Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Голева Олена Геннадіївна

УДК 612.017.1+616-001.28-097

Імуномодулююча дія фактора переносу за умови

радіаційного впливу

03.00.01 - радіобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі радіобіології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник

академік НАН України, доктор біологічних наук, професор

Гродзінський Дмитро Михайлович

завідувач відділу біофізики та радіобіології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Цудзевич Борис Олександрович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії

доктор медичних наук, професор Мельников Олег Федосійович, Київський науково-дослідний інститут отоларингології ім. О.С. Коломийченка, завідувач лабораторії патофізіології та імунології

Провідна установа:

Український науковий центр радіаційної медицини АМН України, Інститут клінічної радіології (м. Київ)

Захист відбудеться 26 червня 2000 р. о 16 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою:

Київ-127, проспект академіка Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 24 травня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради ________________ проф. Брайон О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розширення контактів людини та всього живого з іонізуючим випромінюванням робить особливо актуальним вивчення його біологічної дії, в тому числі на людський організм, імунна система якого є надзвичайно чутливою до дії іонізуючого випромінювання, що засвідчують дані численних експериментальних та клінічних досліджень [Руднєв М.І., 1997; Нальовіна О.Є., та ін., 1997; Цудзевич Б.О., та ін., 1998; Савцова З.Д., 1996; Ярилин А.А., 1997; Комиссаренко С.В., и др., 1994]. При дії опромінення на імунну систему первинну роль відіграють два чинники: загибель стовбурових клітин, що позначається на зміні популяцій лімфоїдних клітин, та зміна регуляторних процесів, які визначають функціональний стан та компетентність клітин імунної системи. Якщо перша складова досліджена досить досконало, то друга залишається мало вивченою.

За умов дії малих доз іонізуючого випромінювання зміна регуляторних подій в діяльності імунної системи є однією з визначальних. Відомо, що система цитокінів та рецепторні структури імунокомпетентних клітин приймають участь в інтеграції та регуляції імунної відповіді [Ярилин А.А., 1997; Несмеянов В.А., 1997]. Дослідження регуляторних впливів цитокінів за умов опромінення, можливості відновлення функціонального стану імунокомпетентних клітин опроміненого організму в такий спосіб та з'ясування їх участі в регуляторних та інтегративних процесах в опроміненому організмі є одним з перспективних напрямків. Серед таких цитокінів - фактор переносу імунної реактивності (ФП) - лімфокін, феномен якого полягає у здатності в короткий строк переносити стан сенсибілізації до певних антигенних субстанцій інтактним реципієнтам [Fudenberg H.H., et al., 1994; Rozzo S.J., et al., 1992; Kirkpatrick C.H., et al, 1983]. Застосування його виявилось ефективним для стимуляції клітинно-опосередкованого імунітету у реципієнтів з імунодефіцитними станами, зумовленими різними чинниками (бактеріальними, вірусними, грибковими інфекціями, малігнізацією тощо) [Fudenberg H.H., et al., 1994].

Рядом дослідників показано, що багато цитокінів, речовин з імуномодулюючими властивостями також володіють протипроменевими властивостями, і тому успішно застосовуються для імунореабілітації [Легеза В.И., и др., 1998; MacVittie T.J., et al., 1995; Doria G., et al., 1995; Иванов А.А., 1994; Рогачева С.А., 1998]. Випробування препаратів фактора переносу на наявність у них модифікуючих дію опромінення властивостей, а також вивчення механізмів реалізації його дії на Т- та В-лімфоцити при опроміненні, становить суттєвий інтерес. Це дає підстави сформулювати основну мету і задачі дослідження.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи є з'ясування механізмів системної дії фактора переносу імунної реактивності на опромінений тваринний організм та обгрунтування можливості їх використання для послаблення променевого ураження.

В задачі даної роботи входило:

1.Одержати препарати фактора переносу з лімфоїдних органів та лімфоцитів крові експериментальних тварин.

2.Охарактеризувати їх фізико-хімічні властивості.

3.Дослідити стан основних популяцій імунокомпетентних клітин за умов дії фактора переносу сумісно з іонізуючим випромінюванням.

4.На основі сукупності одержаних даних з'ясувати можливість корекції імунодефіцитних станів як наслідку дії іонізуючого випромінювання за допомогою фактора переносу.

5.Вивчити чутливість опромінених тварин до інфекційних агентів бактеріального походження та оцінити можливість застосування фактора переносу для антиінфекційного захисту на моделі радіаційно індукованого імунодефіцитного стану з експериментальною стафілококовою інфекцією.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі радіобіології та кафедрі мікробіології і загальної імунології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Результати роботи ввійшли до наукової теми № 98500 "Розробка методів одержання та застосування високоефективних імуностимулюючих препаратів природного походження на основі фактора переносу" (замовник - МОЗ України) (Етап №3 - Корекція імунодефіцитних станів, як наслідку дії екологічних та антропогенних факторів довкілля з допомогою фактора переносу клітинної імунної реактивності).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше продемонстровано здатність фактора переносу імунної реактивності послаблювати променеве ураження за умов тотального гострого опромінення в експерименті. Вперше встановлено, що реалізація такої дії фактора переносу здійснюється за участю медіаторів імунної відповіді, головним чином завдяки специфічним гемо- та імунокорегуючим властивостям досліджуваних препаратів. Виявлено, що в основі даних властивостей препаратів фактора переносу лежить їх здатність ефективно впливати на різні ланки становлення та розвитку імунної відповіді опроміненого організму. Визначені особливості мітогенної дії фактора переносу на лімфоцити опромінених тварин. Показано, що даний препарат може застосовуватись для імунореабілітації у реципієнтів з експериментально індукованими опроміненням імунодефіцитами (радіаційно індукований гіпотиреоз, вторинний імунодефіцитний стан). Дослідження особливостей будови даної субстанції підтвердили її рибонуклеопротеідну природу.

Запропоновано можливий механізм реалізації протипроменевої дії фактора переносу шляхом регуляції функціональної активності різних типів клітин імунної системи, здатності відновлювати рецепторні структури імунокомпетентних клітин, активації продукції цитокінів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані сприяють більш глибокому розумінню механізмів регуляції функціональної активності лімфоцитів за участю фактора переносу при дії опромінення, що дає практичний внесок в розробку стратегії підвищення радіорезистентності клітин за допомогою засобів природного походження. Все це розширює наші теоретичні уявлення про механізми регуляторних процесів, які відбуваються в опроміненому організмі. Продемонстровано перспективність використання фактора переносу як засобу, що відновлює функціональну активність різних ланок імунної відповіді опроміненого організму на фоні імунодефіцитного стану, що розвивається внаслідок дії опромінення.

Запропонований метод одержання фактора переносу може бути покладений в основу промислових способів одержання даного препарату в умовах розширення використання його імуномодулюючих властивостей для послаблення променевої дії, а також для імунореабілітації.

Враховуючи результати роботи створено експериментальну модель для вивчення можливостей застосування речовин з протипроменевими властивостями та корекції імунодефіцитних станів, що виникають під впливом опромінення.

Одержані дані відносно фізико-хімічних властивостей фактора переносу імунної реактивності встановили основні підходи щодо подальшого вивчення структури досліджуваної субстанції та її феномену.

Матеріали проведених досліджень використовуються в навчальному процесі на кафедрі радіобіології у спецкурсі і спецпрактикумі "Клітинна радіобіологія", на кафедрі мікробіології та загальної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченка у теоретичних і практичних спецкурсах "Радіоімунологія", "Імуномодулятори", "Клітинний імунітет", великих спецпрактикумах "Радіоімунологія", "Клітинний імунітет".

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно виконані основні експериментальні дослідження, проаналізовано їх результати і обгрунтовано науково-практичні висновки. Автор висловлює вдячність за науково-консультативну допомогу в процесі виконання окремих розділів роботи д.б.н. Мацу О.Н., НДІ вакцин і сироваток ім. І.І. Мєчнікова РАМН (Москва); д.б.н. Саніну О.В., д.б.н. Проніну О.В., НДІ епідеміології та мікробіології ім. М.Ф. Гамалеї РАМН (Москва); д.б.н. Козлову Є.А., Інститут молекулярної біології і генетики НАН України (Київ); ст.н.с., к.б.н. Гущі М.І., Інститут клітинної біології та генної інженерії НАН України (Київ); д.м.н. Степанчуку В.А., НДІ гематології і переливання крові МОЗ України (Київ); пров.н.с., к.м.н. Пастеру І.П., НДІ ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка МОЗ України (Київ); д.м.н. Кравчуку О.П., НДІ екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя МОЗ України (Київ).

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації представлено у 12 доповідях на міжнародних наукових конференціях, зокрема, на 7-му Українському біохімічному з'їзді (Київ, Україна, 1997), 3-му з'їзді з радіобіологічних досліджень (Москва, 1997), з'їзді європейських радіобіологічних товариств (ESRB'98) (Капрі, 1998), 10th International Symposium on Transfer Factor (Bologna, Italy, 1995), Congress of Molecular Medicine (Berlin, Germany, 1997), 2-nd Congress of Molecular Medicine (Berlin, Germany, 1998), 4-th International Congress on Immunorehabilitation and Rehabilitation in Medicine (Sochi, Russia, 1998), XIth International Congress on Transfer factor (Monterrey, Mexico, 1999), на конференціях Наукового товариства студентів і аспірантів Київського національного університету імені Тараса Шевченка (1997, 1999 роки).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано у 21 науковій праці: 9 у фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 12 у матеріалах конгресів та наукових конференцій.

Структура та об'єм дисертації. Дисертацію побудовано за загальноприйнятою структурою. Дисертація викладена на 190 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 21 таблицею та 24 рисунками, складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 3 розділів власних досліджень, заключення, висновків та списку використаних джерел, який містить 257 літературних джерел (з них 94 вітчизняних та 163 іноземних).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження

Експериментальних тварин опромінювали на установці "Исследователь - Со60" з потужністю дози 50 Р/хв. Поле калібрували тканинно еквівалентним детектором, градуйованим на одиниці поглинутої дози опромінення. В роботі в залежності від поставлених задач використовували дози опромінення 0,5, 1, 2, 4, 6, 8,3; 9 Гр.

Висновок про протипроменеву дію досліджуваних препаратів ФП робили на підставі даних по їх впливу на виживаність протягом 30 діб мишей лінії Balb/c, опромінених в широкому діапазоні доз з інтервалом 0,75 Гр. Препарати вводили інтраперитонеально в дозі 1-2 МО на тварину за 24 год до чи після опромінення. Контрольним тваринам в ці ж строки вводили фізіологічний розчин.

Для з'ясування можливого механізму дії ФП за умови опромінення в роботі проводили комплексне дослідження впливу цих препаратів на функціональний стан основних популяцій імунокомпетентних клітин опромінених тварин.

Функціональний стан лімфоцитів за умов опромінення при дії ФП характеризували за допомогою мікрометоду реакції бласттрансформації лімфоцитів [Холодная Л.С., и др., 1982]. Функціональну активність клітин визначали через 6 та 12 год після тотального опромінення в дозах 0,5 та 1 Гр. ФП застосовували сумісно з стандартними мітогенами (ФГА, ЛПС) для характеристики мішені дії ФП.

Фагоцитарну та бактерицидну активність нейтрофілів периферійної крові, перитонеальних макрофагів експериментальних тварин та їх зміни під впливом ФП визначали через 12 та 24 год після опромінення в дозі 2 Гр [Петров Р.В., и др., 1992; Пастер Е.У., и др., 1989].

Вплив ФП на гемопоез досліджували методом ендо- та екзоколонієутворення в селезінці сублетально (6 Гр) та летально (8,3 Гр) опромінених мишей ліній СВА та С57Bl [Till L.E., et al., 1964]. Дози опромінення були підібрані експериментально у відповідності з кількістю колонієутворюючих одиниць в селезінці опромінених тварин порівняно з неопроміненим контролем. Препарати ФП вводили тваринам у стандартні строки: за 1, 3, 5, 7, 14 діб до опромінення, через 4 год, добу після опромінення, відповідно.

Дослідження участі ФП в процесах секреції основних регуляторних цитокінів за умов опромінення проводили на базі лабораторії клітинного імунітету НДІ епідеміології та мікробіології ім. М.Ф. Гамалеї РАМН (Москва). Визначали вплив ФП на продукцію інтерлейкіну-1 (ІЛ-1) [Smith K.A., et al., 1981], інтерлейкіну-2 (ІЛ-2) [Кузьмина Е.Г., и др., 1986; Ковальчук Л.Б., и др., 1986], інтерферону (ІФН) [Ершов Ф.И., 1996; Тазулахова Э.Б., и др., 1991], фактора некрозу пухлин (a-ФНП) [Пронин А.В., и др., 1996; Панютич Е.А., и др., 1992] тваринами, опроміненими в дозах 1 та 2 Гр.

З використанням радіаційних химер - мишей лінії СВА, опромінених в дозі 9 Гр, методом локального гемолізу в гелі [Jerne N., et al., 1963] у відповідь на введення еритроцитів барана як стандартного Т-залежного мітогену визначали вплив ФП на кооперативні процеси лімфоцитів. Летально опроміненим тваринам вводили сингенні клітини кісткового мозку та тимоцити в різних комбінаціях з ФП, кооперативні взаємодії клітин аналізували по кількості IgM антитілоутворюючих клітин в селезінках на 5 добу після трансплантації.

Відновлення рецепторних структур лімфоцитів за умов застосування ФП досліджували в реакції розеткоутворення на лімфоцитах двох груп донорів-людей: практично здорові донори та донори з імунодефіцитами, що проживають на забруднених радіонуклідами внаслідок аварії на ЧАЕС територіях, у співробітництві з НДІ гематології та переливання крові МОЗ України (Київ). В роботі визначали кількість Т-, В-, D-розеткоутворюючих і "нульових" лімфоцитів [Гришина Т.И., и др., 1978] та співвідношення теофілін-чутливих та теофілін-резистентних клітин (Т-хелпери/Т-супресори) [Дондоладзе М.Б., и др., 1986].

В експериментальних дослідженнях використовували щурів лінії Вістар (105) та мишей ліній СВА (251), Ваlb/c (250), C57Bl (175), F1(СВАґC57Bl) (105), C3H/Hej (35). Дослідження фармакологічних властивостей препаратів ФП проводили на безпорідних морських свинках (30), безпорідних білих мишах (30) та кролях (10).

Препарати фактора переносу імунної реактивності були одержані експериментально з лімфоїдних органів сенсибілізованих тварин (морських свинок, биків) та крові сенсибілізованих донорів за методикою Lawrence [Шредер И., и др., 1979] в модифікації [Голева О.Г., та ін., 1996]. Попередньо проводили сенсибілізацію тварин та донорів, створюючи стійкий стан гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ), за загально прийнятою схемою [Медуницын Н.В., и др., 1980]. В якості індукторів ФП використовували такі антигени: корпускулярний антиген золотистого стафілококу (КАС), клітинно-зв'язаний білок А стафілококу (КЗБА), стафілококовий анатоксин (СА), дифтерійний анатоксин (ДА), дифтерійно-правцевий анатоксин (ДПА). Умови та способи сенсибілізації зазначені в роботах [Голева О.Г., та ін., 1996; Голева О.Г., та ін., 1999]. Препарат, одержаний з 5ґ108 клітин, вважали 1 міжнародною одиницею ФП (МО) [Kirkpatrick C.H., et al., 1983].

Препарати були гель-хроматографічно очищені [Burger D.R., et al., 1976], їх чистота та склад досліджені методами електрофорезу за Laemmli [Laemmli U.K., 1970], високовольтного форезу на папері [Кавсан В.М., и др., 1968], УФ-спектрофотометрії. Аналіз амінокислотного складу ФП здійснено на аналізаторі Biotronic LC 5021 (ФРН).

Активність препаратів ФП визначали за загально прийнятими критеріями по їх здатності індукувати стан ГСТ у інтактних реципієнтів та по впливу на продукцію фактора гальмування міграції лейкоцитів/макрофагів [Borkowsky W., et al., 1981; Fudenberg H.H., et al., 1983; Суслов А.П., и др., 1979].

Стерильність, пірогенні, алергенні, токсигенні та мутагенні [Maron D.M., et al., 1983; Медуницын Н.В., 1999] властивості препаратів ФП досліджено у відповідності з інструкціями по контролю препаратів крові МОЗ України.

В роботі вивчали дію ФП при радіаційно індукованих імунодефіцитних станах (гіпотиреоз та вторинний імунодефіцитний стан), а також можливість його застосування для антиінфекційного захисту на моделі з імунодефіцитним станом та експериментальною стафілококовою інфекцією.

Стан стійкого гіпотиреозу створювали за допомогою інтраперитонеального введення щурам лінії Вістар радіойоду по 8,325 МБк/ммоль йоду-131 (Дослідне підприємство "Радиопрепарат" Інституту ядерної фізики АН Узбекистану) у вигляді NaI в 0,3 мл 0,9%-ного розчину NaCl. Через 28 діб поглинута доза, яку отримав кожен щур за рахунок b-випромінювання радіойоду, становила 3,7 Гр для тіла та 81,0 Гр для щитовидної залози.

Вторинний імунодефіцитний стан з пригніченням клітинного та гуморального імунітету індукували тотальним гострим опроміненням мишей лінії Balb/c в дозі 4 Гр. За зазначених умов опромінення у тварин викликали експериментальну стафілококову інфекцію - інтраперитонеально вводили мікробні клітини Staphylococсus aureus Cowan-1 в дозі ЛД50 (2ґ1010 мікробних клітин/мл). Препарати ФП вводили разом з бактеріальною культурою, чи попередньо за 1 – 7 діб, та визначали виживаність експериментальних тварин.

Достовірність числових відмінностей в роботі оцінювали за критерієм Стьюдента. Імовірність похибки p визначали згідно таблиць з допомогою розрахованого значення t. Різницю вважали статистично імовірною при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Послаблення променевого ураження за умови застосування фактора переносу імунної реактивності.

Ефективним засобом підвищення радіорезистентності організму в цілому та лімфоїдної системи зокрема може бути імуностимуляція. Показано, що антигенна та мітогенна стимуляція можуть суттєво модифікувати чутливість лімфоцитів до опромінення [Нальовіна О.Є., та ін., 1997; Ярилин А.А., 1997; Легеза В.И., и др., 1998].

В даній роботі вперше були проведені дослідження впливу фактора переносу імунної реактивності на виживання тварин за умов дії іонізуючого випромінювання. Досліджувані препарати ФП підвищували виживаність опромінених мишей протягом 30 діб при їх застосуванні за 24 год до чи після опромінення (рис. 1), що свідчить на користь їх здатності послабляти променеве ураження в діапазоні доз ЛД50/30-ЛД70/30. По мірі зростання дози опромінення даний ефект зникає.

Рис. 1 Залежність виживаності мишей лінії Balb/c від дози опромінення при введенні препаратів фактора переносу імунної реактивності за 24 год до (1 - опромінення, 2 -ФПбич_КАС, 3 - ФПбич_ДПА) чи після опромінення (4 - опромінення, 5 - ФПбич_КАС, 6 - ФПбич_ДПА).

Рис. 2 Динаміка виживаності мишей лінії Balb/c після опромінення в дозі 6,75 Гр при введенні препарату фактора переносу (ФПбич_КАС).

Динаміка смертності опромінених мишей, яким вводили препарат ФПбич_КАС, як комплексний показник дії ФП за умов радіаційного впливу, свідчить, що ФП попереджує загибель експериментальних тварин головним чином протягом перших двох тижнів після опромінення (рис. 2).

Виходячи з одержаних даних, можна припустити, що послаблення фактором переносу променевого ураження полягає в його здатності стимулювати відновлювальні процеси в опроміненому організмі. Передбачається, що ФП може впливати на пострадіаційне відновлення захисних функцій опроміненого організму за рахунок наявності комплексу гемо- та імунорегулюючих властивостей, дослідженню яких за умов дії іонізуючого випромінювання були присвячені наступні розділи даної роботи.

Властивості препаратів фактора переносу імунної реактивності.

Діалізовані екстракти з активністю фактора переносу імунної реактивності були одержані з лейкоцитів сенсибілізованих донорів, лімфоїдних органів сенсибілізованих тварин та очищені за допомогою гель-фільтрації на Sephadex G-25. Активність ФП була виявлена в першому хроматографічному піці.

Таблиця 1

Вплив препаратів фактора переносу імунної реактивності на гальмування міграції лейкоцитів/макрофагів різних груп донорів

Препарат Гальмування міграції лейкоцитів/макрофагів

інтактних донорів-людей (n=7 в групі) інтактних морських свинок (n=5 в групі)

Вага зони міграції, М±м, мг Гальмування міграції, % Вага зони міграції, М±м, мг Гальмування міграції, %

ФПлюд_СА 21,3±2,5 53,4 22,5±2,1 42,6

ФПбич_КАС 19,6±1,7 57,1 20,4±2,0 48,0

ФПмор.св._КЗБА 23,6±2,1 48,4 25,6±1,9 34,7

Неочищений ФПлюд_СА 28,7±2,5 37,2 31,7±2,7 26,8

Неочищений ФПбич_КАС 31,2±2,9 31,7 25,0±2,1 36,2

Контроль 45,7±4,0 -- 39,2±3,1 --

З допомогою одержаних препаратів ФП здійснено перенос стану ГСТ інтактним морським свинкам, що підтверджується шкірними пробами на розрізнюючу дозу антигену, що був застосований для сенсибілізації. В дослідах in vitro з використанням реакції гальмування міграції лейкоцитів/макрофагів, яка добре корелює з реактивністю гіперчутливості сповільненого типу in vivo, препарати ФП виявили активність в гомологічній та гетерологічній системах (клітини різних видів тварин), отже мають універсальну міжвидову дію. Досліджувані препарати володіють антигенспецифічними властивостями, оскільки здатні антигенспецифічно гальмувати міграцію лейкоцитів/макрофагів сенсибілізованих тварин (табл. 1).

Згідно даних електрофорезу в поліакріламіднному гелі хроматографічно очищені досліджувані імуноактивні фракції препаратів ФП містять низькомолекулярні субстанції з молекулярною вагою до 14 кДа.

Амінокислотний аналіз препарату ФП виявив слідуючий склад: Asp:Thr:Ser:Glu:Gly:Ala:His:Orn у співвідношенні: 1:1:4:2:3:1:1:1. У зразку переважають серин, гліцин, глутамінова кислота. Їх присутність, враховуючи умови гідролізу (гідроліз зразка проводили в умовах, при яких серин та треонін руйнуються), вказує на значно більший вміст цих амінокислот у даному зразку, або ж це може свідчити про певний стабілізуючий вплив з боку інших сполук на збереження даних амінокислот при гідролізі.

Одержаний нами УФ-спектр досліджуваного зразка виявився типовим для сполук, в яких присутні гетероциклічні основи. При дослідженні препаратів ФП до ряду вірусних та грибкових агентів (за даними інших дослідників) встановлено, що фактор переносу - це олігорибонуклеопротеід, його гіпотетична молекула містить пептидний ланцюг з 8-12 амінокислот та кілька рибонуклеотидів [Qi H.Y., et al., 1992; Kirkpatrick C.H., 1993; Fudenberg H.H., et al., 1994]. В досліджуваному нами зразку за даними орцинової реакції присутня рибоза, яка, звичайно, може бути зв'язаною у складі рибонуклеотиду.

Одержані дані дають змогу висловити деякі припущення щодо особливості структури субстанції ФП. Вона є нейтральною (не несе заряду) при рН 6,5, тому, можливо, фосфатні групи рибонуклеотидів врівноважені в даній молекулі позитивним зарядом (основними залишками амінокислот). При рН 1,9 дана молекула також не несе заряду, що дуже важливо, оскільки фосфати від'ємно заряджені, а при рН 1,9 гістидин та орнітин несуть позитивний заряд, тоді в ній не більше 2 фосфатних груп, аспарагін та глутамін знаходяться у вигляді амідів. Дана субстанція не фарбується нінгідрином, отже, N-кінцева аміногрупа заблокована. З літературних джерел відомо, що через N-кінець в даній молекулі відбувається зв'язування нуклеотидної частини [Fudenberg H.H., et al., 1994]. Тому на підставі наших експериментальних даних можна припустити, що досліджувана субстанція ФП містить як найменьше 2 нуклеотиди та пептидну частину, яка складається з 7-14 амінокислотних залишків, і має молекулярну вагу до 3,5 кДа.

В даній роботі проведена оцінка фармакологічних властивостей одержаних нами препаратів ФП: їх мутагенні властивості в тесті Еймса Salmonella/мікросоми [Maron D.M., et al., 1983] алергенність, токсичність, пірогенність, нешкідливість. Встановлено, що ні власне досліджувані препарати ФП, ні їх метаболіти, утворені in vitro в модельній системі, що імітує ферментативні процеси в клітинах теплокровних тварин, не виявили мутагенних властивостей в інтервалі доз 0,5 - 1 МО. Проведені тести підтвердили стерильність препаратів ФП. На протязі часу спостереження у тварин не відзначали запальних (пірогенних) та алергічних реакцій в місці введення препаратів, падіння маси тіла, зміни загальної реактивності. Досліджувані зразки не викликали ознак інтоксикації у експериментальних тварин. Патоморфологічні дослідження тканин в місці введення препаратів та внутрішніх органів даних тварин не виявили патологічних змін, окрім незначної інфільтрації лейкоцитами в місці ін'єкції.

Дослідження механізмів дії фактора переносу за умови радіаційного впливу.

Оскільки ФП сприяє виживанню опромінених тварин в дозах, що супроводжуються проявом пострадіаційного кістково-мозкового синдрому, головним чином протягом перших 2 тижнів з часу променевого ураження, можна передбачити, що його дія пов'язана з впливом на імунокомпетентні клітини та їх попередники завдяки наявності комплексу гемо- та імунорегулюючих властивостей, дослідженню яких були присвячені наступні розділи даної роботи. Для пояснення властивості ФП послаблювати променеве ураження нам довелося більш детально зупинитися на аналізі його впливу на різні складові імунної відповіді в опроміненому організмі.

Методом селезіночних колоній нами встановлено, що препарати ФП сприяють відновленню гемопоезу опромінених тварин. Введення мишам ліній СВА та С57Bl препаратів ФП за 1-14 діб до опромінення в сублетальній дозі (6 Гр) та через 4 та 24 год після опромінення призводило до значної стимуляції утворення ендогенних колоній в селезінці. Найбільшу кількість колоній отримано при введенні ФП через добу після опромінення. Слід відмітити дозозалежний характер стимуляції ендоколонієутворення.

Для пояснення можливого механізму протипроменевої дії даних препаратів і визначення мішеней їх дії були проведені експерименти, в яких клітини кісткового мозку попередньо перед введенням летально опроміненим реципієнтам (8,3 Гр) in vitro обробляли препаратами ФП. Виявлено вірогідне збільшення кількості утворених екзогенних колоній в селезінці у порівнянні з контрольними тваринами. Кількість екзоколоній вірогідно збільшувалась із збільшенням концентрації препаратів ФП, що використовувались для обробки in vitro сингенних клітин кісткового мозку.

На підставі одержаних даних нами був зроблений висновок про те, що захисна дія ФП може бути зумовлена як його власними гемопоетичними ефектами, чи, що більш ймовірно, індукцією ним синтезу ендогенних лімфокінів, оскільки, як відомо, лімфокіни можуть послабляти пошкоджуючу дію іонізуючого випромінювання на популяцію стовбурових кровотворних клітин, збільшуючи вихід колоній з опроміненого кісткового мозку [Рождественский Л.М., 1997]. Можливо, колонієстимулюючі ефекти ФП зумовлені його впливом на продукцію колонієстимулюючих факторів та ІЛ-3, оскільки саме ці цитокіни є поліпотентними гемопоетичними факторами, що забезпечують ріст кістковомозкових попередників [Ярилин А.А., 1997, Несмеянов В.Я., 1997].

За умови опромінення відбувається загибель лімфоцитів, зниження функціональної активності клітин, що вижили, та досить повільне її відновлення, що скоріше пов'язане не з "одужанням" лімфоцитів, а з їх заміщенням новоутвореними клітинами [Ярилин А.А., 1997].

При дії ФП спостерігалась стимуляція проліферації спленоцитів щурів лінії Вістар, тотально опромінених в дозах 0,5 Гр та 1 Гр. Функціональну активність клітин визначали через 6 та 12 год після опромінення. Відомо, що опромінення в даних дозах призводить до змін у проліферативній відповіді лімфоцитів за рахунок структурних і функціональних порушень у самих клітинах, розбалансування чутливості лімфоцитів до мітогенів. Реалізація цих ефектів здійснюється протягом доби з часу опромінення [Нальовіна О.Є., та ін., 1998; Остапченко Л.І., та ін., 1998]. Нами встановлено, що індекси стимуляції включення міченої тритієм тимідинової мітки залежали від часу введення препаратів ФП після опромінення. Одержані результати можуть бути одним із аргументів на користь реабілітуючої дії ФП за умови опромінення (рис. 3).

Рис. 3 Включення [3Н]-тимідину в ДНК лімфоцитів селезінки опромінених щурів лінії Вістар в присутності фактора переносу імунної реактивності (спленоцити отримано через 6 (а, в) та 12 год (б, г) після опромінення).

З метою встановлення клітинних мішеней дії ФП вивчали бласттрансформацію спленоцитів інтактних щурів під впливом ЛПС та ФГА як стандартних мітогенів, мішені дії яких добре відомі, а також під впливом ФП в комбінації з ЛПС або ФГА. Було висунуто припущення, якщо за рахунок сумісної дії стандартного мітогену та досліджуваного препарату індекс стимуляції знижується, порівняно з відповіддю на стандартний мітоген, то це вказує на те, що дані субстанції мають аналогічну мішень дії, адже їх сумісна дія швидко виснажує клітинну популяцію, на яку вони діють, викликаючи її проліферацію. Будучи активованими, клітини даної популяції стають несприйнятливими до впливу цих мітогенів. І, навпаки, якщо за рахунок сумісної дії стандартного мітогену та досліджуваного препарату індекс стимуляції зростає, порівняно з відповіддю на стандартний мітоген, то це свідчить про те, що клітини-мішені для дії даних субстанцій різні.

Одержані нами дані свідчать про те, що ФП, очевидно, виступає мітогеном для Т-клітин, на що також вказує суттєве зменшення індексу стимуляції (ІС) при сумісній дії ФП та ФГА (3278 ± 250 імп/хвґпробу, ІС=1,94), та стимуляція бласттрансформації при сумісному застосуванні ЛПС з ФП (9060 ± 230 імп/хвґпробу, ІС=5,35), порівняно з дією мітогенів та ФП у тих же дозах окремо. Отже, встановлені Т-мітогенні ефекти ФП на спленоцити опромінених тварин. Безумовно, такий активуючий вплив ФП повинен позначитися на секреції регуляторних цитокінів опроміненими імунокомпетентними клітинами. Вважається, що за умов дії іонізуючого випромінювання в дозах до 2 Гр зміна регуляторних подій в діяльності імунної системи є визначальною [Ярилин А.А., 1988; Ярилин А.А., 1997]. Та, нажаль, остаточно не узгоджено, як змінюється секреція основних регуляторних цитокінів за умов опромінення. Одержані нами дані свідчать, що за умови опромінення в дозах 1 та 2 Гр відбуваються зміні рівня секреції ключових цитокінів, отже відбувається розбалансування імунорегуляторних процесів (рис. 4). Введення препартів ФП ініціює каскад активаційних подій – стимуляцію секреції регуляторних цитокінів – ФНП, ІФН, ІЛ-1, ІЛ-2 (рис. 4). Важко встановити, на продукцію якого з цих цитокінів цей вплив є безпосереднім, а на які ця дія є опосередкованою, адже йдеться про цитокінову сітку, в якій цитокіни регулюють влаcну продукцію, впливають на продукцію інших цитокінів (стимулюють чи пригнічують її) та викликають каскадну активацію відповідних імунокомпетентних клітин. Виходячи з одержаних даних, можна передбачити, що ряд ефектів ФП збігається з ефектами інших цитокінів, що можна пояснити властивістю цитокінів, як зазначають деякі дослідники [Ярилин А.А., 1997; Несмеянов В.Я., 1997], бути плейотропними, їх здатністю перекривати власні ефекти завдяки існуванню спільних клітин-мішеней їх дії та стандартності відповіді клітин на різноманітні стимули, існуванню обмеженої кількості рецепторів для дії цитокінів та за наявності спільних компонентів на шляху передачі сигналів від рецептора до клітини.

Активна участь клітин моноцитарно-макрофагального ряду у дозріванні та постпроменевому виживанні лімфоцитів є додатковими факторами, які модифікують і частково підтримують життєздатність та збереження функцій Т- і В-лімфоцитів [Комиссаренко С.В., и др., 1994]. Літературні дані є дуже суперечливими щодо характеру фагоцитарної та бактерицидної активності фагоцитуючих клітин при різному дозовому навантаженні. Вважається, що за умов опромінення в дозах до 2 Гр відбувається неспецифічна стимуляція фагоцитарної активності клітин [Ярилин А.А., 1997; Жербин Е.А., и др., 1989], через добу після опромінення в дозі 2 Гр спостерігається пригнічення функціональної активності фагоцитуючих клітин. За даних умов нами встановлено ефект стимуляції фагоцитарної активності нейтрофілів периферійної крові та перитонеальних макрофагів інтактних та опромінених в дозі 2 Гр тварин препаратами ФП. Така стимуляція не залежала від використаного об'єкту фагоцитозу (еритроцитів барана, корпускул стафілококу, дріжджів), але не досягала рівня інтактного неопроміненого контролю (знаходилась в межах 75-80% контрольного рівня). Даний ефект зберігався в культурі перитонеальних макрофагів до 3 діб. Пік активації спостерігався вже через 2 год культивування макрофагів in vitro. Подібні зміни були виявлені і при вивченні бактерицидної активності нейтрофілів периферійної крові інтактних чи опромінених тварин в дозі 2 Гр за умов застосування препаратів ФП.

Рис. 4 Продукція регуляторних цитокінів за умови застосування фактора переносу імунної реактивності.

Примітка. Індекси стимуляції розраховані відносно рівня секреції відповідних цитокінів інтактними тваринами. У випадку з ФНП контрольний рівень умовно прийнятий за 100%.

Радіаційне втручання у функціонування імунної системи пов'язане не тільки з ураженням певних типів клітин, які беруть участь в імунній відповіді, але й із зрушеннями у кооперативних процесах в під час розвитку імунної відповіді [Сахно Т.О., та ін., 1997; Ярилин А.А., 1997]. В роботі досліджували вплив ФП на кооперативну взаємодію лімфоцитів за умов розвитку імунної відповіді на Т-залежний антиген - еритроцити барана - з використанням методу радіаційних химер. Трансплантація клітин кісткового мозку та тимуса чітко виявила кооперативний характер взаємодії клітинних популяцій при розвитку гуморальної імунної відповіді. При введені суміші Т- та В-лімфоцитів в селезінці опромінених реципієнтів виявляється значно більше антитілоутворюючих клітин (АУК), ніж сумарна кількість АУК, що утворюються при окремому введенні Т- чи В-лімфоцитів. Введення сингенних клітин від тварин, яким попередньо вводили препарат ФПбич_КАС, значно стимулювало утворення АУК в селезінці опромінених тварин порівняно з введенням клітин від інтактних мишей. Найвищим індекс стимуляції виявився при введенні сингенних клітин кісткового мозку від тварин, яким попередньо вводили препарат ФП. Одночасне введення клітин від інтактних тварин з препаратом ФП летально опроміненим реципієнтам викликало найкращий ефект стимуляції антитілоутворення (ІС=2,8) (табл.2).

Таблиця 2

Вплив фактора переносу на окремі клітинні популяції та їх взаємодію при розвитку імунної відповіді на еритроцити барана

Група мишей (n=5-8) Схема досліду Кількість антитілоутворюючих клітин в селезінці на 5 добу після трансплантації (ґ104) Індекс стимуляції

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Т В Т+В То Во То+Во То+В Т+Во Т+В+ФП 3±0,1 5±0,2 25±0,6 7±0,2 26±0,7 51±1,4 24±0,5 35±0,7 70±1,1 1 (для Т-клітин) 1 (для В-клітин) 1 (для Т+В клітин) 2,33 5,20 2,04 0,96 1,40 2,80

Примітки:

1.Реципієнти всіх груп в день трансплантації одержували внутрівенно ЕБ в концентрації 108 клітин/мл.

2.То - тимоцити тварин, що одержували ФП.

3.Т - тимоцити інтактних тварин.

4.Во - клітини кісткового мозку тварин, що одержували ФП.

5.В - клітини кісткового мозку інтактних тварин.

Отже, передбачається, що вплив ФП на гуморальну імунну відповідь до еритроцитів барана у мишей зумовлений його дією на кооперацію Т- і В-клітин. Можна передбачити, що це відбувається через активацію диференціації В-клітин в плазматичні клітини, що синтезують антитіла.

Серед проявів функціональної дефективності опромінених лімфоцитів слід відзначити зниження їх здатності до кооперативної взаємодії та міграційних процесів через зміни, які відбуваються у рецепторному апараті клітин. Зважаючи на те, що променеве ураження в першу чергу призводить до порушень мембранних процесів, особливий інтерес викликають дослідження, що стосуються змін розеткоутворюючої здатності лімфоцитів після дії радіації, оскільки процес розеткоутворення безпосередньо пов'язаний з функціонуванням мембранних рецепторів. Виявлено, що у постпроменевому періоді відбувається втрата лімфоцитами специфічних рецепторів, даний ефект дозозалежний і підсилюється в часі [Нальовіна О.Є., та ін., 1997].

Препарати фактора переносу до різних антигенних субстанцій виявились здатними впливати на розеткоутворення лімфоцитів різних груп донорів (практично здорових, донорів з імунодефіцитними станами, що проживають на забруднених радіонуклідами внаслідок аварії на ЧАЕС територіях). Встановлено стимуляцію утворення Т-розеток (Е-розетки) та В-розеток (В-розетки з зимозаном). Показана імуномодулююча дія ФП, про що свідчить підвищення співвідношення Т-хелпери/Т-супресори на користь Т-хелперів з пригніченням Т-супресорів в тесті розеткоутворення з теофіліном у імунодефіцитних донорів.

Виходячи з численних експериментів, в яких була встановлено, що ФП володіє комплексом гемо- та імунокорегуючих властивостей, була зроблена спроба застосувати препарати ФП для модуляції імунодефіцитного стану, зумовленого дією іонізуючого випромінювання. У щурів лінії Вістар експериментально створювали стан стійкого радіаційно індукованого гіпотиреозу за рахунок введення радіойоду, що призводило до зниження рівня тиреоїдних гормонів та пригнічення функціональної активності спленоцитів щурів. Використання ксенотрансплантату органної культури щитовидної залози новонароджених поросят з метою відновлення нейроендокринних розладів призводило до зростання рівня тиреоїдних гормонів в сироватці тварин та функціональної активності спленоцитів щурів при відповіді на ФГА або препарати фактора переносу імунної реактивності. Зазначені мітогени активували включення [3H]-тимідину в ДНК спленоцитів опромінених щурів. Це вказує на імуномодулюючі властивості досліджуваних препаратів ФП, а також можливість їх застосування при імунодефіцитних станах, зумовлених опроміненням.

Фактор переносу володів імуностимулюючими ефектами у опромінених мишей. Так, у мишей лінії Balb/c індукували однократним опроміненням в дозі 4 Гр (потужність дози 50 Р/хв) розвиток вторинного імунодефіцитного стану. Препарати ФП вводили інтраперитонеально в дозі 1 МО на тварину через 2 місяці після опромінення, коли за даними імунологічних реакцій, що характеризують функціональний стан імунної системи та неспецифічної резистентності організму, були виявлені чіткі ознаки імунодефіцитного стану як наслідку дії опромінення. Спостерігалось поступове відновлення імунної реактивності опромінених тварин. Препарати ФП значно вплинули на проліферацію кістково-мозкових попередників клітин крові (за даними теста колонієутворюючих одиниць в селезінці), стимулюючи гемопоез. Препарати ФП сприяли відновленню клітинної, а також гуморальної імунної відповіді.

Відомо, що за умов радіаційно індукованого імунодефіцитного стану існує вірогідність високої сприйнятливості опромінених тварин до різноманітних інфекцій [Савцова З.Д., 1996]. Препарати ФП стимулювали антистафілококову резистентність у опромінених тварин (перенос ГСТ реактивності за даними шкірних проб, стимуляція фагоцитозу). Застосування специфічних стафілококових препаратів ФП сприяло виживанню опромінених тварин з експериментальною стафілококовою інфекцією.

ВИСНОВКИ

1.З метою дослідження дії фактора переносу за умов опромінення він був ізольований з лейкоцитів сенсибілізованих донорів та лімфоїдних органів сенсибілізованих тварин та хроматографічно очищений. За даними амінокислотного аналізу, УФ-спектрометрії та високовольтного форезу на папері субстанція ФП має молекулярну масу 3,5 кДа, містить як найменьше 2 нуклеотиди та пептидну частину з заблокованим N-кінцем, у складі якої переважають серин, гліцин, глутамінова кислота, не несе заряду при рН 6,5 та рН 1,9. Препарати здатні індукувати антигенспецифічну клітинну імунну відповідь у інтактних тварин, виявляють універсальну міжвидову дію. Досліджувані препарати, їх метаболіти, утворені in vitro, не виявили мутагенних властивостей, стерильні, не токсичні, не алергенні, апірогенні.

2.Вперше встановлено, що препарати фактора переносу імунної рективності здатні підвищувати виживаність опромінених мишей протягом 30 діб в діапазоні доз ЛД50/30-ЛД70/30 при їх застосуванні за добу чи через 24 год після опромінення..

3.Встановлено, що послаблення променевого ураження за умови застосування ФП полягає в його здатності стимулювати відновлювальні процеси в опроміненому організмі завдяки наявності комплексу гемо- та імунорегулюючих властивостей. Реалізація протипроменевих ефектів ФП обумовлена його власними гемопоетичними ефектами, ініціацією каскаду активаційних процесів - стимуляцією синтезу ендогенних регуляторних цитокінів – a-ФНП, ІФН, ІЛ-1, ІЛ-2, забезпеченням активації імунокомпетентних клітин, модифікацією їх рецепторних структур.

4.Виявлено ефект стимуляції фагоцитарної та бактерицидної активності нейтрофілів периферійної крові та перитонеальних макрофагів інтактних та опромінених в дозі до 2 Гр тварин препаратами ФП.

5.При опроміненні ФП має виражений імуностимулюючий вплив на клітинну та гуморальну імунну відповідь за рахунок Т-мітогенних властивостей, активації диференціації В-лімфоцитів в плазматичні клітини та сприяння кооперативній взаємодії клітин в процесі розвитку гуморальної імунної відповіді.

6.Застосування препаратів ФП в модельних системах радіаційно індукованого імунодефіцитного стану (гіпотиреоз та вторинний імунодефіцит) сприяло відновленню імунної реактивності опромінених тварин.

7.Препарати