МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

КРИМСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. С.І. ГЕОРГІЄВСЬКОГО

ФОМІНА КСЕНІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 591.444:591.147.6:616 – 092.4- 53

Морфогенез щитоподібної залози

при впливі на організм підвищеного рівня глюкокортикоїдів

та їх інгібітора на різних етапах постнатального онтогенеза

(анатомо-експериментальне дослідження)

14.03.01 – нормальна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Сімферополь – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Луганському державному медичному університеті, Міністерство охорони здоров’я України.

Науковий керівник:

Офіційні опоненти:

Провідна установа: |

заслужений діяч науки і техніки України, лауреат Державної премії України, доктор медичних наук, професор Ковешніков Володимир Георгійович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри анатомії людини.

заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Козлов Володимир Олексійович, Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри анатомії людини;

доктор медичних наук, професор Каширіна Надія Костянтинівна, Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського МОЗ України, професор кафедри гістології, цитології та ембріології.

Харківський державний медичний університет МОЗ України, кафедра анатомії людини.

Захист відбудеться “ 14 лютого 2007 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 52.600.02 при Кримському державному медичному університеті ім. С.І. Георгієвського (95006, Україна, АР Крим, м. Сімферополь, бульвар Леніна, 5/7).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського (95006, Україна, АР Крим, м. Сімферополь, бульвар Леніна, 5/7).

Автореферат розісланий “ 12 ” січня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Г.О. Мороз

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Щитоподібна залоза – найважливіша периферійна ланка серед ендокринних органів людини та хребетних тварин, яка чутливо реагує на зміни гормональної рівноваги організму та має виражену спроможність до морфофункціональних перебудов під впливом різноманітних ендогенних і екзогенних чинників (Я.І. Федонюк, 1997; В.Б. Шадлінський, 1999; М.П. Загородній, І.В. Пилипець, 2002). Численність органів і систем, що реагують на тиреоїдні гормони, включає проблеми тиреоїдології в сферу інтересів представників самих різних медичних дисциплін (М.Е. Бронштейн, В.І. Кандрор, 1999; Ю.І. Караченцев, 2001; С.Т. Зубкова, 2004; М.І. Балаболкін, 2005). Чимало робіт присвячено вивченню цього органу при впливі на організм фармакологічних препаратів, здатних посилити (Т.І. Віхрук, О.С. Бєрєснєва, 2000; І.В. Качур, 2003; В.Г. Ковешніков, О.С. Болгова, 2004; О.Я. Ткаченко, 2005), або послабити активність щитоподібної залози, а відповідно, і процеси синтезу та секреції тиреоїдних гормонів (Б.Г. Салтанов, О.Д. Сідорова, 1998; В.Г. Ковешніков, В.А. Пастухова, 2002). Відомо, що глюкокортикоїди, які володіють потужним та різноманітним регуляторним впливом, проявляють виражені антітиреоїдні властивості (Н.Т. Старкова, 2002; В.Г. Климовицький із співав., 2005).

Дисбаланс гормонів порушує стан здоров’я, тому будь-які плодотворні пошуки ефективних коректорів виникаючих при цьому дисбалансі станів мають не тільки теоретичне, але і велике практичне значення. Бісфосфонати являють собою цілий клас потенційних терапевтичних ліків для лікування різних захворювань кісток і м’яких тканин, які супроводжуються порушенням обміну кальцію (R.E. Marx, 2003; S.L. Ruggiero et al., 2004; I.R. Reid, S. Papapoulos, 2005), а також проявляють тиреоактивуючу дію (Л.Є. Зіганшина із співав., 2002).

Незважаючи на велику кількість клінічних спостережень, комплексних анатомо-експериментальних досліджень морфогенезу щитоподібної залози в умовах впливу на організм підвищеного рівня глюкокортикоїдів та бісфосфонатів не проводилося, існуючі відомості літератури мізерні та суперечні, що і обґрунтовує актуальність даного дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану наукових досліджень Луганського державного медичного університету і є складовою частиною науково-дослідної теми кафедри анатомії людини “Особливості морфогенезу кісткової, імунної та ендокринної систем під впливом екологічних чинників”, номер державної реєстрації 0103U006652.

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження стало виявлення в експерименті на щурах різного віку морфофункціональних особливостей будови щитоподібної залози при впливі на організм підвищеного рівня глюкокортикоїдів, бісфосфоната “Зомета” окремо та при їх комбінованому впливі. Для досягнення зазначеної мети поставлені наступні задачі:

1. Вивчити на органному, гістологічному та ультрамікроскопічному рівнях особливості будови щитоподібної залози щурів статевонезрілого, репродуктивного та старечого віку, підпадавших під вплив гідрокортизону з різною тривалістю.

2. Виявити особливості будови щитоподібної залози на всіх рівнях організації при впливі на організм тварин дексаметазону.

3. Вивчити морфофункціональні особливості будови щитоподібної залози піддослідних тварин при впливі бісфосфоната “Зомета” на різних етапах постнатального онтогенезу.

4. Встановити можливості бісфосфоната “Зомета” в якості коректора негативного впливу на щитоподібну залозу підвищеного рівня гідрокортизону.

Об'єкт дослідження: особливості морфогенезу ендокринних органів під впливом різноманітних ендогенних чинників.

Предмет дослідження: морфофункціональний стан щитоподібної залози щурів при впливі на їх організм гідрокортизону, дексаметазону та бісфосфоната “Зомета” на різних етапах постнатального онтогенезу.

Методи дослідження: органометрія – для вивчення морфологічних змін щитоподібної залози на органному рівні; світлооптична мікроскопія – для вивчення структури органу на тканинному рівні; гістоморфометрія – для вивчення змін морфометричних показників щитоподібної залози на клітинному рівні; електронномікроскопічне дослідження – для вивчення структур органу на субклітинному рівні; імуноферментний аналіз крові – для визначення рівня тиреоїдних гормонів; варіаційно-статистичний аналіз – для визначення вірогідності отриманих результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше на великому експериментальному матеріалі виявлені морфофункціональні зміни щитоподібної залози щурів різних вікових періодів під впливом на їх організм глюкокортикоїдів та бісфосфонату. Виразність і спрямованість цих змін залежала від віку тварин, виду, хімічного складу та дози препаратів і тривалості експерименту. Вперше досліджена динаміка змін ультрамікроскопічної структури щитоподібної залози щурів після введення гідрокортизону, дексаметазону та бісфосфоната “Зомета”. Доказана цілісообразність використання бісфосфоната з метою корекції негативного впливу на організм підвищеного рівня гідрокортизону.

Практичне значення отриманих результатів. В результаті даного дослідження були одержані свідчення про морфофункціональні зміни щитоподібної залози при тривалому впливі на організм підвищеного рівня глюкокортикоїдів та бісфосфонату в різні вікові періоди. Отримані дані значно поширюють сучасну уяву про вплив глюкокортикоїдів безпосередньо на щитоподібну залозу та поглиблюють можливості застосування препаратів нового покоління – бісфосфонатів, а саме, золедронату. Доказана ефективність використання золедронату як коректора морфофункціональних змін в щитоподібній залозі на всіх етапах постнатального онтогенезу при впливі на організм підвищеного рівня гідрокортизону. Дана робота може бути основою для подальших клінічних досліджень, розробки нових методів профілактики і лікування захворювань щитоподібної залози.

Основні положення та висновки дисертаційної роботи впроваджено в навчальний процес і науково-дослідну роботу кафедр нормальної анатомії людини Тернопільського, Буковинського, Донецького, Харківського державних медичних університетів, Вінницького та Львівського національних медичних університетів, Дніпропетровської державної медичної академії та Української медичної стоматологічної академії, а також кафедри нормальної анатомії з топографічною анатомією та оперативною хірургією Сумського державного університету та кафедри анатомії людини і гістології Ужгородського національного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором проаналізована вітчизняна та іноземна література за темою дисертаційної роботи. Самостійно проведено забір матеріалу від контрольних та піддослідних тварин для подальших морфологічних досліджень та кров із клубових судин для визначення змісту тиреоїдних гормонів в плазмі крові. Автор особисто визначав масу та об’єм щитоподібної залози і проводив аналіз отриманих даних на органному рівні. Для виготовлення гістологічних препаратів була удосконалена методика гістологічної обробки щитоподібної залози. Автором самостійно проведено комп’ютерний морфометричний аналіз гістологічних зрізів, статистична обробка отриманих результатів та їх узагальнення. Ультрамікроскопічне дослідження проводили спільно із співпрацівниками лабораторії електронної мікроскопії Харківського НДІ радіології ім. С.П. Григор’єва. Зміни на електронограмах будови щитоподібної залози в умовах експерименту описані автором самостійно. Інтерпретація отриманих результатів, основні положення та висновки дисертаційної роботи належать авторові.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися і обговорювалися на ІІ Міжрегіональній конференції молодих вчених „Актуальні питання біології та медицини” (Луганськ, 2005); Міжнародному конгресі „What is new in Bisphosphonates?” (Davos, Switzerland, 2006); II Всеукраїнській науково-практичній конференції „Актуальні проблеми біомінералогії” (Луганськ, 2006); засіданні Луганського обласного товариства анатомів, гістологів і топографоанатомів (Луганськ, 2006); IV Національному конгресі АГЕТ України (Сімферополь, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових праць у наукових фахових виданнях, затверджених ВАК України, з них 8 –одноосібно.

Структура та обсяг дисертації. Матеріали дисертаційної роботи викладено на 277 сторінках друкованого тексту. Робота включає розділи: вступ, огляд літератури, матеріал та методи дослідження, результати дослідження, аналіз та узагальнення результатів дослідження, висновки, практичні рекомендації, перелік використаних джерел літератури, який містить 318 найменувань: 236 – вітчизняних та 82 – іноземних. Дисертаційна робота ілюстрована 38 таблицями та 115 малюнками: 17 діаграм, 54 мікрофотографій та 44 електронограми (займають 79 сторінок).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. Експериментальне дослідження проведено на 372 білих щурах-самцях, розподілених в залежності від віку на три серії: статевонезрілі (5 тижнів від народження з початковою вагою 50-55 г), статевозрілі (2,5 місяців – 130-150 г) та щури періоду старечих змін (11 місяців – 290-310 г). Проведення експерименту здійснювалося відповідно до правил робіт з лабораторними тваринами (І.П. Западнюк із співав., 1983) та правил Європейської конвенції захисту хребетних тварин (Council of Europe, 1986), що підтверджено Комісією з біоетики Луганського державного медичного університету (протокол №6 від 26.04.2006).

Тварини кожної серії розподілялися на групи в залежності від впливу та тривалості експерименту. Першу (контрольну) групу склали інтактні щури. Тварини другої групи отримували гідрокортизона ацетат у вигляді стандартної ампульованої 2,5% суспензії (серія №1720403 виробництва ВАТ „Фармак”, м. Київ, реєстраційний номер Р № UA/3288/01/01). Препарат вводився щоденно внутрішньом'язово в дозі 21 мг. Третю групу склали щури статевозрілого віку, які отримували ампульований 0,4% розчин дексаметазону гемісукцінату (виробництва KRKA: VO2323 D, Словенія). Препарат вводився щоденно внутрішньом'язово в дозі 1,07 мг. Оскільки в клінічній практиці найчастіше призначається преднізолон, то перерахування від лікарських форм глюкокортикоїдів до призначених ін'єкцій проведено згідно з рекомендацією Європейського симпозіуму по глюкортикоїдній терапії, що затвердила “преднізоновий еквівалент”: 7,5 мг преднізолону (преднізону) по хімічній активності відповідає 21 мг гідрокортизону та 1,07 мг дексаметазону (F. Buttegerit, 2002). Щури четвертої групи отримували бісфосфонат п’ятого покоління – золедронат – ліофілізат золедронової кислоти (“Зомета”, виробництва Novartis Pharma AG, Basel, Switzerland, реєстраційний номер в Україні № Р.06.01./03.164, серійний номер 993 931.4-983/20 es). Препарат вводився внутрішньоочеревинно один раз на місяць у дозі 0,362 мг/кг, відповідно константі біологічної активності (Ю.Р. Риболовлєв, Р.С. Риболовлєв, 1979). Щурам п’ятої групи вводили сумісно два препарата – гідрокортизон та “Зомета”.

Тварин виводили із експерименту на 7, 15, 30 та 90 добу дослідження шляхом декапітації під ефірним наркозом. Ми виділили строк “30+60 днів” як період реадаптації, в якому із 90 діб експерименту тільки 30 днів щури отримували лікарські препарати. Щитоподібну залозу виділяли разом з трахеогортанним комплексом, відпрепаровували (Н.К. Каширіна, 1987), визначали масу залози, зважуючи виділені її частки на лабораторних вагах ВЛР – 200 з точністю до 0,25 мг, та об’єм за допомогою пристрою для вимірювання об’єму невеликих біологічних об’єктів (В.В. Овчаренко, 2004).

Після фіксації матеріал промивали в проточній воді протягом 1 години. Проводку та виготовлення парафінових блоків здійснювали за модифікованою автором методикою (К.О. Фоміна, В.В. Овчаренко, 2005) шляхом прискореного виготовлення гістологічних зрізів під впливом ультразвукового озву-чен-ня. Після цього препарати заливали в суміш (парафін + віск + стеаринова кислота). На санному мікротомі виготовляли серійні гістологічні зрізи товщиною 3-4 мкм, за-барвлювали гематоксилін-еозином та поміщали в канадський бальзам. Мікро-морфометричне дослідження щитоподібної залози проводили на комп’ютерному морфометричному комплексі, до складу якого входять: мікроскоп Olympus BX-41, цифровий фотоапарат Olympus C5050Z з п’ятимегапіксельною матрицею та персональний комп’ютер Athlon XP 2200+ Mh, DDR RAM 512 mB, HDD 128 Gb, video: GeForce FX5200 128Mb. Гістологічні зрізи вивчали на світлооптичному рівні і проводили аналіз цифрових даних за допомогою комп’ютерної програми для морфометричних досліджень „Morрholog” (В.В. Овчаренко, В.В. Маврич, 2004). Визначались наступні параметри: більший та менший діаметри фолікулів, їх площа та площа колоїда, висота і площа фолікулярного епітелію, кількість тироцитів у фолікулі, більший та менший радіуси, площа та периметр ядер тироцитів. Морфометричні дані експортувалися в програму Excel для подальшої статистичної обробки та зберігання, достовірною вважалась ймовірна похибка менш 5% (р<0,05). Також визначали індекси активності щитоподібної залози: фолікулярно-колоїдний (ФКІ); індекс накопичення колоїду (ІНК); ядерно-цитоплазматичний індекс (ЯЦІ) (О.К. Хмельницький, М.С. Третьякова, 1998).

Для електронномікроскопічного дослідження шматочки щитоподібної залози першої та другої серій щурів розміром 1 мм3 спочатку фіксували у 2,5% розчині глютарового альдегіду на 0,1М фосфатному буфері рН 7,2, а далі у 1% осмієвому фіксаторі по Паладе. Після дегідратації у етанолі зростаючої концентрації та абсолютному ацетоні матеріал заливали у суміш епоксидних смол (епон-аралдит). Ультратонкі зрізи отримували на ультрамікротомі УМТП-4 Сумського виробничого обєднання “Електрон” (Україна), контрастували у розчині уранілацетату і цитраті свинця по Рейнольдсу та переглядали у електронному мікроскопі ЕМ-125 того ж виробничого обєднання. Досліджений матеріал документували у виді негативних та позитивних фотознімків.

Проби крові забиралися у тварин перед забоєм з клубових судин. Отримана кров одразу центрифугувалася з додаванням гепарину на центрифузі протягом 15 хвилин зі швидкістю 1500 обертів/хв. Одержана плазма поміщалася в стерильні мікропробірки й негайно транспортувалася в лабораторію П.К. Бойченко, де визначалися загальний рівень трийодтироніну та тироксину за допомогою тесту “HUMAN ELISA” методом твердофазного імуноферментного аналізу, як одного із самих надійних і зручних скрінінгових тестів (В.М. Славнов, В.О. Олейник, 1999; M. Laurence et al, 2004)

Результати дослідження та їх аналіз. При впливі на організм щурів різного віку підвищеного рівня глюкокортикоїдів визначено ряд змін в будові щитоподібної залози, які спостерігаються на всіх рівнях її структурної організації. Аналізуючи дані органометрії ми встановили, що маса і об'єм органу не досягають контрольних показників впродовж усіх строків спостереження. При цьому у статевонезрілих тварин відхилення найбільш виразні: на 11,55% – 22,83% (р<0,05). У статевозрілих щурів і щурів періоду старечих змін спостерігається аналогічна динаміка: показники нижчі за контроль на 3,90% – 16,06% (р<0,05) і 7,71% – 17,40% (р<0,05) після введення нативного препарату та на 1,46% – 13,39% (р<0,05) після введення синтетичного аналогу. По закінченні періоду реадаптації дані органометрії наближаються до контрольних показників у щурів всіх вікових періодів.

При мікроскопічному дослідженні щитоподібної залози щурів різних вікових періодів, що піддавалися дії глюкокортикоїдів, протягом всіх строків спостереження визначається поліморфізм критеріїв гістофункціонального стану органу з переважанням ознак його гіпофункції. Порівняно з інтактними тваринами, у піддослідних щурів паренхіма органу пізніше диференціюється на часточки. Функціональний стан часточок в різних зонах залози нерівнозначний. З часом спостереження збільшується кількість часточок за рахунок розростання сполучно-тканинних прошарок. Присутні дисциркуляторні розлади. Виявлена топографічна гетерогенність фолікулів. Так, дрібні і середні фолікули локалізуються в центральних відділах залози, проте, вони крупніші, ніж на препаратах контрольної групи. У великих фолікулах, розташованих переважно субкапсулярно, спостерігається розрив їх стінок, вилив колоїду в міжфолікулярний простір, в якому зустрічаються так звані колоїдні “озера”. Звертають на себе увагу ділянки редукції фолікулів, і поява компактно розташованих здавлених фолікулів щілиноподібної форми. Деякі фолікули деформуються, зливаються і містять десквамовані тироцити. А, як відомо, десквамація епітелію щитоподібної залози – один з найважливіших морфологічних показників функціональної напруги органу (О.В. Волкова, М.І. Пекарський, 1976).

Більший та менший діаметри фолікулів у статевонезрілих тварин більше контрольних значень на 6,73% – 11,85% (р<0,05), а у статевозрілих – на 6,70% – 13,92% (р<0,05) після введення гідрокортизону та на 0,71% – 11,84% після введення дексаметазону. Порівняно з молодими і зрілими особинами, що одержували гідрокортизон, а також з інтактними щурами, у старих тварин фолікули значно збільшені в розмірах. Так, більший і менший діаметри фолікулів перевищують контрольні показники на 6,82% – 23,22% (р<0,01) з часом спостереження.

У динаміці такого показника, як площа фолікулів, достовірних відхилень виявлено не було. Чимало фолікулів перерозтягнено колоїдними масами яскраво-рожевого кольору, переважно розтрісканого вигляду, що наказує на те, що процеси колоїдонакопичення в тканині залози значно переважають над процесами колоїдовиведення. На фоні збільшення діаметрів фолікулів посилене накопичення і різка конденсація колоїду свідчать про те, що відбувається порушення секреторного циклу з відставанням фази виведення (В.Б. Шадлинський, С.М. Рустамова, 1998). У свою чергу застій колоїду нерідко супроводжується сплощенням і атрофією розтягнутих оточуючих фолікулів. У тварин, що піддавалися дії гідрокортизону, площа колоїду перевищує контрольні значення на 11,37% (р<0,05) – 40,38% (р<0,001) за всі періоди спостереження. Індекс накопичення колоїду залежно від тривалості дії препарату наростає від 3,81 (у статевонезрілих особин – на 7 добу спостереження) до 9,24 (у старих щурів – на 90 добу спостереження). У статевозрілих щурів, які піддавалися впливу дексаметазону, площа колоїду вище контролю на 4,12% 13,65% (р<0,01), а ІНК знаходиться у межах 3,93 – 4,07, що указує на те, що застосування дексаметазону приводить до менш виразних змін з боку щитоподібної залози.

Тиреоїдний епітелій темно-клітинний, переважно кубічний, а в окремих ділянках навіть плоский, що також свідчить про зниження функціонального стану щитоподібної залози. Площа і висота фолікулярного епітелію у щурів різного віку після дії гідрокортизону нижчі за контрольні значення на 4,39% – 14,33% (р<0,001), 8,89% – 21,83% (р<0,001) та на 13,38% (р<0,05) – 24,33% (р<0,01), відповідно. Фолікулярно-колоїдний індекс з часом спостереження знижується від 1,9 до 0,52, що свідчить про напружену функціональну активність щитоподібної залози, яка посилюється в міру дорослішання тварин. У щурів репродуктивного віку, які отримували дексаметазон, зареєстровано зменшення висоти тиреоїдного епітелію на 10,00% (р<0,05) – 13,06% (р<0,01). Середня кількість тироцитів у фолікулярному вистиланні збільшується унаслідок безперервного зростання фолікулів. Ядра в них значно зменшуються в розмірах і ущільнюються, нерідко орієнтовані паралельно базальній мембрані. Серед тварин всіх вікових періодів більший радіус ядер нижчий за контрольні значення на 5,56% – 25,91% (р<0,01), менший радіус ядер – нижче на 14,05% (р<0,01) – 26,83% (р<0,01), площа ядер – на 12,43% (р<0,05) – 27,69% (р<0,001), периметр ядер – нижче за контроль на 8,11% – 26,16% (р<0,001). Виразність відхилень залежить не тільки від виду та тривалості дії препаратів, але і від віку тварин – в міру старіння функціональна значущість ядер значно знижується. З часом спостереження зменшується ЯЦІ. Подібні ознаки свідчать про пригнічення як секреторних, так і синтетичних процесів (К. Ташке, 1980).

У разі припинення введення глюкокортикоїдів тваринам з 30 доби, на 90 день спостереження щитоподібна залоза має мікроструктуру, подібну такій у інтактних щурів на даному строкові спостереження з урахуванням їх віку. При цьому відновлення морфофунціонального стану органа реалізується більш ефективно у щурів, які отримували дексаметазон. Фолікули переважно округлої форми, вислані кубічним, темно-клітинним епітелієм і заповнені рідким, блідо-забарвленим колоїдом. Фолікули з ознаками порушення структурно-функціонального стану представлені у малій кількості. У динаміці морфометричних параметрів достовірних відхилень не було виявлено, їх наближення до контрольних значень свідчить на користь високої тканинної регенерації органу.

На ультрамікроскопічному рівні організації щитоподібної залози щурів, що піддавалися дії глюкокортикоїдів, зареєстрована поліморфна картина. Стінка багатьох фолікулів складена з різних тироцитів: типових, “ажурних” і зруйнованих, з різним ступенем функціональної активності. Присутні ознаки виснаження функціональної активності тиреоїдного епітелію і посилення деструктивних і десквамативних процесів в тироцитах, прогресуючі з часом спостереження. Так, стінку одного фолікула, крім типових, можуть утворювати “ажурні” тироцити. Вони мають темні ядра неправильної форми, з розширеним перинуклеарним простіром, функціонально напружені і виснажені мітохондрії, значно збільшені профілі гранулярної ендоплазматичної сітки, які містять велику кількість тироглобуліну. Іноді в порожнині фолікула виявляються залишки колоїду, що містять уламки тироцитів: пікнотичні ядра, зруйновані органели. У тканині залози більше, ніж звично, з'являється тироцитів низькопризматичної форми. Апікальна поверхня тироцитів плоска, а плазматична мембрана практично позбавлена мікроворсинок. Ядра таких клітин витягуються паралельно порожнині фолікула. Базальна мембрана потовщена і позбавлена складок. У розширеному міжфолікулярному просторі зареєстровані складові сполучної тканини: товсті пучки колагенових волокон, розташовані в подовжньому і поперечному перетинах, які створюють своєрідну опору для фолікулів, огрядні клітини з темними невеликими ядрами і характерними крупними гранулами, а також лімфоцити. Парафолікулярні клітини та інтерфолікулярні острівці зустрічаються рідше, ніж на електронограмах щитоподібної залози інтактних щурів, що відбувається в умовах ослаблення функціональної активності щитоподібної залози.

Виявлені зміни є морфологічним виразом різкого зниження продукції і виведення тиреоїдних гормонів (М.П. Горбунова,1981), що підтверджує наші дані про вміст тироксину і трийодтироніну в плазмі крові, одержані методом імуноферментного аналізу. Коливання концентрації тиреоїдних гормонів в крові щурів різних вікових періодів, що одержували гідрокортизон, нижчі за контрольні значення впродовж всіх строків спостереження: трийодтироніна на 3,64% – 24,32% (р<0,05) та тироксина на 2,50% – 14,43%. У статевозрілих щурів, які отримували дексаметазон, зареєстровано менш виразні зміни: Т3 на 3,28% – 20,41% (р<0,05) та Т4 – на 0,51% – 3,63%. Оскільки істинним гормоном щитоподібної залози є трийодтиронін, який в 5-6 разів перевершує тироксин по активності і в 2-3 рази по швидкості кругообігу (Б.В. Альошин, В.І. Губський, 1983), тому відносний зсув спектру гормонів у бік менш активної форми – Т4 обумовлено, найімовірніше, глибокими порушеннями обміну речовин, одним з проявів якого є уповільнення швидкості елімінації тиреоїдних гормонів в кров'яне русло (Н.С. Хоч із співав., 1994). Зниження вмісту в крові трийодтироніна без зменшення рівня тироксина доводить, що глюкокортикоїди уповільнюють перетворення Т4 в Т3 (Н.Т. Старкова, 1983).

У даній роботі був вивчений морфогенез щитоподібної залози при дії на організм тварин різних вікових періодів бісфосфоната “Зомета”. Детально проаналізувавши одержані дані на всіх рівнях організації досліджуваного органу, ми переконалися, що бісфосфонати володіють тиреоактивуючею дією.

Результати органометрії показали, що маса і об'єм щитоподібної залози у щурів, що одержували “Зомету”, впродовж всього експерименту збільшуються по мірі зростання тривалості дії препарату на організм тварин. У порівнянні з аналогічними показниками у інтактних щурів маса і об'єм перевищують контрольні значення у всі строки дослідження, що може відбуватися при підвищенні функціональної активності органу (М.Ю. Самарін із співав., 2000). У статевонезрілих щурів параметри більше контролю на 3,64% – 12,02%, у статевозрілих – на 1,07% – 14,45% (р<0,05), а у старих – на 1,16% – 23,77% (р<0,05). По закінченні періоду реадаптації дані органометрії наближаються до контрольних значень у всіх вікових серіях.

При світлооптичному дослідженні оглядових гістологічних препаратів щитоподібної залози щурів, що одержували “Зомету”, на відміну від інтактних тварин, межі часточок виразно контуруються вже на першому строку спостереження (7 доба – статевонезрілі щури). Часточки дрібних розмірів, полігональної форми, рівномірно розсіяні в паренхімі органу і розділяються між собою прошарками строми. Спостерігається збільшення просвіту гемокапілярів в міжфолікулярних просторах. Виражене повнокров'я і розширення капілярів, розташованих уздовж міжчасточкових септ. У окремих ділянках паренхіми, а саме, в зонах її проліферації, характерно посилення капілярного кровопостачання, що свідчить про підвищення віддачі гормональних продуктів в циркуляцію. Дійсно, за даними імуноферментного аналізу, у тварин всіх вікових періодів зареєстровано підвищення змісту тиреоїдних гормонів в плазмі крові. При цьому відбувається зсув спектру гормонів у бік активнішої форми – Т3. Концентрація трийодтиионіна перевищує контроль на 4,42% – 25,41% (р<0,05), а тироксина – на 1,10% – 11,70%, досягаючи максимуму відхилень у статевонезрілих тварин. Визначається зменшення фолікулів у розмірах. Так, більший та меньший діаметри фолікулів нижчі за контрольні значення протягом всіх строків спостереження, а саме, на 6,50% – 18,18% (р<0,01) та на 2,01% – 17,08% (р<0,01) у молодих особин; на 12,37% (р<0,05) – 16,88% (р<0,001) та на 12,77% (р<0,01) – 19,05% (р<0,01) у зрілих особин; на 9,39% – 16,92% (р<0,001) та на 3,72% – 25,76% (р<0,001) у тварин періоду старечих змін. Площа фолікулів також нижча за контроль на всіх етапах постнатального онтогенезу, проте, відхилення максимально виражені у старих щурів (на 11,09% (р<0,01) – 22,42% (р<0,001)). Колоїд слабо концентрований, рожевого кольору і заповнює фолікулярну порожнину не повністю, що свідчить про активну його резорбцію. Тому площа колоїду нижча за контроль на всіх етапах постнатального онтогенезу на 19,87% (р<0,001) – 38,57% (р<0,001), досягаючи максимуму відхилень у молодих особин. Індекс накопичення колоїду також коливається на низькому рівні практично на всіх строках спостереження (2,43 – 2,99), що вказує на підвищення інтенсивності виведення колоїду, а, значить, посилення віддачі тиреоїдних гормонів в циркуляцію. Фолікули вислані переважно циліндровим епітелієм. Підвищення активності тиреоїдного епітелію підтверджують такі морфологічні параметри, як площа і висота тироцитів. Найбільш вагомі відхилення від контрольних значень у бік збільшення були одержані у статевонезрілих тварин, що пов'язано з інтенсивним зростом щитоподібної залози і становленням її функції в цьому віці: площа епітелію більше контролю на 4,40% – 22,64% (р<0,01), а його висота – на 18,76% (р<0,001) – 22,45% (р<0,001). У статевозрілих щурів відхилення менш значні, оскільки цей вік характеризується морфофункціональною стабільністю залози і високими компенсаторними можливостями організму в цілому: площа тироцитів перевищує контроль на 1,95% – 11,45%, а висота – на 14,78% (р<0,05) – 18,85% (р<0,01). На відміну від статевозрілих, а тим більш статевонезрілих щурів, у старих тварин виявляються ознаки помірної активації синтетичних і секреторних процесів в тканині органу, тому достовірних відхилень по даних параметрах виявлено не було. Коливання фолікулярно-колоїдного індексу на вищому рівні зареєстровані також у статевонезрілих тварин (3,46 – 3,64), а далі по мірі дорослішання ФКІ поступово знижується від 2,54 до 0,95, залишаючись при цьому вище за контроль навіть наприкінці експерименту (90 доба – старі щури). Підвищується проліферативна активність тироцитів, а, отже, і їх кількість у фолікулярному епітелії збільшується від 23,12 до 38,23. Ядра тироцитів крупні, овальні і займають більшу частину цитоплазми клітин. Розміри ядер більше контрольних значень впродовж всього експерименту, досягаючи максимуму відхилень у молодих особин (до 26,67% (р<0,001)). Зниження ЯЦІ наприкінці експерименту указує на те, що ядра найбільш активні в ранні строки спостереження. Тому на початку фази гіперактивності щитоподібної залози, що викликається введенням “Зомети”, ядерно-цитоплазматичне відношення зростає. В кінці цієї фази площа цитоплазми залишається підвищеною унаслідок супутніх білковому синтезу гідратації і накопичення в ній гормональних речовин (К. Ташке, 1980).

У групі реадаптації на 90 добу спостереження щитоподібна залоза практично не відрізняється від такої у інтактних щурів на цьому строкові у тварин всіх вікових періодів.

При введенні щурам препарату “Зомета” виявляється його вплив і на ультраструктуру щитоподібної залози. Фолікулярний епітелій при цьому переважно високопризматичної форми. У апікальній частині тироцитів виявляються численні мікроворсинки, апікальні гранули та псевдоподії. Ядра овальної форми і розташовуються ближче до базальної частини клітин. Гетерохроматін концентрується у вигляді вузької майже безперервної стрічки уздовж внутрішньої мембрани ядерної оболонки і у вигляді невеликих скупчень в середній частині ядра. Ядришко займає місце на периферії ядра. У цитоплазмі спостерігаються профілі гранулярної ендоплазматичної сітки, виразно виявляється комплекс Гольджі і мітохондрії. Характерна наявність округлих краплин, по своїй структурі схожих на колоїд, а також лізосомоподібних тілець, що відбувається при посиленні функціональної активності щитоподібної залози. Серед волокон сполучної тканини зустрічаються фібробласти. У парафолікулярних клітинах цитоплазма містить велику кількість секреторних гранул, в ній виразно виражені типові органели, що указує на підвищену секреторну активність С-клітин. А, як відомо, функціональний стан С-клітин не може не відображатися на діяльності тироцитів. Кальцитонін сприяє посиленню функціональної активності тироцитів, діючи на них синергідно з серотоніном, а значить, парафолікулярні клітини потенціюють функціональну діяльність фолікулярного апарату (К.А. Зуфаров із співав., 1989; В.Б. Шадлинський, С.М. Рустамова, 2000). Кількість інтерфолікулярного епітелію також помітно зростає, визначається диференціювання інтерфолікулярних острівців в мікрофолікули, що відбувається в умовах посилення секреторної активності щитоподібної залози (А.В. Павлов, 1992; D.H. Copp, 1994).

Поєднане введення “Зомети” і гідрокортизону приводить до вирівнювання органометричних показників щодо аналогічних у інтактних тварин впродовж всього експерименту. При цьому коригуючий вплив золедронової кислоти на показники маси і об'єму щитоподібної залози виявляється в різні строки спостереження залежно від віку тварин: у статевонезрілих щурів на 30 добу (показники нижчі за контроль всього на 2,63% і 4,79%), у статевозрілих – на 15 добу (нижче на 1,54% і 2,94%), а у старих тварин вже з 7 дня спостереження маса і об'єм органу практично не відрізняються від контрольних значень (нижче на 0,70% і 1,71%).

При мікроскопічному дослідженні в щитоподібній залозі щурів різних вікових періодів, що одержували одночасно гідрокортизон і “Зомету”, з часом спостереження відмічається поступове диференціювання органу на часточки. Останні розділяються між собою сполучно-тканинними прошарками, в яких виявляються колагенові волокна, фібробласти, міжчасточкові судини. Такі морфометричні показники, як більший та менший діаметри фолікулів, площа фолікулів трохи відрізняються у бік зменшення, що указує на превалювання ефектів бісфосфоната над глюкокортикоїдом і, отже, поліпшення морфофункціонального стану щитоподібної залози в цілому. Тиреоїдний епітелій переважно кубічний, темно-клітинний, але в окремих ділянках паренхіми відбувається його трансформація в циліндровий, що указує на підвищення функціональної активності таких тироцитів, або – в плоский, що свідчить про згасання як синтетичних, так і секреторних процесів в таких фолікулярних клітинах. Площа і висота тироцитів достовірно не відрізняються від контролю (вище на 0,60% – 4,83%). Колоїд гомогенний, блідо-рожевий, заповнює фолікулярну порожнину повністю або зберігається тільки в її центрі. Відхилення площі колоїду коливаються в межах від -0,78% до -9,03%, що свідчить про значне поліпшення секреторної активності досліджуваного органу. Дійсно, введення “Зомети” на фоні підвищеного вмісту в організмі тварин гідрокортизону приводить до коливань тиреоїдних гормонів в плазмі крові, наближаючи їх до контрольних значень. У молодих особин сплеск концентрації трийодтироніна зареєстровано на 15 добу спостереження (Т3 більше контролю на 9,20%), у зрілих особин – відбувається рівномірне надходження тиреоїдних гормонів в циркуляцію, а у щурів періоду старечих змін – зсув спектру гормонів у бік активнішої форми – Т3 спостерігається на 30 добу дослідження (рівень Т3 вищий за контроль на 15,21%, а Т4 – нижче на 8,04%). Крім того, з часом спостереження виявляється підвищення ФКІ і одночасне зниження ІНК, що указує на достатньо високу функціональну активність щитоподібної залози, чого не спостерігається при монодії гідрокортизоном. Це свідчить про здатність золедронової кислоти коригувати негативний вплив гідрокортизону на організм тварин. Визначено посилення проліферативної активності щитоподібної залози на фоні помірного перебігу процесів синтезу, депонування та секреції гормональних продуктів. На відміну від тварин, що піддавалися ізольованій дії гідрокортизону або “Зомети”, навіть у старих щурів, що одержували обидва препарати, аж до 90 дня спостереження має місце зв'язане посилення виразності ознак колоїдонакопичення та колоїдовиведення.

Коли введення препаратів припиняється після 30 дня експерименту, на 90 добу спостерігається поліморфність фолікулів за розмірами, формою і функціональною активністю. Виразність відхилень за морфометричними показниками декілька посилюється, але достовірних відхилень не було виявлено. Після закінчення періоду реадаптації спостерігається відновлення осмотичного балансу між ядром і цитоплазмою фолікулярних клітин, унаслідок чого ядерно-цитоплазматичне відношення повертається до норми.

При електронномікроскопічному дослідженні щитоподібної залози щурів, що піддавалися комбінованій дії гідрокортизону і “Зомети”, виявлені незначні відмінності ультраструктури залози піддослідних тварин від такої у контрольних щурів. В основному переважають функціонально повноцінні активні клітини. Апікальна поверхня покрита мікроворсинками і занурена в колоїд. Ядра тироцитів овальної форми, з рівними контурами, містять невеликі скупчення гетерохроматіну. У цитоплазмі виявляються порожнини гранулярної ендоплазматичної сітки, комплекс Гольджі і ниткоподібні мітохондрії. Виявляється багато інтерфолікулярних острівців, подібних по своїй будові таким у тварин контрольної групи. Сусідні клітки, створюючи острівець, з'єднуються за допомогою міжклітинних контактів, поблизу яких виявляються численні апікальні гранули. С-клітини розташовані групами, займають парафолікулярне положення до стінки фолікула і контактують з капілярами. У їх цитоплазмі виявляється велика кількість секреторних гранул, що скопилися переважно поблизу базальної мембрани.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вирішена актуальна наукова задача – вивчені морфофункціональні особливості будови щитоподібної залози щурів на органному, тканинному, клітинному та субклітинному рівнях організації при впливі на їх організм підвищеного рівня глюкокортикоїдів (нативного препарату гормонів пучкової зони кори наднирків – гідрокортизону та його синтетичного аналога – дексаметазону), введення “Зомети” (препарату золедронової кислоти із класа бісфосфонатів) та комбінованого впливу гідрокортизону та “Зомети” на різних етапах постнатального онтогенезу.

1. Характер та спрямованість визначених змін в морфології щитоподібної залози залежать від виду, тривалості термінів впливу гідрокортизону, дексаметазону і золедронату та від віку тварин. У статевонезрілих щурів виникають більш значні структурно-функціональні перебудови, ніж у статевозрілих і щурів старечого віку. По закінченні періоду реадаптації відновлення морфофунціонального стану щитоподібної залози реалізується ефективніше у щурів статевозрілого віку після впливу всіх препаратів.

2. В результаті впливу глюкокортикоїдів на організм тварин різних вікових періодів протягом всього експерименту в їх щитоподібній залозі визначені морфологічні ознаки, які свідчать про зниження її функціональної активності. Органометричні показники нижче контролю на 3,90% – 22,83%. Визначена запізнене диференціювання паренхіми на часточки, збільшення розмірів фолікулів на 6,70% – 23,22%, сплощування фолікулярного епітелію із зменшенням його висоти на 12,79% – 21,83%, ущільнювання колоїду, зниження ФКІ та одночасне підвищення ІНК в поєднанні із зменшенням розмірів ядер тироцитів, зниженням ЯЦІ, підсиленням деструктивних та десквамативних явищ з часом дослідження.

3. На ультрамікроскопічному рівні після дії гідрокортизону визначаються низькопризматична форма фолікулярних клітин, сплощування апікальної мембрани тироцитів та відсутність складок базальної мембрани, зменшення кількості та розмірів мікроворсинок, парафолікулярних клітин та інтерфолікулярних острівців в поєднанні з темними ядрами неправильної форми, функціонально напруженими та виснаженими мітохондріями, розширеними цистернами гранулярної ендоплазматичної сітки. За імуноферментним аналізом визначається відносне зміщування спектру тиреоїдних гормонів у бік менш активної форми – Т4.

4. Застосування дексаметазону викликає менш виразні зміни в морфофункціональній реакції щитоподібної залози у порівнянні із групою щурів, отримувавших гідрокортизон. Органометричні показники нижче контролю на 1,46% – 13,39%. Зареєстровано збільшення розмірів фолікулів на 0,71% – 11,84%, зменшення висоти тиреоїдного епітелію на 10,00% – 13,06% у поєднанні із затримкою перетворення Т4 в Т3, про яку свідчить зменшення рівню трийодтироніну (на 3,28% – 20,41%) на фоні незмінного рівня тироксину (0,51% – 3,63%).

5. Застосування “Зомети” спричиняє виразні структурні зміни з боку щитоподібної залози на всіх етапах постнатального онтогенезу, які супроводжуються ознаками підвищення її функціональної активності. Органометричні показники вище контролю на 1,07% – 23,77%. При світлооптичній мікроскопії та гістоморфометрії визначено: передчасне диференціювання паренхіми на часточки, зменшення розмірів фолікулів на 6,50% – 19,05%, підвищення висоти (на 18,76% – 22,45% та площі фолікулярного епітелію (на 4,40% – 22,64%), розріджування колоїду та наявність у ньому вакуолей резорбції, підвищення ФКІ та одночасне зниження ІНК в поєднанні із збільшенням розмірів ядер тироцитів, підвищенням ЯЦІ, активацією проліферативних процесів в тироцитах.

6. За електронномікроскопічним дослідженням після дії “Зомети” визначаються високопризматична форма клітин, наявність великої кількості апікальних гранул, псевдоподій та довгих гіллястих мікроворсинок, складчастість базальної мембрани в поєднанні зі світлими ядрами овальної форми, колоїдними краплинами, лізосомоподібними тільцями, великою кількістю секреторних гранул у цитоплазмі С-клітин, диференціюванням інтерфолікулярних острівців у мікрофолікули. За даними імуноферментного аналізу визначається відносне зміщування спектру тиреоїдних гормонів у бік більш активної форми – Т3.

7. У результаті органометричного, мікроскопічного та ультрамікроскопічного методів дослідження та аналізу крові встановлено, що введення тваринам “Зомети” на фоні підвищеного рівня в організмі гідрокортизону спричиняє незначні зміни в структурно-функціональному плані щитоподібної залози щурів всіх вікових періодів. Органометричні показники нижче контролю на 0,70% – 4,79%. Зменшення розмірів фолікулів на 0,78% – 9,03%, збільшення площі та висоти епітелію на 0,60% – 4,83%, наближення концентрацій тиреоїдних гормонів до контрольних показників свідчать на користь застосування препарату золедронової кислоти в якості коректора негативного впливу гідрокортизону.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Встановлено, що в умовах підвищеного рівня в організмі глюкокортикоїдів, в щитоподібній залозі на всіх рівнях її організації відбуваються морфологічні перебудови, які супроводжуються зниженням її функціональної активності. Тому