх щурів виводили з експерименту через 2 місяці від початку в умовах ефірного наркозу шляхом декапітації. Утримання тварин і всі маніпуляції над ними здійснювали відповідно до вимог і положень Європейської Конвенції по захисту хребетних тварин (Страсбург, 1986), схвалених Першим національним конгресом по біоетиці (Київ, 2001) і Закону України №3447-IV від 21.02.2006 р. „Про захист тварин від жорстокого поводження”, та узгодженням із комісією з питань біоетики Донецького державного медичного університету ім. М. Горького.

Під спостереженням перебували 49 хворих на мезангіальні ГН (25 чоловіків і 24 жінки) віком від 16 років до 67 років (у середньому 35,90±2,42 років). Тривалість маніфестації захворювання складала від 2 місяців до 14 років (у середньому 2,90±0,44 років). У 28,6пацієнтів діагностовано нефротичний синдром, у 34,7констатовано систолічну артеріальну гіпертензію (>140 мм рт.ст.), у 32,7– діастолічну (>90 мм рт.ст.). Рівень середнього АТ склав 114,80±3,24 мм рт.ст., параметри ПСО – 2817,10±101,85 дин.с.см—5. Хворі перебували в I-III стадіях хронічного захворювання нирок (величини КФ склали від 33 мл/хв до 129 мл/хв, у середньому – 117,50±7,54 мл/хв). Показники швидкості КФ в чоловіків виявилися на 28,6меншими, ніж у жінок (p=0,035). Усім хворим було виконано пункційну нефробіопсію. У 75,5випадках установлений хронічний МПГН, в інших – МКГН. У 77,6зафіксовано ТІК ниркової патології. Імунофлуоресцентне дослідження нефробіоптатів проведено 27 хворим (13 чоловікам і 14 жінкам) віком від 16 років до 62 років (у середньому 31,40±2,64 років). У 77,8випадків спостерігався МПГН, у 22,2– МКГН. Як контроль обстежено 30 практично здорових людей (12 чоловіків і 18 жінок) віком від 18 років до 60 років.

Нефробіопсію виконували на фоні атаралгезії під контролем ультразвукового дослідження із застосуванням високошвидкісного пістолета “Biopty” (“Bard”, США). Гістологічні зрізи забарвлювали гематоксиліном-еозином і за Ван-Гізон, ставилася PAS-реакція. Проводили імунофлуоресцентний метод дослідження для визначення імуноглобулінових депозитів. Ураження окремих ниркових структур оцінювали в балах (від 0 до 3), підраховували СПУ за формулою:

СПУ = ( а+ 2b + 3c ) : ( a + b + c + d )

де: а, b, c – кількість досліджень відповідно з 1, 2 і 3 балами;

d – кількість досліджень з відсутністю даної ознаки.

Рівень NO у крові оцінювали за кінцевим продуктом його метаболізму – нітритом, із застосуванням реактиву Гріса (Голиков П.П. та співавт., 2000) Це дослідження, а також вимірювання рівня креатиніну крові виконували на спектрофотометрі SPECORD-200 (Німеччина). Швидкість КФ розраховували за формулою Кокрофта-Гольта, ПСО – стандартним методом.

Визначення рівнів ЕТ-1, cGMP, IL1в, IL6, TNFб, PgI2 і TxA2 у плазмі крові здійснювали імуноферментним методом на рідері PR2100 („Sanofi Diagnostic Pasteur”, Франція) з використанням наборів реагентів „ProCon” (Росія) і „Amercham” (Велика Британія).

Комп’ютерну статистичну обробку отриманих результатів проведено з використанням варіаційного, кореляційного, регресійного, одно- і багатофакторного дисперсійного аналізу (програми “Microsoft Excel” і “Statistica”). Розраховували середні значення, їх помилки, коефіцієнти кореляції, критерії регресії, дисперсії, Стьюдента, Уїлкоксона-Рао, ч-квадрат і вірогідність статистичних показників (р).

Результати дослідження та їх обговорення. У всіх нелікованих тварин з моделлю ГН виявлено дистрофію, атрофію, некроз епітелію канальців, у 88– проліферацію мезангіальних клітин і лімфогістіоцитарну інфільтрацію строми, у 75– збільшення мезангіального матриксу, у 50– склероз/гіаліноз клубочків і склероз строми, у 38– проліферацію епітелію капсули Шумлянського-Боумена. При цьому СПУ склав 18,88±1,27 балів і був вірогідно вищим, ніж у тварин контрольної групи – 4,44±0,82 балів (p<0,001). Проліферація мезангіоцитів і епітеліоцитів капсули розвивалася тільки при моделюванні ГН, при цьому констатували частішання випадків збільшення мезангіального матриксу (p=0,013) і змін епітеліоцитів канальців (p=0,015).

У щурів контрольної групи рівень у крові NO складав 4,70±0,22 мкмоль/л, cGMP – 7,30±0,52 пмоль/мл, ET-1 – 1,80±0,21 пг/мл, IL1в – 14,10±0,52 пг/мл, IL6 – 3,60±0,38 пг/мл, TNFб – 21,00±0,62 пг/мл. При експериментальному ГН зростали на 75концентрації NO (p<0,001), у 3,1 рази – ЕТ1 (p<0,001), на 82– IL1в (p<0,001), на 47IL6 (p=0,008), на 72TNFб (p<0,001) і зменшувався на 34вміст cGMP (p=0,004). Моделювання ГН у 2-й групі тварин визначило наявність прямих кореляційних зв'язків ЕТ-1 з IL6 (p<0,001) і IL1в з TNFб (p=0,010).

На інтегральний стан ЕФ у тварин 2-ї групи впливали ступені проліферації мезангіальних клітин (p=0,037), збільшення мезангіального матриксу (p=0,018) і склерозу строми (p=0,033). Однофакторний дисперсійний аналіз виявив вплив збільшення мезангіального матриксу на рівень NO (p<0,001), дистрофії, атрофії, некрозу епітелію канальців – ЕТ-1 (p=0,039), проліферації епітелію капсули – IL1в (p<0,001), склерозу/гіалінозу клубочків – TNFб (p=0,032). Зафіксовано залежність ступенів проліферації мезангіоцитів і збільшення мезангіального матриксу від показників NO (відповідно p=0,012 і p<0,001), проліферації епітелію капсули і склерозу строми – від IL1в (p=0,002 і p=0,003), склерозу строми – від TNFб (p=0,003). Регресійний аналіз показав пряму залежність параметрів у крові TNFб від ступеня тяжкості ушкодження ниркових структур (p=0,025). При цьому синтез цього цитокіну, поряд з його агоністом IL1в визначала інтегральний СПУ (відповідно p=0,001 і p=0,019).

Застосування базисної терапії ГН у 3-й групі тварин знижало СПУ до 17,47±1,35 балів, а додавання до комплексу терапевтичних заходів ІАПФ – до 16,00±0,75 балів (в контрольній групі СПУ складав 18,88±1,27 балів). Однак, порівняно з тваринами 2-ї групи, у щурів 3-ї групи частота проліферації мезангіальних клітин була меншою (p=0,036), а частота збільшення мезангіального матриксу – більшою (p=0,038). Дещо несподіваним виявилося частішання випадків склерозу клубочків і строми (відповідно р=0,020 і р=0,004) у тварин 4-ї групи, що одержували еналаприлат. Разом з тим спостерігали зниження частоти збільшення мезангіального матриксу (р=0,040) і зникнення випадків проліферації епітелію капсули Шумлянського-Боумена.

Застосування дексаметазону і циклофосфаміду супроводжувалося в 3-й і 4-й групах тварин зниженням показників у крові NO (відповідно p<0,001 і p=0,001), IL1в (p=0,014 і p<0,001) і TNFб (p=0,002 і p<0,001), при цьому додаткове застосування еналаприлату у 4-й групі спричиняло підвищення NO (p=0,002). Ступінь збільшення мезангіального матриксу у тварин 3-ї групи впливав на інтегральний стан ЕФ (p=0,009), тоді як додаткове використання ІАПФ таку дію нівелювало. На вміст IL1в впливали зміни епітеліоцитів канальців (p=0,007), а на IL6 – збільшення мезангіального матриксу (p=0,003).

Як показав дисперсійний аналіз, застосування еналаприлату пригнічувало залежність концентрацій у крові IL1в і IL6 від ступеня виразності морфологічних ознак ГН, але виявляло вплив проліферації мезангіальних клітин на рівень TNFб (p=0,008) і склерозу строми на _NO (p=0,040). У свою чергу регресійний аналіз показав у 3-й групі пряму залежність ступеня збільшення мезангіального матриксу від синтезу IL6 (p<0,001), а в 4-й групі проліферації мезангіальних клітин – від продукції TNFб (p<0,001). У такий спосіб було встановлено патогенетичний зв'язок описаних структурних змін нирок при експериментальному ГН із прозапальною гіперцитокінемією, що залежала від використання в комплексі лікувальних заходів ІАПФ.

При експериментальному ГН проліферації ендотеліоцитів капілярів клубочків і артеріол нирок, відповідно виявлялися в 100 % і 63тварин, що було частіше, ніж у контрольній групі у 2,7 рази (p<0,001) і в 3,3 рази (p=0,012). СПУ ендотеліальних клітин гломерулярних капілярів складав у 1-й групі 0,50±0,18 балів, а в 2-й групі – 3,63±0,13 балів (p<0,001). СПУ артеріолярних ендотеліоцитів – відповідно 0,19±0,10 балів і 1,75±0,36 балів (p=0,001).

Застосування базисної терапії призводило до зменшення кількості випадків проліферації ендотеліоцитів капілярів клубочків до 87а додаткове використання ІАПФ – до 83Разом з тим, збільшилася частота спостереження проліферації ендотеліальних клітин артеріол у 3-й групі до 73а в 4-й – до 75Отже, патогенетична терапія ГН подвійно впливала на проліферацію ендотелію: з одного боку, сприяла пригніченню проліферації едотеліоцитів гломерулярних капілярів, з іншого – викликала проліферативну реакцію ендотеліальних клітин більших ниркових судин.

Однофакторний дисперсійний аналіз засвідчив вплив тяжкості ураження ендотелію артеріол на параметри NO (p=0,015). У свою чергу, регресійний аналіз указував на наявність залежності ступеня проліферації ендотелію капілярів клубочків від показників у крові ET-1 і IL6 (відповідно p=0,022 і p=0,021). Треба підкреслити, що в групі тварин, які одержували гормонально-цитостатичну терапію, виявлено вплив на інтегральний стан ЕФ проліферації ендотелію капілярів (p=0,016), але не артеріол. При додатковому застосуванні ІАПФ спостерігали вплив обох морфологічних ознак на рівень у крові NO (відповідно p=0,024 і p=0,040).

У тварин з ГН відзначався вплив ступеня проліферації епітеліоцитів капсули Шумлянського-Боумена (p=0,033) і лімфогістіоцитарної інфільтрації строми (p=0,006) на рівень змін ендотелію гломерулярних капілярів. На стан ендотелію артеріол впливали вираженість проліферації мезангіоцитів (p=0,002) та епітеліальних клітин капсули клубочків (p=0,028), збільшення мезангіального матриксу (p=0,005), склерозу клубочків і інтерстицію (відповідно p=0,045 і p=0,001). У свою чергу, від ступеня змін ендотеліоцитів гломерулярних капілярів залежала проліферація мезангіальних клітин (p=0,049), а від рівня пошкодження ендотелію артеріол – проліферація мезангіоцитів (p=0,007), збільшення мезангіального матриксу (p=0,013) і склероз строми (p<0,001).

Ступінь змін ендотеліоцитів артеріол впливав на рівень у крові NO (p=0,015). Проліферація ендотелію гломерулярних капілярів прямо пов'язана із синтезом ЕТ-1 (p=0,018) і IL6 (p=0,021), про що свідчили дані дисперсійного і регресійного аналізів. Виявлено обернену залежність концентрації в крові NO від ступеня змін ендотеліальних клітин артеріол (p=0,026).

У 98хворих на мезангіальні ГН виявлено проліферацію мезангіальних клітин, у 96– дистрофію, атрофію і некроз епітелію канальців, у 88– збільшення мезангіального матриксу, у 80– зрощення капілярних петель з капсулою клубочка, у 71– склероз строми, у 69– лімфогістіоцитарну інфільтрація строми, у 49– стовщення базальної мембрани капсули Шумлянського-Боумена, у 41– склероз/гіаліноз клубочків, у 39– стовщення базальної мембрани гломерулярних капілярів, у 37– проліферацію епітелію капсули, у 31–проліферацію ендотелію судин, у 27– проліферацію ендотелію капілярів клубочків, у 25– периваскулярну інфільтрацію, у 20– плазматичне просочування судин, у 14– склероз/гіаліноз судин, у 10% – мікропівмісяці. СПУ клубочків склав 8,40±0,64 балів, СПУ канальців – 1,80±0,13 балів, СПУ судин – 1,20±0,26 балів, СПУ строми – 2,60±0,29 балів.

На морфологічну картину ГН впливали наявність нефротичного синдрому (p=0,001), рівень АТ (p<0,001) і тяжкість ТІК (p<0,001). Стадія ГН впливала на стан ендотелію капілярів (p=0,023), наявність мікропівмісяців (p<0,001), склероз/гіаліноз клубочків і судин (відповідно p=0,002 і p=0,048), інфільтрацію строми і її склероз (відповідно p=0,015 і p=0,020). Величина АТ, в свою чергу впливала на зрощення петель капілярів з капсулою (p=0,019), стовщення базальної мембрани капілярів (p<0,001) і склероз строми (p=0,009). ПСО зумовлював стовщення базальної мембрани капілярів (p=0,026), периваскулярну інфільтрацію (p=0,011) і плазматичне просочування судин (p=0,022). Відзначався істотний вплив морфологічного варіанта ГН на ступінь проліферації ендотелію гломерулярних капілярів (p=0,002).

Відкладення IgA були відзначені в 85хворих у капілярах клубочків, у 74– у мезангіумі, у 52– у стромі, IgG – відповідно в 3356і 44IgM – у 4848і 30У 41спостережень депозити імуноглобулінів виявлялися в капілярах субендотеліально.

Морфологічна форма ГН впливала (p<0,001) на ступінь відкладення IgG і IgM у гломерулярних капілярах, а тяжкість ТІК – на депозити IgA у капілярах (p=0,027), мезангіумі (p=0,009) і стромі (p<0,001), IgG – тільки в мезангіумі (p=0,017) і стромі (p<0,001), IgM – лише в стромі (p=0,002). За даними дисперсійного аналізу, ступінь тяжкості ураження клубочків впливав на відкладення IgA у капілярах (p=0,026) і стромі (p=0,034), IgG у мезангіумі (p<0,001) і стромі (p=0,003), IgM у мезангіумі (p=0,010).

Ступінь інтерстиціальних і гломерулярних ушкоджень пов'язаний з відкладенням IgA у капілярах (p=0,018) і стромі (p<0,001), IgG у мезангіумі (p=0,034) і стромі (p=0,001), а також IgM у стромі (p<0,001). Глибина судинних порушень визначала депозити IgA у капілярах (p=0,004), IgG у мезангіумі (p=0,028) і IgM у стромі (p=0,041). Регресійний аналіз дозволив зробити висновок про те, що відкладання імуноглобулінів у структурах нирок було несприятливою ознакою щодо уражень клубочків і строми та позитивною – щодо тяжкості ушкоджень канальців і судин.

Серед обстежених хворих було виділено 3 групи: 1-а – із проліферацією ендотелію капілярів клубочків, 2-а – із субендотеліальними відкладаннями IgA, IgG, IgM і 3-я – з проліферацією ендотелію артеріол нирок. 1-у групу склали 272-у – 41і 3-ю – 31хворих. Депозити імуноглобулінів були виявлені у всіх пацієнтів із МКГН, і тільки в 24випадків у хворих на МПГН (p=0,001). Стадія захворювання впливала на ступінь проліферації ендотелію капілярів (p=0,023), а виразність ТІК – на проліферацію ендотелію більших судин (p=0,017). Регресійний аналіз відображав пряму залежність КФ від змін ендотелію капілярів (p=0,003), а кореляційний аналіз виявив позитивний зв'язок тяжкості ТІК і ушкодження ендотелію судин (p=0,010).

Морфологічна форма ГН впливала на ступінь змін ендотелію капілярів (p=0,002) і рівень відкладення в них імуноглобулінів (p<0,001). Зафіксовано прямий кореляційний зв'язок між ступенями проліферації ендотеліальних клітин і відкладанням Ig (p=0,001).

На інтегральну тяжкість морфологічних ознак ГН впливала (p<0,001) виразність проліферації ендотеліальних клітин капілярів клубочків і артеріол. За даними дисперсійного аналізу, ступінь проліферації ендотелію капілярів впливає на тяжкість зрощень капілярних петель з капсулою клубочків (p=0,001) і проліферації епітелію капсули (p=0,021), розвиток мікропівмісяців (p=0,002), склероз/гіаліноз клубочків, строми і судин (відповідно p<0,001; p<0,001; p=0,002). Виразність проліферації ендотелію артеріол мала вплив на проліферацію мезангіальних клітин (p=0,010), збільшення мезангіального матриксу (p=0,002), лімфогістіоцитарну інфільтрацію інтерстицію (p=0,035), плазматичне просочування і склероз судин (відповідно p=0,001 і p=0,002). Субендотеліальні відкладення імуноглобулінів капілярів впливали на стовщення базальної мембрани капілярів (p<0,001).

Регресійний аналіз засвідчив пряму залежність вираженості ураження ендотелію артеріол від ступеня збільшення мезангіального матриксу (p=0,002), проліферації епітелію капсули (p=0,003), лімфоплазматичної інфільтрації і склерозу строми (відповідно p=0,025 і p=0,014). Разом з тим, було виявлено обернене співвідношення зі ступенем стовщення базальної мембрани капілярів клубочків (p=0,006). Ці дані дозволяють припустити більш значну проліферацію ендотелію артеріол у хворих на МПГН. Спостерігався також прямий кореляційний зв'язок вираженості проліферації ендотелію капілярів клубочків з відкладенням у них IgG (p<0,001) і IgM (p=0,038), а також депозитів IgG у мезангіумі і стромі (відповідно p=0,003 і p=0,043). Більше того, відкладення імуноглобулінів під ендотелієм були позитивно пов'язані (p<0,001) з рівнем депозитів IgG и IgM в інших структурах капілярів.

У здорових людей рівень NO у крові складав 5,10±0,06мкмоль/л, cGMР – 11,10±0,19пмоль/л, ЕТ-1 – 4,10±0,11пг/мл, IL1в – 58,60±0,57пг/мл, IL6 – 6,00±0,21пг/мл, TNFб – 56,40±1,54пг/мл, PgI2 – 77,60±11,82нг/мл, ТхА2 – 7,80±1,69нг/мл. У хворих на ГН збільшувалися на 6концентрації NO (p=0,002), на 12– cGMP (p=0,032), на 68– ЕТ-1 (p<0,001), на 36– IL1в (p<0,001), на 12– TNFб (p=0,004), при цьому вміст PgI2 зменшувався в 2,6 рази (p<0,001).

Установлено вплив нефротичного синдрому на інтегральний стан ЕФ (p=0,010). У хворих з нефротичним синдромом були меншими на 7показники у крові NO (p=0,026) і на 20– ТхА2 (p=0,012), разом з тим виявилися підвищеними концентрації в крові IL1в на 39(p=0,003), TNFб – на 16(p=0,014) і PgI2 – на 32 % (p=0,004). Зафіксовано різноспрямовані кореляційні зв'язки NO і ET-1 з IL1в (відповідно p=0,026 і р=0,035) і з IL6 (відповідно p=0,048 і p=0,006). Рівень ТхА2 обернено співвідноситься із вмістом у крові ET-1 (p=0,048), IL6 (p=0,005) і PgI2 (p<0,001). Останній, у свою чергу, також корелював з рівнем NO (p=0,008). На концентрації PgI2 і ТхА2 впливали наявності нефротичного синдрому (відповідно p<0,001 і p=0,030), рівні АТ (відповідно p<0,001 і p=0,022) і ПСО (відповідно p<0,001 і p=0,001).

Інтегральний стан ЕФ був тісно пов'язаний з морфологічною формою ГН (p=0,034) і тяжкістю ТІК (p=0,020), яка достовірно впливала тільки на рівень ЕТ-1 (p=0,021). Серед усіх середніх показників ЕФ у хворих з різними варіантами ГН лише концентрація PgI2 була на 29вищою при МКГН порівняно з МПГН (p=0,013). Цей же показник був на 28більшим у пацієнтів з ТІК (p=0,033).

За даними дисперсійного аналізу, СПУ капілярів впливав на параметри NO (p=0,011), ET-1 (p<0,001) і IL1в (p=0,030); СПУ канальців – тільки на ЕТ-1 (p=0,015); СПУ строми – на ЕТ-1 (p=0,017) і IL1в (p=0,032); СПУ судин – на NO (p=0,002), IL1в (p=0,004), IL6 (p=0,030) і TNFб (p=0,015). У свою чергу, регресійний аналіз виявив пряму залежність СПУ капілярів і СПУ канальців від вмісту в крові ЕТ-1 (відповідно p=0,008 і p=0,029), а СПУ строми – від концентрації IL1в (p=0,049).

Ступені збільшення мезангіального матриксу (p=0,004), периваскулярної інфільтрації (p=0,041) і склерозу строми (p=0,002) впливали на інтегральний стан ЕФ, при чому, від площі мезангіального матриксу обернено залежали параметри NO (p=0,029) і PgI2 (p=0,016). Величини концентрації ЕТ-1 прямо пов'язані з клітинною інфільтрацією і склерозом строми (p=0,017). В свою чергу, рівні у крові NO визначали проліферацію епітелію капсули Шумлянського-Боумена (p=0,015), cGMP – периваскулярну інфільтрацію (p=0,004), ЕТ-1 – зміни епітелію канальців (p=0,008), IL6 – зрощення капілярних петель з капсулою клубочків (p=0,028), TNFб – лімфогістіоцитарну інфільтрацію строми (p=0,025), PgI2 і ТхА2 – збільшення мезангіального матриксу (відповідно p=0,007 і p=0,021).

Зафіксовано вплив на інтегральний стан ЕФ ступеня відкладень у с стромі IgA (p=0,049) і IgM (p=0,009), причому, коли від першої морфологічної ознаки ГН прямо залежав рівень ЕТ-1 (p=0,011), то друга визначала показники NO (p=0,002) і IL6 (p=0,044). Водночас, рівень ЕТ_впливав на депозити IgG (p=0,013) і IgM (p=0,017) в капілярах клубочків, а IL6 – на відкладення IgA (p=0,035) і IgM (p<0,001) в стромі.

Ступінь ураження ендотелію капілярів і артеріол впливала на стан ЕФ (відповідно p=0,001 і p=0,017). Зафіксовано зв'язок з цими морфологічними ознаками рівня NO (відповідно p=0,014 і p=0,010), до того ж з'ясовано, що проліферація ендотелію капілярів визначала вміст у крові ЕТ-1 (p=0,001) і IL1в (p=0,022). В той же час проліферація ендотеліальних клітин артеріол була взаємопов'язана з концентрацією TNFб (p=0,011). Вміст у крові ET-1 і IL1в залежав (відповідно p=0,033 і p=0,047) також від ступеня депозитів імуноглобулінів під ендотеліальними клітинами капілярів.

У хворих із проліферацією гломерулярних ендотеліоцитів виявилися на 9меншими показники NO (p=0,004) і на 19– cGMP (p=0,012), але більшими на 35– ЕТ-1 (p=0,001), на 44– IL1в (p<0,001) і на 13– TNFб (p=0,024). Збільшення ступеня проліферації ендотеліальних клітин артеріол супроводжувалося підвищенням у крові на 13концентрації IL6 (p=0,028), що відбувалося на фоні зменшення на 14вмісту ТхА2 (p=0,049).

Регресійний аналіз показав пряму залежність вираженості проліферації ендотеліоцитів капілярів клубочків від рівня ЕТ-1 (p=0,023). Ступінь проліферації ендотеліальних клітин зворотньо залежав від параметрів ТхА2 (p=0,017).

Інтегральна схема ролі ЕД в патогенезі ГН відображена на рис. . Етіопатогенні чинники захворювання за допомогою активації імунокомпетентних клітин, ендотелію і тромбоцитів призводять до підвищеного синтезу прозапальних цитокінів і імуноглобулінів з подальшим порушенням функції ендотелію.

ЕД пов'язана з гіперпродукцією ЕТ-1, порушеннями синтезу NO, простагландинів, пошкодженням функції ферментів за рахунок активації вільно-радикальних процесів з руйнуванням клітинних мембран. ЕД призводить до порушення судинного тонусу і проліферації ендотелію, що разом з розвитком запально-склеротичних і імунокомплексних пошкоджень ниркових структур призводить до розвитку хронічної ниркової недостатності (ХНН).

Рис. . Схема ролі ЕД в патогенезі ГН.

Важливо, що прозапальна гіперцитокінемія відігравала провідну роль в формуванні дисфункції ендотелію при гломерулонефриті.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення та нове вирішення наукового завдання – на підставі вивчення показників ЕФ і характеру морфологічних змін нирок у тварин з моделлю ГН і у хворих на мезангіальні ГН виявлено проліферацію ендотеліоцитів гломерулярних капілярів і артеріол, ступінь тяжкості якої визначала запально-склеротичні та імунокомплексні пошкодження в клубочках, канальцях і стромі нирки; встановлено їх взаємозв'язок зі станом ЕФ; визначено динаміку показників ЕФ і патоморфоз ниркових структур під впливом патогенетичної терапії; доведена роль ЕД в патогенезі ГН.

1. Моделювання ГН викликало виразні зміни чинників ЕФ і цитокінів у вигляді збільшення синтезу NO, ET-1, IL1в, IL6, TNFб на фоні зниження продукції cGMP, показники яких корелювали між собою, залежали від ступеня тяжкості ураження окремих ниркових структур, проведеної патогенетичної терапії з використанням глюкокортикоїдних гормонів, цитостатиків і ІАПФ, при чому прозапальна гіперцитокінемія відігравала провідну роль у патогенезі захворювання, утворюючи тим самим замкнене коло підтримки ЕД. Виникала проліферація ендотеліальних клітин капілярів клубочків і артеріол, яка патогенетично взаємопов'язана з ЕД, визначала продукцію вазоактивного NO й інтегральний стан ЕФ і залежала від активності ангіоконстриктора ЕТ-1 і прозапального IL6.

2. Ступінь змін ендотеліоцитів у тварин з моделлю ГН впливала на синтез NO, визначала тяжкість запальних і склеротичних процесів у клубочках, канальцях і стромі нирок, залежала від проліферації мезангіоцитів, збільшення мезангіального матриксу, склерозу клубочків та інтерстицію, ушкоджень епітеліоцитів капсули Шумлянського-Боумена і канальців, прямо співвідносилася з вираженістю ендотеліальної дисфункції.

3. У хворих з мезангіальними ГН тяжкість ураження окремих структур нирок залежала від наявності нефротичного синдрому, рівнів АТ, ПСО і стадії захворювання, патогенетично взаємопов'язана з відкладенням у клубочках, мезангіумі і стромі імуноглобулінів класів A, G, M, які брали участь у гломерулярних і стромальних ушкодженнях, але були сприятливими факторами щодо патології канальців і судин.

4. Проліферація ендотелію артеріол спостерігалася в 31хворих на мезангіальні ГН, ендотелію капілярів клубочків – у 27а відкладення під ним імуноглобулінів – у 41що залежало від морфологічної форми захворювання, взаємопов'язано з функцією нирок, тяжкістю ураження окремих ниркових структур, визначало проліферацію мезангіальних клітин і збільшення мезангіального матриксу, склеротичні гломерулярні, інтерстиціальні і судинні зміни, при чому розвиток проліферації ендотеліоцитів зумовлено їх імунокомплексним ушкодженням.

5. При мезангіальних ГН спостерігалася виражена ендотеліальна дисфункція, яку характеризували зміни показників NO, cGMP, ET-1, IL1в, TNFб, PgI2 і ТхА2, співвідносні між собою, що залежало від морфологічної форми захворювання, тяжкості ТІК і наявності нефротичного синдрому, було пов'язано з рівнями АТ і ПСО, при цьому параметри ЕТ-1 і IL1в впливали на ступінь ураження клубочків, канальців і строми нирок.

6. У хворих на ГН ступінь проліферації епітелію капсули Шумлянського-Боумена залежала від рівня синтезу NO, периваскулярна інфільтрації від – cGMP, пошкодження епітелію канальців від – ЕТ-1, зрощення капілярних петель з капсулою клубочків від – IL6, лімфогістіоцитарна інфільтрація строми від – TNFб, збільшення мезангіального матриксу від – PgI2 і ТхА2. Якщо з депозитами IgA в стромі прямо пов'язан рівень ЕТ-1, а з IgM – показники NO і IL6, то зміст у крові ЕТ-1 впливав на ступінь відкладення в капілярах клубочків IgG і IgM, а рівень IL6 визначав депозити IgA і IgM у стромі. Ступінь проліферації ендотеліальних клітин судин нирок визначала параметри NO, ET-1, IL1в і TNFб. У свою чергу, від рівня ЕТ-1 залежала вираженість проліферативних змін ендотеліоцитів гломерулярних капілярів, а від змісту ТхА2 - ступінь проліферації ендотелію артеріол.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Синяченко О.В., Зяблицев С.В., Чернобривцев П.А. Эндотелиальная дисфункция при гломерулонефрите: Монография.– Донецк: Новый мир, 2006.– 152 с.

2. Синяченко О.В., Зяблицев С.В., Чернобривцев П.А. Нарушение эндотелиальной функции и морфологические изменения почек у животных с экспериментальным гломерулонефритом // Архив клинической и экспериментальной медицины. – 2006. – Т.15, №2. – С. 130-132. (Особисто здобувачем проведені експериментальні дослідження, виконана статистична обробка отриманих даних, сформульовані висновки).

3. Синяченко О.В., Чернобривцев П.А., Зяблицев С.В. Показатели эндотелиальной дисфункции при мезангиальных гломерулонефритах // Укр. терапевт. журн. – 2006. – №3. – С. 50-54. (Особисто здобувачем проведено огляд літературних джерел, узагальнення результатів дослідження, а також сформульовано висновки).

4. Взаимосвязь тяжести поражения структур почек при хронических мезангиальных гломерулонефритах / П.А. Чернобривцев, С.В. Зяблицев, О.В. Синяченко, И.В. Василенко, Е.А. Дядык // Укр. мед. альманах. – 2007. – Т.10, №2. – С. 179-181. (Особисто здобувачем проведено огляд літературних джерел, узагальнення результатів дослідження, а також сформульовано висновки).

5. Синяченко О.В., Зяблицев С.В., Чернобривцев П.А. Состояние эндотелия и морфологические изменения структур почки при экспериментальном гломерулонефрите // Патологія. – 2007. – Т.4, №1. – С. 23-26. (Особисто здобувачем проведені експериментальні дослідження, виконана статистична обробка отриманих даних, сформульовані висновки).

6. Состояние эндотелия сосудов почки при хронических мезангиальных гломерулонефритах / П.А. Чернобривцев, С.В. Зяблицев, О.В. Синяченко, И.В. Василенко, Е.А. Дядык // Вестник неотложной и восстановительной медицины. – 2007. – Т.8, №1. – С. 57-59. (Особисто здобувачем проведено огляд літературних джерел, узагальнення результатів дослідження, сформульовано висновки).

7. Чернобривцев П.А. Состояние эндотелиальной функции и морфологические изменения почки под влиянием патогенетической терапии у животных с экспериментальным гломерулонефритом // Запорожский медицинский журнал. – 2007. – №2 (41). – С. 10-13.

8. Чернобривцев П.А. Повреждение эндотелиоцитов почки, как фактор эндотелиальной дисфункции при экспериментальном гломерулонефрите // Таврический медико-биологический вестник. – 2007. – Т.10, №1. – С. 154-157.

9. Чернобривцев П.А. Морфологические изменения почечных структур и состояние эндотелиальной функции (ЭФ) у животных с моделью гломерулонефрита (ГН) // Питання експериментальної та клінічної медицини / Зб. статей. – Донецьк: ДонДМУ, 2006. – Вип. 10, Т.2. – С. 99-103.

10. Чернобривцев П.А. Депозиты иммуноглобуллинов в структурах почек при мезангиальных гломерулонефритах: связь с эндотелиальной дисфункцией // Питання експериментальної та клінічної медицини / Зб. статей. – Донецьк: ДонДМУ, 2007. _Вип.11, Т.1. – С. 174-178.

11. Чернобривцев П.А. Взаимосвязь метаболизма оксида азота с состоянием перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты при экспериментальном гломерулонефрите // Труды Крымского государственного медицинского университета им. С.И. Георгиевского, 2006. – Т. 142, Ч. 3. – С. 257.

12. Чернобривцев П.А., Зябліцев С.В., Синяченко О.В. Морфологічні зміни з боку нирок та стан метаболізму оксиду азоту при експериментальному гломерулонефриті // Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю „Морфологічний стан тканин і органів у нормі та при моделюванні патологічних процесів”. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2006. – С. 156-159. (Особисто здобувачем проведені експериментальні дослідження, виконана статистична обробка отриманих даних, сформульовані висновки).

АНОТАЦІЯ

Чернобривцев П.А. Роль ендотеліальної дисфункції в патогенезі гломерулонефриту (експериментально-клінічне дослідження). – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 – патологічна фізіологія. – Донецький державний медичний університет МОЗ України, Донецьк, 2007.

Дисертаційна робота присвячена вивченню патогенетичної ролі різних ланок порушень ендотеліальної функції при експериментальному гломерулонефриті у тварин і у хворих із хронічними мезангіокапілярним і мезангіопроліферативним гломерулонефритами. Встановлено взаємозв'язок порушень ендотеліальної функції з тяжкістю ураження клубочків, канальців і строми нирки, а також зі ступенем проліферації гломерулярних і артеріолярних ендотеліоцитів та взаємозалежність ендотеліальної функції і характеру імунокомплексного ушкодження структур нирок.